CHNG 5: PH LC

5.1. Cch pha mt s ha cht

5.1.1. Cch pha dung dch m [4,6]
* Dung dch m acid citric - Na2HPO4 (pH 3, 4, 5)
- Dung dch acid citric 0,1M: Ha tan 10,504g acid citric (C6H8O7) trong
500ml nc ct (dung dch a)
- Dung dch Na2HPO4 0,2M: Ha tan 71,7g Na2HPO4. 12H2O trong 500ml
nc ct (dung dch b)
Dung dch m acid citric - Na2HPO4 c pH khc nhau ph thuc vo s ml
dung dch a v s ml dung dch b vi tng th tch 100ml
Acid citric 0,1M

Na2HPO4 0,2M

(dd a, ml)

(dd b, ml)

79,45

20,55

3,0

61,45

38,55

4,0

48,50

51,50

5,0

pH

* Dung dch m phosphate (pH 6, 7, 8)

- Dung dch NaH2PO4 0,2M: Ha tan 27,8g NaH2PO4 trong 500ml nc ct
(dung dch a)
- Dung dch Na2HPO4 0,2M: Ha tan 71,7g Na2HPO4. 12H2O trong 500ml
nc ct (dung dch b)
Dung dch m phosphat c pH khc nhau ph thuc vo s ml dung dch a
v s ml dung dch b vi tng th tch 200ml
NaH2PO4 0,2M

Na2HPO4 0,2M

(dd a, ml)

(dd b, ml)

87,7

Nc (ml)

pH

12,3

100

6,0

39,0

61,0

100

7,0

5,3

94,7

100

8,0

82

5.1.2. Cch pha mt s ha cht khc [4,6]

- Thuc nhum Bradford: Ha tan 10mg Coomassive Brilliant Blue vo
50ml etanol 96o, thm 100ml H3PO4 85%, nh mc vi nc ct n 1000ml.
- Dung dch Albumin 100 g/ml: cn 10mg Albumin pha vi nc ct thnh
100ml
- Dung dch Na2HPO4 1/15M: ho tan 5,96g Na2HPO4.12H2O trong nc
thnh 250 ml
- Dung dch KH2PO4 1/15M: ho tan 0,9072g KH2PO4 trong nc thnh
100ml
- Dung dch m Sorensen 1/15M, pH 7.6: trn 177ml dung dch Na2HPO4
1/15M v 23 ml dung dch KH2PO4 o v chnh li pH cho ng.
- Dung dch Casein 1%: un si cch thu 1g Casein trong m Sorensen
n tan hon ton ri sau nh mc bng m Sorensen cho 100ml.
- Dung dch TCA (tricloro acid) 10%: ho tan 10g TCA trong nc cho
100ml
- Dung dch NaOH 0,5N: ho tan 10g NaOH trong nc cho 500 ml
- Dung dch HCl 0,2N: trn 4,25ml HCl m c vi nc cho 250 ml
- Dung dch tyrosin 20mM: khuy nghin 0,118 g tyrosin trong dung dch
HCl 0,2N va 50ml
- Dung dch tyrosin chun 1mM: pha long 5 ml tyrosin 20mM trong HCl
0,2N thnh 100 ml.
5.2. Xy dng ng chun Bradford
Bng 5.1. Tng quan gia gi tr OD vi nng albumin
ng nghim s

Nng protein
(g/ml)

10

20

30

40

50

OD595nm

0,051

0,070

0,084

0,099

0,110

0,125

OD

0,019

0,033

0,048

0,059

0,074

83

y = 0,0015x

0,08

R2 = 0,9907

0,07
0,06

OD

0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
0

10

20

30

40

50

60

Nng protein (g/ml)

th 5.1. S tng quan gia gi tr OD v nng albumin

Bng 5.2 . Gi tr OD tng ng khi xc nh hm lng protein trong l tr
nguyn liu
Mu 1
Mu 2
Mu 3
OD595nm

