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Proceso de bioseparacin
Definicin: Recuperacin, aislamiento, purificacin y refinamiento de productos sintetizados por procesos biotecnolgicos Definicin extendida: Etapas de refinamiento final de procesos tales como tratamiento de efluentes y purificacin de agua por biotecnologa
UPSTREAM - formulacin de medios - desarrollo de inculo - esterilizacin - inoculacin FERME TACI
DOW STREAM - extraccin de producto, purificacin y refinamiento - tratamiento de aguas - recuperacin de subproducto
Productos biolgicos
Producto Naturaleza de requerida la bioseparacin
Cerveza, vino, licores cido actico, cido ctrico Vitamina C, vitamina B12, riboflavina
Clarificacin, distilacin Precipitacin, filtracin, adsorcin, extraccin con solventes Precipitacin, filtracin, adsorcin, extraccin con solventes Precipitacin, filtracin, adsorcin, extraccin con solventes Precipitacin, filtracin, adsorcin, extraccin con solventes Precipitacin, filtracin, adsorcin Precipitacin, filtracin, adsorcin, extraccin con solventes
Carbohidratos: Lpidos:
Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa Correlacin entre concentracin de producto antes de la purificacin y precio de venta
10 5 Agua Etanol 10 3 cido ctrico Penicilina Treonina Cefalosporina Gentamicina cido giberlico Glucosa oxidasa Amilasas Hormona humana de crecimiento Activador plasmingeno de tejido Vacuna B hepatitis
Insulina Renina Glicerofosfato deshidrogenasa Luciferasa Enzimas teraputicas Factor VIIII Urokinasa
Enzimas de diagnstico 10 -5
Anticuerpos monoclonales
10 -7 10 -3
10 -1
10 1
10 3
10 5
10 7
10 9
10 11
(Knight, 1989)
Medio 2 m.o. mutados y DNA recomb. Mediana a alta 90 - 99 % 50 90 % 0.3 0.7 0.1 0.5
Bajo 3 m.o. DNA recomb. Alta 99.95 - 100 % 5 50 % 0.5 0.9 0.01 0.2
cido ctrico, 300,000 TON/ao (1987) Insulina, 1 TON/ ao (1987) Interferon, 10-5TON/ao (1987)
Velocidad
Capacidad
Recuperacin
Minimice el manejo de la muestra Minimice el nmero de etapas Use diferentes tcnicas en cada etapa Cada tcnica ofrece un balance Entre resolucin, capacidad, Velocidad y recuperacin
Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa Propiedades de las tcnicas de purificacin comnmente usadas
Tcnica Propiedad explotada Capacidad Resolucin Alta Muy baja Muy baja Muy baja Alta Media Media Rendimiento Costo promedio Medio Alto Alto Variable Medio Medio Bajo Bajo Bajo Alto Medio Medio Composicin muestra
-1 >1 mg ml
Composicin producto Volumen pequeo Concentracin alta I alto Volumen pequeo Concentracin alta Concentracin de polmero alta (PEG) I alto pH diferente I bajo pH diferente Presencia de anfolitos I alto pH diferente Condiciones de desnaturalizacin potencial Diluido
Precipitacin con Hidrofobicidad Alta (NH4)2SO4 Extraccin en dos Mezcla fases acuosas Bioafinidad Cromatografa de Carga intercambio inico Alta Alta Media
-1 >1 mg ml
Alta Alta
Cromatografa de Mezcla afinidad de teido Cromatografa de Bioactividad afinidad de ligando Cromatografa de Tamao permeacin en gel
Estrategia convencional:
Recuperacin, aislamiento, purificacin y refinamiento Basado en arreglos lgicos de mtodos de bioseparacin Las tcnicas de baja resolucin, alta capacidad (por ejemplo, precipitacin, filtracin, centrifugacin, cristalizacin) se usan primero para recuperacin y aislamiento Las tcnicas de alta resolucin (por ejemplo, adsorcin, cromatografa, electroforesis) son entonces usadas para purificacin y aislamiento
Mtodos de bioseparacin
Baja resolucin alta capacidad
Ruptura celular Precipitacin Centrifugacin Extraccin lquido-lquido Percolacin Filtracin Extraccin con fludos supercrticos Microfiltracin Dilisis Ultracentrifugacin Adsorcin Cromatografa de lecho empacado Separacin por afinidad Electroforesis
Alta resolucin-alta capacidad Ultrafiltracin Cromatografa de lecho fluidizado Cromatografa de membrana Cromatografa de columna de Monolith
Captura
Definicin: Purificacin inicial de la molcula objetivo de un material crudo Meta: Rpido aislamiento, estabilizacin y concentracin Resolucin
Velocidad
Capacidad
Recuperacin Use una tcnica de alta capacidad para reducir el volumen de la muestra Concntrese en lo robusto y simple de la primera etapa de purificacin
Purificacin intermedia
Definicin: Nueva remocin de contaminantes Meta: Purificacin y concentracin Resolucin
Velocidad
Capacidad
Refinamiento
Definicin: Remocin final de contaminantes traza, Ajuste de pH, sales o aditivos para almacenamiento Meta: Producto final de alto nivel de pureza requerido Resolucin
Velocidad
Capacidad
Precipitado
Centrifugacin Precipitacin
Intercambio inico
Dilisis
Filtracin en gel
Secado
Enzima en polvo
Produccin de celulasas
Cultivo sumergido
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Produccin de enzimas
Cultivo microbiano Fermentador para siembra
Cultivo slido
Enzimas extracelulares
Centrifugacin o filtracin
Enzimas intracelulares
Rompimiento celular Centrifugacin o filtracin
Precipitacin Secado
Estrategia de purificacin
Produccin
Calidad Cantidad
Enzima
Economa
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Preservando la actividad
Minimizar
La desnaturalizacin La inactivacin La protelisis Otras precauciones
Falla del ensayo Composicin incorrecta del buffer Impureza de los reactivos Protelisis Precipitacin Presencia de un inhibidor Prdida de un inhibidor o cofactor
Rendimiento
Es la evaluacin de la cantidad de actividad o protena activa obtenida despus de una tcnica de purificacin. Generalmente es reportada en %. Siendo el 100% la actividad del extracto crudo
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