Pemanfaatan miroorganisme

dalam pengembangan obat

Marlia Singgih Wibowo
Sekolah Farmasi ITB
Tokoh mikrobiologi dunia
Louis Pasteur Alexander Flemming
Penyakit Infeksi
Disebabkan oleh Mikroba patogen
Bakteri
Fungi
Algae
Parasit
Mikroba pada Gigi
Streptococcus
sobrinus
Streptococcus
mutans
Karies pada gigi
Perlu Antibiotik untuk
mengobati nya ??
SUBCUTANEOUS MYCOSES
PARACOCCIDIOIDOMYCOSIS
BLASTOMYCOSIS
Antibotik :
sulfamethoxypyridazine and sulfadimethoxine
HISTOPLASMOSIS - DARLING'S DISEASE
Antifungi yang digunakan : Amphotericin B, Ketokenazol
Antibiotik
Antibiotik didefinisikan sebagai suatu senyawa
yang dapat membunuh atau menghambat
pertumbuhan bakteri.
Sampai hari ini ketergantungan kita terhadap
antibiotik tidak dapat dipungkiri. Di tahun 1998,
di United States, dilaporkan sekitar 80 juta resep
(prescriptions) antibiotik diterbitkan untuk
keperluan penyembuhan penyakit infeksi pada
manusia , dan hal itu equivalen dengan sekitar
12.500 ton antibiotik dalam 1 tahun .
Secara umum cara kerja antibiotik
merupakan salah satu dari 5 cara berikut :
Inhibisi sintesis asamnukleat
(mis. Rifampicin; Chloroquine)
Inhibisi sintesis protein
(mis. Tetracyclines; Chloramphenicol)
Aksi pada membran sel (mis. Polyenes; Polymyxin)
Interferensi dgn sistemenzyme
(mis. Sulphamethoxazole)
Aksi pada dinding sel (mis. Penicillin; Vancomycin)
Mekanisme kerja antibiotik pada bakteri
Penemuan baru dan perkembangan
antibiotik
In 1928, Alexander Fleming menemukan penisilin
antibiotik pertama yang dihasilkan oleh suatu jamur
(mould) Penicillium notatum yang tumbuh di atas
cawan yagng berisi bakteri Staphylococcus yang
sedang tumbuh.
Selanjutnya walaupun telah diencerkan 800 kali
kultur jamur tersebut tetap dapat menghambat
pertumbuhan bakteri.
Struktur dasar Penisilin
Alexander Flemming, 1928
Biosintesis penisilin dan sefalosporin
L--aminoadipic acid
L-cysteine
L-valine
-(L--aminoadipyl)-L-cystein
-(L--aminoadipyl)-L-cystein-D-valine
Isopenicilin N
Penicilin N Penicilin G
Deacetoxycephalosporin C
Deacetylcephalosporin C
Penicillium chrysogenum
C.Acremoneum, Streptomyces sp.
Cephalosporin C
3 prekursor asam
amino:
L-valine, L-cystein, L-
-aminoadipat
Siklisasi 2 tahap
Perkembangan penemuan
antibiotik
Di tahun 1939, Ernst Chain dan Howard Florey
mengembangkan cara mengisolasi penisilin dan menggunakan
nya pada Perang Dunia II.
Beberapa strategi telah dilakukan untuk menemukan senyawa
antibiotik baru. Kandidat yang Potential sebagai natural
antibiotics ditemukan dengan cara screening terhadap
spesies bakteri dan fungi yang memiliki aktivitas antimikroba.
Semi-sintetik antibiotik dibuat dengan cara memodifikasi
natural antibiotics
Obat Sintetik dirancang dengan mempelajari mekanisme
virulensi bakteri patogen
Pembentukan eritromisin
Oleh karena penggunaan antibiotik semakin
luas, prevalensi resistensi antibiotik oleh
bakteri sangat meningkat
Hasil evaluasi di Atlanta USA, 25% dari kasus
pneumonia oleh bakteri terbukti resisten
terhadap pensilin, sementara 25% lainnya
sudah resisten terhadap lebih dari satu
antibiotik.
