rea de microbiologa:

Anlisis de microorganismos y patgenos en alimentos.

El laboratorio para el anlisis microbiolgico trabaja con productores alimentarios
de gran distribucin alimentaria para garantizar que sus productos alimentarios
estn libres de microorganismos nocivos para la salud, garantizando de esta forma
la calidad y seguridad de los alimentos en el mercado as como la satisfaccin del
consumidor y su imagen de marca. El laboratorio para el anlisis microbiolgico en
alimentos cuenta con amplia experiencia en la industria alimentaria que le ayudan
a realizar los siguientes anlisis microbiolgicos en alimentos:
Anlisis de microorganismos indicadores en alimentos:
Mesfilos aerobios (recuento de placa de aerobios 30C), ISO 4833:2003
Mohos y levaduras, ISO 21527-1:2008
Coliformes totales, ISO 4832:2006
Anlisis de microorganismos indicadores de contaminacin fecal en
alimentos:
Coliformes fecales, ISO 4832:2006
E.coli, ISO 16649-2:2001
Enterobacterias, ISO 21528-2:2004
Clostridia perfringens, ISO 7937:2004
Estreptococos fecales
Anlisis de patgenos en alimentos:
Campylobacter
Clostridia perfringens, ISO 7937:2004
E.coli, ISO 16649-2:2001
Listeria, ISO 11290-1:1998+A1:2004
Salmonella, ISO 6579:2002
Estafilococo aureus, ISO 6888-1:1999+A1:2003
Shigella, ISO 21567:2004

Vibrio cholerae, ISO 21872-1:2007

Vibrio Parahaemolyticus, ISO 21872-1:2008
Bacillus cereus, ISO 7932:2004
Pseudomonas, ISO 13720:2010
Otros anlisis microbiolgicos de alimentos incluyen:
Clostridios sulfitorreductores, ISO 15213:2003
Bacterias cido lctica / Lactobacillus, ISO 15214:1998
Recuento en placa de anaerbios mesfilos
Recuento en placa de esporas anaerbias
Recuento en placa de esperas aerbias
Recuento de Listeria, ISO 11290-2:1998+A1:2004
Estabilidad y esterilidad, NP 4404-1 / NP 2309-2
-Instrumentos:
Incubadora
En microbiologa, una incubadora es un dispositivo
que sirve para mantener y hacer crecer cultivos
microbiolgicos o cultivos celulares. La incubadora
mantiene la temperatura, la humedad y otras
condiciones en grado ptimo, tales como el
contenido de dixido de carbono (CO2) y de
oxgeno en su atmsfera interior. Las incubadoras
son esenciales para una gran cantidad de trabajos
experimentales en biologa celular, la
microbiologa y en biologa molecular y se utilizan
para cultivos celulares, tanto bacterianos como de clulas eucariotas.
Las incubadoras son tambin utilizadas en la industria de cra de aves de corral
para que acten como un sustituto de las gallinas en el proceso de incubacin de
los huevos fecundados. Esto se traduce a menudo en tasas de eclosin muy altas
debido a la capacidad de controlar la temperatura y la humedad. Varias marcas de
incubadoras estn disponibles en el mercado para los ganaderos.

Estructura
La forma ms simple de incubadora es la de una caja isotrmica con un sistema
de calefaccin y termostato ajustable, que por lo general se regula con una
temperatura entre 60 y 65 C (de 140 a 150 F), aunque algunos modelos pueden
regularse a mayores temperaturas (generalmente menor de 100 C). La
temperatura ms utilizada, tanto para cultivo de bacterias como de E. Coli, de uso
frecuente, as como de clulas de mamferos es de aproximadamente 37 C, ya
que estos organismos se desarrollan bien en esas condiciones. Para otros
organismos utilizados en los experimentos biolgicos, como la levadura
Saccharomyces cerevisiae, para la cual es ptima una temperatura de crecimiento
de 30 C.
La mayora de las incubadoras de laboratorio tambin poseen la posibilidad de
bajar la temperatura (a travs de la refrigeracin), o la capacidad de controlar los
niveles de humedad o de CO2. Esto es importante en el cultivo de clulas de
mamferos, donde la humedad relativa es normalmente es del 95% y se consigue
un pH ligeramente cido manteniendo un nivel de CO2 del 5%.
La mayora de las incubadoras incluyen un cronmetro, y algunas tambin pueden
ser programadas para realizar un ciclo a travs de diferentes temperaturas,
diferentes niveles de humedad, etc. Las incubadoras pueden variar en tamao
desde una mesa a unidades del tamao de una habitacin pequea.
Hay maneras de sustituir una incubadora, cuando no est disponible. El famoso
cientfico Louis Pasteur utiliz como incubadora un pequeo hueco debajo de la
escalera.
La temperatura mxima para la esterilizacin es 200 C.

