25

CHNG 2

VT LIU V PHNG PHP

26

2.1 Vt liu 2.1.1 Chng vi sinh vt Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Escherichia coli do Phng Th Nghim Chuyn ha Sinh hc Trng i Hc Khoa Hc T Nhin cung cp. 2.1.2 Dng c v thit b Erlen 100 250 500 ml ng nghim Que cy vng, que tri, n cn Pipetman 10-100 v 100-1000l km u tp v trng tng ng T cy (Sanyo MCV711ATS - Japan) Cn phn tch (Sartorius - Germany) My o pH (Eutech 510 - USA) Ni hp v trng (Hirayama HV110 - Japan) My siu m (Branson 1510 - USA) My ly tm (Rotina 38 - Germany) My lc (FGL 3006- Germany) My UV-Vis (Cary100 - Australia) My chp TEM (JEM 1400 - Japan) My XRD (D8 Advance Germany) 2.1.3 Ha cht: Cc ha cht pha mi trng: cao tht, pepton, NaCl, CaCl2.2H2O, MgSO4.7H2O, MnSO4.H2O, K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4 (China, 99%) Nc ct v trng (Phng Th Nghim Cng Ngh Nano) AgNO3 (Merck- Germany, 99%) - Mi trng lng c trng Bacillus [MT1] Peptone Cao tht 5g 3g

27

NaCl MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O MnSO4.H2O Nc ct pH = 6,8 0,2

3g 0,2g 0,15g 0,05g va 1000ml

- Mi trng Nutrient Broth [MT2] (HiMedia India) Cao tht Cao nm men Pepton NaCl Nc ct pH = 7,4 0,2 1,5g 1,5g 5g 5g va 1000ml

- Mi trng Nutrient Agar [MT3] (HiMedia India) Cao tht Cao nm men Pepton NaCl Agar Nc ct pH = 7,4 0,2 1,5g 1,5g 5g 5g 15g va 1000ml

28

2.2 Phng php tin hnh 2.2.1. Kho st kh nng tng trng ca B.subtilis v B.licheniformis 2.2.1.1 Dng ng tng quan tuyn tnh gia mt quang OD ( c) v mt vi khun (CFU/ml) Nguyn tc: Khi mt pha lng c cha nhiu phn t khng tan th s hnh thnh mt h huyn ph v c c bi cc phn t c mt trong mi trng lng cn nh sng, lm phn tn chm nh sng ti. T bo vi sinh vt l mt thc th nn khi hin din trong mi trng cng lm mi trng tr nn c. c ca huyn ph t l vi mt t bo. Trong mt gii hn nht nh ca c v mt t bo, c th xc lp c quan h t l tuyn tnh gia mt t bo v c. C th dng ng quan h tuyn tnh gia mt t bo v c (OD) bng cch s dng mt s huyn ph t bo c c xc nh v mt t bo ca mi huyn ph c xc nh theo cc phng php nh phng php m trc tip, phng php m khun lc... Phng php tin hnh Dch huyn ph vi khun (B.subtilis, B.licheniformis) c pha long c OD t cc gi tr ln cn vi 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 v 0,5. o OD ca cc huyn ph va c pha, ghi nhn s o thc t. Vi mi pha long ly 100l em tri ln a petri mi trng [MT3] xc nh mt t bo tng ng. Mt vi khun trong dung dch ban u ng vi mt gi tr OD xc nh c tnh theo cng thc sau:

Mi (CFU/ml) = Ai

Di V

(2.1)

Trong Ai l s khun lc trung bnh trong a Di l pha long V l dung tch huyn ph t bo cho vo mi a (ml)

29

Tnh gi tr log (CFU/ml) tng ng vi mi gi tr OD. V ng biu din ca log (CFU/ml) (trc tung) theo OD ca dung dch (trc honh). Dng chng trnh Excell 2007 xc nh phng trnh tuyn tnh gia mt quang OD v mt vi khun

