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FACULTAD DE QUMICA-UNAN DEPARTAMENTO DE BIOLOGA MICROBIOLOGA EXPERIMENTAL 1515 GRUPO 10 SEMESTRE 2014/2 EQUIPO: NOMBRE: NOMBRE: 2 Hernndez Pichardo

Alejandra Gutirrez Ponce Ma. Teresa

PRCTICA No.

07 Tcnicas de aislamiento de microorganismos

NOMBRE DE LA PRCTICA: FECHA(S) DE REALIZACIN: FECHA DEL REPORTE:

18 y 25/03/14 27/02/14

CALIFICACIN DEL REPORTE: COMENTARIOS GENERALES:

REVISADO POR:

Diagrama Experimental
hasta que est lquido (~45C)

dilucin
1 asada en tubo 2 (de tubo 1)

Calentar 2 tubos con BHI

agotamiento
vertir en cajas

Gram a tubo con muestra

1 asada en tubo 1 (de muestra)

Inocular en los diferentes medios

YPMD y Sabourab en gaveta


Incubar 24h/37 C

Por cuadrante radial (7) medios)

en todos los medios inoculados

Cuadrante radial

Localizar colonias aisladas y puras

Gram

siembra en caja

comprobar pureza

Gram

CONSERVAR

Incubar 24h/37 C

incubar 24/37C

colonia pura en ResiemBHI

bra

Incubar 24h/37 C

comprobar pureza

ver desarrollo (pura)

Simbra en tubo
Estra ondulada

Objetivos: Conocer el tipo y fundamento de los diferentes medios de cultivo empleados. Aplicar las tcnicas aprendidas hasta ahora para el aislamiento de microorganismos con caractersticas especficas. Obtener cultivos puros y comprobar la pureza de estos. Utilizar tcnicas de conservacin para los cultivos puros obtenidos. Analizar los nutrimentos que aportan los medios y relacionarlos con el tipo de necesidades de cada microorganismo para hacer una suposicin del cultivo puro.

Resultados: Tabla 1.1. Clasificacin y caractersticas de los diferentes tipos de medios empleados. NOMBRE COMPOSICIN (en gramos por litro de agua).
Infusin de cerebro de ternera 7.5, infusin de corazn de res 10.0, glucosa 2.0, peptona de gelatina 10.0, cloruro de sodio 5.0, di-Sodio Hidrgeno Fosfato 2.5.

TIPO

CARACTERSTICAS ADICIONALES
Se emplea para el cultivo de bacterias exigentes como Estreptococos, Neumococos, Meningococos y otros. Por la adicin de estreptomicina, gentamicina o cloranfenicol resulta un medio selectivo para hongos. La dextrosa es la fuente de energa para el crecimiento de microorganismos. La peptona y el extracto de levadura proporcionan factores de crecimiento y la fuente de nitrgeno. El extracto de malta debido a su elevado contenido en diversos carbohidratos, sobre todo en maltosa y dextrosa son la base para el crecimiento de mohos y levaduras. Por la combinacin de estos dos colorantes y los dos hidratos de carbono se pueden distinguir algunos gneros. Las bacterias lactosa-negativas y sacarosa negativas (Salmonella y Shigella) dan colonias incoloras, mientras que las lactosa y/o sacarosa-positivas dan colonias prpura-violeta negruzco con/sin un centro

Agar Infusin de Cerebro y Corazn:BHI

Si se aade antibitico el medio se hace selectivo para hongos.

YPMD

Agar 20.0, extracto de malta 3.0, dextrosa 10.0, extracto de levadura 3.0, peptona 5.0

Selectivo para cultivo y aislamiento de levaduras, mohos y otros microorganismos acidricos.

Agar Eosina Metileno:EMB

Azul

de

Eosina amarillenta 0.4, azul de metileno 0.065, lactosa 5.0, peptona bacteriolgica 10.0, di-potasio hidrgeno fosfato 2.0, sacarosa 5.0, agar 13.5.

Medio diferencial para el aislamiento y diferenciacin de bacterias entricas Gram-negativas.

