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 Ministerio de Salud INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Jr. Cpac Yupanqui 1400, Jess Mara Telf. 471-3254 / Fax: 471-7443 Lima, Per, 1997
Diseo e impresin : Art. Lautrec S.R.Ltda.

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNOSTICO DE MICOSIS OPORTUNISTAS Y PROFUNDAS

COMIT DE REDACCION: Dra. Susana Zurita Macalupu Blgo. Jos Casquero Cavero

COMIT EDITOR: Dr. Alfonso Zavaleta Martnez-Vargas Dr. Csar Cabezas Snchez Dr. Carlos Carrillo Parodi Dr. Jaime Chang Neyra

MINISTERIO DE SALUD ALTA DIRECCIN Dr. Marino Costa Bauer Ministro Dr. Alejandro Aguinaga Recuenco Viceministro INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Dr. Carlos Carrillo Parodi Jefe CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PUBLICA Dr. Csar Cabezas Snchez Director General

PERFIL DE LOS AUTORES

Dra. Susana Zurita Macalupu Mdico Cirujano, Especialista en Enfermedades Infecciosas y Tropicales Jefe, Divisin de Micologa, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica, INS, MINSA Profesor Auxiliar, Departamento Acadmico de Microbiologa, Facultad de Ciencias y Filosofa, Universidad Peruana Cayetano Heredia Blgo. Jos Casquero Cavero Bilogo, Egresado de Maestra en Microbiologa Escuela de Postgrado Vctor Alzamora Castro Universidad Peruana Cayetano Heredia Jefe, Laboratorio de Micosis Oportunista, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica, INS, MINSA

PERFIL DE LOS EDITORES

Dr. Alfonso Zavaleta Martnez-Vargas Mdico Cirujano, Doctor en Farmacologa Director General, Centro Nacional de Control de Calidad, INS, MINSA Profesor Principal, Seccin Farmacologa, Departamento Acadmico de Ciencias Fisiolgicas, Facultad de Ciencias y Filosofa, Universidad Peruana Cayetano Heredia Miembro, Instituto de Medicina Tropical Alexander Von Humbolt, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Dr. Csar Cabezas Snchez Mdico Cirujano, Master en Medicina, Especialista en Enfermedades Infecciosas y Tropicales Director General, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica, INS, MINSA. Profesor invitado de Medicina Tropical, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Dr. Carlos Carrillo Parodi Mdico Cirujano, Doctor en Medicina Profesor Principal, Departamento Acadmico de Microbiologa, Facultad de Ciencias y Filosofa, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Jefe, Instituto Nacional de Salud Dr. Jaime Chang Neyra Mdico Cirujano, Master of Science in Community Health in Developing Countries Director Ejecutivo de Garanta de la Calidad, Centro Nacional de Control de Calidad, INS, MINSA Investigador, Instituto de Medicina Tropical Alexander Von Humbolt, Universidad Peruana Cayetano Heredia.

La edicin de este Manual se efectu en el marco del Convenio de Cooperacin suscrito entre el Instituto Nacional de Salud y la Universidad Peruana Cayetano Heredia. El Comit Editor agradece al Dr. Jorge Barnaby Rodrguez, por la revisin y los comentarioes efectuados a esta obra.

INDICE

Presentacin ..................................................................................................................................... 7 Resolucin Jefatural ......................................................................................................................... 9 CAPITULO I Introduccin ..................................................................................................................................... 11 CAPITULO II Bioseguridad .................................................................................................................................... 17 CAPITULO III Obtencin de la Muestra .................................................................................................................. 23 CAPITULO IV Procesamiento de la Muestra ............................................................................................................ 25 CAPITULO V Reactivos y Medios de Cultivo ........................................................................................................ 27 CAPITULO VI Identificacin de Hongos Patgenos ................................................................................................ 33 CAPITULO VII Transporte y Remisin de Muestras ................................................................................................. 47 CAPITULO VIII Bibliografa ...................................................................................................................................... 49 CAPITULO IX ANEXOS ......................................................................................................................................... 51 Anexo 1: Ficha epidemiolgica ....................................................................................................................... 53 Anexo 2: Fluxograma para identificar hongos Patgenos verdaderos ............................................................. 55 Anexo 3: Fluxograma para identificar principales Mohos patgenos .............................................................. 57 Anexo 4: GLOSARIO ..................................................................................................................................... 59

PRESENTACIN

Las micosis humanas son infecciones frecuentes en nuestra poblacin en todo el territorio nacional. A nivel mundial las micosis por oportunistas y profundas son cada vez ms frecuentes y actualmente tienen una alta prevalencia. El empleo de antibiticos de amplio espectro, la quimioterapia en cncer, los transplantes de rganos, la infeccin con VIH, y otros procedimientos teraputicos son las causas principales de la emergencia de las micosis por oportunistas y profundas en especial como complicacin grave. El laboratorio de diagnstico juega hoy da, un rol cada vez ms importante para confirmar la presencia del agente etiolgico y complementar el manejo clnico para proporcionar un tratamiento ms adecuado al paciente. El Instituto Nacional de Salud en cumplimiento de la poltica sectorial, presenta el manual para Procedimientos de laboratorio para el diagnstico de Micosis Oportunistas y Profundas, dirigido a personal profesional y tcnico en esta rea, con la finalidad de promover las Buenas Prcticas de Laboratorio Diagnstico desde la recepcin de la muestra hasta el aislamiento e identificacin del agente etiolgico de la enfermedad, reforzar las medidas de bioseguridad y difundir el conocimiento tcnico cientfico en la especialidad.

