Kauno technologijos universiteto gimnazija

ARBATOS IR PIENO GRYB UPIL PRITAIKYMAS ANTIBAKTERINIO ODOS KREMO GAMYBAI

Darb atliko: Karolina Zakarauskait Darbo vadov: dr. Vilma Petrikait

Lietuvos sveikatos moksl universitetas, VU Biotechnologijos institutas

Darbo konsultantas: prof. Alvydas Pavilonis

Lietuvos sveikatos moksl universitetas

2012 m.
1

TURINYS

SANTRUMPOS VADAS 1. TYRIM APVALGA 2. EKSPERIMENTIN DALIS 2.1. Arbatinio ir pieno gryb upilo antimikrobinio aktyvumo tyrimai 2.2. Antibakterinio kremo priemikrobinio aktyvumo tyrimai 3. REZULTATAI IR J APTARIMAS IVADOS LITERATROS SRAAS PRIEDAS

3 4 5 6 6-7 7-8 9-12 13 14 15-16

SANTRUMPOS

S. aureus E. coli B. subtilis K. pneumoniae C. albicans P. aeruginosa P. mirabilis B. cereus A. hydrophila

Staphylococcus aureus Escherichia coli Bacillus subtillis Klebsiella pneumoniae Candida albicans Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Bacillus cereus Aeromonas hydrophila

VADAS
Darbo aktualumas Kombucha arbata tai juoda saldinta, arbatos grybe fermentuota arbata [3]. Arbatos grybo tvyn Ryt Azija. Gryb sudaro arbatos paviriuje plduriuojanios bakterij (Schizosaccharomyces pombe, Acetobacter xylinum ir kt.) kolonijos (r. 1 paveiksl). Pagrindins Kombucha arbatos sudedamosios dalys yra acto rgties bakterijos ir gliukorono rgtis [1,2]. Dl organini rgi arbata gyja saldiargt skon. Daniausiai is grybas platinamas tik i rank rankas, o kai kuriose alyse, pvz. JAV, Norvegijoje parduodamas parduotuvse ir vaistinse. Kombucha arbata naudojama liaudies medicinoje nuo vairi negalavim. Teigiama, kad ji stiprina imunin sistem, naikina kai kurias kenksmingas bakterijas skrandyje ir arnyne, valo organizm nuo toksin. Netgi manoma, kad arbatos grybas ukerta keli irdies ir kraujagysli, kasos, inkst ir viniams susirgimams. Kai kurie mons j vadina stebuklinguoju grybu ar jaunysts eliksyru, stabdaniu senjim. Vis dlto, kyla klausimas, kiek iose kalbose yra tiesos. Kurias bakterijas i ties is grybas veikia, ir ar i viso veikia? O galbt is grybas, ypa paplits tarp vyresnio amiaus moni, i ties turi potenciali naud ir gali bti naudojamas daug plaiau nei tik kaip geriama arbata? Siekdami isiaikinti kilusius klausimus, nutarme itirti grybo upilo antimikrobines savybes ir pabandyti j pritaikyti kaip konservant arba kaip antimikrobin mediag kremo gamybai. Darbo tikslas sukurti antibakterin krem, panaudojant kaip antimikrobines mediagas arbatos gryb Kombucha ir pieno gryb. Udaviniai: 1. 2.
3.

interneto upilas

1 pav. Arbatos grybo Kombucha

Itirti pieno grybo antimikrobines savybes. Itirti arbatos grybo antimikrobines savybes ir j priklausomyb nuo fermentacijos laiko. Pagaminti kremus su arbatos grybo skirtingomis koncentracijomis. vertinti pagaminto kremo antimikrobines savybes.

4.