Agar Sabouraud

Agar 15.0, dextrosa 40.0, peptona 10.0

Selectivo

oscuro y quedan rodeadas de una zona incolora. Por el efecto de estos mismos colorantes tambin queda inhibido el crecimiento de bacterias Gram-positivas. Tambin es posible la identificacin de Candida albicans. Para cultivo y conservacin de hongos patgenos y no patgenos, particularmente dermatofitos, levaduras y microorganismos acidricos. Cuando los materiales en estudio presentan abundantes contaminantes, el aislamiento mejora si se adiciona al medio de cultivo sustancias antimicrobianas selectivas, como cicloheximida, penicilina y estreptomicina antes de usarlo, inhibiendo de esta forma la flora contaminante que interfiera en el cultivo de hongos.

Rosa de bengala

Agar 15.5, peptona de soya 5.0, cloranfenicol 0.1, rosa de bengala 0.05, dextrosa 10.0, fosfato monopotsico, 1.0, sulfato de magnesio 0.5

Selectivo

Para aislamiento y recuento de levaduras y mohos. La dextrosa es la fuente de energa para el crecimiento de microorganismos. La peptona proporciona factores de crecimiento y la fuente de nitrgeno. La presencia de rosa de bengala en la base, suprime el crecimiento de bacterias y restringe el tamao y la altura de las colonias de mohos de crecimiento rpido. Esta restriccin ayuda en el aislamiento de mohos de crecimiento lento y pueden crecer las levaduras. Con la adicin del rosa de bengala se facilita el recuento de mohos y levaduras. El cloranfenicol inhibe el crecimiento de bacterias

presentes en el medio ambiente y alimentos. Triptena Soya Agar: TSA Triptena 15.0, peptona de soya 5.0, cloruro de sodio 5.0, agar 15.0. Medio utilizado para propsitos generales, favorece el desarrollo y aislamiento de una gran variedad de microorganismos aerobios, y anaerobios facultativos y estrictos. El agregado de sangre, permite el aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes y la observacin de reacciones de hemlisis. Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentracin salina. Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o prpura. En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de carbono, nitrgeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentracin) es el agente selectivo, y el rojo fenol es el indicador de pH. Las bacterias que crecen en un medio con alta concentracin de sal y fermentan el manitol, producen cidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo. La Cetrimida acta como elemento inhibidor de una amplia variedad de microorganismos, de tal

Manitol Sal Rojo de Fenol: MSA

Extracto de carne 1.0, pluripeptona 10.0,dmanitol 10.0, cloruro de sodio 75.0, agar 15.0, rojo de fenol 0.025.

Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciacin de estafilococos.

Agar Cetrimide

Cetrimida 0.3, cloruro de magnesio, 1.4, digerido pancretico de gelatina 20.0, sulfato de potasio

Medio selectivo para Pseudomonas aeruginosa

10,0, agar 13.6.

manera que no inhibiendo el crecimiento de las Pseudomonas aeruginosa s lo hace con otras especies de Pseudomonas. Adems su accin tensioactiva produce la liberacin del fsforo y del nitrgeno a las clulas bacterianas distintas de Pseudomonas aeruginosa. Por la presencia de cloruro de magnesio y sulfato de potasio se favorece la produccin de piocianina que dar al medio coloracin azul verdoso o marrn. Algunas especies de Proteus, Klebsiella y Providencia pueden contaminar el medio.

Resultados del Gram inicial (Gutirrez Ponce Ma. Teresa). Microscopio: Z-13 Fecha: 18/03/14 Muestra: dilucin en SSI Aumento: 1000veces Tincin: Gram Descripcin: clula alargada con formas opacas dentro de ella; cocobacilos en fila formando espirales y curvas

Resultados del Gram inicial (Hdz Pichardo Alejandra). Microscopio: Z-13 Fecha: 18/03/14 Muestra: dilucin en SSI Aumento: 1000veces Tincin: Gram Descripcin: Bacilos largos y delgados morados aislados, bacilos cortos morados aislados, cocobacilos grandes morados, cocos morados de tamao mediano formando redes irregulares, cocos rojos medianos formando redes irregulares. 6