EL COMIT EDITOR
.

CAPITULO I

INTRODUCCION

El Instituto Nacional de Salud a travs de su rgano tcnico normativo el Centro Nacional de Laboratorios en Salud Pblica promueve, fortalece y desarrolla la Red Nacional de Laboratorios; asimismo acta como Centro de Referencia de los Laboratorios del pas y brinda capacitacin especializada al personal de salud con la finalidad de realizar vigilancia epidemiolgica de las enfermedades transmisibles, control de las mismas y participar en investigaciones epidemiolgicas. La Divisin de Micologa y sus componentes los Laboratorios de Micosis Oportunista y de Micosis Profunda han elaborado este manual con la finalidad de establecer criterios uniformes para la identificacin de los principales hongos que originan estas etiologas en nuestro pas. A continuacin se presentan algunas definiciones y se describen las principales caractersticas de los hongos patgenos ms comunes. 1.1 MICOLOGIA MEDICA Estudia las manifestaciones patolgicas causadas directa o indirectamente por hongos patgenos. El diagnstico definitivo de las infecciones micticas est basado en la informacin que proporciona el laboratorio. Los mtodos diagnsticos son el examen directo y cultivo con aislamiento e identificacin del agente etiolgico a partir del espcimen. La eficiencia de estos mtodos depender de la apropiada toma de muestra y del envo al laboratorio para el procesamiento respectivo. 1.2 MICOSIS OPORTUNISTA Son infecciones causadas por hongos saprofitos que estn mediadas por factores predisponentes (TBC cavitaria, neoplasia, infeccin-HIV, uso de antibiticos de amplio espectro, drogadiccin, alcoholismo, diabetes, embarazo, etc...) presentes en el hospedero humano. Entre las principales infecciones tenemos: Aspergilosis, Criptococosis, Candidiasis, y Fusariosis. Por lo tanto los agentes micticos de mayor incidencia son Candida spp., Cryptococcus neoformans, Aspergillus spp. y Fusarium spp. 1.2.1. Candida spp. Es un gnero que se encuentra distribuido universalmente y forma parte de la flora nonnal de las mucosas del tracto gastrointestinal y genitourinario del hombre, por lo que la principal fuente de infeccin es endgena. La infeccin puede ser aguda o crnica, superficial o profunda presentando un amplio espectro de manifestaciones clnicas: Candidiasis cutnea, ungueal, sistmica, y de mucosas. Entre las especies ms frecuentes tenemos a Candida albicans, Candida tropicalis, Candida krusei y Candida glabrata. La identificacin se realiza macroscpicamente y mediante pruebas morfolgicas, bioqumicas y fisiolgicas. 1.2.2 Aspergillus spp. Presenta una distribucin mundial y es ubicuo en la naturaleza. Se le encuentra con mayor frecuencia en ambientes hmedos asociado a material orgnico (plantas, tierras, telas, granos almacenados y filtros de aire acondicionado). La clasificacin clnica basada en la asociacin hongo-hospedero refiere tres grupos de enfermedades: Aspergilosis pulmonar, colonizacin por Aspergillus, y Aspergilosis invasiva. Se han estudiado ms de un centenar de especies, pero slo tres originan la mayora de las infecciones en el hombre: Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus y Aspergillus niger. 1.2.3 Cryptococcus neoformans

