CHNG 1: LI M U

GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh

Page 1

1.1. t vn Theo xu hng ton cu hi nhp kinh t, hng ha c tng cng lu thng gia cc ni trn th gii. Sn phm khng ch c sn xut mt ni m c th ch to, lp t qua nhiu cng on ti nhiu quc gia khc nhau. T do ha thng mi, hng ro thu quan b xa b, th trng m rng trong v ngoi nc cng thm khoa hc cng ngh ngy cng pht trin gip cc doanh nghip tng nng sut, gim chi ph, nhng iu ny gy p lc cnh tranh ln cho hu ht cc cng ty. Trong iu kin , cht lng sn phm tr thnh mt nhn t quan trng, gip thu ht khch hng v l vn c cc doanh nghip quan tm ci tin nhm pht trin bn vng. Hin nay, s pht trin ca nn nng nghip nc ta ang i vo mc thm canh cao vi vic s dng ngy cng nhiu phn bn ha hc, thuc bo v thc vt ha hc v hng lot cc bin php nh: trng la 3 v, ph rng canh tc c ph, h tiu, iu vi mc ch khai thc, chy theo nng sut v sn lng. Chnh v vy, vi s canh tc trn lm cho t ai ngy cng thoi ha, dinh dng b mt cn i, mt cn bng h sinh thi trong t, h vi sinh vt trong t b ph hy, tn d cc cht c hi trong t ngy cng cao, ngun bnh tch ly trong t cng nhiu dn n pht sinh mt s dch hi khng d bo trc. Chnh v vy, xu hng quay tr li nn nng nghip hu c vi vic tng cng s dng ch phm sinh hc, phn bn hu c trong canh tc cy trng ang l xu hng ca Vit Nam ni ring v th gii ni chung. Hin cc ch phm ang c s dng nhiu ti cc vng trng rau sch nh Lt, Vnh Phc, Thanh Tr, Hi Dng, H Ty, ng Anh... ca Vit Nam. Nhiu thp k qua, thuc ha hc bo v thc vt (BVTV) pht huy c tc dng tch cc trong vic phng tr su bnh, bo v cy trng, tuy nhin n cng gy ra nhng tcdng khng mong mun nh nh hng xu n mi trng sng, nhim lng thc, thc phm, gy ng c cht GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh Page 2

ngi... Do vy, vic s dng cc tc nhn sinh hc nh virut, vi khun, vi nm hay cc hp cht t nhin c hot tnh sinh hc mnh phng tr su bnh cho cy trng l rt hu ch v cn thit, trong thuc tr su vi sinh v ang c la chn. Trong thuc tr su sinh hc Bacillus thuringiensis (Bt) thuc nhm thuc tr su vi sinh n c nhiu u im i vi cy trng v an ton i vi mi trng c nhiu ngi la chn. Nhn thy vai tr quan trng ca thuc tr su sinh hc Bt nn vic m bo cht lng ch phm thuc tr su sinh hc Bacillus thuringiensis (Bt) l ht sc quan trng, tuy nhin vic kim tra cht lng hin nay vn cn gp nhiu kh khn v phng php thc hin. V vy chuyn phn tch ch phm Bacillus thuringiensis c thc hin nhm xy dng c qui trnh kim tra cht lng v phng php tin hnh kim tra ch phm. 1.2. Mc ch Xy dng phng php xc nh cht lng sn phm ca thuc tr su sinh hc Bt c t yu cu ch tiu cht lng ca nh nc a ra hay khng gm: + Phn tch nh lng tng s bo t Bacillus thuringiensis trong ch phm. + Xc nh hiu qu tiu dit su hi ca ch phm Bt.

GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh

Page 3

CHNG 2: TNG QUAN TI LIU

GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh

Page 4

2.1. Thuc tr su sinh hc Bt 2.1.1. Lch s Ln u tin vo nm 87 , nh c hc Pasteur ngi Php pht hin mt loi vi khun gy bombycis Sau vo nm 9 nh cho con tm v t tn l Bacillus , nh cn tr ng hc ngi c l t erline

pht hin loi vi khun ny trn loi su xm Thuringia v ng a Trung Hi v t tn l Bacillus thuringiensis vit tt l khong gia th k XX, ngi ta pht hin nhiu chng khun Sau n t k sinh trn

nhiu loi su khc nhau nh su xanh, su keo, su rm thng T vi t c ch to thnh thuc tr su s dng trong nng nghip t ln u 9 ti Nht n i nh sinh vt hc nhiu nc, m u cho cng ngh thuc tr su sinh hc tin c pht hin vo nm