Tipos de incubadora:
INCUBADORA SECA: Cuando no disponemos
de un recinto cuya temperatura asegure el
crecimiento celular, es necesario adquirir una
incubadora seca equivalente. Incluso con una
habitacin caliente, a veces es conveniente
tener una incubadora para tripsinizacin. La
incubadora debe tener un tamao adecuado,
unos 50-200 L por usuario, y debe tener
circulacin de aire forzado, control de

temperatura de 0,2 C, y un termostato de seguridad que apague la incubadora

si se sobrecalienta o, mejor an, que regule la incubadora si el termostato no
funcionase correctamente. La incubadora debe ser resistente a la corrosin (por
ejemplo, el acero inoxidable o el aluminio anodizado resultan aceptables para una
incubadora seca), y deben ser fciles de limpiar.

Una incubadora de cmara doble, o dos incubadoras apiladas, una encima de la

otra, independientemente reguladas, son preferibles a una sola incubadora de
gran tamao, ya que pueden acomodar ms cultivos celulares con mejor control
de temperatura, y si una de las dos no funciona o necesita ser limpiada, la otra
todava puede ser utilizada. Muchas incubadoras tienen una camisa exterior de
agua caliente para distribuir el calor uniformemente alrededor de la caja, evitando
as la formacin de zonas fras. Estas incubadoras tambin mantienen su
temperatura ms tiempo en el caso de un fallo del calentador o un corte de
energa elctrica. Sin embargo, el aislamiento de alta eficiencia y los elementos
difusores de la superficie del calentador han eliminado la necesidad de esa camisa
de agua y han conseguido que la estructura de la incubadora sea mucho ms
simple.

Los estantes de las incubadoras suelen estar perforados para facilitar la

circulacin de aire. Sin embargo, las perforaciones pueden dar lugar a
irregularidades en la distribucin de clulas en cultivos monocapa, con variaciones
en la densidad celular siguiendo el modelo de aberturas en los estantes. Las
variaciones pueden deberse a las corrientes de conveccin generadas en los
puntos de contacto en relacin con los agujeros en el estante, o pueden ser
relacionados con las reas que se enfran ms rpidamente cuando se abre la
puerta. Aunque esto no es un problema en general, los frascos y las placas de
cultivos deben ser colocados en una baldosa aislada o en una bandeja de metal,
para aquellos experimentos en los que la densidad uniforme sea importante.
Interior de una incubadora de CO2 como las
empleadas en cultivos celulares.

Incubadora hmeda de CO2:

Aunque los cultivos celulares pueden ser incubados
en frascos sellados en una incubadora seca o en una

Interior de una incubadora de CO2 como las

empleadas en cultivos

celulares.

habitacin caliente, algunos recipientes, por ejemplo, las placas de Petri o las
placas de pocillos mltiples, requieren de un ambiente controlado con una
humedad alta y una presin parcial de CO2 elevada. La manera ms barata de
controlar la fase gaseosa es colocar los cultivos en una caja de plstico o en una
cmara (Bellco, MP Biomedicals), aadir al recipiente la mezcla correcta de CO2 y
luego sellarlo. Si la incubadora no est totalmente llena de placas, incluir un
recipiente abierto con agua permite aumentar la humedad dentro de la cmara.
Las incubadoras de CO2 son ms caras, pero su facilidad de uso y un control
superior de la presin de CO2 y de la temperatura justifican el gasto (los frascos
anaerbicos y los desecadores tardan ms en calentarse).Una atmsfera
controlada se logra mediante el uso de una bandeja de humidificacin y el control
de la presin de CO2 con un dispositivo de monitorizacin del CO2, que extrae el
aire de la incubadora en una cmara de muestra, determina la concentracin de
CO2, e inyecta CO2 puro en la incubadora para compensar cualquier deficiencia.
El aire circula alrededor de la incubadora por conveccin natural o mediante el uso
de un ventilador para mantener uniformes tanto el nivel de CO2 como la
temperatura. Se afirma que las incubadoras con ventiladores se recuperan ms
rpido despus de la apertura, a pesar de que las incubadoras de conveccin
natural tambin consiguen una recuperacin rpida y reducen considerablemente
los riesgos de contaminacin.Las incubadoras de paredes calientes secas tambin
sufren una menor contaminacin por hongos en las paredes, porque las paredes
tienden a permanecer secas, incluso con una humedad relativamente alta.
Algunos controladores de CO2 deben ser ajustados cada pocos meses, pero el
uso de hilo de oro o detectores de infrarrojos minimizan las desviaciones y muchos
modelos restablecen el cero del detector de CO2 de forma automtica. El tamao
de la incubadora requerida depender del uso previsto, tanto el nmero de
personas que lo usan como los tipos de cultivos.
Un incubador de este tipo dispone de:

Dispositivos de control de temperatura, con termostato de seguridad.

Dispositivo de inyeccin de una mezcla de aire y CO2, en la proporcin
deseada, entre el 4 y el 7 %, controlado mediante un dispositivo IRGA
("infra-red gas analyzer").
Dispositivo de control de la humedad ambiente. La mejor forma consiste en
inyectar agua estril y filtrada.
Dispositivo de recirculacin de aire con filtros HEPA intercalados.

CMARAS DE CULTIVO

Se coloca un rtulo en el exterior, indicando la temperatura a la que deben

mantenerse. Algunos modelos suelen ser muy sensibles a las variaciones
diarias de la temperatura ambiente y se deben adoptar las precauciones
necesarias, especialmente en verano.
La temperatura interior se debe observar con uno o ms termmetros,
segn el tamao de la estufa. Las cmaras grandes sufren menos
fluctuaciones de temperatura que la
pequeas . El margen de tolerancia es de + 1 a 2C. El termmetro de
inmersin parcial, con un intervalo de graduacin de 0,1C, debe estar
inserto en un tubo con agua
cuya boca estar sellada con masilla para evitar la evaporacin. Todos los
termmetros deben calibrarse una vez al ao .
Para cultivos a 15-20C se requiere ms bien un refrigerador antes que una
estufa, pero algunas cmaras tienen ambas cualidades con controles de
calentamiento y enfriamiento.
Los recipientes con los cultivos deben estar claramente etiquetados con el
nombre del analista y la fecha y hora en que se introdujo. Los cultivos que
deben incubarse durante 3 a 7 das se colocan dentro de bolsas plsticas
junto a un vaso con agua para mantener la humedad .Todo derrame que se
produzca dentro de una cmara se debe absorber y desinfectar de
inmediato. Por lo menos una vez al mes se debe limpiar en interior de las
cmaras.

BAO DE AGUA
Se emplea toda vez que se deba mantener la temperatura dentro de un
margen de tolerancia de + 0,2C. Se carga con agua destilada para evitar
depsitos calcreos, excepto los que estn conectados al grifo de agua
corriente porque tienen un dispositivo que mantiene el nivel constante. La
tapa tiene que estar bien ajustada para impedir una excesiva evaporacin.
Si no se utilizar en dos semanas, se drena el agua, se lava y seca el
interior. Se debe inspeccionar con frecuencia para impedir o retrasar los
daos causados por la corrosin.
La temperatura se suele controlar despus de un perodo de estabilizacin
de 3 horas, con un termmetro de inmersin total cuyo intervalo de
graduacin es de 0,1C. Generalmente se utiliza a 44,5 - 45,5C, rango en
el cual un cultivo deEscherichia coli incubado durante 24 hs produce gas y
el de Enterobacter aerogenes no lo forma en el medio EC (triptona 20g,
lactosa 5 g, sales biliares 1,5 g, fosfato dipotsico 4 g, fosfato
monopotsico 1,5 g, cloruro de sodio 5 g) .
REFRIGERADOR Y CONGELADORA