La criptococosis humana es causada principalmente por Cryptococcus neoformans y se encuentra asociada a pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Este es un hongo monomrfico que se caracteriza por presentar una cpsula de mucopolisacrido visualizada al examen directo utilizando tinta china. Se le puede distinguir en dos variedades segn el tipo de hbitat, esto es C. neofonnans var. neoformans asociado a suelo contaminado con excretas de palomas y C. neoformans var. gattii asociado a rboles de Eucalyptus en floracin. 1.2.4 Fusarium spp. Microorganismo presente en forma comn en suelo y como patgeno de plantas. Es uno de los agentes etiolgicos que ocasionan la Hialohifomicosis, infeccin que agrupa a hongos de tipo oportunista que se caracterizan por presentar una clnica heterognea. La caracterstica comn de esta micosis es el desarrollo de hifas hialinas, septadas en los tejidos del hospedero. Dentro de las infecciones localizadas se diagnostican casos de queratitis, endoftalmitis, peritonitis, infeccin nasal y pulmonar, articulaciones y lesiones post-traumticas del hueso. En los ltimos aos se describe en forma creciente infecciones invasivas en pacientes neutropnicos. 1.3 MICOSIS PROFUNDA Denominada tambin micosis sistmica. La va de ingreso es a travs de la inhalacin de esporas del hongo hacia el pulmn, a partir de la cual puede diseminarse a otros rganos llegando a producir la muerte del paciente. Entre los agentes etiolgicos causantes de este tipo de infeccin en nuestro pas tenemos: Paracoccidioides brasiliensis, e Histoplasma capsulatum. 1.3.1 Paracoccidioides brasiliensis Este hongo dimrfico produce la infeccin denominada Paracoccidioidomicosis la cual constituye una de las micosis sistmicas por hongos verdaderos patgenos ms importantes en Amrica Latina. Actualmente se desconoce su hbitat natural pero todo indica al suelo de zonas endmicas como probable nicho ecolgico. La infeccin es primariamente de origen pulmonar presentndose como un infiltrado micronodular simulando una tuberculosis. Con frecuencia la enfermedad involucra boca, cavidades nasales, amgdalas o laringe producindose lceras supurativas y granulomatosas progresivas. En nuestro pas se reportan como zonas endmicas Quillabamba (Cusco), Sibia y San Francisco (Ayacucho), Chanchamayo (La Merced). 1.3.2 Histoplasma capsulatum var. Capsulatum Es el agente etiolgico de la Histoplasmosis clsica. La infeccin se adquiere por inhalacin de conidias y fragmentos de hifas al tener contacto el hospedero con polvo de lugares como cavernas, cuevas donde se acumulan excretas de aves y murcilagos compuestos de elevado contenido de nitrgeno. La forma comn de esta enfermedad es la infeccin subclnica y afecta a individuos con inmunidad celular disminuida, cncer, infeccin por VIH, y verruga peruana. En nuestro pas existen reportes de reas endmicas como Hunuco (Cueva de las Lechuzas), Tingo Mara, Pucallpa, y San Francisco (Ayacucho). La Histoplasmosis diseminada ha sido incluida por el Centro de Enfermedades Comunicables de Atlanta-Estados Unidos como una de las infecciones oportunistas que definen el caso de SIDA. En la Tabla 1 se muestra la relacin existente entre el tipo de Muestra y Micosis. En la Tabla 2 se muestran las principales caractersticas fngicas al examen directo.

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TABLA 1 RELACION ENTRE TIPO DE MUESTRA Y MICOSIS

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TABLA 2 CARACTERISTICAS FUNGICAS AL EXAMEN DIRECTO

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CAPITULO II
BIOSEGURIDAD

2.1. CONCEPTOS GENERALES: 2.1.1 Definicin Es un conjunto de medidas preventivas de sentido comn que permiten proteger la salud y la seguridad del personal que labora en laboratorio frente a diferentes riesgos producidos por agentes biolgicos, fsicos, qumicos, y mecnicos. 2.1.2 Agentes de riesgo Las actividades que realiza el personal de laboratorio le pueden originar enfermedades o dao, pudiendo afectar a sus familiares y a la comunidad. Estas enfermedades pueden ser causadas por: - Agentes biolgicos transmitidos por ingestin, inhalacin, inoculacin, por contacto directo a travs de la piel, y por la formacin de aerosoles. - Agentes fsicos y mecnicos como las temperaturas extremas, radiaciones ionizantes, contactos elctricos, o conexiones defectuosas, vidrios resquebrajados de recipientes daados o tubos rotos. - Agentes qumicos que pueden ser: Corrosivos causando destruccin o alteracin de los tejidos; Txicos cuyos efectos se manifiestan segn la va de exposicin, por inhalacin, ingestin o contacto directo con mucosas o piel, carcinognicos, inflamables, o explosivos. 2.2. MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICOLOGIA El Laboratorio debe de estar adecuadamente ventilado e iluminado, funcionando correctamente los servicios de luz, agua, desage y gas. Colocar en la puerta de acceso al rea de trabajo y en forma obligatoria la seal de RIESGO BIOLOGICO. Usar zapatos cerrados que cubran la totalidad del pie. Usar mandil limpio de manga larga. Pipetear reactivos o fluidos corporales con una propipeta. Limpiar los pisos del laboratorio con una tela limpia impregnada con desinfectante. Desinfectar el rea de trabajo diariamente, evitando la acumulacin de polvo en las esquinas o grietas, donde las esporas y conidias pueden germinar. No colocar plantas en el laboratorio. No comer ni almacenar alimentos en el laboratorio. Tratar a todas las muestras como altamente infecciosas evitando un posible contagio. Nunca oler un cultivo de hongo. Utilizar cabina de bioseguridad para manipular mohos aislados de secreciones respiratorias, biopsias, orina, sangre, y lquido-cefaloraquideo. Manipular en cabina de bioseguridad las formas infectantes de hongos sistmicos. Antes de descartar los cultivos esterilizarlos por autoclave. Las pipetas de vidrio reutilizable, pipetas Pasteur, lminas portaobjetos y cubreobjetos deben ser colocadas horizontalmente en un depsito con desinfectante para proceder a esterilizarlas.

2.3.