0,119

0,119

0,120

OD

0,068

0,068

0,069

45,33 x 50 =
2266,5

45,33 x 50 =
2266,5

46 x 50 =
2300

2,27

2,27

2,30

Hm lng protein trong

nguyn liu suy ra t ng
chun (g/ml)
Hm lng protein trong
nguyn liu suy ra t ng
chun (mg/ml)
5.3. Cc s liu thc nghim

Bng 5.3. Gi tr OD tng ng khi xc nh hot PPO trong nguyn liu

OD420nm KC

OD420nm TN

OD

Mu 1

0,016

0,321

0,305

Mu 2

0,018

0,327

0,309

Mu 3

0,019

0,349

0,330

84

Bng 5.4. Gi tr OD tng ng khi xc nh pH ti u cho hot ng ca PPO

pH
3

OD420nm KC
0,008
0,007
0,010
0,011
0,010
0,012
0,010
0,010
0,011
0,015
0,015
0,016
0,017
0,019
0,017
0,018
0,017
0,017

Anova: Single Factor

SUMMARY
Groups
3
4
5
6
7
8
ANOVA
Source of Variation
Between Groups
Within Groups
Total

OD420nm TN
0,166
0,164
0,170
0,250
0,245
0,251
0,330
0,327
0,340
0,232
0,232
0,235
0,164
0,172
0,170
0,099
0,112
0,110

Count
3
3
3
3
3
3

SS
4919341,122
9322,961539
4928664,083

Sum
3356,8905
5038,8693
6826,8551
4614,8410
3201,4134
1901,0601

df
5
12
17

OD
0,158
0,157
0,160
0,239
0,235
0,239
0,320
0,317
0,329
0,217
0,217
0,219
0,140
0,153
0,160
0,081
0,095
0,093

Average
1118,9635
1679,6231
2275,6184
1538,2803
1067,1378
633,6867

Variance
116,5370
266,3703
1947,8330
66,5926
599,3332
1664,8146

MS
983868,2244
776,9134616

F
1266,3807

85

OD TB
0,158
0,002
0,238
0,002
0,322
0,006
0,218
0,001
0,151
0,003
0,090
0,005

se
10,80
16,32
44,13
8,16
24,48
40,80

P-value
6,70064E-16

F crit
3,105875

Bng 5.5. Gi tr OD tng ng khi xc nh nh hng ca pH n bn

ca PPO
pH
OD420nm KC
OD420nm TN
OD
OD TB
3

Anova: Single Factor

SUMMARY
Groups
3
4
5
6
7
8
ANOVA
Source of Variation
Between Groups
Within Groups
Total