1. TYRIM APVALGA
4

rodyta, jog Kombucha arbata teigiamai veikia mediag apykait, gydo artrit, skrandio veiklos sutrikimus ir vairias vio ris. Tyrimai rodo, jog Kombucha apsaugo kepenis nuo kenksmingo paracetamolio poveikio [10]. 2000 metais atliktas tyrimas, kuriame tirtas grybo poveikis Shigella sonnei, Escherichia coli, Aeromonas hydrophila, Yersinia enterolitica, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae ir kt. bakterijoms. rodyta, jog grybas antibakterikai veikia B. cereus, E. coli, A. hydrophila, S. typhimurium [8]. Skirting Kombucha upil koncentracija skiriasi, priklausomai nuo to, kokia grybo kultra naudojama [8]. Pagrindins organins rgties Kombucha arbatoje acto rgties didiausia koncentracija pasiekiama penkiolikt fermentacijos dien. Dar viena i pagrindini rgi yra L-gliukorono rgtis. Didiausia jos koncentracija bna dvylikt fermentacijos dien. Manoma, kad btent dl ios rgties Kombucha veikia detoksifikuojaniai [7]. Pieno ir citrin rgi fermentuotame arbatos tirpale yra labai mai kiekiai. i rgi daugiausia bna trei fermentacijos dien. Joki azoto turini jungini nra pridedama arbat prie j fermentuojant, taiau baltym kiekis fermentacijos metu auga. Tai rodo, jog arbatinio grybo bakterijos ir raugas iskiria papildomus baltymus [8]. Dl ios prieasties arbatinis grybas greitai dauginasi, todl j patogu naudoti pramonje. Pieno grybas yra bakterij kolonija, kurio tvyn Azija. Jame fermentuojamas pienas, kuris savo skoniu ir konsistencija po 24 valand fermentacijos primena kefyr. iam grybui priskiriamas antibakterins ir priegrybelins savybs. rodytas pieno grybo prieudegiminis poveikis granuliomos atveju [10].

2. EKSPERIMENTIN DALIS
1. Arbatos grybo upilo gamyba Arbatos gryb gavome i Lietuvos gyventoj, kurie j augino namuose, juodojoje arbatoje. Tyrimams arbatos grybo upil gaminome pagal kit mokslinink straipsniuose apraytas ir jau ibandytas metodikas [2,4,5], jas pritaikius ms laboratorijos slygoms. verdant igrynint vanden dedama 100 g/l cukraus, 3 paketliai/l juodosios arbatos ir virinama 3-5 min. Atvsinama iki kambario temperatros ir supilama stiklin ind. paruot arbat dedama 150 g arbatos grybo ir paliekama fermentuotis kambario temperatroje, pridengus marle. Taip paruotas grybo upilas laikomas iki tyrim pabaigos, po to i jo atsisluoksniavusio naujo grybo sluoksnio gaminamas naujas upilas. 2. Pieno grybo upilo gamyba Pieno gryb gavome i Lietuvos gyventoj, auginani j namuose. Jis auginamas piene, kuris keiiamas kiekvien dien, perkoiant pien per sietel, nuplaunant pieno gryb ir vl j upilant nauju pienu. 3. Arbatos ir pieno gryb upild antimikrobini svybi tyrimas Arbatos ir pieno grybo upil antimikrobin aktyvum in vitro tyrme skirting bakterij ir grybelio kultroms:

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella pneumoniae ATCC 33499 Bacillus cereus ATCC 6633 Candida albicans ATCC 60193 Streptococcus epidermidis Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ios bakterij ir grybeli kultros buvo auginamos 5 ml talpos mgintuvliuose ant

Proteus mirabilis ATCC 12459

nuoulnaus triptozs sojos agaro. Kas 7 dienas jos buvo persjamos viei triptozs sojos agar, laikomos aldytuve (28 C temperatroje). Antimikrobinis aktyvumas nustatytas standioje terpje (Mueller-Hinton broth II, BBL, Cockeysville, JAV) cilindr metodu. Tyrimai vyko keliais etapais:
6