AGENTES MICOTICOS 2.3.1 Cryptococcus neoformans Slo se ha reportado una exposicin en el laboratorio a Cryptococcus neoformans, en la cual se produjo una laceracin por una hoja de bistur muy contaminada con clulas encapsuladas. Esta fuerte exposicin no produjo infeccin local o sistmica lo que sugiere

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que el nivel de patogenicidad es bajo. No se ha reportado infecciones respiratorias como consecuencia de la exposicin en Laboratorio. Riesgo de Laboratorio: La inoculacin accidental parenteral de cultivos u otros materiales infecciosos, mordidas por ratones infectados o manipular materiales infectados representa un riesgo potencial para el personal de Laboratorio, particularmente aquellos que pueden ser inmunocomprometidos. (Tabla 3) Precauciones Recomendadas: Nivel de bioseguridad 2 para trabajar con muestras clnicas, cultivos o con animales experimentales infectados. Nivel 1 2 para trabajar con muestras de suelos u otros materiales afines. (Tabla 4) 2.3.2 Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasiliensis La histoplasmosis es un peligro documentado; se han reportado infecciones pulmonares como resultado de un pinchazo accidental con una aguja de cultivo viable, colectando o procesando muestras de tierras de reas endmicas. Las esporas son resistentes al secado y pueden permanecer viables por largos perodos de tiempo. El pequeo tamao de la macroconidia (< 5 um) hace que se pueda producir una dispersin en el aire y retencin pulmonar. Se seala que slo 10 esporas son capaces de producir muerte en ratones. Asimismo la Paracoccidioidomicosis con base en el frecuente compromiso pulmonar de los pacientes y en los datos experimentales disponibles, se acepta que el hongo ingresa al hospedero por va inhalatoria a partir de muestras que contengan conidias infectantes. Riesgos de Laboratorio: La forma infecciosa de estos hongos dimrficos (conidia) est presente en los cultivos y en tierras de reas endmicas. La forma levaduriforme est presente en tejidos o fluidos de animales infectados. Precauciones Recomendadas: Nivel de bioseguridad 2 para las actividades con materiales clnicos, tejido animal y animales infectados. Nivel de bioseguridad 3 para procesar los cultivos de moho, tierra y otros materiales que se conozca que contengan conidias infecciosas. (Tabla 4)

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TABLA 3 CLASIFICACION DE HONGOS SEGN GRUPO DE RIESGO

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TABLA 4 NIVELES DE BIOSEGURIDAD

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CAPITULO III
OBTENCION DE LA MUESTRA

El paciente debe estar sin terapia antimictica. De lo contrario suspender el tratamiento cinco das antes de la obtencin de la muestra. En el caso de utilizar hisopos de algodn estriles para la toma de muestras y una vez realizada sta colocar los hisopos en tubos de vidrio con tapa rosca conteniendo 1 mL de solucin salina estril. En el Anexo 1 se muestra la ficha recomendada para el Registro de los datos epidemiolgicos necesarios para la toma de la muestra. 3.1. MUCOSA ORAL Se obtienen por raspado de superficies epiteliales daadas utilizando un bistur romo o esptula y en el caso de observar placas blanquecinas recolectar mediante hisopo de algodn. 3.2. MUCOSA VAGINAL Se realiza mediante la utilizacin de un espculo introduciendo un hisopo de algodn estril en el fondo del saco vaginal rotndolo por espacio de 10 a 15 segundos aproximadamente. La muestra debe ser tomada por un mdico. 3.3. MUCOSA GENITAL MASCULINA Y PERIANAL Los especmenes se recolectarn de la zona interna del prepucio y glande con ayuda de un hisopo de algodn estril, y de la zona perianal se realizar mediante un bistur romo o hisopo de algodn. 3.4. ESPUTO El paciente antes de emitir la muestra deber haber realizado una higiene bucal previa con solucin salina y permanecer en ayunas. Para emitir la muestra realizar una inspiracin profunda expirando fuertemente y tosiendo al mismo tiempo. En el caso de no expectorar se inducir una nebulizacin. La muestra ser vertida en un frasco de vidrio o recipiente estril descartable de cierre hermtico (30 mL de capacidad aproximadamente). Aquellas muestras que contengan trazas de saliva, alimentos y secreciones nasales o farngeas no sern procesadas. Para ejecutar un adecuado diagnnstico de laboratorio se recomienda obtener como mnimo 3 muestras seriadas consecutivas. 3.5. CEPILLADO BRONQUIAL Y LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) Es realizado por el mdico especialista mediante un broncoscopio de fibra ptica. La muestra deber ser colocada en un tubo o frasco estril de tapa rosca. 3.6. ORINA En el caso de mujeres realizar un lavado previo de genitales externos. Depositar 40 a 50 mL de muestra a partir del chorro medio en un frasco de vidrio estril de boca ancha o en un recipiente descartable de cierre hermtico. Los especmenes tambin pueden ser obtenidos mediante puncin suprapbica o a travs de un catter instalado con esa finalidad. En el caso de nios utilizar bolsas colectoras colocadas preferentemente en el centro de salud. 3.7. LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO (LCR) Es realizado por un mdico mediante puncin lumbar. La muestra ser vertida en un tubo de vidrio estril de tapa rosca. Para un adecuado examen micolgico se requiere como mnimo 5 mL.

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3.8. ABSCESOS CERRADOS, FISTULAS Y ULCERAS Limpiar la zona afectada y realizar una puncin aspiracin mediante una jeringa con aguja N 18 conteniendo 0,5 a 1,0 mL de solucin salina estril. 3.9. BIOPSIA Es realizado por el mdico a partir de los bordes de la lesin. La muestra ser colocada en una placa petri o en un frasco de vidrio conteniendo solucin salina estril. De realizarse extendidos stos no sern coloreados hasta su llegada al laboratorio (Patologa: Hematoxilina-eosina o Mucicarmin de Mayer). 3.10 LIQUIDOS CORPORALES Se realiza mediante una aspiracin percutnea o drenaje utilizando una jeringa o tubo estril de tapa rosca conteniendo anticoagulante.