Y = aX
Trong X: OD ca dung dch Y: mt vi khun trong dung dch (CFU/ml) - Dng phng trnh tuyn tnh thu c tnh mt vi khun trong mu khi bit gi tr OD. 2.2.1.2 Dng ng cong tng trng : Nguyn tc: T bo vi sinh vt khi hin din trong mi trng s cn nh sng ti lm cho mi trng tr nn c. c ca huyn ph t l vi mt t bo. Do vy c th xc nh c mt t bo vi khun theo thi gian thng qua c (OD) bng my so mu bc sng thch hp [8]. Phng php tin hnh Nui vi khun (B.subtilis, B.licheniformis) trong bnh cha 250 ml mi trng [MT1], cch mt khong thi gian nht nh (1 gi) tin hnh ht 5 ml huyn ph cho vo cuvette o OD bc sng 660nm. Cuvette i chng cha mi trng khng cy vi sinh vt. Vi mi tr s OD o c, da vo phng trnh tuyn tnh v ng tng quan tuyn tnh gia OD v mt , suy ra mt vi khun tng ng ti thi im o. Nu gi tr OD thu c vt qu 0,5 (ngng gi tr chnh xc ca my o) ta pha long sau o gi tr OD dung dch pha long, ghi nhn t l pha long.

30

T gi tr mt vi khun xc nh c th mt t bo log(CFU/ml) (trc Oy) theo thi gian nui cy (gi) (trc Ox). Mt th ng din t c 4 pha tng trng ca vi sinh vt: pha tim tng, pha tng trng hm m, pha n nh v pha suy tn. T xc nh tc tng trng c trng ti a ca vi khun. Gi tr ny chnh l tc tng trng c trng ca vi khun pha log v c xc nh bng cng thc sau:

(2.2)
Trong : : tc tng trng c trng (1/h). X0, Xm: mt sinh khi u v cui qu trnh tng trng. t: di thi gian ca qu trnh tng trng. 2.2.2. Kho st qu trnh sinh tng hp nano bc 2.2.2.1. Kho st hm lng sinh khi vi khun thch hp Chng B.subtilis, B.licheniformis c nui cy lc trong mi trng [MT1] 37oC, 200rpm; Sau 24 gi, dch vi khun c ly tm vi tc 3000 rpm, 15 pht; Loi b dch ni, thu sinh khi v ra vi m phosphate pH 7,0; Chuyn ln lt 3, 5, 10, 20g sinh khi vi khun thu c vo cc bnh cha 100ml dung dch AgNO3 1mM; Tin hnh phn ng trong ti, lc vi tc 200rpm, 37oC trong 4 ngy. Dch nui cy c ly tm 5000 rpm trong 15 pht: i vi B.subtilis thu ly dch ni sau ly tm em o UV-Vis. i vi B.licheniformis thu sinh khi v ra vi dung dch m phosphate pH7;

31

Huyn ph sinh khi trong 20ml m phosphate pH 7; Ph mng t bo bng sng siu m trong vng 30 giy (lp li 5 ln); Dch sau khi x l em ly tm tc 10000 rpm trong 30 pht; Thu ly dch ni sau ly tm em phn tch. Tin hnh tng t i vi mu i chng gm: 10g sinh khi B.subtilis hoc B.licheniformis v 100ml nc ct. Da vo kt qu phn tch ph UV-Vis xc nh lng sinh khi vi khun ph hp cho qu trnh sinh tng hp nano bc. 2.2.2.2. Kho st nh hng ca nng AgNO3 n qu trnh sinh tng hp nano bc Chng B.subtilis, B.licheniformis c nui cy lc trong mi trng [MT1] 37oC, 200rpm; Sau 24 gi, dch vi khun c ly tm tc 3000 rpm, 15 pht; Thu sinh khi v ra vi m phosphate pH 7,0; Chuyn 10g sinh khi vo bnh cha 100ml dung dch AgNO3 c nng ln lt l 0.5mM, 1mM, 2mM, 3mM; Tin hnh trong ti v lc vi tc 200rpm, 37oC trong 4 ngy; . Ly 100 l dch nui cy mi nng em pha long v tri trn mi trng Nutrient Agar [MT3]; 37oC trong 24-48 gi. m s khun lc thu c, xc nh c mt vi khun sng st ng vi cc nng AgNO3 khc nhau. ng thi dch nui cy cng c ly tm 5000 rpm trong 15 pht Vi B.subtilis thu ly dch ni sau ly tm em o UV-Vis. Vi B.licheniformis thu sinh khi, ra sch v huyn ph sinh khi trong 20ml m phosphate pH 7; Dng sng siu m ph mng t bo vi khun (5 chu k, mi chu k ko di 30 giy); Dch x l vi sng siu m c ly tm vi tc 10000 rpm trong 30 pht;