ShigenteIshiwarti, khi ng tm ra nguyn nhn gy ra ci cht t ngt ca mt s su t ShigenteIshiwarti u tin phn lp vi khun Bacillus thuringiensis, gi l Bacillus sotto Nm 1911, Bernard - ngi c, tm thy trong mt xng t m Thuringia, mt ging vi khun k sinh trong c th cn tr ng, c sc tr su rt mnh, gi l khun Thuring. Nm 1971, ch phm t c nghin cu Vi nhng thnh tu ca di t truyn hc v cng ngh sinh hc, ngi ta pht hin nhiu chng

c kh nng k sinh mnh, sn xut ra nhng ch phm c hm lng c t v tnh n nh cao tng hiu lc dit su v m rng ph tc dng trn nhiu loi su hi thuc nhiu t, trong cn tr ng nhiu v ng kh hu khc nhau xc nh c ti trn 5 loi su hi nhim cc chng ao gm hu nh ton cc loi su hi c Vit Nam. t chim phn ln th trng thuc t Hin nay thuc tr su t vi khun

tr su sinh hc trn th gii cng nh nc ta Ngoi vic d ng lm thuc tr su, hin nay ngi ta tch mt s gen t vi khun gh p vo h thng gen ca cy to ra cc ging cy khng su nh ging ng khng su xanh, ging l a khng su c thn, su cun l, ging ng khng su Vit Nam, ch phm thuringiensis c nghin cu t nm GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh 97 Hn 2 t Bacillus t ch phm

Page 5

nhp khu v ni a cho kt qu tt trong phng th nghim v ngoi ng i vi mt s su hi chnh trn ng rung nh su xanh , m trng, su xm, su t, su hi ng, su o Cc lai sn phm thng mi c trn th trng kh nhiu nh Vi-Bt 32000WP,16000WP; BT Xentary 35WDG, Firi iotox P dng t, Firi iotox C dng dch c c

Hnh 2.1. Sn phm Bt trn th trng 2.1.2. Phn loi Thuc nhm tr su sinh hc, c ngun gc vi sinh vt

Bacillus

thuringiensis , ph dit rng v hu hiu vi cc loi su nh su cun l, su t, su xanh, su khoang, su n tp C nhiu loi thuc Bacillus thuringiensis trn th trng th gii nh:- Bacilus thuringiensis var aizawai kiu serotype, hot cht dng o t v tinh th, ch in thnh dung dch c, d ng tr u trng mt hi kho tng. Bacillus thuringiensis var israelensis tn khc: Teknar hot cht dng tinh th -endotoxin to thnh qua ln men Bacillus thuringiensis Berliner var. israelensis, Serotuper (H- 4 Thuc c gia cng nhiu dng nh dch, t thm nc d ng tr mui, u tr ng rui Bacillus thuringiensis var. kurstaki (tn khc Bakthane, Agritol, Bacto speine plus, iotrol , hot cht dng o t v tinh th -endotoxin c to thnh qua ln men Bacillus thuringiensis Berliner, var. kurstaki, GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh Page 6

Serotype H-3a 3

Thuc c gia cng thnh nhiu dng nh t thm d ng tr u tr ng Lepidoptera

nc, sa huyn ph , dung dch c

nh su khoang, su t, su xanh v nhiu loi su khc hi rau, mu v cy n tri Bacillus thuringiensis var morrisoni, hot cht dng o t v tinh th -endotoxin c to thnh qua ln men t kh tan trong nc v acillus thuringiensis Berliner var morrisoni, serotype 8a 8 Thuc c gia cng thnh dng t thm nc, d ng tr u tr ng Lepidoptera hi rau mu, cy n tri, cy cnh, cy cng nghip Bacillus thuringiensis var San Diego tn khc: Myx 85 , d ng tr cnh cng cho khoai ty, c chua, cy xanh.

2.1.3. Tnh an ton ca thuc sinh hc Bt Cc sn phm t c s dng rng ri trn th gii, chim nm 99

n 2%

tng sn lng thtrng thuc tr su trn th trng th gii vo nhng Protein Cry c tnh chiu cao ti cc loi cn tr ng c ch ch Cc protein Cry t hoc khng nh hng ti cc loi sinh vt khc. Trong gn 4 nm c s dng rng ri trn ton th gii, ch ng ta cha tm thy nh hng xu ca ch ng ti sc khe con ngi hay mi trng ( EPA, 1998a; Mc Clontock et. A;..1995 ). K t nm 96 n nm 998 ti Hoa K hin c t nht 8 sn phm vi sinh WHO v tnh an ton ca sn phm vi sinh t c ng k kim t v khng nh rng: t ti con ngi, ng nh Ti chu u c hn 2 sn phm Theo cuc kho st gn y ca Khng tn ti mi nguy him no ca sn phm

vt c xng sng khc hoc ti cc sinh vt khng ch ch khc (IPCS, 2000).