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CAPITULO IV
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA

Consiste en realizar un examen directo (KOH 10%, Tinta china, Giemsa), mediante una tcnica sencilla y rpida de implementar en cualquier laboratorio, proporciona un diagnstico presuntivo o preliminar, mientras que el definitivo lo proporciona el Cultivo. Todo tipo de muestras se debe trabajar cerca a un mechero de alcohol o bunsen, no olvidando de tomar las medidas de bioseguridad anteriormente sealadas. El cultivo (Agar Sabouraud Dextrosa) se realiza por duplicado y se incuba a 2 temperaturas (25 C y 37 C) para demostrar el dimorfismo en aquellos gneros que lo presenten. 4.1.

MUCOSA ORAL, GENITAL, PERIANAL

Colocar en una lmina portaobjeto una gota de KOH 10% con la muestra. Homogenizar suavemente con ayuda de una laminilla. Observar al microscopio. Controlar el cultivo diariamente hasta por un lapso de 15 das.

4.2.

LIQUIDO CEFALORAQUIDEO Centrifugar a 3000 r.p.m. por 30 minutos. A partir del sedimento realizar el examen directo. No desechar el sobrenadante a partir del cual se podrn hacer pruebas serolgicas. Controlar los cultivos hasta por 4 semanas.

4.3.

ORINA Centrifugar la muestra a 3000 r.p.m. por 10 minutos. El sobrenadante se puede emplear para inmunodiagnstico, mientras que del sedimento se realizar el examen directo y el cultivo. Incubar a 25C. Controlar hasta por 30 das.

4.4.

ESPUTO-CEPILLADO BRONQUIAL-LAVADO BRONCOALVEOLAR De encontrarse muy adheridas las muestras a las paredes de los recipientes que las contienen se puede aadir 1 mL de solucin salina estril. El examen directo se realiza utilizando KOH, mientras que el cultivo se controla hasta por 4 semanas.

4.5.

BIOPSIA-FISTULA-ULCERAS-ABCESOS CERRADOS El examen direclo se realiza usando KOH homogenizando con la muestra a estudiar. Controlar el cultivo por espacio de 4 semanas.

4.6.

LIQUIDOS CORPORALES Si la muestra es purulenta no necesita ser centrifugada, de lo contrario centrifugar a 3000 r.p.m. por 10 minutos. Los exmenes micolgicos (examen directo y cultivo) se realizan a partir del sedimento.

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CAPITULO V
REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO
5.1 REACTIVOS 5.1.1 Hidrxido de Potasio: Es el reactivo que ms se utiliza en micologa mdica. Digiere el material proteico, aclara los pigmentos, y disuelve el cemento que mantiene pegadas a las clulas queratinizadas y las de otros tejidos, permitiendo observar elementos fngicos. KOH ........................................................................................................ 10 g Agua destilada ....................................................................................... 100 mL Preparacin: - Agregar los cristales de KOH al agua destilada. - Mezclar hasta disolver totalmente. - Cuando se observen precipitados filtrar con papel filtro. Nota: Se puede aadir Glicerol al 20%, para evitar la precipitacin del KOH.

5.1.2 Tinta china: Es un mtodo de contraste que permite visualizar microscpicamente la presencia de la cpsula de Cryptococcus neoformans al no poder penetrarla. Se utiliza tinta china.

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5.1.2.a Tcnica: (KOH y tinta china) - Colocar una gota de KOH 10% y tinta china sobre una lmina portaobjeto. - Agregar una gota de la muestra. Mezclar. - Colocar una laminilla. Evitar la formacin de burbujas de aire. - Observar al microscopio con objetivos de 10X y 40X. 5.1.3 Coloracin Giemsa: Se utiliza para el diagnstico de Histoplasmosis. 5.1.3.a Solucin concentrada del colorante: Giemsa en polvo ............................................................................... 0,6 g Metanol ............................................................................................. 50,0 mL Glicerina neutra ................................................................................. 50,0 mL 5.1.3.b Preparacin: - Triturar el colorante en un mortero con 30 mL de glicerina. - Transferir la mezcla a un frasco limpio y completar el volumen de glicerina. - Colocar al bao Mara a 55 C por 2 horas. - Utilizar 20 mL de alcohol para remover el colorante adherido al mortero. - Retirar el frasco del bao Mara. Dejar enfriar. Completar el volumen de alcohol. - Dejar reposar el colorante por 2 semanas. Luego filtrar. - Guardar la solucin en frasco mbar. 5.1.3.c Solucin Tampn pH 7,2: Na2HPO4 ............................................................................................... 6,77 g KH2PO4 ................................................................................................. 2,59 g Agua destilada ...................................................................................... 100 mL 5.1.3.d Solucin de Trabajo: Solucin concentrada del colorante ........................................................... 2 mL Solucin Tampn ....................................................................................... 6 mL Agua destilada ...................................................................................... 1000 mL Mezclar. 5.1.3.e Tcnica: - Fijar el extendido con metanol por 3 a 5 minutos. - Agregar la solucin de trabajo por 15 minutos. - Lavar con agua. - Secar la lmina. Observar al microscopio con objetivo de inmersin. 5.2 MEDIOS DE CULTIVO 5.2.1 Agar Sabouraud Dextrosa: Es el medio de cultivo que ms se utiliza en micologa mdica debido a que las caractersticas

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que se estudian y describen se ajustan cuando los hongos desarrollan sobre este medio de cultivo (no se sugiere ninguna marca en especial). Para inhibir el desarrollo bacteriano se puede agregar Cloramfenicol al 0,05%. Dextrosa .............................................................................................................. 20 g Peptona ............................................................................................................... 10 g Agar .................................................................................................................... 20 g Agua destilada ................................................................................................. 1000 mL pH final: 7,0 + 0,2 a 25 C. Disolver y autoclavar a 121 C por 15 minutos.