Kasus retensi mikroba patogen menaikkan
dosis nya atau mengganti dengan antibiotik
baru
Resistensi Bakteri
Kasus resistensi yang meluas, memaksa para peneliti
untuk mencari dan mengembangkan antibiotik baru
agar memperoleh obat yang efektif dalam mengobati
penyakit infeksi yang disebabkan oleh bakateri
patogen.
Modifikasi antibiotik yang telah ada termasuk salah
satu usaha meningkatkan kinerja antibiotik
Terjadinya resistensi
Diperoleh melalui mutasi spontan
Vertical gene transfer
Lateral or horizontal gene transfer
(transduksi, transformasi atau konjugasi)
Inaktivasi enzim terhadap antibiotik
The first rule of antibiotics is try not to use them, and the second rule
is try not to use too many of them
Paul L. Marino, The ICU Book
Mekanisme resistensi pada bakteri
Bakteri menjadi drug-resistant melalui berbagai cara ,
salah satunya adalah dengan memproduksi enzim
yang dapat menginaktifkan molekul antibiotik yang
ada sehingga tidak lagi efektif membunuh bakteri
Kasus MRSA (Methicilin-Resistant Staphylococcus aureus)
Supergerm
Proses multiresistensi antibiotik
Beberapa contoh kasus resistensi
Penggunaan antibiotik dalam makanan ternak
merupakan salah satu penyebab resistensi
bakteri terhada antibiotik . Beberapa bakteri
yang ada dalam makanan (Foodborne), seperti
Salmonella, E. coli dan Campylobacter adalah
bakteri yang bersimbiosis dengan hewan ternak
sapi dan ayam.
Salah satu penggunaan yang salah : antibiotik untuk
mengatasi penyakit yg disebabkan virus
Usaha memerangi resistensi bakteri
Para peneliti mempelajari bentuk molekul dari enzim
yang dihasilkan oleh drug-resistant bacteria,
kemudian mencoba untuk mendesain "fighter
molecules" yang secara tepat dapat mendeaktifkan
enzim tersebut, sehingga bakteri akan sensitif
kembali terhadap antibiotik yang sama.
Mencari sumber antibiotik baru
The discovery of antibiotics
Untuk memerangi terjadinya kejadian
resistensi bakteri, industri farmasi harus selalu
mengembangkan penelitian bersama
perguruan tinggi dan lembaga penelitian
dalam menemukan antibiotik baru demi
mempertahankan efektivitas pengobatan
penyakit infeksi dengan antibiotik
Top 25 Biotechnol Company (2011)
Abbott Laboratories
Amgen, Inc.
AstraZeneca Pharmaceuticals
Bayer HealthCare Pharmaceuticals
Biogen Idec Inc.
Boehringer Ingelheim
Pharmaceuticals, Inc.
Bristol-Myers Squibb Company
Chiron Corporation
Eli Lilly and Company
Forest Laboratories.
Genentech, Inc.
Genzyme Corporation
Gilead Science, Inc.
GlaxoSmithKline LLC
Johnson & Johnson
Merck / Schering-Plough
Pharmaceuticals
MGI Pharma, Inc./ Eisai
Millennium Pharmaceuticals, Inc.
Mylan Pharmaceuticals Corporation
Novaris Pharmaceuticals Corporation
Pfizer
Roche Diagnostics Corporation
Sanofi-Aventis
Takeda Pharmaceuticals North America,
Inc.
Teva Pharmaceutical Industries Ltd.
Kebutuhan antibiotik sejak 1940 sampai
sekarang (Sumber : Timeline of Antibiotics)
Berbagai cara penemuan obat baru
Obat baru untuk TB
Setelah Percobaan klinik tahap I
dilanjutkan kepada tahap II dan III,
persetujuan dari Badan pengawasan
Makanan dan Obat (FDA) diberikan
kepada Antibiotik bagi TB itu kini
diberi nama diarylquinolones.
Diarylquinolone TMC207 merupakan
preparat baru yang mempunyai
potensi sebagai antituberculosis.