El refrigerador se debe mantener a una temperatura de menor a 5C. El

exterior se limpia por lo menos una vez al mes y el interior del equipo
desconectado cada tres meses. Se vigila con termmetros de inmersin
para baja temperatura cuyo intervalo de graduacin es de 1C.La
congeladora se mantiene a una temperatura de -20C y se debe
desconectar y limpiar cada seis meses. Todos los recipientes tienen que
llevar rtulos con el tipo de material, el nombre del responsable y la fecha
de depsito.
Todo funcionamiento defectuoso de los aparatos del laboratorio y las
reparaciones realizadas deben ser documentadas.
AUTOCLAVE
Es preferible el modelo de carga horizontal. Conviene que posea un
termmetro calibrado para medir una temperatura interna de 120C (2), el
uso de un manmetro de presin no es til a alturas superiores a los 900 m
snm porque ya no coincidir la temperatura interna con la escala dada por
los fabricantes a nivel del mar .El interior de la cmara de esterilizacin se
debe limpiar todos los das. Semanalmente se lava el desage de la
cmara y el generador de vapor, y se verifican las seales de control y el
estado del aparato. Todos los meses se lubrica la bisagra de la puerta de la
cmara y trimestralmente se inspeccionan las juntas de la puerta y la
vlvula de purga. Se debe utilizar agua
con baja dureza .
En caso de que e disponga del clsico autoclave de Chamberland (tipo olla
a presin) hay que considerar que el vapor saturado a una presin absoluta
de 2,02 kg/cm2 tiene una temperatura de 120C, y la presin absoluta es la
suma de la presin atmosfrica del lugar ms la presin indicada por el
manmetro. Cuanto mayor sea la altura sobre el nivel del mar, ms baja es
a presin ambiente y mayor la presin que debeindicar el manmetro para
alcanzar la temperatura de esterilizacin, por ejemplo la lectura
manomtrica en San
Salvador de Jujuy y en Salta debe ser de 1,2 kg/cm2, y de 1,4 kg/cm2 en
Abra Pampa (5).
Se debe registrar en cada ciclo de esterilizacin, la temperatura y el tiempo,
los materiales, la presin mxima alcanzada, la fecha y la hora de comienzo
y finalizacin .
La eficacia se controla mediante el mtodo indirecto de colocar una ampolla
con esporos de Geobacillus stearothermophilus, los que deben estar
muertos luego de cumplir el ciclo de esterilizacin. Todas las semanas se
vaca la caldera y trimestralmente se inspeccionan la vlvula de purga, la
junta de la tapa y las arandelas de los tornillos de cierre, reemplazndolas
cuando fuere necesario.

ESTUFA U HORNO DE ESTERILIZACIN

Se emplea para la mayora del material de vidrio. Se registra el mateial
tratado, el tiempo y la temperatura en cada ciclo de esterilizacin.
Peridicamente se hace un control de esterilidad del material de vidrio
tratado
El horno debe tener un termmetro calibrado que registre temperaturas
entre 160 y 180C. Se deben vigilar diversos puntos internos con
termmetros para altas temperaturas cuyo intervalo de graduacin no
supere 1C. Todos los meses se deben limpiar las superficies internas y
externas.
Balanza
El laboratorio debe estar equipado con una balanza de 200- 300 g de
capacidad y una sensibilidad de 0,1 g, y otra con un capacidad de 100-150
g y una sensibilidad de 1 mg. Cada vez que se usan se debe limpiar los
platillos de pesada. La exactitud de las balanzas debe verificarse cada tres
meses con pesas calibradas. Conviene que anualmente un representante
del fabricante haga una limpieza y calibracin de la balanza analtica de alta
precisin.
PHMETRO
Es preferible usar un medidor de pH antes que las tiras indicadoras para los
medios rehidratados, las soluciones y otros materiales, pero para productos
con pH <4,0 es aceptable el empleo de los papeles indicadores (3).
Si el aparato es nuevo se deben seguir las instrucciones del fabricante para
su puesta en marcha. Los electrodos necesitan cuidados especiales.
Cuando se transfieren de una solucin a otra, se deben enjuagar con la
segunda solucin y con agua desmineralizada al terminar el trabajo. El
procedimiento de almacenamiento depende del tipo de electrodo, los de
vidrio deben colocarse en una solucin reguladora neutra, para los de
referencia se usa una solucin de cloruro de potasio 0,1 M. Los pHmetros
se controlan antes de cada uso con soluciones reguladoras de pH 4,0, 7,0
y 10,0. Hay que dejarque las muestras y soluciones alcancen la misma
temperaturaantes de de efectuar las mediciones.
Con el uso o el tiempo la eficiencia de un electrodo sereduce. Deber
limpiarse la punta con cido clorhdrico 0,1 M,luego con solucin de EDTA,
terminando con acetona o metanol. Si las lecturas errticas persisten se
debe a otra causas y probablemente haya que sustituirlo
CAMPANA DE FLUJO LAMINAR
De preferencia el flujo debe ser vertical, provisto de un filtro HEPA que
elimine partculas < 0,3 m de dimetro. Deben ponerse en marcha slo
cuando vaya a ser utilizada. No

