13.02.

2011

Cromozomii umani
reprezint substratul morfologic al E i V; nivelul supramolecular de organizare a materialului genetic (ADN + proteine histone + proteine nonhistone + ARN)

reprezint structuri dinamice ca form, aspect, grad de compactizare, activitate genetic: crs mono sau bicromatidian; cromatin sau cromozom; activ pentru transcripie sau inactiv.

crs se autoreproduc prin replicarea ADN ce i constituie numai n perioada S a interfazei. crs reprezint grupuri de nlnuire a genelor: - fiecare crs conine un numr anumit de gene; - fiecare gen are o poziie fix pe cromozom locus; - genele unui cromozom formeaz grupuri lincage, ce de regul, se transmit n bloc, nlnuit setul diploid de crs a unui individ formez cariotipul: 23 perechi: 22 perechi autozomi + 1 pereche gonozomi (XX sau XY). Cromozomii pereche = cromozomi omologi
3

Originea gonosomilor

repere de identificare a cariotipului

lungimea relativ i absolut a crs poziia centromerului = constricia primar - c prezena constriciilor secundare h prezena sateliilor - s

Studiul cromozomilor se poate realiza n: Metafaz prin colorare omogen sau n benzi Prometafaz prin colorare n benzi Interfaz prin hibridare cu sonde moleculare marcare fluorescent

13.02.2011

Cromozomii au o structur neomogen: - Secvene codificatoare i necodificatoare; - Segmente de eucromatin i heterocromatin, - secvene unice i repetitive; - Secvene bogate n GC i AT; - Secvene transcrise i netranscrise; - segmente bogate n proteine acide i bazice. !!! Acestea explic originea benzilor cromozomiale Anomaliile de numr sau de structur a crs se manifest prin anomalii multiple de dezvoltare sindroame crs plurimalformative
7

Structura cromozomului metafazic. Repere cromozomiale

Forma cromozomului metafazic depinde de POZIIA CENTROMERULUI

8

Cariotipul uman

Ic p p q x100

10

CLASIFICAREA CROMOZOMILOR
Dup lungime: -Mari -Medii -Mici Dup form: -Metacentrici -Submetacentrici -Acrocentrici Grupe: A 1-3 B 4,5 C X, 6-12 D 13-15
11

Dup tip: -Autozomi -Gonozomi 46,XX 46,XY

Cariotipul uman i formula cromozomial

47,XXY 45,X E 16-18 F 19,20 G 21, 22, Y 47,XY,+21 45,XY,-21 46,XX,5p-

Dup prezena altor repere: -Cu h pe braul p -Cu h pe braul q -Cu satelii

12

13.02.2011

Cnd putem presupune o anomalie crs de NR sau de structur ?

Anomalii de dezvoltare mutiple sindrom plurimalformativ Anomalii de sexualizare Anomalii de reproducere
Nou nscut mort plurimalformat Avorturi spontane repetate Sterilitate primar

ETAPELE CARIOTIPRII

1. Colectarea sngelui pentru a obine celule nucleate (!!! leucocitele sngelui periferic au nuclee n interfaz)

2. Obinerea culturii de celule n diferite perioade ale mitozei

3.Pregtirea cromozomilor pentru microscopie

Citostatic colhicin Sol hipotonic

37 C
Cel sgelui + mediu de cretere

Peste 72 ore

Cel n diferite faze ale mitozei

Celule n diferite faze ale mitozei

72 ore

Stoparea metafazei

Sedimentarea celulelor

Dispersarea cromozomilor

4. Colorarea i microscopia preparatului cromozomic

5. Analiza cariotipului

Colorare

Fotografierea
Lam cu cel fixate Lam cu plci metafazice

plcii metafazice

Decuparea cromozomilor

Realizarea cariogramei = cariotipului

13.02.2011

Tehnici de citogenetic de analiz a cariotipului:

Pentru identificarea anomaliilor de numr analiza cromozomilor metafazici cu colorate omogen. Pentru identificarea anomaliilor de numr i de structur analiza cromozomilor metafazici cu colorare difereniat Q, G, R; analiza cromozomilor prometafazici cu colorare difereniat Q, G, R. Pentru identificarea polimorfismului cromozomial analiza cromozomilor metafazici cu colorare difereniat C, T. Analiza crs metafazici

Studiul cariotipului uman

Analiza crs prometafazici Analiza crs interfazici

Colorare uniform

Colorare n benzi G,Q,R,C,T

colorare n benzi G, R

Testul cromatinei sexuale X i Y

Metode molecular citogenetice FISH, mFISH SKY CGH

*** NR benzi pentru setul haploid: 300-400 m / 550 pm / 850p

19

Colorarea cromozomilor
Omogen Difereniat, n benzi

Nomenclatura benzilor
Cromozomul brae regiuni benzi subbenzi 4p22.2

T 5q13.4 9p21.3

Benzile G+ = Q+ = R Benzile G- = Q- = R +

1p35

1p22

46,XY,del(1)(p11-p34) 1q23

1q41 46,XY,del(1)(p11-p34)

13.02.2011

Cariotip
Normal Normal cu polimorfisme Aneuploid Poliploid Cu aberaii cromosomiale

46,XX 46,XY

46,XX,9qh+ 46,XY,16qh46,XX,14s++

47,XX,+21 45,XY,-12 48,XXXY 45,X

69,XXX 69,XXY

46,XX,1q46,XY,16p+ 46,X,r(X) 46,XY,del(5p) 46,XX,t(12,22)

46,Y,del(X)(q12.1-q24.3)