0,008

0,054

0,046

0,010

0,052

0,042

0,008

0,055

0,047

0,010

0,159

0,149

0,012

0,172

0,160

0,010

0,163

0,153

0,011

0,331

0,320

0,011

0,332

0,321

0,012

0,336

0,324

0,015

0,236

0,221

0,017

0,240

0,223

0,018

0,231

0,213

0,019

0,172

0,153

0,020

0,170

0,150

0,020

0,183

0,163

0,019

0,118

0,099

0,018

0,116

0,098

0,019

0,121

0,102

Count
3
3
3
3
3
3

SS
6943231,211
12086,55371
6955317,765

Sum
954,0636042
3265,017668
6819,787986
4643,109541
3293,286219
2113,074205

Average
318,0212014
1088,339223
2273,262662
1547,70318
1097,762073
704,3580683

Variance
349,61106
1548,2775
216,42589
1398,4442
2314,0922
216,42589

df

MS
1388646,242
1007,212809

F
1378,7019

5
12
17

86

0,045
0,003

0,154
0,006

0,322
0,002

0,219
0,005

0,155
0,007

0,100
0,002

se
18,70
39,35
14,71
37,40
48,11
14,71

P-value
4,02872E-16

F crit
3,105875

Bng 5.6. Gi tr OD tng ng khi xc nh nhit ti u cho hot ng

ca PPO
o
Nhit ( C)
OD420nm KC
OD420nm TN
OD
OD TB
0,014
0,331
0,317
0,317
20
0,014
0,328
0,314
0,003
0,015
0,334
0,319
0,014
0,378
0,364
0,359
30
0,014
0,372
0,358
0,004
0,014
0,369
0,355
0,017
0,225
0,208
0,206
40
0,018
0,225
0,207
0,003
0,017
0,220
0,203
0,024
0,198
0,174
0,173
50
0,024
0,194
0,170
0,003
0,023
0,198
0,175
0,023
0,164
0,141
0,139
60
0,029
0,162
0,133
0,005
0,024
0,167
0,143
0,030
0,141
0,111
0,109
70
0,030
0,136
0,106
0,003
0,029
0,139
0,110
0,030
0,098
0,068
0,070
80
0,029
0,097
0,068
0,003
0,028
0,102
0,074
Anova: Single Factor
SUMMARY
Groups
Count
20
3
30
3
40
3
50
3
60
3
70
3
80
3
ANOVA
Source of Variation
SS
Between Groups
10256446,85
Within Groups
8823,51717
Total
10265270,36

Sum
6713,780919
7611,30742
4367,491166
3667,844523
2946,996466
2310,954064
1484,09894

Average
2237,926973
2537,102473
1455,830389
1222,614841
982,3321555
770,3180212
494,6996466

Variance
316,3147665
1048,833173
349,6110577
349,6110577
1398,444231
349,6110577
599,3332418

df

MS
1709407,808
630,2512265

F
2712,264151

6
14
20

87

se
17,79
32,39
18,70
18,70
37,40
18,70
24,48
P-value
1,24609E-20

F crit
2,84773

Bng 5.7. Gi tr OD tng ng khi xc nh nh hng ca nhit n bn

ca PPO
o
Nhit ( C)
OD420nm KC
OD420nm TN
OD
OD TB
30

40

50

60

70

80

Anova: Single Factor

SUMMARY
Groups
30
40
50
60
70
80
ANOVA
Source of Variation
Between Groups
Within Groups
Total

0,014

0,345

0,331

0,015

0,340

0,325

0,014

0,343

0,329

0,015

0,323

0,308

0,016

0,321

0,305

0,018

0,325

0,307

0,016

0,256

0,240

0,019

0,254

0,235

0,017

0,243

0,226

0,015

0,112

0,097

0,017

0,114

0,097

0,018

0,110

0,092

0,016

0,061

0,045

0,016

0,062

0,046

0,019

0,071

0,052

0,018

0,045

0,027

0,017

0,047

0,030

0,018

0,050

0,032

Count
3
3
3
3
3
3

SS
13179160,4
9089,8875
13188250,3

Sum
6961,130742
6501,766784
4954,063604
2021,201413
1010,600707
628,975265

Average
2320,376914
2167,255595
1651,354535
673,7338045
336,8669022
209,6584217

Variance
466,1480769
116,5370192
2513,869986
416,2036401
715,870261
316,3147665

df

MS
2635832,081
757,490625

F
3479,689377

5
12
17

88

0,328
0,003

0,307
0,002

0,234
0,007

0,095
0,003

0,048
0,004

0,030
0,003

se
21,59
10,80
50,14
20,40
26,76
17,79

P-value
1,5706E-18

F crit
3,10587524

Bng 5.8. Gi tr OD tng ng khi xc nh nh hng ca nhit n bn

ca PPO theo thi gian
Nhit
(oC)