32

Thu ly dch ni sau ly tm em phn tch UV-Vis. Tin hnh mu i chng tng t nh mc 2.2.2.1. Da vo kt qu phn tch ph UV-Vis v mt vi khun sng st theo nng AgNO3 xc nh nng mui AgNO3 ph hp cho qu trnh tng hp. 2.2.2.3. Kho st thi gian sinh tng hp nano bc Hai chng B.subtilis v B.licheniformis c nhn sinh khi trong mi trng [MT1] 37oC, 200rpm trong 24 gi; Dch nui cy c ly tm tc 3000 rpm trong 15 pht; Thu sinh khi v ra vi dung dch m phosphate pH 7; Chuyn 10g sinh khi vo 100ml dung dch AgNO3 2mM v trong ti 37oC, 200 rpm trong vng t 1 n 6 ngy; Ln lt thu ly 15 ml dung dch trn t ngy 1 n ngy th 6 v em ly tm 5000 rpm trong 15 pht; i vi B.subtilis thu ly dch ni em o UV-Vis. i vi B.licheniformis thu sinh khi v ra sch vi dung dch m phosphate pH7; Cho vo my siu m ph mng t bo (5 chu k, mi chu k 30 giy); Sau em ly tm vi tc 10000 rpm trong 30 pht loi mnh v t bo; Thu ly dch ni sau ly tm em phn tch UV-Vis. Tin hnh mu i chng tng t nh mc 2.2.2.1. Da vo kt qu phn tch ph UV-Vis ca cc mu theo thi gian xc nh thi gian tng hp nano bc thch hp nht.

33

2.2.3. Phn tch gin nhiu x tia X (XRD) Tin hnh phn ng sinh tng hp vi: 10g sinh khi B.subtilis trong 100ml dung dch AgNO3 (2mM), sau 4 ngy ly tm 5000 rpm trong 15 pht thu dch ni. 10g sinh khi B.licheniformis trong 100ml dung dch AgNO3 (2mM), sau 5 ngy ly tm thu sinh khi, ra sch v huyn ph sinh khi trong 20ml m phosphate pH 7; Dng sng siu m ph mng t bo vi khun (5 chu k, mi chu k ko di 30 giy). Dch x l vi sng siu m c ly tm vi tc 10000 rpm trong 15 pht (2 ln), thu ly dch ni sau ly tm. Dch ni ny c tri ln lame kh v em phn tch XRD khng nh s hin din ca ht nano bc. 2.2.4. Phn tch kch thc v hnh dng ht nano bc to thnh (TEM) Thc hin phn ng sinh tng hp vi 100ml dung dch AgNO3 (2mM) v 10g sinh khi B.subtilis (trong 4 ngy), B.licheniformis (5 ngy). Sau x l mu v thu ly dch ni ging nh trong phn [2.2.3]. Dch ni thu c em chp TEM xc nh hnh dng v s phn b kch thc ht nano bc. 2.2.5. Kho st hot tnh khng khun ca dung dch nano bc Nguyn tc S dng phng php m khun lc xc nh s lng t bo vi sinh vt cn sng hin din trong mu. T bo sng l t bo c kh nng phn chia v to thnh khun lc trn mi trng chn lc. Trong phng php ny cn phi pha long mu thnh nhiu pha long bc 10 lin tip sao cho c pha long vi mt t bo thch hp xut hin cc khun lc ring r trn b mt thch vi s lng ln hn ch sai s khi m v tnh ton. m s khun lc mc trn mi trng thch dinh dng t cc nng pha long sau khi nui cy 37oC