Preparacin del antibitico: Disolver una cpsula de Cloramfenicol de 250 mg en 10 mL de metanol. Agregar 2 mL del antibitico en un litro de Agar Sabouraud Dextrosa estril a 45 a 50 C. Vertir en placas o tubos. 5.2.2 Agar Harina de Maz: Se utiliza para realizar la prueba de Clamidospora. Se puede adquirir en forma comercial como Com Meal Agar (Difco), Agar Clamidospora (BBL), o preparar ingrediente por ingrediente. Harina de maz amarillo .............................................................................................. 62 g Agua destilada ......................................................................................................... 1000 mL Preparacin: - Incubar en bao Mara (55-65C) por 1 hora. Filtrar. - Llevar a volumen de 1 L. Agregar 20 g de Dextrosa y 20 g de Agar. - Disolver y autoclavar a 121C por 15 minutos. Repartir sobre lminas estriles formando un rea de 1 cm2. 5.2.3 Medio Base-Carbohidratos: Se utiliza como base para proporcionar los requerimientos nutricionales indispensables para el desarrollo de levaduras. Peptona ...................................................................................................................... 5 g Extracto de Carne ...................................................................................................... 1 g Cloruro de Sodio ....................................................................................................... 5 g Agar ......................................................................................................................... 15 g Agua destilada ....................................................................................................... 990 mL Indicador .................................................................................................................. 10 mL pH final: 5,6 Disolver y autoclavar a 121 C por 15 minutos.

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Indicador: Disolver 0,1 g de Prpura de Bromocresol en 18,5 mL de NaOH 0,01N. Diluir a 250 mL con agua destilada para obtener una solucin al 0,04%. Carbohidratos: Se utiliza: Glucosa, Lactosa, Sacarosa, Galactosa, Maltosa, y Rafinosa. Se disuelven en agua destilada estril y se esterilizan por filtracin (Dimetro de filtro: 0,2 um). Concentracin final de cada carbohidrato 10%. Agregar al medio base a temperatura de 45 a 50C. Mezclar y repartir en tubos 13 x 100 mm de tapa rosca. Antes de utilizar controlar a 37 C por 24 horas. 5.2.4 Agar Urea Base: Su uso es sealado para la identificacin de Cryptococcus neoformans y algunas especies del gnero Candida. El medio se adquiere en forma comercial. Su preparacin requiere seguir las indicaciones dadas por el fabricante. 5.2.5 Agar Infusin Cerebro Corazn: El propsito de su uso es el aislamiento y subcultivos de Paracoccidioides brasiliensis e Histoplasma capsulatum. Infusin de cerebro de ternero ............................................................................... 200,0 g Infusin de corazn de res ..................................................................................... 250,0 g Proteosa-peptona ...................................................................................................... 10,0 g Bacto-dextrosa ........................................................................................................... 2,0 g Agua destilada ........................................................................................................ 990,0 mL Cloruro de Sodio ......................................................................................................... 5.0 g Fosfato disdico .......................................................................................................... 2.5 g Agar ........................................................................................................................... 15.0 g pH final: 7,4 + a 25 C. En el caso de utilizar el medio comercial seguir las indicaciones dadas por el fabricante.

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CAPITULO VI
IDENTIFICACION DE PRINCIPALES HONGOS PATOGENOS
6.1 IDENTIFICACION DE Candida sp 6.1.1 Prueba del Tubo Germinativo: Suspender un inculo de la cepa pura de Candida en 0,5 mL de suero humano. Incubar a 37 C por 2 a 3 horas. Observar al microscopio con objetivo de 40X. Se considera como prueba positiva el visualizar una estructura elongada que se origina de una levadura (Figura 4). Esta caracterstica identifica a la especie C. albicans.

De ser negativo el tubo germinativo realizar las siguientes pruebas para determinar otras especies. (Fluxograma 1)

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FLUXOGRAMA 1 FLUXOGRAMA PARA IDENTIFICAR PRINCIPALES LEVADURAS PATOGENAS

6.1.2 Produccin de Clamidospora: Sembrar la cepa sobre el medio Agar harina de maz. Colocar una laminilla sobre el inculo. Incubar en cmara hmeda a temperatura ambiente 25 C por 5 das. Observar al microscopio sin retirar la laminilla. Considerar presencia de clamidospora al observar estructuras circulares de pared gruesa, intercalares o terminales a una hifa. Asimismo esta prueba permite visualizar diversas morfologas como: Blastosporas, Pseudohifas e Hifas.

