Universidad Catlica de Temuco

Escuela de Ciencias de la Salud

Laboratorio N 4: Determinacin cuantitativa de glcidos

Introduccin
La determinacin de glcidos es una de las tcnicas de mayor demanda a nivel de laboratorios de bioqumica clnica y analtica, siendo glucosa el analito mayormente analizado. Sin embargo, otros azucares simples tambin tienen importancia clnica, como por ejemplo la fructosa, la cual juega un rol importante en la funcin espermtica, por lo que su determinacin se utiliza de manera rutinaria dentro de los anlisis bioqumicos de lquido seminal, sobre todo en casos donde existe sospecha de infertilidad masculina. Si bien las determinaciones de disacridos como sacarosa y lactosa tienen importancia especialmente a nivel de laboratorios de anlisis de alimentos, la mayora de las tcnicas utilizadas para determinarlos se basan en la escisin enzimtica de los disacridos en sus porciones monomricas, cuantificando la glucosa liberada de esta reaccin. Para el diagnstico de anormalidades en el almacenamiento de glucgeno, se realiza la determinacin de este polisacrido principalmente en tejido heptico y muscular y al igual que las determinaciones de disacridos, se basan en la obtencin de molculas de glucosa por ruptura qumica o enzimtica del enlace glucosdico. SI bien existen mtodos de determinacin directa de glucgeno que pueden resultar ms exactos, suelen ser ms engorrosos, adems de contar con poca cantidad de fabricantes que ofrecen estas tcnicas en forma de kits comerciales. Por esta razn, las determinaciones de glucgeno generalmente no son consideradas de rutina en el laboratorio clnico, siendo mayormente utilizadas en laboratorios de investigacin.

Importancia clnica de la determinacin de glucosa

La concentracin de glucosa en sangre se mantiene normalmente dentro de lmites relativamente estrechos en diferentes situaciones metablicas (estado postprandial, ayuno o ejercicio intenso), gracias a hormonas reguladoras como la insulina, el glucagn o la epinefrina. Adems de la simple cuantificacin de glucosa plasmtica en estado de ayuno, la determinacin de este analito tambin se realiza conjuntamente con otras pruebas asociadas, como el test de tolerancia a glucosa oral, la glicemia postprandial, etc. Estos estudios tienen un gran valor en el diagnstico, seguimiento y tratamiento de la Diabetes Mellitus, el desorden del metabolismo de los carbohidratos sanguneos ms frecuentemente diagnosticado. Una hiperglicemia superior a 300 mg/dL (16,5 mmol/L) puede conducir a una cetoacidosis o un coma hiperosmolar. Por otra parte, cualquier hipoglicemia
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duradera, inferior a 30 mg/dL (1,7 mmol/L), es susceptible de conllevar lesiones cerebrales graves e irreversibles. Cuando la glucosa sangunea alcanza valores relativamente altos (como en la Diabetes Mellitus), el rin ejerce un efecto regulador. La glucosa es filtrada continuamente por los glomrulos, siendo habitualmente reintegrada completamente a la sangre por el sistema de resorcin de los tbulos renales. La capacidad del sistema tubular para absorber glucosa est limitada a una tasa aproximada de 350 mg/min. Cuando la cantidad de glucosa en la sangre sobrepasa la que puede ser reabsorbida, el exceso pasa a la orina producindose glucosuria.