Thi gian
(pht)
0

10

15
60
20

25

30

35

40

OD420nm KC OD420nm TN

OD

0,014

0,378

0,364

0,014

0,372

0,358

0,014

0,369

0,355

0,014

0,354

0,340

0,015

0,352

0,337

0,014

0,348

0,334

0,017

0,291

0,274

0,015

0,282

0,267

0,015

0,289

0,274

0,019

0,228

0,209

0,017

0,221

0,204

0,019

0,220

0,201

0,018

0,202

0,184

0,017

0,212

0,195

0,021

0,202

0,181

0,018

0,137

0,119

0,017

0,137

0,120

0,022

0,142

0,120

0,015

0,112

0,097

0,017

0,114

0,097

0,018

0,110

0,092

0,018

0,097

0,079

0,017

0,090

0,073

0,02

0,090

0,070

0,018

0,082

0,064

89

OD TB

0,3590,005

0,3370,003

0,2720,004

0,2050,004

0,1870,007

0,1200,001

0,0950,003

0,0740,005

0,0650,001

10

15

70

20

25

30

35

40

0,018

0,083

0,065

0,019

0,084

0,065

0,014

0,378

0,364

0,014

0,372

0,358

0,014

0,369

0,355

0,017

0,183

0,166

0,017

0,186

0,169

0,019

0,182

0,163

0,016

0,104

0,088

0,019

0,107

0,088

0,018

0,104

0,086

0,018

0,085

0,067

0,018

0,088

0,070

0,017

0,082

0,065

0,018

0,084

0,066

0,018

0,080

0,062

0,016

0,083

0,067

0,015

0,076

0,061

0,016

0,076

0,060

0,017

0,075

0,058

0,018

0,062

0,044

0,016

0,070

0,054

0,016

0,065

0,049

0,018

0,052

0,034

0,018

0,057

0,039

0,018

0,055

0,037

0,018

0,042

0,024

0,017

0,047

0,030

0,016

0,045

0,029

90

0,359 0,005

0,166 0,003

0,087 0,001

0,067 0,003

0,065 0,003

0,060 0,002

0,049 0,005

0,037 0,003

0,028 0,003

10

15

80

20

25

30

35

40

0,014

0,378

0,364

0,014

0,372

0,358

0,014

0,369

0,355

0,017

0,128

0,111

0,017

0,138

0,121

0,015

0,138

0,123

0,018

0,048

0,030

0,016

0,045

0,029

0,015

0,046

0,031

0,016

0,042

0,026

0,017

0,040

0,023

0,016

0,046

0,030

0,019

0,040

0,021

0,017

0,041

0,024

0,015

0,045

0,030

0,016

0,035

0,019

0,016

0,039

0,023

0,018

0,036

0,018

0,017

0,028

0,011

0,019

0,024

0,005

0,019

0,026

0,007

0,017

0,022

0,005

0,016

0,022

0,006

0,015

0,020

0,005

0,016

0,020

0,004

0,017

0,023

0,006

0,016

0,020

0,004

91

0,359 0,005

0,118 0,006

0,030 0,001

0,026 0,004

0,025 0,005

0,020 0,003

0,008 0,003

0,005 0,001

0,005 0,001

Bng 5.9. Gi tr OD tng ng khi xc nh nh hng ca nng c cht n

hot ca PPO
Nng
OD420nm KC
OD420nm TN
OD
OD TB
c cht (mM)
0,009
0,102
0,093
0,093
10
0,009
0,095
0,086
0,008
0,008
0,109
0,101
0,012
0,125
0,113
0,115
20
0,010
0,129
0,119
0,003
0,010
0,124
0,114
0,011
0,171
0,160
0,161
30
0,014
0,176
0,162
0,001
0,014
0,176
0,162
0,013
0,260
0,247
0,243
40
0,015
0,253
0,238
0,005
0,015
0,260
0,245
0,020
0,348
0,328
0,330
50
0,018
0,347
0,329
0,002
0,017
0,349
0,332
0,019
0,343
0,324
0,328
60
0,017
0,354
0,337
0,008
0,020
0,343
0,323
0,023
0,352
0,329
0,331
70
0,020
0,351
0,331
0,002
0,025
0,358
0,333
0,025
0,347
0,322
0,326
80
0,027
0,362
0,335
0,008
0,024
0,345
0,321
0,027
0,368
0,341
0,335
90
0,028
0,355
0,327
0,007
0,027
0,363
0,336
0,030
0,354
0,324
0,326
100
0,028
0,351
0,323
0,005
0,027
0,359
0,332