34

trong 24-48 gi [8]. T tnh mt t bo v hiu sut khng khun theo cng thc (2.1) v (2.3). Phng php tin hnh Cho 1ml dung dch nano bc (thu c sau 2, 3, 4, 5, 6 ngy tin hnh sinh tng hp) vo ng nghim cha 1ml dch vi khun E.coli trong mi trng Nutrient Broth [MT2]. Tin hnh mu i chng tng t nhng thay dung dch cha nano bc bng nc ct. Sau 15 pht dch vi khun t ng th nghim v ng i chng c em pha long n 10-2, 10-3, 10-4. T mi nng pha long ly ra 100l em tri ln a mi trng Nutrient Agar [MT3]. 370C trong 24-48 gi ri m s khun lc thu c. Cch tnh kt qu: m s khun lc trn cc a. Dng nhng a c s khun lc t 25-300 (theo FDA) tnh mt t bo vi sinh vt trong mu ban u. Mt t bo vi sinh vt c tnh theo cng thc sau [6]:

Mi (CFU/ml) = Ai

Di V

(2.1)

Trong Ai l s khun lc trung bnh trong a Di l pha long V l dung tch huyn ph t bo cho vo mi a (ml) Mt t bo trung bnh MI trong mu ban u l trung bnh cng ca Mi cc nng pha long khc nhau. Hiu sut khng khun c xc nh theo cng thc sau:

N1 N2 N1

100%

(2.3)

Trong N1 l s khun lc trong a i chng N2 l s khun lc trong a cha nano bc

35

2.2.6. Kho st bn ca dung dch nano bc to thnh Tin hnh phn ng sinh tng hp vi: 10g sinh khi B.subtilis trong 100ml dung dch AgNO3 (2mM), sau 4 ngy ly tm 5000 rpm trong 15 pht thu dch ni. 10g sinh khi B.licheniformis trong 100ml dung dch AgNO3 (2mM), sau 5 ngy ly tm thu sinh khi, ra sch v huyn ph sinh khi trong 20ml m phosphate pH 7, ph mng t bo vi khun bng sng siu m, em ly tm vi tc 10000 rpm trong 15 pht (2 ln), thu ly dch ni sau ly tm . Dch ni thu c em o UV-Vis sau tip tc bo qun trong 3 thng ri em o li UV-Vis. So snh kt qu thu c gia 2 ln o. 2.2.7. Ch to vi khng khun non-woven Phng php ngm tm c s dng ch to vi non-woven khng khun. Qui trnh ch to c th c m t nh sau: Mu vi c ct vi kch thc khong 9,5 17 cm sau c ra sch v sy kh. em mu vi sau khi s ch ngm vo trong dung dch keo nano bc tng hp c trong khong thi gian 2 gi. Sau khi ngm tm xong, mu vi c em sy kh v git li cho cc ht nano bc bm trn b mt tm vi vi lc lin kt yu c thot ra v loi b phn dung dch cha bm ln vi. Cc mu vi trc v sau khi ngm tm c em phn tch FE-SEM nh gi kh nng bm dnh cc ht Ag trn nn vi non-woven. ng thi cc mu vi sau khi ngm c git qua 5, 10, 15 ln. Sau kho st kh nng khng khun da theo phng php m khun lc tng t nh trong phn [2.2.5].