2.1.3.1. Sc khe con ngi Cc nghin cu v tnh an ton ca thuc tr su vi sinh t trong hn 4 nm chng minh rng khng tm thy du hiu nh hng no ti GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh Page 7

vic tng cn, khm nghim lm sng hay trn t thi (McClintock et al., 1995). Cc protein o v Mi trng Hoa k US Environmental Prtectin Agency US-EPA trin khai nhng nh gi c t v thm ch cc t c th liu lng cao hn Theo Extension Toxicology Network Extoxnet , cc d n v thng tin thuc tr su mt s trng i hc ca Hoa k cho thy Kt qu cuc th nghim trn 8 ngi mi ngy n gram t thng mi trong vng 5 ngy, v trong cc ngy khc nh g Nhng ngi n gram t/ngy nhau khng gy ra chng

trong 3 ngy lin tc han ton khng ng c hay nhim nh Hn na, mc phn t protein nhanh chng phn hy i dch v d dy trong iu kin phng th nghim Extoxnet, 996 t tn ti 2.1.3.2. nh hng n mi trng Nc ngm v h sinh thi t: Nc ngm protein tng i n trong t v c phn loi vo dng t ng v n khng c kh nng di chuyn hoc thm qua nc ngm Protein ny khng n vng trong iu kin t axit, v phn hy nhanh chng kh i phi di nh sng mt tri, di tc ng ca tia UV Cc chuyn gia tin hnh nhng nghin cu c lp nhm iu tra cc nh hng ca cy trng t i vi sinh vt t v cc loi cn tr ng khc c xem l c ch trong nng nghip Kt qu cho thy, ch ng khng gy ra nh hng t li i vi cc sinh vt t khng phi l ch tn cng ca ch ng, thm ch ngay c khi cc sinh vt ny c x l t vi liu lng cao hn nhiu so vi thc t c th xy ra trong iu kin trng trt t chothy khn g c s thay i no trong qun th vi sinh vt t gia cc cnh ng c nguyn liu thc vt t v cnh ng c nguyn liu thc vt truyn thng t v cy khng chuyn gen t Donegan Donegan v cng s, 995 , cng nh khng quan st thy s khc it gia cc cnh ng trng cy v cng s, 996 2.1.3.3. ng vt v cn trng

GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh

Page 8

Cc th nghim tin hnh trn ch, chut, chut lang, th, c, ch, k nhng v chim cho thy protein t khng gy ra nhng nh hng c hi Cng cn nhn mnh rng, c t cng hon ton khng gy nh hng n cc loi cn tr ng c ch hoc ng vt n tht nh mt s loi ong v cnh cng Extoxnet, 996 Nm 999, c mt o co v nh hng c hi ca ht phn t cy ng Bt n u trng ca loi m Monarch. Bo co ny gy ra mi quan tm v lo ngi v nhng ri ro m thc vt t c th gy ra i vi sinh vt khng cn dit Tuy nhin, nhng t gy nh hng khng ng k i nghin cu gn y cho thy ng

vi qun th m Monarch trn cnh ng N lc nghin cu hp tc gia cc nh khoa hc Hoa K v Canada cung cp nhng thng tin xy dng qu trnh nh gi ri ro tiu chun v nh hng ca ng i vi qun th ging lai thng mi, protein t m Monarch H i n kt lun rng, hu ht cc t c iu hin vi nng thp trong

ht phn v nghin cu trong phng th nghim cng nh trn cnh ng cho thy mi mt ht phn u khng gy nh hng c hi trn ng rung 2.1.3.4. Tnh an ton ca cy trng c bo v bi Bt c chng minh nh cc c tnh sau + Cy trng c o v i t khng c c t ti con ngi v khng tm thy du hiu ca s d ng. + Da trn hai tiu ch v lng thc v thc phm th cy trng Bt l an ton cho tiu th + Cc protein Cry gn nh khng c c t ti cc sinh vt khng ch ch, ngoi tr cc loi cn trng c quan h gn gi vi vt ch ch + Protein Cry, cc marker v cy trng mi trng t khng tm thy ri ro ti

GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh

Page 9

2.1.4. ng dng ca ch phm Bt 2.1.4.1. Dit su bnh Ngy nay cc ch phm sinh hc an ton cho phng tr su hi cy trng v nng sn o qun c khuyn khch, ng dng thay th dn cc thuc tr su ho hc, trong thuc tr su vi sinh Bacillus thuringiensis gi tt l t c d ng rng ri nht Trong nhng nm gn y cc nh khoa hc c rt nhiu c gng phn lp vi khun ny t mi trng ca nhiu nc trn th gii vi hy vng tm ra nhng chng t c ph gy nh mi v khong vt ch rng hoc nng cao hot tnh cc chng t i vi cc nhm cn tr ng mi, hay tm kim ngun gen t nhng chng phn lp cho cc k thut di truyn tip theo Vi s pht trin mnh m ca cng ngh sinh hc hin i, c it l cng ngh gen m ra nhng tim nng ht sc to ln cho vic pht trin thuc tr su sinh hc t Vic lm giu thm su tp cc chng thuringiensis phn lp Vit Nam v ngun gen qu t nhng chng ny nhm to ra cc chng ti t hp mi c ph dit su rng hn i vi mt s loi cn tr ng quan trng l rt cn thit th nghim hot tnh dit su ca chng c hot tnh dit 9 exiqua; 7/ hiu qu dit chng thuringiensis var kurstaki phn lp c tinh th hnh qu trm, trong 9/ % i vi su t P xylostella v su keo S / chng c chng c hiu qu dit 8 -9 % i vi su khoang S litura; 6/ % i vi su ngi go C cephalonica

chng c hot tnh dit 5 -6 % i vi su ng H armigera

2.1.4.2. Cy trng Bt Cy trng t l cng c dit su nh thc vt mi Vn khai thc

mi kh nng gim thit hi m a mng v tng sn lng lng thc tr nn cp ch khi dn s ton cu tng ln nhanh chng v din tch t canh tc li gim ng k C ng vi k thut canh tc nng nghip thch hp, cng ngh khng cn tr ng loi ngi Nhng li ch ca cy trng Tng cng qun l su nh GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh Page 10 t: t c th em li rt nhiu li ch cho

 Gim s dng thuc tr su Thu c li nhun nhiu hn Ci thin iu kin cho cc sinh vt c ch Ng cha t c t mycotoxin c t c th gy cht gia sc v ung th cho ngi Qun l tnh khng cn tr ng IRM Cy Ng i gen 2.1.4.3. Ngoi ra vi khun Bt cn c dng dit lng qung Mt nhm cc nh khoa hc ti Vin Pasteur TPHCM va nghin cu thnh cng ch phm vi sinh t chng vi khun Bacillus thuringiensis subsp. israelensis serotype dit lng qung TS H Th Hng Nhung - Vin Pasteur TP HCM c ng cc cng s va nghin cu thnh cng mt loi ch phm vi sinh hc t chng vi khun c tc dng dit tr c lng qung trong nhiu iu kin sng khc nhau Ch cn 2 ng c th qung Loi ch phm sinh hc cha vi khun ny c tc dng dit lng qung trong nhiu iu kin sng khc nhau, t ao t nc ng cho n nc knh rch Khi Bt theo nc v thc n vo trong rut ca lng qung, c cht ca vi khun s gy thng rut v dit lng qung Trn th gii, cc nc pht trin nh c M, Chu u kim sot ti ri xung cc khu g ch phm ny, vi gi thnh khong 3 ha khi nn lng o v c mt khu vc c din tch t khng cn tr ng in

c dch st xut huyt do hn ch c lng qung Mt trong cc in php l s dng ch phm vi sinh c thnh phn vc t nhin c mui sinh sng t c th git c mi loi lng qung mui thng cng nh mui truyn nh st xut huyt, vim no Nht n, st r t, hay loi nh mi nh vim no Nipar Philipine , nh vim no Chikungunya GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh Page 11

2.2. Vi khun bacillus thuringiensis 2.2.1 c im vi khun Bacillus thuringensis (Bt) Bacillus thuringiensis l loi vi khun t in hnh c phn lp v ng Thuringia, c Vit Nam trong s 85 mu t, H Ni, H Nam, Nam nh, Thi nh phn lp c 92 chng n thu thp nh, Hi Dng, Hng Yn, Ninh acillus vi c im Gram +, hnh acillus c tinh th c phn loi n nc, ao h Hnh t t phn lp c dng tinh t

que, o t khng phnh Ch c 295 chng trong s c tinh th hnh trn, thp i, hnh kim Cc chng thnh loi Bacillus thuringiensis (Bt). t c trong cc mu t rung, t vn, thnh loi ph rt a dng Phn ln cc chng hnh dng khc nhau t l trc khun sinh dng tinh th mt trong nhng c im quan trng phn loi

th hnh thp i, mt s hnh cu v mt s chng c tinh th vi cc o t hiu kh khng uc, gram dng khng mt mu nhum khi ty ng it v cn, kch thc 3 - 6 m, c ph tim mao khng dy, t o ng ring r v xp thnh tng chui, cha tinh th c c kh nng dit su t dng hnh oval, hnh trng di ,2 1,6 m. t pht trin trong iu kin nhit 5 -)45 o C nhng thch hp nht 29 -)30 o C. Bo

GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh

Page 12

Hnh 2 2 Vi khun Bacillus thuringensis

Hnh 2 3 Khun lc vi khun Bacillus thuringensis Trng thnh mi t bo vi khun c mt bo t hnh trng v mt tinh th c hnh qu trm.