Resultados de las observaciones macroscpicas del desarrollo presentado en los diferentes medios de cultivo (Gutirrez Ponce Ma. Teresa). BHI (25): observ slo 1 tipo de colonia pequea, blanca, redonda, brillosa, elevada EMB (17): al menos 3 colonias distintas; aislada slo 1 planas con morado en el centro, brillosas y aspecto verde metlico en el centro convexas, moradas-rosceas y grandes, brillosas (blanquizcas en el centro) blancas, brillantes y pequeas TSA (60): al menos dos tipos de colonias colonias rosas, brillosas y translcidas colonias blancas, brillosas y translcidas MSA (31): no observ crecimiento Cetrimida (11): no observ crecimiento Dilucin colonias pequeas, blancas, brillosas, poco elevadas Sabourab (55) colonias irregulares, grandes, blancas, translcidas con rosa intenso en el centro y otras pequeas color rosa intenso, brillantes, redondas YPMD (73): crecimiento de distintas colonias, al menos 4 5 colonia naranja-rojizo, convexas, brillosas, medianas, ms concentradas en el centro, redondas. colonias blancas, pequeas, altas, opacas, redondas colonias blancas, translcidas, planas, irregulares colonias amarillas, convexas, opacas, pequeas

Resultados de las observaciones macroscpicas del desarrollo presentado en los diferentes medios de cultivo (Hdz Pichardo Alejandra). BHI (25): 2 tipos de colonia Colonias pequeas, blancas brillosas y elevadas Colonias amarillas, brillosas, pequeas y con elevacin. EMB (17): Slo 1 colonia aislada Colonia grande con elevacin de color morado brilloso. Se observ un crecimiento irregular elevado de color morado brilloso y en algunas partes con coloracin verde metlico. TSA (60): al menos tres tipos de colonias colonias pequeas amarillas, brillantes y con elevacin. colonias grandes blancas, brillosas y con elevacin. colonias medianas de color rojo, opacas y con elevacin. MSA (31): 1 colonia. colonia blanca brillante con elevacin de tamao pequeo. 7

Cetrimida (11): no observ colonias aisladas Crecimiento irregular blanco brilloso con elevacin. Dilucin colonias pequeas, blancas, brillosas y elevadas Sabourab (55) colonias pequeas rosadas, opacas y planas. presencia de un crecimiento blanco translcido brilloso convexo y en algunas partes el crecimiento presenta una coloracin rosada. YPMD (73): crecimiento de 5 colonias distintas colonias pequeas blancas y brillantes con elevacin . colonias rojo brillante (intenso en el centro y disminuye hacia los bordes) convexas de varios tamaos. colonias blancas opacas, translcidas, planas e irregulares colonias amarillas, opacas, planas y pequeas Colonias de tamao grande planas de color amarillo intenso. Despus de seleccionar una colonia aislada los resultados del Gram para el cultivo puro seleccionado son: Observacin al microscopio del cultivo puro (Gutirrez Ponce Ma. Teresa). Microscopio: 17 Fecha: 20/03/14 Muestra: Colonia de EMB Aumento: 1000veces Tincin: Gram Descripcin: bacilos gram negativos.

Observacin al microscopio del cultivo puro (Alejandra Hdz Pichardo). Microscopio: 17 Fecha: 20/03/14 Muestra: Colonia de MSA Aumento: 1000veces Tincin: Gram Descripcin: cocobacilos gram positivos formando redes irregulares.

Despus de sembrar la colonia en el medio BHI los resultados fueron: Resultados de la siembra del cultivo puro (Ma. Teresa Ponce). Observ colonias blancas, pequeas, brillantes.

Microscopio: Z-10 Fecha: 25/03/14 Muestra: Colonia de cultivo puro en BHI. Aumento: 1000 veces. Tincin: Gram Descripcin: bacilos gram negativos (varios agrupamientos).

Resultados de la siembra del cultivo puro (Alejandra Hdz Pichardo). Observ colonias pequeas, blancas, brillantes y con elevacin.

Microscopio Z-10: Fecha: 25/03/14 Muestra: Colonia de cultivo puro en BHI. Aumento: 1000 veces. Tincin: Gram Descripcin: cocobacilos Gram positivos formando redes Irregulares.

Anlisis de resultados: Tomamos muestra que contena distintos tipos de microorganismos (columna), la cual se diluyo en SSI, se realiz Gram inicial para poder apreciar los microorganismos presentes y sta se inocul en distintos medios de cultivo (por agotamiento) para evaluar selectividad de medios y tambin para aislar slo un tipo de microorganismo dependiendo de sus necesidades nutrimentales y metablicas. Se realiz tambin dilucin para disminuir la carga microbiana. De los medios inoculados se identificaron colonias aisladas y puras y se comprob pureza con Gram. Se resembr la colonia que se encontraba pura en BHI; se volvi a verificar pureza y se sembr de nuevo para poder tener mayor crecimiento de colonias aisladas y as lograr conservarlo despus en tubo. Como se puede apreciar al hacer la prueba de Gram a la muestra que obtuvo de la columna haba en esta una amplia variedad de microorganismos tanto (+) y (-). En el primer caso se tom una colonia pequea 9