1. Etalonini mikroorganizm kultr paruoimas. Etalonins bakterij ir grybelio C. albicans kultros buvo auginamos 2024 val. 3537 C temperatroje ant Miulerio-Hintono agaro. Mikrob suspensija gaminama i iaugint mikrob kultr fiziologiniame natrio chlorido (0,9 proc.) tirpale, standartizuojama McFarland standartiniu indikatoriumi, kuris matuoja mgintuvlyje esanios suspensijos drumstum. Mikrob suspensija laikoma standartizuota, kai indikatoriaus reikm lygi 0,5 (tai reikia, kad 1 ml mikrob suspensijos yra 1,5 108 mikrob lsteli). 2. Tiriamj gryb upil paruoimas mikrobiologiniam tyrimui. Tyrimams naudojami arbatos grybo upilai buvo sterilizuojami, juos filtruojant per 0,2 m por skersmens filtrus. Pieno grybo upilas prie filtravim centrifguojamas 20 min. esant 5000 aps./min. greiiu. Antimikrobinio aktyvumo tyrim metu buvo atliekama upilo sterilumo kontrol. 3. Terpi su mikroorganizm kultromis paruoimas. Standi Miulerio-Hintono terp ilydoma ir atvsinama iki 50 C temperatros. Aseptinmis slygomis atmatuojama 15 ml terps, sumaioma su 1 ml paruotos atitinkamos mikroorganizm suspensijos ir perkeliama sterili Petri lktel. Sustingus terpei, ant jos paviriaus aseptinmis slygomis idliojami madaug vienodu atstumu vienas nuo kito 5 arba 6 sterils cilindrai, kuri vidinis diametras yra 7 mm, o iorinis diametras 8 mm.. Paliekama madaug 15-20 min., kad cilindrai smigt terp apie 1-2 mm. 4. Gryb upil ipilstymas cilindrus. Paruotas tyrimams grybo upilas sterilia pipete perkeliamas Petri lktelse idliotus cilindrus po 0,1 ml. Petri lktels dedamos termokamer 1 arba 2 paroms. Po 1 arba 2 dien vertinamas mikrob augimas ir lyginamas su kontrole. Kontroliniame mginyje cilindrus upilas nebuvo pilamas. Esant antimikrobiniam arbatos veikimui, aplink cilindrus susidaro sterili (skaidri) zona, kurios skersmuo matuojamas liniuote. 4. Kremo gamyba Kremo gamybai naudojome hidrofilin kremo pagrind, gaut i Lietuvos svekatos moksl universiteto Vaist technologijos katedros prof. Jurgos Bernatoniens. Kremo pagrindo stabilumas itirtas kit mokslinink ir nustatyta, kad jis ilieka stabilus, j dedant iki 20 proc. vandens arba vandeninio tirpalo. Buvo gaminami penki koncentracij kremai: pagrind dedama 1 proc., 5 proc., 10 proc., 15 proc. ir 20 proc. Kombucha upilo, fermentuoto 8 dienas, arba pieno grybo upilo, fermentuoto par. Gamybai naudojami gryb upilai buvo sterilizuojami, juos filtruojant per 0,2 m por skersmens filtrus. Porceliano grstuvje atsvertas kiekis kremo pagrindo (5 g) piestele

sukamaisiais judesiais maiomas su reikiamu kiekiu upilo apie 10 min. Pagaminti kremai perkelti tamsaus stiklo usukamus buteliukus. Kadangi pagrind dto upilo pH yra rgtinis, vertinome pagamint krem stabilum centrifgavimo metodu (3500 aps./min., centrifgavimo trukm 5 min.). Nustatyta, kad visi pagaminti kremai yra stabils. 5. Kremo antimikrobini svybi tyrimas Pagamint krem antimikrobinis aktyvumas nustatytas standioje terpje (MuellerHinton broth II, BBL, Cockeysville, JAV) ulinli metodu. Metodika tokia pati, kaip ir vertinant upil antimikrobin aktyvum, tik standioje terpje buvo aseptinmis slygomis ipjaustyti ulinliai (7 mm diametro) ir juos dedamas tiriamasis kremas.

3. REZULTATAI IR J APTARIMAS
Prie tiriant upil ir kremo antimikrobin aktyvum, buvo vertintas galimas saldintos juodosios arbatos (be grybo) poveikis mikroorganizmams (1 pav.).