Hnh 2 4 T o vi khun

t vi tinh th crystal v o t spore

2.2.2. c im tinh th c v c ch tc ng ca vi khun Bacillus thuringiensis. 2.2.2.1. c im tinh th c Da vo c ch tc ng dit cn tr ng ngi ta xc nh c 4 loi c t:- Ni c t endotoxin, cn gi l tinh th c crystal: cry I, cry II, cry III, cry IV Hu ht l cc chng GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh t c mt hoc nhiu gen tin c t C Page 13

s gy nh cho cn tr ng chnh l cc gen Cry khc nhau Gen Cry c chia thnh 4 lp chnh: Cry I, II, III, IV + Gen Cry I: Thng tng hp cc protein hnh thoi gy nh cho cn tr ng cnh vy + Gen Cry II: To tinh th dng hnh thp gy nh cho cn tr ng cnh vy v cn tr ng 2 cnh V d nh gen Cry IIA gy nh cho loi Lymantria dispa, Cry IIB Helicoverpaarmigera. + Gen Cry III: Tng hp tinh th dng hnh thoi, gy nh cho cn tr ng cnh cng Coleoptera . + Gen Cry IV: Tng hp c tinh th dng hnh thoi v hnh thp, ch gy nh cho cn tr ng 2 cnh Diptera.

Hnh 2.5. Pansy peacock

GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh

Page 14

Hnh 2.6. Diaethria

Hnh 2.7. Helicoverpa armigera

GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh

Page 15

Hnh 2.8. Lymantria dispa

Hnh 2 9

cnh cng coleoptera

Hnh 2

2 cnh Diptera

GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh

Page 16

Nm 1955, C.L. Hannay v P.C Fitz James xc nh c bn cht protein c lin quan n c tnh ca vi khun. Tinh th c ca Bt c dng hnh thoi, hnh qu trm, hnh thp mang bn cht protein v c c tnh cao vi rt nhiu loi cn trng, chim 30% trng lng kh ca t bo. Khi nhum xanh metylen hoc fusin th c t bt mu di knh hin vi i pha tinh th c. Tinh th c rt bn vng nhit cao, c trng lng phnt l 5000 n v v khng phi bo t no cng c tinh th c. Trong qu trnh bo qun nu lu Bt s mt hot tnh do tinh th c b bin dng hoc phn hu . Cht formandehyde 20% v tia t ngoi c th lm mt hot tnh ca tinh th c.

Hnh 2

o t

t v tinh th c

n cht ha hc ca tinh th: trong tinh th c c nhiu loi acid amin, trong c hai loi c t l cao nht l acid glutamic v acid asparaginic Trong tinh th c cha lng kh ln 5 nguyn t C, N, H, O, S Ngoi ra cn cha 9 nguyn t khc nhng khng c P.Cc phn t c khi lng ln th c c tnh cn loi c phn t lng nh th khng c c tnh Tinh th n vng vi nhit cao so vi c t gi dng ha tan, chng hn tinh th B.thuringensis sotto 65 o C sau

vn cn hot tnh trong khi cc dng khc s mt hon ton c tnh GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh Page 17

Ngoi c t anpha exotoxin, cn c gi l phospholipaza Thc cht y l mt loi men lin quan n s phn hy phospholipit dn n cn tr ng cht Ngoi c t eta exotoxin, cn gi l ngoi c t n nhit, ch ng c khi lng phn t thp 7 7 )850. Sau 15 pht 2 o C vn cn hot tnh Ch ng tc ng ln cn tr ng lm cn tr vic tng hp ARN thng tin Ch ng cn c tc ng cng hng vi ni c t, sau khi ni c t ph v iu rut gia, chng nhanh chng xm - Ngoi c t nhim vo huyt tng v mu i n cc c quan lm thay i qu trnh trao i cht v lm cho cn tr ng mau cht lng phn t thp 2 6
o

(gamma) exotoxin, cn gi l c t tan trong nc Ch ng c khi -)2000, c mt s acid amin t do, tan trong nc, mn cm vi nh sngv c it mt hot lc trong 5 ph t C tr ln 2.1.2.2. C ch tc ng