se recomienda el empleo de mecheros dentro de la campana pues

provocan una columna ascendente de aire ms intensa
que el flujo descendente de aire filtrado .
En una cmara de flujo laminar (o de seguridad tipo II) elrededor del 70%
del aire es reciclado a travs de los filtros de manera que el rea de trabajo
es baada por aire casi estril.Pero algo del aire (alrededor del 30%) sale a
la atmsfera y es reemplazado por una cortina de aire ambiental que entra
por la cara frontal del equipo. Esto previene el escape de cualquier partcula
o aerosol generado durante el trabajo fuera de la cmara cultivos hacia el
filtro absoluto que permite liberar aire limpio a la atmsfera. El flujo de aire
se debe mantener entre 0,7 y 1,0 m/s, y si no se alcanza este nivel los
filtros deben ser cambiados. La eficiencia de toda cmara depende del
mantenimiento adecuado.
El interior de la campana se debe limpiar y desinfectar despus de usarla.
La eficiencia de la desinfeccin puede controlarse mediante el mtodo de
contacto directo.
Los filtros se deben revisar todos los meses para detectar obturaciones o
acumulacin de suciedad, y cambiarlos segn sea necesario. El
rendimiento de los filtros se verifica exponiendo al aire una placa de agar
para recuento durante 1hora y despus de la incubacin prcticamente no
debe haber colonias. Si tres ensayos sucesivos indican la presencia de
contaminacin, se considera que la campana funciona deficientemente y se
recurrir al servicio tcnico especializado.
La lmpara fluorescente se limpia cada dos semanas cun pao suave
humedecido en alcohol. Cada tres meses hay que controlar la lmpara
ultravioleta germicida, si emitemenos del 80% de la intensidad terica debe
ser reemplazada.
Se debe encender 10 minutos antes de utilizar la campana,estando sta
vaca , y apagarla al hacer los anlisis.
MICROSCOPIO
Es preferible un microscopio estndar binocular, con objetivos y oculares
que proporcionen aumentos de 40x, 100x,400x y 1000x aproximadamente,
un condensador con una abertura numrica de 1,25, un diafragma iris y el
sistema deiluminacin montado en la base. En los laboratorio que lleven a
cabo procedimientos con colorantes fluorescentes, es imprescindible un
microscopio de fluorescencia (2).
Una lupa binocular es conveniente para el examen de lamorfologa del
cultivo y facilita el repique en una placaatestada de colonias .
Deben colocarse en una superficie exenta de vibraciones yno es
conveniente cambiarlos de emplazamiento. Cuando no se utilicen se cubren
con una funda para evitar el polvo.

Los lentes se deben limpiar, despus de usarlos, con papel para lentes o
algodn muy suave.
-Conclusiones:

La informacin y el estado de las muestras que van a ser analizadas influye

de modo muy importante en su validez y por tanto en la calidad de los
resultados obtenidos. Por consiguiente, la toma de muestras debe
realizarse con tanto cuidado como el propio anlisis. La operacin de
muestreo debe ser organizada de antemano con todos los instrumentos
yenvases estriles a mano .
Siempre que sea posible, se eligen cinco o diez unidades del mismo
producto segn el plan de muestreo. Se mezclan y toman muestras de cada
una de estas unidades con cucharas o cuchillos estriles.
Todas las fases (acuosa, grasa, granular, etc.) deben estar representadas.
Se registra la temperatura, el estado y las caractersticas especiales de las
muestras. Las muestras de un lote de alimento preparado a escala
industrial se eligen aleatoriamente y se obtienen al menos diez, siempre
que sea posible.
Cuando el muestreo no es realizado por el analista, es esencial disponer de
un registro escrito que responda de la integridad de la muestra entre el
momento de recoleccin y la utilizacin definitiva.

http://www.unsa.edu.ar/biblio/repositorio/malim2007/6%20calidad%20analitica.pdf