Juodosios arbatos antibakterins savybs

16 Skersmuo (mm) 14 12 10 8 6
is C. al bi ca ns S. ep id er m id is P. ae ru gi no sa P. m ira bi lis au re us ia e on pn eu m ol i su bt il B. E. c

S.

1 pav. Juodosios arbatos poveikis tirtiems mikroorganizmams Nustatyta, kad juodoji arbata turi antimikrobin aktyvum tik prie S. epidermidis (13,17 1,47 mm), o kit bakterj ir grybelio C. albicans praktikai neveikia (sterili zona buvo tik cilindro skersmens, apie 8 mm). Atlikus vairaus fermentacijos laikotarpio grybo upilo antimikrobinio aktyvumo tyrimus, paaikjo, kad ilgjant fermentacijos laikui, poveikis prie mikrobus gerja. Vien dien fermentuotos arbatos aktyvumas prie daugum bakterij ir grybel buvo labai maas (sterilios zonos skersmuo buvo apie 8mm), aktyviausiai veik B. subtilis ir S. epidermidis (sterilios zonos buvo 13 1,26 mm). Tuo tarpu po deimties dien fermentacijos arbata mikroorganizmus veikia 1,5 karto (C. albicans), 2 kartus (B. subtilis, P. aeruginosa) ar net 3 kartus stipriau (kiti mikroorganizmai). Tokie rezultatai leidia manyti, kad norint pritaikyti grybo arbat kaip antimikrobin priemon, tikslinga j fermentuoti 7-10 dien (2 pav.).

K.

Kombucha antimikrobins savybs

35

S. aureus E. coli

30

K. pneumoniae B. subtilis

Skersmuo (mm)

25

C. albicans S. epidermidis P. aeruginosa

20

15

P. mirabilis

10

5 0 2 4 6 8 10

Fermentacijos laikas (dienos)

2 pav. Grybo upilo antimikrobinio aktyvumo priklausomyb nuo fermentacijos laiko

Arbatinis grybas Kombucha stipriausiai veikia ias bakterijas: S. epidermidis, S. aureus, B. subtilis, E. coli, K. pneumoniae. Jam atspariausi: grybelis C. albicans bei bakterijos P. mirabilis ir P. aeruginosa. Gauti rezultatai keli mikrob atvilgiu atitinka literatroje pateiktus antimikrobini tyrim rezultatus [8]. Gali bti, kad acto rgtis tai Kombucha antibakterini savybi prieastis [4,5], taiau nustatyta, jog ir esant beveik neutraliam pH (apie 6), grybo upilas pasiymi antibakterinmis savybmis. Atlikus kremo su vairiomis Kombucha upilo, fermentuoto 8 dienas, koncentracijomis, antimikrobinio aktyvumo tyrimus prie bakterijas ir grybel, nustatme, kad kremas stipriausiai veikia S. aureus, S. epidermidis ir P. aeruginosa bakterijas. Antibakterinis kremo poveikis prie P. aeruginosa pasireik esant 10 proc. ir didesnms koncentracijoms. S. aureus kremas veikia nestipriai ir aktyvumas prie i bakterij beveik nepriklauso nuo koncentracijos. Aktyvumas prie E. coli pasireikia esant bent 10 proc. ir didesnms kremo koncentracijoms (3 pav.).

10

12 S. aureus 10 8 Skersmuo (mm) 6 4 2 0 1 5 10 15 20 S. epidermidis P. aeruginosa E. coli

Upilo koncentracija kreme (proc.)

3 pav. Kombucha kremo antimikrobinio poveikio priklausomyb nuo upilo koncentracijos. Ityrus pieno grybo upilo antibakterin aktyvum, nustatme, kad jis stipriausiai veikia bakterij S. epidermidis, iek tiek silpniau K. pneumoniae, S. aureus, E. coli ir silpniausiai P. mirabilis:

20 Skersmuo (mm) 15 10 5 0
au re us on ia e id is ep id er m ira bi lis E. co li

pn eu m

S.

4 pav. Pieno grybo antibakterins savybs

K.

S.

P.