Determinacin cuantitativa de glucosa: fundamentos

Mtodos Qumicos Los primeros mtodos utilizados para la cuantificacin de glucosa fueron mtodos qumicos, como el del ferricianuro o el de la orto-toluidina (o-toluidina). Este ltimo se basa en la condensacin de la o-toluidina con el grupo aldehdo de la glucosa, formando una mezcla en equilibrio de la glucosilamina y la base de Schiff correspondiente. Las reacciones que tienen lugar despus de la condensacin original producen una mezcla de cromgenos verdes los cuales se miden espectrofotomtricamente a 630 nm. Si bien este mtodo fue ampliamente utilizado, su uso rutinario fue cambiando a favor de los mtodos enzimticos, ms simples y rpidos de utilizar, con menos variables de error y que no utilizan solventes nocivos (tolueno o derivados del cianuro). Mtodos Enzimticos Si bien existen otros mtodos enzimticos de gran desempeo, como el de la glucosa hexoquinasa, el mtodo enzimtico ms utilizado en la actualidad es el de Glucosa Oxidasa Peroxidasa (GOD-PAP), el cual se basa en la especificidad de la enzima glucosa oxidasa (GOD) por la -D-glucosa. La enzima cataliza la oxidacin de la glucosa por oxgeno molecular dando D-gluconato y perxido de hidrgeno (H2O2). Para detectar y cuantificar esta oxidacin se ocupa una reaccin acoplada. El perxido de hidrogeno formado, reacciona bajo la influencia de perxidasa (POD) con fenol y 4-aminoantipirina para formar un complejo rojovioleta de quinona que se cuantifica midiendo la absorbancia a 500 o 546 nm, dependiendo del tipo de lmpara. D glucosa + 02 + H2O GOD cido Glucornico + H2O2 2 H2O2 + 4-aminofenazona + fenol POD Quinineimina + 4 H2O

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Valores de Referencia de Glucosa [glucosa]normal en sangre (ayuno )70 110 mg/dL ( 3,9 6,1 mmol/L). [glucosa]normal en orina 1 15 mg/dL ( 0,06 0,8 mmol/L).

Trabajo experimental
Objetivos: Determinar el rango de linearidad del mtodo de GOD-PAP para la determinacin de glucosa. Determinar la concentracin de glucosa en muestras problema de concentracin desconocida.

Materiales
Matraces aforados de 25 mL Pipetas parciales 5 o 10 mL Micropipetas p100 y/o p10 Espectrofotmetro Vrtex Tubos Khan Reactivo de GOD-PAP Solucin patrn de glucosa (Material de referencia) concentracin ______

Procedimiento
1. Preparacin de la curva de calibracin NOTA: La curva de calibracin se preparar de forma colectiva, entre todos los miembros del grupo (6 integrantes caga grupo). Recuerde encender los espectrofotmetros al menos 15 minutos antes de realizar cualquier lectura. 1.1 A partir de una solucin de 10 g/L de glucosa (Material de Referencia Concentrado), prepare una solucin de una concentracin asignada durante el inicio del laboratorio. Cada alumno tendr una de las siguientes concentraciones asignadas: 30, 70, 100, 150, 300 y 500 mg/dL, la cual deber preparar en un matraz aforado de _____ mL y agua destilada como solvente.

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1.2 Prepare una batera de 5 tubos y siga el procedimiento descrito en el protocolo del reactivo (ver hoja anexa), utilizando el micromtodo. - Coloque 1 mL de reactivo GOD-PAP en cada tubo de ensayo. - A los tres primeros tubos agregue 10 L de su solucin correspondiente de glucosa diluida. 2. Preparacin de las muestras problema 2.1 En el tubo 4, coloque 10 L de la muestra 1 (suero). 2.2 En el tubo 5 coloque 10 L de la muestra 2 (orina). 3. Determinacin espectrofotomtrica de glucosa 3.1 Utilize Parafilm para tapar sus tubos y mezcle con vrtex. 3.2 Deje incubar sus 5 tubos a temperatura ambiente por 10 minutos 3.3 Realice las lecturas espectrofotomtricas a 546 nm, utilizando el modo ATC, y configurando el carril de cubetas para que lea 6 tubos. Adicionalmente se le suministrar un blanco de reactivo el cual debe colocar en la posicin B del carril. 3.4 Calcule sus valores de Absorbancia corregida para cada tubo, restando la Absorbancia del blanco a del resto de sus tubos. 3.5 Complete la siguiente tabla Concentracin Glucosa mg/dL 30 70 100 150 300 500 Absorbancia del blanco: 3.6 Grafique la curva de calibracin y obtenga el factor de calibracin para el mtodo. 3.7 Calcule la concentracin de glucosa en las muestras problema utilizando su absorbancia y el factor de calibracin.
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Volumen MRC

Absorbancia R1

Absorbancia R2

Absorbancia R3

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