Mekanisme antituberculosis dari
diarylquinolone TMC207 ini adalah
dengan cara menghambat sintetase-
ATP dari kuman Mycobaterium.
Pegagan bahan alam untuk
mengobati TB
Centella asiatica
Tahapan pencarian antibiotik baru
Skrining awal kandidat antibiotik
(in-vitro, in-silico)
Uji mutagenitas (uji Ames)
Uji toksisitas (LD50)
Uji aktivitas antimikroba (MIC,MBC) (CLSI
method)
Uji potensi antibiotik (Kirby Bauer method)
Peneliti Norwegian meneliti new antibiotik baru dari bakteri
yang ada di laut sekitar perairan Norwegia. The Norwegian
University of Science and Technology (NTNU) dan Pusat
Penelitian SINTEF telah melakukan bioprospecting selama 5-6
tahun untuk mencari seenyawa-senyawa penting yang dihasilkan
oleh bakteri laut (marine bacteria). Bakteri-bakteri tersebut
dievaluasi fisiologi dan genetik nya, dilakukan screening modern
dan dicoba produksinya di laboratorium fermentasi
Metabolit sekunder untuk pertahanan
diri atau kompetisi dengan mikroba lain
Seleksi mikroorganisme
Mikroorganisme yang digunakan dalam proses fermentasi
biasanya bukan yang wild type. Umumnya telah dilakukan
modifikasi atau mutasi secara genetik untuk menghasilkan
galur mikroba yang unggul
Strain improvement (pemuliaan galur) dilakukan secara
fisik, kimia maupun rekayasa genetik
Mutasi fisik misalnya dengan penyinaran ultraviolet , x-rays
Mutasi kimia dengan senyawa kimia tertentu,
Mutasi biologi dengan cara gene amplification,dimana
beberapa salinan gen pengkode enzim yang terlibat dalam
produksi antibiotik yang dituju dapat diinsersikan ke dalam
suatu plasmid, lalu di insersi kan ke dalam sel host untuk
produksi.
Menguji aktivitas antimikroba
Perubahan morfologi pada Streptomyces.sp saat
diinduksi oleh senyawa atau molekul tertentu
Uji sensitivitas mikroba terhadap
beberapa antibiotik
Menggali potensi mikroorganisme
dalam penemuan obat baru
Perbaikan prosedur Culturing
Extremophiles
Endophytes
Mikroba laut
Biosintesis Kombinatorial
Perbaikan Prosedur Culturing
Perkembangan terbaru tentang teknik pengambilan
biakan dari alam (terutama dari laut dan tanah) (sea-
water and soil)
Gel-encapsulated single cells (gel micro-droplets =
GMDs)
Proses ini mencegah terjadinya over growth oleh
mikroba yang cepat tumbuh, dan dapat menstimulasi
pertumbuhan mikroba yang termasuk slow-growing
microbes
Mikroba yang sulit di biak kan secara in-vitro
Acuan dalam mengeksplor tanah untuk
menggali potensi mikroba nya serta guideline
untuk proses produksi
Extremophiles
Mikroba yang hidup dalam habitat yang
ekstrem, misalnya yang bersifat asidofil
(acidic sulfurous hotsprings) atau alkalofil
(danau yang bersifat alkali)
Mikroba termofil dan hipertermofil
Mikroba yang hidup dalam air yang
mengandung metal atau lingkungan dengan
polusi tinggi
Endophytes
Mikroba yang berasosiasi dengan tumbuhan
Dapat bersifat simbiosis atau patogenik
Banyak ditemukan senyawa bioaktif baru,
contoh:
kakadumycin dari endofit Streptomycete pada
tanaman Grevillea pteridifolia,
Endofit Aspergillus nidulans anti-cancer
agent
Mikroba laut
Sedimen laut dalam merupakan sumber yang
potensial karena terdapat bakteri Actinomycete
yang unik , misalnya Salinospora yang
menghasilkan senyawa Salinosporamide A
suatu inhibitor proteasome yang sangat poten
Endo-symbiosis antara fungi dan bakteri :
Rhizopus dan Burkholderia menghasilkan
senyawa Rhizoxin , semula dikembangkan
sebagai pest-control, lalu menjadi anticancer drug
Biosintesis Kombinatorial
Penggalian informasi tentang peran dan fungsi PKS
(Polyketide Synthase Enzymes) dan gen nya pada
beberapa bakteri
Peran dan fungsi NRP (Non-Ribosomal peptide
synthetase)
Kombinasi informasi ini dapat diarahkan kepada
sintesis senyawa baru melalui proses rekayasa
genetik
Contoh : sintesis Epothilone dari myxobacterium
Sorangiumcellulosum
Bagaimana produksi antibiotik /obat
baru setelah ditemukan kandidat nya?