92

Anova: Single Factor

SUMMARY
Groups
10
20
30
40
50
60
70

Count
3
3
3
3
3
3
3

Sum
1978,7986
2445,2297
3420,4947
5159,0106
6989,3993
6954,0636
7017,6678

Average
659,5995
815,0766
1140,1649
1719,6702
2329,7998
2318,0212
2339,2226

Variance
2813,5366
516,0925
66,5926
1115,4258
216,4259
3046,6106
199,7777

se
53,04
22,72
8,16
33,40
14,71
55,20
14,13

80
90
100

3
3
3

6911,6608
7095,4064
6918,7279

2303,8869
2365,1355
2306,2426

3046,6106
2513,8700
1215,3146

55,20
50,14
34,86

Source of Variation
Between Groups
Within Groups
Total

SS
13118907
29500,514
13148407

MS
1457656,32
1475,03

F
988,22

ANOVA
df
9
20
29

P-value
1,756E-24

F crit
2,392814

Bng 5.10. Gi tr OD tng ng khi xc nh ng hc phn ng ca PPO theo

thi gian
OD420nm
Thi gian
OD420nm TB
(pht)
Ln 1
Ln 2
Ln 3
0

0,012

0,016

0,014

0,0140,002

0,351

0,353

0,349

0,3510,002

10

0,428

0,431

0,426

0,4280,003

15

0,435

0,436

0,431

0,4340,003

20

0,434

0,431

0,429

0,4310,003

25

0,429

0,429

0,426

0,4280,002

30

0,418

0,422

0,418

0,4190,002

35

0,406

0,410

0,401

0,4060,005

40

0,396

0,393

0,384

0,3910,006

45

0,382

0,386

0,379

0,3820,004

50

0,379

0,380

0,376

0,3780,002

55

0,377

0,380

0,376

0,3780,002

60

0,369

0,372

0,372

0,3710,002

93

Bng 5.11. Gi tr OD tng ng khi xc nh nh hng ca acid ascorbic n hot

ca PPO
Nng
OD420nm
OD420nm
HC
acid ascorbic
OD
OD TB
KC
TN
(UI/gNL)
(mM)
0,016
0,215
0,199
0,197
1392,23
0
0,018
0,211
0,193
0,003
24,48
0,017
0,216
0,199
0014
0,188
0,174
0,173
1222,61
1
0,014
0,185
0,171
12,24
0,002
0,015
0,189
0,174
0,014
0,029
0,015
0,017
117,79
5
0,013
0,030
0,017
10,80
0,002
0,014
0,032
0,018
0,013
0,016
0,003
0,003
23,56
10
0,014
0,018
0,004

4,08
0,001
0,013
0,016
0,003
0,015
0,015
0,000
0,001
4,71
50
0,014
0,015
0,001
4,08
0,001
0,013
0,014
0,001
0,014
0,014
0,000
0,000
0,00
100
0,014
0,014
0,000
0,00
0,000
0,014
0,014
0,000
Anova: Single Factor
SUMMARY
Groups
0
1
5
10
50
100
ANOVA
Source of Variation
Between Groups
Within Groups
Total

Count
3
3
3
3
3
3

SS
6531323
1798
6533121

Sum
4176,678
3667,845
353,3569
70,67138
14,13428
0

df
5
12
17

94

Average
1392,226
1222,615
117,7856
23,55713
4,711425
0

Variance
599,3332
149,8333
116,537
16,64815
16,64815
0

MS
1306265
149,8333

F
8718,119

se
24,48
12,24
10,80
4,08
4,08
0,00

P-value
6,36921E-21

F crit
3,105875

Bng 5.12. Gi tr OD tng ng khi xc nh nh hng ca acid citric n hot

ca PPO
Nng
HC
OD420nm
OD420nm
NaCl
OD
OD TB
(UI/mlddE)
KC
TN
(mM)
0,016
0,215
0,199
0,197
1392,23
0
0,018
0,211
0,193
0,003
24,48
0,017
0,216
0,199
0,014
0,194
0,180
0,180
1274,44
1
0,014
0,192
0,178
17,79
0,003
0,014
0,197
0,183
0,014
0,166
0,152
0,156
1100,12
5
0,015
0,174
0,159
24,82
0,004
0,014
0,170
0,156
0,014
0,145
0,131
0,130
921,08
10
0,015
0,144
0,129
8,16
0,001
0,015
0,146
0,131
0,015
0,110
0,095
0,098
694,94
50
0,014
0,112
0,098
24,82
0,004
0,015
0,117
0,102
0,014
0,108
0,094
0,092
650,18
100
0,014
0,103
0,089
18,7
0,003
0,015
0,108
0,093
Anova: Single Factor
SUMMARY
Groups
0
1
5
10
50
100
ANOVA
Source of Variation
Between Groups
Within Groups
Total