Hnh 2 2 C ch tc ng ca tinh th c i vi su Khi c phun ln l cy, protein c t di dng tinh th s dit nhng loi su hi nht nh Tc ng ca tinh th ln cn tr ng l rt phc tp Tc ng in hnh l lm lit ng rut v xoang ming C GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh Page 18

th l sau khi su hi n phi cc tinh th tin c t, di tc dng ca mt loi men tiu ho trong dch rut ca su, tin c t ho tan thnh nhng phn t nh c hot tnh c Cc c t ny m vo mng vi mao trong rut, to ra cc l r cho nc chy vo, lm su mng nc, ngng n v cht Sau khi n tinh th n 7 gi tm du lit ton thn cc t o thng Sau khi m ph t, tinh th xut hin ti thng rut gia su xanh

ci Mt s t o tch ri, in i, cc cht n trong chy ra ngoi mng nh trn su c thn lm tng tnhthm thu Kali v chng minh tng K + trong mu v ch huyt l nguyn nhn gy t lit ng rut v ton thn tm du S thay i tc ng ca tinh th ph thuc vo nhiu yu t Chng hn nh thng, khivo rut trc v rut gia, nu pH cao >7, v c th khng c c ch gii c, tinh th s v ra lm nhim c mu Hin tng thy ph in trn tm, su rm, m ci Tuy vy trong nhiu trng hp khi tinh th c v ra, mt s loi su c c ch t gii c, ngng n, pH ng rut gim xung, sau mt thi gian nht nh ng tiu ha c phc hi Cc ng vt c v khng ng c khi n phi tinh th l do cht pepsin trong rut ng vt hot ng thch hp khi pH =2 lm mt tnh c ca tinh th vi khun

GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh

Page 19

Hnh 2 3 Su cht do tr ng c t thuc tr su Bt

GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh

Page 20

CHNG 3: VT LIU V PHNG PHP PHN TCH CH PHM Bt

GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh

Page 21

3.1. Phn tch nh lng tng s bo t Bacillus thuringiensis trong ch phm 3.1.1. Nguyn tc Trn mi trng c, mi vi sinh vt hoc mi bo t ng ring s pht trin thnh mt khun lc m s khun lc c th tnh ra s lng vi sinh vt trong mi n v th tch ca dch nghin cu u im ca phng php ny l khng pht hin nhm cc vi sinh vt cht hoc cc mnh xc hu c S dng phng php m thch a, m s khun lc trn mi trng thch sau khi hiu kh nhit 37 o C 1 o C trong 24h. Tng s bo t Bacillus trong 1g hoc 1ml mu ch phm kim nghim c tnh t s khun lc m c t cc a nui cy cc nng pha long. 3.1.2. Mi trng v ha cht Mi trng nui cy, pH 7,0 0,2 c thnh phn nh sau: Bng 3.1. Thnh phn mi trng nui cy Thnh phn Cao nm men Peptone NaCl Agar Nc ct Cao nm men Agar NaCl Peptone Nc ct NaOH Khi lng 5g 10g 5g 15()20g 1000ml

- HCl

GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh

Page 22

3.1.3. Thit b, dng c 3.1.3.1. Thit b S dng cc thit b, dng c ca phng th nghim vi sinh thng thng v c th nh sau: T cy vi sinh vt. Ni hp p lc. T m, c th duy tr nhit 37 o C. T lnh. My lc. My m khun lc. My o pH Cn phn tch, c kh nng cn chnh xc n 0,1mg. Knh hin vi quang hc. L vi sng. B iu nhit, c th duy tr nhit 45 o C 1 o C v 80 o C.

GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh

Page 23

Hnh 3.1. Cc thit b dng trong phn tch A. Autoclave B. My o pH C. Cn phn tch 3.1.3.2. Dng c nh nh mc, dung tch 1000 ml (loi A). Page 24 D. My m khun lc E. My lc F. T m

GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh

Bnh nn. ng nghim Pipet, dung tch 1 ml v 10 ml. ng ong, dung tch Bng khng thm nc. ml v 25 ml

Micropipet, dung tch 1000 l.

3.1.4. Ly mu v bo qun mu 3.1.4.1. Yu cu chung - Ly mu theo nguyn tc ngu nhin. Lng thuc trong mu phn tch cng nh trong mu lu t nht phi cho ba ln phn tch hoc phi thc hin cc php th m bo thu c kt qu chnh xc v tin cy Lng thuc ny c tnh ton trn c s tiu chun phng php th ca sn phm Thng thng mi l sn xut c ly hai mu (mt mu phn tch v mt mu lu Trng hp c bit, s mu phn tch v mu lu c th nhiu hn hai gi kim nghim v lu nhiu ni nu xt thy cn thit. Ly mu thnh phm