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6.1.3 Asimilacin de Carbohidratos: Sembrar sobre la superficie del medio de cultivo. Incubar a temperatura ambiente o 25 C por 2 a 3 das. La reaccin se considera positiva al observar un viraje de color hacia el amarillo. (Ver tabla 5)

TABLA 5 PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA IDENTIFICAR ESPECIES DE Candida DE IMPORTANCIA MEDICA

ABREVIATURAS TG: TUBO GERMINATIVO HF: HIFA FP: FORMACION DE PELICULA GLU: GLUCOSA SAC: SACAROSA GAL: GALACTOSA CHL: CLAMIDOSPORA PH: PSEUDOHIFA LEV: LEVADURA LAC: LACTOSA MAL: MALTOSA RAF: RAFINOSA

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6.2 IDENTIFICACION DE Aspergillus sp Desarrollan bien a temperatura ambiente y a 37C. La identificacin se realiza evaluando el aspecto macroscpico (color y textura cuando desarrollan sobre Agar Sabouraud Dextrosa) y el aspecto microscpico: presencia de conidiforo, cabezuela, conidias, distribucin y nmero de hileras de esterigmas. (Ver Tabla 6)

TABLA 6 Identificacin de las principales especies de Aspergillus

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6.3 IDENTIFICACION DE Cryptococcus neoformans Desarrollan a 37 C. Macroscopicamente presentan color blanco que en el transcurso de los das se torna crema oscuro. Presenta textura lisa. Al realizar la prueba con la tinta china se observar la presencia de un halo de color blanco alrededor de la levadura indicando la presencia de la cpsula de mucopolisacrido. Esta levadura se caracteriza por producir ureasa, reaccin visualizada al observar un viraje de color del medio de cultivo (Agar Urea Base) hacia el rojo grosella o intenso.

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6.4 IDENTIFICACION DE Fusarium sp. Las colonias macroscopicamente prcsentan micelio areo algodonoso que puede adquirir por el anverso un color rosado-cremoso con zonas de color amarillo, caf, prpura o violeta, muestras que el reverso puede presentar un color cremoso, rojo vino o caf. A temperatura de 20 a 25 C esporulan alrededor de los 10 a 15 das. Microscpicamente presentan macroconidias y microconidias originadas a partir de filides. Las microconidias uni o bicelulares de forma ovoide se desprenden de filides muy delgadas. Mientras que las macroconidias hialinas, y multicelulares son fusiformes (Media luna o falciforme) presentando de 2 a 11 septaciones. Las clamidosporas pueden estar ausentes o presentes.

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6.5 IDENTIFICACION DE Paracoccidioides brasiliensis En el examen directo (KOH-10%) de muestras clnicas se observan levaduras de diferente tamao con pared gruesa y refringente presentando inclusiones citoplasmticas intracelulares. Las levaduras pueden presentar una nica o mltiples gemaciones dando un aspecto de Timn de barco o Cara de Ratn. Esta prueba presenta una sensibilidad del 85% con respecto a la prueba estndar (cultivo). En cuanto a las caractersticas macroscpicas del hongo al desarrollar sobre Agar Sabouraud Dextrosa o Agar Infusin Cerebro Corazn, presenta un color blanco-beige de aspecto cerebriforme. Para su identificacin hay que demostrar el dimorfismo. Es decir a 25 C la cepa no muestra conidias caractersticas, mientras que a 37 C se observan levaduras grandes de forma oval o irregular sin cpsula. Se puede evidenciar la forma levaduriforme o parasitaria con la tincin Hematoxilina-Eosina. Sin embargo stas pueden ser observadas ms fcilmente usando las tinciones de PAS (Acido peridicoSchiff) o Gomori-Grocott (Methenamine-Nitrato de plata). (Ver Tabla 7).

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6.6 IDENTIFICACION DE Histoplasma capsulatum El examen directo (KOH-10%) de muestras clnicas carece de valor diagnstico. Por lo tanto es necesario realizar una coloracin Giemsa observando levaduras pequeas de 2 a 4 um de dimetro intracelulares a los macrfagos, alrededor de ellas se observa un halo de material no teido que representa la pared celular (Tabla 7). El cultivo (Agar Sabouraud Dextrosa o Agar Infusin Cerebro Corazn) es el mtodo estndar para determinar el diagnstico, sin embargo esta tcnica es poco sensible en la mayora de las formas clnicas y tarda entre 1 a 5 semanas. La macroscopia refiere colonias de color blanco-pardo. La demostracin de macroconidias tuberculadas o dentadas en la fase filamentosa (25 C) y su conversin a la fase levaduriforme (370 C) es necesario para su identificacin definitiva. Las pruebas inmunolgicas permiten sospechar el diagnstico en la mayora de casos y sugieren la necesidad de obtener muestras para demostrar la presencia del hongo.

TABLA 7 Caractersticas diferenciales de H. capsulatum y P. brasiliensis

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6.7 IDENTIFICACION DE HONGOS Y MOHOS PATGENOS En los anexos 2 y 3 se muestran los fluxogramas para identificar hongos patgenos verdaderos y los principales mohos patgenos.