Count
3
3
3
3
3
3

SS
1382010
5127,629
1387137

Sum
4176,678
3823,322
3300,353
2763,251
2084,806
1950,53

df
5
12
17

Average
1392,2261
1274,4405
1100,1178
921,08363
694,93522
650,17668

Variance
599,33324
316,31477
615,98139
66,592582
615,98139
349,61106

MS
276401,95
427,3024

F
646,85325

95

se
24,48
17,79
24,82
8,16
24,82
18,70

P-value
3,72341E-14

F crit
3,105875

Bng 5.13. Gi tr OD tng ng khi xc nh nh hng ca NaCl n hot

ca PPO
Nng
OD420nm
OD420nm
HC
acid citric
OD
OD TB
KC
TN
(UI/gNL)
(mM)
0,016
0,215
0,199
0,197
1392,23
0
0,018
0,211
0,193
24,48
0,003
0,017
0,216
0,199
0,015
0,199
0,184
0,182
1286,22
1
0,016
0,194
0,178
24,48
0,003
0,014
0,198
0,184
0,017
0,198
0,181
0,180
1274,44
5
0,016
0,194
0,178
14,71
0,002
0,016
0,198
0,182
0,015
0,182
0,167
0,166
1170,79
10
0,014
0,179
0,165
8,16
0,001
0,014
0,179
0,165
0,015
0,152
0,137
0,134
949,35
50
0,016
0,150
0,134
17,79
0,003
0,014
0,146
0,132
0,015
0,143
0,128
0,129
911,66
100
0,015
0,143
0,128

12,24
0,002
0,015
0,146
0,131
Anova: Single Factor
SUMMARY
Groups
0
1
5
10
50
100
ANOVA
Source of Variation
Between Groups
Within Groups
Total

Count
3
3
3
3
3
3

SS
567049,7
3895,666
570945,4

Sum
4176,678
3858,657
3823,322
3512,367
2848,057
2734,982

Average
1392,2261
1286,2191
1274,4405
1170,7892
949,35218
911,66078

Variance
599,33324
599,33324
216,42589
66,592582
316,31477
149,83331

df

MS
113409,94
324,63884

F
349,34188

5
12
17

96

se
24,48
24,48
14,71
8,16
17,79
12,24

P-value
1,46665E-12

F crit
3,105875

Bng 5.14. S thay i OD420nm theo thi gian trong ch bin tr en (mu TN)
Thi gian (pht)

Mu 1

Mu 2

Mu 3

0,300

0,297

0,311

0,315

0,314

0,330

10

0,340

0,337

0,340

15

0,365

0,360

0,369

20

0,388

0,384

0,385

25

0,412

0,398

0,401

30

0,436

0,430

0,434

35

0,464

0,461

0,466

40

0,484

0,483

0,481

45

0,507

0,498

0,500

50

0,522

0,516

0,52

55

0,538

0,532

0,538

60

0,555

0,549

0,557

Bng 5.15. S thay i OD420nm theo thi gian trong ch bin tr xanh (mu TN)
Thi gian (pht)

Mu 1

Mu 2

Mu 3

0,373

0,369

0,372

0,374

0,367

0,373

10

0,373

0,369

0,375

15

0,372

0,368

0,374

20

0,372

0,368

0,375

25

0,373

0,369

0,373

30

0,373

0,369

0,373

35

0,373

0,367

0,375

40

0,374

0,369

0,374

45

0,372

0,368

0,375

50

0,372

0,368

0,375

55

0,374

0,368

0,373

60

0,374

0,369

0,373

97

Bng 5.16. Gi tr OD tng ng khi xc nh hot ca ch phm PPO th t l

tr nguyn liu
Hot

Th tch

Khi lng

chung

dung dch

PPO th (g)