Mu c ly ti nhng v tr khc nhau ca l sn xut, khng c ph l cc n v ng gi sn phm ly mu. T cc n v ly mu c tp hp li thnh mu chung v mu cui cng. S lng mu thnh phm cn ly theo quy nh ti Bng 1. Bng 3.2. S lng mu cn ly theo quy cch ng gi Quy cch ng gi (g hoc ml) S lng mu ly (n v bao gi) n 2 T 2 n 5 T 5 n 50 70 30 7

GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh

Page 25

T 5 n 100 T 100 tr ln

4 3

Trong trng hp c bit th t y theo quy cch ng gi v tnh cht ca thuc ch ly mu phn tch v lu 3.1.4.2. Bo qun mu Xem tiu chun c th i vi sn phm lin quan hoc theo hng dn ca nh sn xut. 3.1.5. Cch tin hnh 3.1.5.1. Chun b dung dch pha long Cn 9g natri clorua, ha tan trong nc ct ng trong nh nh mc 1000ml, chnh pH sao cho sau khi kh trng l 7,0 0,2 bng dung dch HCl 0,1N v NaOH 0,1N. Dng ng ong cho vo nh nn mi bnh 90ml v dng pipet ly cho vo ng nghim mi ng 9ml dung dch trn. y bng nt bng khng thm nc, c giy bc, hp tit trng nhit 121 o C trong 15 pht. Bo qun trong t lnh nhit 2 n 8 o C, s dng trong 15 ngy. 3.1.5.2. Chun b mi trng Cn cc thnh phn mi trng PCA theo bng 1 hoc ly 22,5g mi trng tng hp, chnh pH sao cho sau khi kh trng l 7,0 0,2 bng dung dch HCl 0,1N v NaOH 0,1N. Lc u v un cch thy hoc trong l vi sng n khi si mi trng trong). Rt vo bnh 250ml lng mi trng 100ml. Tit khun trong ni hp nhit 121 o C trong 15 pht. Nu mi trng s dng ngay, ngui n 45 o C 1 o C b iu nhit, nu cha s dng ngay th cn bo qun trong t lnh nhit t 2 n 8 o C khng qu 30 ngy. 3.1.5.3. Chun b mu th Cn v trng khong 10g (10ml , chnh xc n 0,1mg, mu th cho vo nh nn ng 90ml dung dch pha long tit tr ng c pha GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh Page 26

long 10 -1 . Cho ln my lc ng ho mu khong 3 min t trong b iu nhit 80 0 C trong 10 pht. 3.1.5.4. Cc bc tin hnh - Pha long mu Dng micropipet ly 1ml dch pha long 10 -1 t bnh nn mu ng ha cho vo ng nghim cha 9ml dung dch pha long tit tr ng c pha long 10 -2 . Tip tc pha long tng t n pha long cn thit m c t 15 khun lc n 300 khun lc trn a theo d kin. - Cy ging i vi mt mu kim nghim phi nui cy t nht 3 nng pha long lin tip, mi nng d ng 2 a petri v tr ng Ly 1ml mu hoc dung dch pha long cc nng khc nhau cho vo gia tng a petri Mi trng PCA un nng chy, ngui n 45 o C 1 o C. Rt vo tng a 2ml n 15ml mi trng thch, o u dung dch mu vi mi trng bng cch lc 3 ln sang phi v 3 ln sang tri. cc a thch ng t nhin trn mt phng mt, nm ngang. Thi gian bt u pha long n khi rt mi trng vo a khng c qu 30 pht. 3.1.5.5. m Khi thch ng, lt p a v cho vo t m 37 0C trong thi gian t 18h n 24h. 3.1.5.6. c kt qu Sau 24h, m kt qu, m tng s cc khun lc mc trn cc a Vi khun Bacillus trn mi trng thch to thnh khun lc mu trng, hnh dng thay i.

GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh

Page 27

3.1.6. Tnh v biu th kt qu 3.1.6.1. Tnh kt qu Chn nhng a c t 15 khun lc n 300 khun lc ca 2 nng pha long lin tip tnh kt qu. Nu chnh lch cc gi tr 2 nng nh hn hoc bng 2 ln, th tnh s N bo t cho 1 g hoc 1 ml sn phm bng cch tnh trung bnh cng ca tng s khun lc m c trn cc a theo cng thc sau:

Trong : C: l tng cc khun lc m c trn tt c cc a c gi li t 2 nng pha long lin tip. V: l th tch mu cy trn mi a, tnh ng mililit (ml). n 1 : l s a c nng pha long th nht c gi li. n 2 : l s a c nng pha long th hai c gi li. d: l h s pha long tng ng vi pha long th nht. Lm trn s kt qu c c, ch gi li 2 s c ngha 3.1.6.2. Biu th kt qu Biu th kt qu di dng thp phn gia s 1,0 v 9,9 nhn vi 10 n (n l s m thch hp ca 10). Nu chnh lch cc gi tr 2 nng ln hn 2 ln, th ly gi tr ca nng pha long thp hn tnh kt qu. Nu 2 a ca sn phm lng nguyn cht hoc nng pha long ban u c t hn 5 khun lc tnh kt qu l trung bnh cng ca cc khun lc m c c 2 a tnh ra cho 1g hoc 1ml sn phm. Nu tt c cc a khng c khun lc no mc, nh gi kt qu nh sau: GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh Page 28

- t hn

khun lc Bacillus trong 1 ml sn phm.