11

Atsivelg iuos rezultatus sukrme antibakterinmis savybmis pasiymint krem:

3 Skersmuo (mm)

2 E. coli S. aureus 1 P. aeruginosa

0 10 20

Upilo koncentracija kreme (proc.)

5 pav. Pieno grybo kremo poveikio priklausomyb nuo upilo koncentracijos. Atlikus kremo su vairiomis pieno grybo upilo, fermentuoto 1 par, koncentracijomis, antimikrobinio aktyvumo tyrimus prie bakterijas ir grybel, nustatme, kad kremas veikia S. aureus, E.coli ir P. aeruginosa bakterijas.

IVADOS
1. Arbatos ir pieno grybo upilai pasiymi antimikrobinmis savybmis. Stipriausiai arbatos grybo upilas veikia S. aureus, S. epidermidis, B. subtilis, K. pneumoniae ir E.
12

coli bakterijas; labai maai veikia P. mirabilis, P. aeruginosa, C. albicans. Pieno grybo upilas stipriausiai veikia bakterij S. epidermidis. 2. Ilgjant arbatos fermentacijos laikui iki 10 dien, stiprja antimikrobins upilo savybs. 3. Kremas, sudtyje turintis 10 proc. ir daugiau Kombucha arbatos arba pieno grybo upilo, veikia S. aureus, E. coli, ir P.aeruginosa bakterijas. Kremas su Kombucha arbata veikia ir S. epidermidis. Abu kremai galt bti pritaikyti kaip antibakterins priemons.

13

LITERATROS SRAAS
1. Changes in content of organic acids and tea polyphenols during kombucha tea fermentation

R. Jayabalan, S. Marimuthu, K. Swaminathan. 2. Blanc, P. J. (1996). Characterization of tea fungus metabolites. Biotechnology Letters, 18(2), 139142 3. Chen, C., & Liu, B. Y. (2000). Changes in major components of tea fungus metabolites during prolonged fermentation. Journal of Applied Microbiology, 89, 834839.
4. Greenwalt, C. J., Ledford, R. A., Steinkraus, K. H.: Determination and characterization of

the antimicrobial activity of the fermented tea Kombucha. Lebensm. Wiss. Technol. 31 (1998),291296.
5. Steinkraus, K. H., Shapiro, K. B., Hotchkiss, J. K., Mortlock, R. P.: Investigations into the

antibiotic activity of tea fungus/Kombucha beverage. Acta Biotechnol. 16 (1996), 199205. 6. Vijayaraghavan, R., Singh, M., Rao, P. V. L., Bhattacharya, R., Kumar, P., Sugendran, K., Kumar, O., Pant, S. C., & Singh, R. (2000). Subacute (90 days) oral toxicity studies of Kombucha Tea. Biomedical and Environmental Sciences, 13, 293299. 7. Loncar, E. S., Petrovic, S. E., Malbasa, R. V., & Verac, R. M. (2000). Biosynthesis of glucuronic acid by means of tea fungus. Nahrung, 44, 138139.
8. Sreeramulu, G., Zhu, Y., & Knol, W. (2000). Kombucha fermentation and its antimicrobial

activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry,48, 25892594.)

9. Pauline, T., Dipti, P., Anju, B., Kavimani, S., Sharma, S. K., Kain, A. K.,Sarada, S. K.

S.,Sairam, M., Ilavazhagan, G., Kumar, D., &Selvamurthy, W. (2001). Studies on toxicity; anti-stress and hepatoprotective properties of kombucha tea. Biomedical and Environmental Sciences, 14(3), 207213. Study of anti-inflammatory activity of Tibetanmushroom, a symbiotic culture of bacteria and fungi encapsulated into a polysaccharide matrix (2003) R.O Diniz, L.K Garla, J.M Schneedorf, J.C.T Carvalho. 49-52
10.

14

PRIEDAS

1 pav. Cilindr metodas antimikrobiniuose tyrimuose

2 pav. Sterilios zonos

3 pav. ulinli metodas kremo antimikrobiniuose tyrimuose 15

4 pav. Paruoti kremai

5 pav. Kremo antimikrobiniai tyrimai

16