Pengembangan skala lab
Pengembangan skala pilot
Pengembangan skala industri
Antibiotik diproduksi dalam skala industri
melalui proses fermentasi atau total sintesis
kimia atau kombinasi kedua nya
Proses Fermentasi dengan menggunakan
inokulum mikroba minimum dalam large
containers (100,000150,000 liters or more),
dengan pengaturan oksigen dialirkan ke dalam
medium cair, pengaturan suhu dan pH.
Oleh karena antibiotik adalah metabolit
sekunder, jumlah nya harus dikontrol dengan baik
untuk mendapatkan hasil yang optimal. Setelah
proses produksi selesai, antibiotik yang terbentuk
harus diekstraksi, isolasi, dan dimurnikan.
Berbagai cara pemurnian telah dikembangkan
antara lain melalui cara kromatografi penukar
ion, adsorpsi, atau pengendapan kimiawi .
Cara sintesis kimia melibatkan reaksi berantai
yang menggunakan pelarut organik, katalis dan
proses kimia lainnya.
Tahapan dalam proses fermentasi
Formulasi medium untuk mikroorganisme
Sterlisasi medium dan persiapan lainnya
Produksi yang aktif dan inokulasi kultur murni
Ekstraksi produk dan pemurnian
Penanganan produk limbah (effluent)
Proses fermentasi secara umum :
contoh Sacharomyces cereviseae
Sistem kultur untuk pertumbuhan dan produksi
menggunakan mikroorganisme
Sistem batch (kultur curah)
Sistem fed-batch (kultur curah umpan)
Sistem continuous (kultur sinambung)
Batch Fed-batch
Continuous
Fermentor
Kontrol pada proses fermentasi
contoh : produksi Sefalosforin
Modifikasi sruktur antibiotik kuinolon
MODIFIKASI EFEK
Satu atom Fluor di posisi C-6 Meningkatkan aktivitas inhibisi DNA
girase
Atom Fluor kedua pada posisi C-8 Meningkatkan absorpsi , memperpanjang
waktu eliminasi, memingkatkan
fototoksisitas
Gugus Piperazin pada posisi C-7 Meningkatkan aktivitas terhadap bakteri
Gram negatif Staphylococci dan
Pseudomonas
Alkilasi cincin C-7 Memperbaiki aktivitas terhadap bakteri
Gram positif
Gugus metil pada atom N di cincin C-7
piperazin
Meningkatkan eliminasi dan memperbaiki
bioavalibilitas
Uji bakteriostatik dan bakterisida
KLT untuk identifikasi kandungan metabolit
sekunder dari biakan mikroba
Proses PCR dilanjutkan dengan Elektroforesis
1 2 3 4 5
NOTE :
1. DNA marker /HindIII/EcoRI
2. DNA plasmid pSTA14 (isolated)
3. DNA plasmid pSTA14 (PCR product/ positive control)
4. DNA transformants (PCR product with plasmid)
5. DNA mutant (PCR product / negative control)
Conclusion : gene niaD in pSTA14 plasmid proved
existed in transformant cells
811 bp
546,15 bp
KONDISI DI INDONESIA
Bidang usaha kefarmasian nasional masih
didominasi oleh perdagangan (trading), dan
masih sangat lemah dibidang manufakturing
Perusahaan farmasi lokal, yang sampai saat ini
berjumlah 344 masih terkonsentrasi pada
pengembangan formula, yang bahan baku
obatnya 95% masih diimpor
Untuk pasar antibiotik, amoksisilin masih