Cariotip normal

46,XX 46,XY Crs D i G variaii ph sau s: Crs 1,9,16,9,Y variaii qh Trisomii 47,XXX; 47,XXY; 47,+21; 47,+13; 47,+18; 47,+8 Monosomii 45,X inv t rob del dup r i

Fenotip normal Fenotip normal Fenotip patologic Fenotip normal

??? polimorfisme
p i q conin segmente cromozomiale codificatoare i necodificatoare p+ sau p- - anomalii q+ sau q- - anomalii c mai mare sau mai mic polimorfism t mai mare sau mai mic polimorfism h+ sau h- - polimorfism s+ sau s- - polimorfism

Polimorfisme

Anomalii de numr

Anomalii de structur echilibrate

Anomalii de structur neechilibrate

Fenotip patologic

Testul cromatinei sexule

Testul cromatinei sexule X = testul Barr - vizualizarea crs X inactiv, heterocomatinizat pe nucleele interfazice ale celulelor somatice

Cromozomul X ~2000 gene:

Cromozomul Y ~ 300 gene: gene reglatoare masculinizante pseudogene !!! Braul q conine heterocromatin constitutiv

Testul cromatinei sexule Y = testul F vizualizarea a 2/3 din braul qY pe nucleele interfazice ale celulelor somatice sau ale spermatozoizilor

gene structurale somatice gene reglatoare feminizante; gene structurale feminizante; gene structurale masculinizante

13.02.2011

!!! Important
Cromozomul X este indespensabil celulei somatice : n cel 46,XX este activ numai un X n cel 46,XY este activ i X i Y n cel 47,XXX - este activ numai un X n cel 47, XXY- este activ numai un X i un Y n cel 48, XXXY- este activ numai un X i un Y Cromozomul Y este obligator pentru i

De ce? Exist o explicaie?

Dimorfismul sexual - echilibrat Caractere sexuale primare - diferite Caractere sexuale secundare - diferite Caractere somatice - asemntoare

Regiunile crs X i Y
I regiunea pseudoautosomal (PA) cu gene comune i pe crs X i pe crs Y: - Xpter - Ypter II regiunea crs X cu gene specifice numai X III regiunea crs Y cu gene masculinizante IV regiunea crs Y (2/3Yq) cu secvene necodificatoare heterocromatin constitutiv

La persoanele 46,XX:

Concluzii:

Sunt active genele celor 22 perechi autosomi; Sunt active genele unui crs X + genele regiunii PA Xpter a celui de-a doilea crs X

La persoanele 46,XY:
Sunt active genele celor 22 perechi autosomi; Sunt active genele unui crs X + genele regiunii PA crs Y (Ypter) + genele de ale crs Y (Yp i 1/3Yq pericentromeric)

Rol: controlul dozelor genelor somatice la i + controlul diferenierii sexuale !!! Dimorfism sexual echilibrat

Mecanisme moleculare implicate n lyonizare (inactivarea crs X)

X q13 - centru de inactivare a crs X (XIC) - gena XIST (450 Kb) : gena XIST - promotor cu trei regiuni: regiunea activatoare; regiunea de stabilizare a ARN XIST la nivelul crs inactiv; regiunea inhibitoare asupra regiunii activatoare. regiunea codificatoare - codific ARN care rmne asociat cu crs inactivat genetic captul 3' al genei - regleaz numrarea cromozomilor i determin care X ( sau ) rmne activ.

13.02.2011

!!! Gena XIST este o gen atipic a pierdut potenialul de codificare proteic
Funcia genei XIST (X inactivation specific transcript) La nivel molecular codific sinteza ARNm-XIST; La nivel celular inactivarea unui crs X
ARNm XIST rmne ataat la crs inactiv Dezacetilarea H1 Heterocromatinizarea crs X

Amprentarea genomic (sau imprinting-ul parental)

Mecanism de reglare a activitaii transcripionale i expresiei fenotipice a unei gene din perechea de alele reprezint represarea permanent, dependent de originea parental:
a unei gene sau a unui cromozom sau a genomului sau

La nivel de organism controlul dozelor genelor Xlincate materne i paterne controlul dezvoltrii organismului feminin

modificri epigenetice n cursul gametogenezei i/sau embriogenezei precoce Ex: genele X-lincate la ; diferite gene autosomale (s. Angelman, s. Prader-Willy)

46,XX

46,XY

Testul Barr
Cromatina sexual X: - reprezint cromozomul X inactiv, heterocromatin facultativ, n celulele somatice 46,XX; - se prezint sub forma unui corpuscul Barr de 1 m n nucleii interfazici ai celulelor somatice; - testul Barr este util n identificarea nr de crs X n celulele somatice: NR crsX = nr corpusculilor Barr + 1 (un crs X activ). 46,XX 1 corpuscul Barr 46,XY 0 47,XXX 2 47,XXY - 1 45,X 0 48,XXXX 3 !!! Explicaia originii cromatinei X ipoteza M. Lyon (1961)

Crs Y Crs X activ eucromatinizat

Crs X neactiv heterocromatinizat

Crs X activ eucromatinizat

Bra p - activ Bra q - inactiv

Corpuscul Barr = 1m

Corpuscul F = 0,25 m

Testul F
Cromatina sexual Y: - reprezint braul q al crs Y, heterocromatin constitutiv (2/3q), n cel. somatice 46,XY sau n spermatozoizii 23,Y; - se prezint sub forma unui corpuscul F (fluorescent) de 0,25 m n nucleele interfazice; - testul F este util n identificarea crs Y (determinarea prenatal a sexului): NR crsY = NR corpusculilor F 46,XX 0 46,XY 1 47,XYY 2 47,XXY - 1 48,XXYY 2 46,X,i(Yp) 0 46,X,i(Yq) 1 (0,5 m)