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CAPITULO VII
TRANSPORTE Y REMISION DE MUESTRAS

Una vez obtenidas las muestras, stas debern ser transportadas de inmediato al laboratorio para su procesamiento. Un LCR de no procesarse de inmediato mantenerlo a temperatura ambiente. Mientras que en el caso de una muestra de Esputo el tiempo transcurrido entre la toma de muestra y su procesamiento no debe ser mayor de 2 horas. En las muestras provenientes de mucosas (vaginal, perianal y genital masculina) de no procesarse de inmediato es recomendable realizar un extendido al momento de su obtencin, el cual se colorear con Tincin Gram al llegar al laboratorio. 7.1 RECOMENDACIONES El envase donde estar contenida la muestra deber estar etiquetado con cinta Masking tape o esparadrapo para ser rotulado mediante bolgrafos de tinta indeleble o lpiz Faber N 2. La escritura deber efectuarse con letra de imprenta y en forma legible; considerando las siguientes especificaciones: N de Cdigo. Fecha de coleccin de la muestra. Tipo de muestra.

Cada muestra deber estar acompaada de una ficha epidemiolgica donde se debe consignar: Nombre del paciente. Direccin del Hospital o Centro de Salud. Nombre del Mdico solicitante. Antecedentes clnicos. Tipo de muestra. Direccin y nombre del Laboratorio al que se remite.

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CAPITULO VIII
BIBLIOGRAFIA

1.

Arango, M; Castaeda E. 1995. Micosis Humanas. Procedimientos diagnsticos, Exmenes directos. Instituto Nacional de Salud. Colombia. Campbell M; Stewart J. 1980. The Medical Mycology Handbook. John Wiley Sons. New York. Daz. F.J. 1988. Seguridad en el laboratorio Clnico. En Bioseguridad en el laboratorio. Acta Bioquim Clin Latinomaer. (Sup 4):35-40. Favero M. S. 1987. Etiological Hazards in the Laboratory. Lab. Med. 18 (10):665-670. Grigoriu D; Delacretaz J; Porelli D. 1987. Medical Mycology. Ediciones Roche. Basilea. Hall C. T. 1986. La seguridad en el Laboratorio de Microbiologa Clnica. En Sonnenwirth AJ, Gradwohl L. Mtodos y Diagnstico de Laboratorio Clnico. Edit. Mdico Panamericana 8va. Ed. Buenos Aires. Organizacin Mundial de la Salud. Manual de Bioseguridad en el laboratorio. 1994. Ginebra 2 Edic. 149 pp. Organizacin Mundial de la Salud. Manual de normas bsicas para un laboratorio de Salud. 1983. Publicacin cientfica N 439. Koneman E. W; Roberts G. D. 1996. Micologa. Prctica de Laboratorio. Cuarta reimpresin de Tercera impresin. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires. Argentina.

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CAPITULO IX

ANEXOS

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ANEXO 1

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ANEXO 2

FLUXOGRAMA PARA IDENTIFICAR HONGOS PATOGENOS VERDADEROS

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ANEXO 3

FLUXOGRAMA PARA IDENTIFICAR PRINCIPALES MOHOS PATOGENOS

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ANEXO 4

GLOSARIO
LEVADURA: Hongo unicelular que presenta gemacin y reproduccin sexual o asexual. CLAMIDOSPORA O CLAMIDOCONIDIA: Es una espora tlica asexual que se redondea y agranda con el incremento en el grosor de la pared celular y densidad protoplsmica. Se liberan por desintegracin de clulas vecinas. Son estructuras de supervivencia. ESCLEROCIO: Conjunto de clulas que bajo condiciones desfavorables pueden permanecer latentes durante largos perodos de tiempo. Esta estructura germina cuando se esta en condiciones ambientales favorables. CONIDIOFORO: Hifa especializada sobre la cual se desarrollan las conidias. CONIDIA: Estructura de reproduccin asexual que se forma de nuevo a partir de clulas hifales preformadas. CAPSULA: Cubierta hialina de mucopolisacridos que rodea a la clula. CABEZUELA: Dilatacin del extremo del conidiforo sobre la cual se desarrollan las filides o clulas conidigenas. HIFA: Estructura tubular que representa la unidad estructural de la mayora de hongos. PSEUDOHIFA: Cadena de blastoconidias que permanecen adheridas formando un filamento semejante a una hifa. BLASTOSPORA: Estructura de reproduccin asexual originada por gemacin. Son liberadas por fisin a travs de un septo doble. FIALIDE: Clula conidigena en forma de botella o frasco. DIMORFICO: Que presenta dos formas. Se usa comnmente para describir a aquellos hongos que crecen como mohos a temperatura ambiente y como levaduras a 37 C. GEMACION: Multiplicacin asexual. Se caracteriza por la formaci6n de una pequea evaginacin o gema a partir de una clula madre. La evaginacin se agranda, se individualiza y se separa de la clula madre, originando una clula independiente. Es una estructura tpica de levaduras donde se les conoce como blastosporos o blastoconidias, aunque algunos mohos tambin los presentan. TUBO GERMINATIVO: Parte inicial de la germinacin de una blastoconidia, conidia, o de una espora, y que de seguir desarrollndose forma una hifa e incluso micelio. HABITAT: Nicho ecolgico donde crece y vive normalmente un hongo. MACROCONIDIA: Es la ms grande de dos tipos de conidias en hongos.

Esta publicacin se termin de imprimir en diciembre de 1997 en los Talleres Grficos de Art. Lautrec S.R.Ltda. Av. Paseo de la Repblica 731 - Lima 13 Tel/Fax: 423-7616

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