merupakan kebutuhan tertinggi
Sumber :
Kebutuhan tahun 2007: Amoksisilin 892,7 ton;
Ampisilin: 79,8 ton; Sefalosporin dan derivatnya 260
ton (Data Deputi I Badan POM)
Baru satu industri di Indonesia yang memproduksi
amoksisilin dengan bahan baku diimpor dari China
(6-APA dan Dane Salt)
Perlunya kemandirian nasional dalam pemenuhan
kebutuhan amoksisilin
Sumber :
Fakta dan Data
NO JENIS ANTIBIOTIK JUMLAH PRODUKSI (Kg) PRESENTASE (%)
1 Amoxicillin 892,713.21 72.54
2 Cefadroxil 224,775.96 18.26
3 Ampicillin 79,763.39 6.48
4 Cefotaxime 13,148.97 1.07
5 Ceftriaxone 13,039.53 1.06
6 Cefixime 3,234.18 0.26
7 Cefuroxim 1,623.03 0.13
8 Cefotiam 1,319.63 0.11
9 Ceftazidime 682.55 0.06
10 Cefradin 371.61 0.03
Produksi Sepuluh Antibiotik Terbesar (2007)
Sumber :
Biosintesis penisilin dan turunannya (Ferreira et al., 2000)
Sumber :
Topik Penelitian dengan Mahasiswa S3 di
Sekolah Farmasi ITB
Fermentasi antibiotik Sefalosporin dan Pemuliaan galur
Cephalosporium acremonium dengan cara mutasi sinar uv
Produksi antikolesterol (Lovastatin) dari Aspergillus terreus dan
Monascus purpureus dengan cara fermentasi
Pemuliaan galur Aspergillus terreus melalui fusi protoplast, copy
gen produksi.
Studi Transformasi genetik Monascus purpureus.
Studi protein spesifik dari Mycobacterium tuberculosis untuk
mencari kandidat vaksin baru untuk penyakit TBC
Fermentasi dan modifikasi pigmen karotenoid dari jamur oncom
Neurospora sp. untuk pewarna obat, makanan dan kosmetika
Produksi Plantaricin dari Lactobacillus plantarum sebagai anti
Candida albicans
Contoh Topik Penelitian Mahasiswa S1 dan S2 di
Sekolah Farmasi ITB dalam rangka pencarian
senyawa antimikroba
Antibacterial Activity of Cinnamomum cassia L.
Barks and Salvadora persica L.
Heartwood Extracts Against Dental Caries Bacteria
Marlia Singgih, Irda Fidrianny, Khaliesah Aimi Kamal Ariffin
ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF ETHANOL EXTRACT OF
INDONESIAN TEA LEAVES (Camellia sinensis L.) AGAINST
Streptococcus mutans ISOLATED FROMDENTAL CARIES
PATIENTS
MarliaSinggihWibowo, IrdaFidrianny, NovritaLestiaUtami
AKTIVITAS ANTIMIKROBA REMPAH REMPAH
TERHADAP BAKTERI PATOGEN PADA MAKANAN
KERANG LAUT
Marlia Singgih, Amanda Bernadine
FORMULASI SAMPO ANTI KETOMBE YANG
MENGANDUNG
TEA TREE OIL DAN PENGUJIAN AKTIVITAS SEDIAAN
TERHADAP MALASSEZIA FURFUR
Jessie S.Pamudji, Marlia Singgih, Angelia
Mol. Nutr. Food Res. 2008, 52, 000 000
DOI10.1002/mnfr.200700282
Research Article
Identification and quantification of
methylglyoxal as the dominant antibacterial
constituent of Manuka (Leptospermum
scoparium) honeys from New Zealand
Elvira Mavric, Silvia Wittmann, Gerold Barth, and Thomas Henle
Institute of Food Chemistry, Technische Universitt Dresden, Dresden,
Germany
Institute of Microbiology, Technische Universitt Dresden, Dresden, Germany