blanca y brillosa del medio EMB el cual segn la literatura se emplea como medio diferencial para el aislamiento y diferenciacin de bacterias entricas Gram negativas, lo cual concuerda con lo observado en el microscopio despus de realizar la tincin de Gram (bacilos Gram negativos) lo segundo que se reporta en la literatura sobre las caractersticas macroscpicas del crecimiento en los medios es por la combinacin de los colorantes y los hidratos de carbono se pueden distinguir las bacterias lactosanegativas y sacarosa negativas (Salmonella y Shigella) dan colonias incoloras, mientras que las lactosa y/o sacarosa-positivas dan colonias prpura-violeta negruzco con/sin un centro oscuro rodeadas de una zona incolora. Se sabe que Salmonella y Shigella son bacilos segn la literatura, pero las caractersticas macroscpicas de las colonias observadas no corresponden del todo as que no se puede asegurar que sean estos microorganismos y slo se puede decir que se aisl un bacilo Gram negativo lo cual era lo esperado para este medio. En el segundo caso se tom una colonia blanca, brillosa, pequea y con elevacin del medio MSA, es importante decir que era la nica colonia presente en el medio y a primera vista se puede suponer que puede que este no sea el medio adecuado del microorganismo, pero que de cierta forma pudo encontrar la forma de sintetizar algunos componentes para poner vivir; al realizar Gram a esta colonia se observaron cocobacilos Gram positivos, la literatura reporta que es un medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciacin de estafilococos, al ser diferencial se pueden conocer las actividades metablicas de los microorganismos mediante de los indicadores que tiene el medio se sabe segn la literatura que los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color y los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o prpura pero las caractersticas macroscpicas de la colonia no presentan ninguna de estas caractersticas y lo ms importante la morfologa del microorganismo no encaja con lo esperado pues es un medio para estafilococos (racimos de uvas). Despus de resembrar al microorganismo en el medio BHI el cual se sabe que es para bacterias exigentes como Estreptococos, Neumococos, Meningococos, se ve que la morfologa que se presenta ahora es que son cocos Gram positivos, as que se hace la suposicin que la primera morfologa presentada se debe a que el desarrollo de la bacteria no es ptimo debido a los nutrientes del medio y se cree que puede tratarse de Estreptococos, Neumococos o Meningococos. Conclusiones: Los microorganismos necesitan de distintos nutrimentos y condiciones, por lo cual no todos presentaron crecimiento en los distintos medios ya que algunos son selectivos lo cual nos indica que hay elementos que inhiben el crecimiento de otros microorganismos y en el caso de los diferenciales nos permiten saber un poco del metabolismo del microorganismo, en este caso mediante indicadores en el medio. As mismo los microorganismos que se seleccionaron para estudiar fueron bacterias por su rpido crecimiento (hongos y protozoarios necesitan periodos ms largos de incubacin). El proceso de siembra y observacin se realiza para obtener un cultivo puro slo se puede asegurar (en el caso de bacterias) realizando una tincin de Gram y observando al microscopio pues se puede tener colonias que aparentemente estn puras pero que en la realidad estn contaminadas. Como ya se observ todo este proceso de aislamiento se logra mediante las buenas tcnicas para el manejo, sembrado y 10

conservacin de los microorganismos pues evitar la contaminacin es un punto importante, para obtener buenos resultados, la prueba de un buen trabajo es un cultivo sin contaminacin cuando se observa al microscopio. Bibliografa: Disponible en: http://www.dibico.com/fichast/1110.pdf consultado por ltima vez: 27/03/14 a las 1:39 am Disponible en: http://www.dibico.com/fichast/1139.pdf consultado por ltima vez: 27/03/14 a las 1:41 am Disponible en: http://www.dibico.com/fichast/1017.pdf consultado por ltima vez: 27/03/14 a las 1:43 am Disponible en: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/manitolsalagar.htm consultado por ltima vez: 27/03/14 a las 1:48 am Disponible en: http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8771 consultado por ltima vez: 27/03/14 a las 1:50 am Pedro Garca Martos, et al, Microbiologa Clnica Prctica, servicio de publicaciones universidad de Cdiz, Espaa 1994 Cultimed: Manual Bsico de Microbiologa, I.C.T S.L

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