(UI/ml ddE)

enzyme (ml)

OD420nm
KC

OD420nm
TN

OD

0,013

0,032

0,019

38

10

0,1661

0,012

0,032

0,02

40

10

0,1763

0,015

0,035

0,020

40

10

0,1756

Mu

Bng 5.17 . Gi tr OD tng ng khi xc nh hm lng protein trong ch phm

PPO th t l tr
Mu 1
Mu 2
Mu 3
OD595nm

0,08

0,084

0,082

OD

0,029

0,033

0,031

Hm lng protein trong CPE

suy ra t ng chun (g/ml)

19,33 x 20=
386,60

22 x 20 =
440

20,67 x 20 =
413,40

Hm lng protein trong CPE

suy ra t ng chun (mg/ml)

0,387

0,440

0,413

5.4. Xc nh s tng quan gia nng v hp thu cc i ca

benzoquinon bc sng 420nm [2]
Bng 5.18. S tng quan gia nng v hp thu cc i ca benzoquinon bc
sng 420nm
Nng
benzoquinon
(mM)
OD420nm

18

27

36

45

54

63

72

81

90

0,045 0,096 0,138 0,183 0,226 0,272 0,321 0,356 0,408 0,454

98

0,50

y = 0,005x

0,45

R2 = 0,9994

OD420mm

0,40
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
9

18

27

36

45

54

63

72

81

90

99

Nng benzoquinon (mM)

th 5.2. S tng quan gia gi tr OD v nng benzoquinon

5.5. Phng php tch chit dung dch enzyme ficin t sung v bromelin t
da [4,7]
- Tch chit enzyme ficin t qu sung: cn khong 20g qu sung, ct nh,
nghin vi 20ml nc ct, lc qua vi thng, dch lc em ly tm vi tc
12000 vng/5 pht, thu dch ni cha enzyme ficin
- Tch chit enzyme bromelin: cn khong 20g qu thm gt b v,
nghin trong ci vi 20ml nc ct, lc qua vi thng, dch lc em ly tm vi tc
12000 vng/5 pht, thu dch ni cha enzyme bromelin
5.6. Phng php xc nh hot protease ca enzyme ficin v bromelin theo
Anson [4,6]
- Nguyn tc:
Cho protease tc dng vi c cht l casein (hoc hemoglobin), sn phm to
thnh l cc peptid ngn hay acid amin, trong cc loi acid amin, tyrosin chim a
s. Xc nh tyrosin bng phn ng mu vi thuc th Folin, t xc nh hot
protease theo nh ngha:

99

Hot ca protease c biu th l s micromole tyrosin sinh ra do thu

phn Casein bi 1ml dung dch hay 1 mg ch phm protease trong thi gian 1 pht
iu kin chun (35,50C, pH 7.6)
- Tin hnh th nghim
Bng 5.19. Phng php xy dng ng chun tyrosin
ng nghim

Dung dch tyrosin chun 1mM (ml)

0.2

0.4

0.6

0.8

Dung dch HCl 0,2N (ml)

0.8

0.6

0.4

0.2

Dung dch NaOH 0,5N (ml)

Thuc th Folin (ml)

0.6

0.6

0.6

0.6

0.6

0.6

Lng tyrosin (mol)

0.2

0.4

0.6

0.8

Lc v yn 10 pht em o mt quang bc sng 660 nm

V th biu din s bin thin mt quang (OD) theo lng tyrosin cc ng.
Bng 5.20. Phng php xc nh lng tyrosin trong dung dch nghin
cu
Dung dch ho cht

ng nghim
Th tht (3 ng)

Th khng (3 ng)

Casein 1% (ml)

TCA 10% (ml)

Dch enzyme mu (ml)

Lc u v gi 35,5oC, trong 30 pht

TCA 10% (ml)

Dch enzyme mu (ml)

Lc, ly 1ml dch lc thc hin phn ng mu

Dch lc (ml)