- t hn /d khun lc Bacillus trong 1g sn phm. trong d l h s pha long ca nng pha long an u (10 -1 ). 3.2 Xc nh hiu qu tiu dit su hi ca ch phm Bt 3.2.1. Vt liu th nghim - Sn phm thuc tr su sinh hc Bt c ly t nh sn xut. - Su xanh c bt ngoi ng v. - Cy u. 3.2.2. Thit b v dng c - Bnh phun. - Hp nha. - Bng biu. 3.2.3. B tr th nghim Chun b 4 hp nha

x2 cm Cy u c ct nh 2x3cm cho vo

4 hp nha lm gi th cho su sng. Cho vo mi hp nha 30 con su xanh. Tip theo ta tin hnh pha ch v phun thuc vo 3 hp nha v mt hp khng phun lm mu i chng. thuc c pha ch theo ng hng dn c in trn bao b v nng v ng liu lng. Sau khi phun xong ta dng vi mng che mu li Sau 2 ngy m k t khi phun chng ti tin hnh iu tra v ghi chp s su cht, theo di cho n tn ngy cui cng. 3.2.4. Tnh ton kt qu T l su cht trong phng th nghim c tnh theo cng thc:

GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh

Page 29

Tnh hiu qu tiu dit su ca thuc

Hiu qu tiu dit su trong th nghim c tnh theo cng thc sau:

Trong : - H%: Hiu qu tiu dit su ca thuc cc cng thc. - K: L t s phn trm s su cht cng thc i chng. - B: L t s phn trm s su cht cng th nghim.

GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh

Page 30

CHNG 4: KT LUN V KIN NGH

GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh

Page 31

4.1. Kt lun Hon thnh qui trnh phn tch tng s bo t c trong sn phm. Hng php nh gi hiu qu dit su ca ch phm Bt xy dng c quy trnh phn tch ch phm Bacillus thuringiensis. Qui trnh ny n gin ha qui trnh kim tra cht lng ca ch phm thuc tr su sinh hc Bacillus thuringiensis. Gip vic qun l cht lng ch phm d dng hn 4.2. Kin ngh Cn phi ch trng u t hn na v mt k thut phn tch nh gi cht lng sn phm. Tip tc nghin cu xy dng hon thin k thut phn tch nh gi cht lng ch phm Bt. Thng xuyn kim tra nh gia cht lng cc sn phm Bt thng xuyn hn

GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh

Page 32

TI LIU THAM KHO 1. Ti liu Ting Vit [1]. Nguyn Th Me, Nguyn Th Nhung, Nguyn Th Hng Vn, Trn Ngc Hn (2001), Kt qu xc nh tnh khng thuc ca ry nu hi la ca mt s Tnh ng bng Sng Hng. tuyn tp cng trnh nghin cu BVTV 2000-2002, NXB Nng Nghip, H Ni 2002. [2] Lng Minh Chu 2007), State of insecticide resistance of brown planthopper in Mekong delta, Viet Nam. [3]. Nguyn Th Nh, Trn Vn Mo, Trn Cng Loanh (2001), iu tra d tnh - d bo su bnh hi trong lm nghip. Nxb Nng nghip - H Ni. [4]. Kt qu kho nghim mt s ch phm sinh hc phng tr su hi chnh b cch vy n l mun en ti Bc Cn. 2. Ti liu Ting Anh [5]. Bacillus thuringiensis an environment biopesticides.(1986), Theory & Practice. [6]. Cannon, R.J.C. (1993) Bacillus thuringiensis use in agriculture: a molecular perspec-tive. [7]. Becker, N., Zgomba, M., Ludwig, M., Petric, D. and Rettich, F. (1992b) Factors influencing the activity of Bacillus thuringiensis var. israelensis treatments. 3. Ti liu Internet [8]. http://www.sinhhocvietnam.com/forum/index.php GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh Page 33

[9]. http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_thuringiensis [10]. http://tailieu.vn [11]. http://violet.vn [12]. http://dienkhanh.vn

GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh

Page 34

GVHD: ThS. Trnh Th Lan Anh

Page 35