Dung dch NaOH 0.5N (ml)

0.6

0.6

Thuc th Folin (ml)

Lc u, yn 10 pht, o OD bc sng 660 nm

100

- Cch tnh: Hot protease:

Hot protease (UI/ml) =

x.V .K
t.v

x: s mol tyrosin suy ra t ng chun

V: tng th tch hn hp phn ng enzyme (11 ml)
v: th tch dch lc em phn tch (1ml)
K: pha long mu
t: thi gian phn ng (30 pht)
1 UI (Anson) = 1 mol Tyrosin/ml/pht ;
hoc = 1 mol/mg/pht
* Kt qu xy dng ng chun tyrosin
Bng 5.21. Tng quan gia gi tr OD vi nng tyrosin
ng nghim
0
1
2
3
4

Lng tyrosin (mol)

0,2

0,4

0,6

0,8

OD660nm

0,027

0,319

0,610

0,860

1,110

1,310

OD

0,000

0,292

0,583

0,833

1,083

1,283

y = 1,3367x

1,4

R2 = 0,994

1,2

OD

1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0

0,2

0,4

0,6

0,8

Nng tyrosin (mol)

th 5.3. S tng quan gia gi tr OD v nng tyrosin

101

* Kt qu xc nh hot chung ca enzyme bromelin v ficin

Bng 5.22. Kt qu o OD khi xc nh hot chung ca enzyme bromelin
v ficin
Mu

Bromelin

pha
long

OD660nm
Th tht

Th
khng

Ln 1

0,413

0,218

Ln 2

0,405

0,216

Ln 3

0,416

0,218

OD660nm TB

0,411

0,217

10

OD

Ficin

Lng tyrosin
suy ra t
ng chun
(mol)

0,145

0,194

Ln 1

0,605

0,438

Ln 2

0,602

0,431

Ln 3

0,606

0,435

OD660nm TB

0,604

0,435

OD

0,139

0,186

Bng 5.23. Kt qu xc nh hot chung ca enzyme bromelin v ficin

Mu

x (mol)

Bromelin

0,145

Ficin

0.139

Hot chung

(ml)

(UI/gNL)

10

4,25

0,37

t (pht)

11

30

11

30

(ml)

102

5.4. Mt s hnh nh minh ha

Hnh 5.1. Phn ng xc tc bi PPO trn c cht catechol

1. Dung dch trc phn ng
2. Dung dch sau phn ng

Hnh 5.2. nh hng ca nhit n s sm mu ca khoai ty

1. Mu t nhit phng
2. Mu x l nhit 100oC
3. Mu x l nhit 4oC

103

Hnh 5.3. nh hng ca nhit n s sm mu ca to ty

1. Mu t nhit phng
2. Mu x l nhit 100oC
3. Mu x l nhit 4oC

Hnh 5.4. nh hng ca pH n s sm mu ca khoai ty

1. Mu khng x l
2. Mu x l pH 2
3. Mu x l pH 3
4. Mu x l pH 4

104

Hnh 5.5. nh hng ca pH n s sm mu ca to ty

1. Mu khng x l
2. Mu x l pH 2
3. Mu x l pH 3
4. Mu x l pH 4

Hnh 5.6. nh hng ca ha cht n s sm mu ca khoai ty

1. Mu khng x l
2. Mu x l vi acid ascorbic
3. Mu x l vi acid citric
4. Mu x l vi NaCl

105

Hnh 5.7. nh hng ca ha cht n s sm mu ca to ty

1. Mu khng x l
2. Mu x l vi acid ascorbic
3. Mu x l vi acid citric
4. Mu x l vi NaCl

Hnh 5.8. nh hng ca enzyme n s sm mu ca khoai ty

1. Mu khng x l
2. Mu x l vi bromelin
3. Mu x l vi ficin

106

Hnh 5.9. nh hng ca enzyme n s sm mu ca to ty

1. Mu khng x l
2. Mu x l vi bromelin
3. Mu x l vi ficin

Hnh 5.10. Ch phm PPO th t l tr

107