3 CHUONG 3: TONG QUAN VE SAC KY LONG" 3.1 PHUONG PHAP SAC KY LONG HIEU NANG CAO (HPLC) HPLC li mot phrong phap tach va phan tich céc hop chat duge sir dung rong rai va phd bién nat hign nay vi nhiéu i do: c6 6 nhay tuong déi cao, cé kha ning dinh Iugng tét, thich hgp cho vige tach cde hop chat khé bay hoi hojic dé bj phan hity nhiét, cd pham vi img dung trai rng trong niu link vye tir nghién ciru khoa hoe trong ede phing nghiém dén cong nghigp va mot 6 tinh vye khée. Hop chat c6 thé phan tich bing sic ky long nhu acid amin, protein, acid nucleic, hydrocacbon, carbohydrate, thuée khang sinh, thude trir su, cde hgp chit v6 co... Dua ‘yao su khae nhau vé co ché chiét tach sir dung trong sic ky long higu nang cao ma nguéi ta cé thé phan chia né ra Lim cac loai: sic ky hap phy, sic ky phan bd, sic ky ion, sic ky ray phan tir... trong 46 sic ky phan bé duge tmg dyng rong rai va phé bién. Tay theo 46 phan cyc pha tinh va dung méi pha dong, ngudi ta phan bigt: ky long pha thudng va sic ky long pha dio. + Sée ky long pha thuong: pha tinh c6 46 phin eye cao hon 49 phan cuc ciia dung méi pha d6ng, ding dé tach va phan tich cic hgp chat c6 49 phan cyc cao voi phan tir lugng khong Ién Lim. . Séec ky long pha déo: nguge véi sic ky pha thuéng, pha tinh cé 46 phan cyc thdp, pha dng cé d6 phan cye cao hon, Phuong phap nay ding dé phan tich cde hgp chat tir Khong phan eye dén phan cue vita, Dung méi sit dung 1d dung m6i phn cue, trong 46 nude déng vai trd quan trong ma lai ré tién, do 46 sic ky long pha dao duge sit dung nhigu nat. 3.2. CAC THONG SO CUA PHUONG PHAP SAC KY LONG 3.2.1 H6 sé phan bé- Can bing cia m@t cdu tir trong hé sic ky c6 thé duge mé ta bing phuong trinh don sii sau: A pha dong <> A pha tinh4 H@ s6 cn bang K cho cn bang nay duge goi la ti 1g phan bé va duge tinh nhu sau: ce x= Cw Cs: néng 46 edu tir trong pha tinh: Cm: ndng d6 cdu tir trong pha dgng S: Pha tinh M: Pha dong K ty thuge ban chit pha tinh, pha dng va chit hda tan, K nho: chat di chuyén nnhanh; K I t di chuyén cham, Théng thudng K > 1 dé chit 06 di Ive véi pha tinh néu khong thi né sé di chuyén nhanh qué lam cho khé téch, Hai chit muén tach ra khéi nhau thi phai c6 K khée nhau, 3.2.2 Thoi gian liu ty oy uty) ——— te time La théi gian dé chat phn tich sau khi tiém vao c6t dén dau do duge tinh theo céng thite: trot tty th: thoi gian uu chét cia cau tir khng bj gitt lai trén Ot, duge tinh gan ding theo cong thite: 0,5xL (de)? trong d6: L; chiéu dai ct, em1s de: dung kinh et, em V: toe d6 dong pha dong, mL/phiit C6 thé nhan danh chat théng qua théi gian luu vi trong diéu kign thi nghiém trén cot thiét bi sic ky long nhdt dinh, thoi gian liu ciia chat d6 18 mot dai luong xéc dinh, ‘Théi gian uu cng lén thi hé sé phn bé cang lén. 3.2.3 Hé sb dung Ingng BE mo ta t6 46 lau cia edu tir phan tich trong c6t ngudi ta sir dung mot hé quan trong goi lé hé s6 dung long k’ Vs: thé tich pha tinh, ‘Vi: thé tich pha dong Kk’ c6 thé tinh theo cong thie ke phai > 1 dé peak ciia chit tan tach khéi peak cua dung méi nhung khéng qué Jon vi hic 46 thd gian phan tich s& kéo dai va mai bj ti do chit 6 trong c6t qué tau. Khoding k’ ly twéng la tir2 dén 5 nhung khi phan tich mot hdn hgp phite tap ching ta c6 nan k’ trong khang tir 0,5 dén 20. K° tang hoge gidm tiy thude 4 manh ciia dung méi pha dong. Trong séc ky phan 'bé pha dao nguge, d manh cita dung méi ting theo phan tram chat hifu co. Théng thudng trong sic ky phin bé pha dao ngugc, khi giam dung méi hitu co trong pha dng 10% thi k’ sé ting lén gap 2 dén 3 lan. 3.2.4 Higu ning Khi néi dén higu nang cia cGt 1a néi dén kha ning tich mii sic ky cia mOt cau tir trén c6t. D6 higu nang N duge biéu dién nhu sé dia ly thuyét cua c6t. N cing lon higu ning tich cia e6t cing lén. N -= =e) . sa(e)16 Voi W: bé rng miii sic ky Win: bé rong cua mii 6 phan nita chiéu cao ‘86 dia ly thuyét cang lon, bé réng W cing nhé, mii cing nhon. 3.2.5 BG chon loc aun. Ka Ky, Ky Kz _t~tw Ky tnty D6 chon loc a Li mét thong sé rdt quan trong, lién quan t6i kha nang téch cia cdc cu tir cdin phan tich, né tay thudc ban chit cia pha tinh, pha dong. Hai chat tach duge khi a # 1 va a cing l6n, kha nang tich cang cao. 6 nhi PH ciia mdi truéng, ban chat cia pha tinh, nk anh hwéng dén 4§ chon Ic nhy thanh phan dung méi pha dong, 49, Trong d6 sit thay di pha dng tir «dung méi nay sang dung mi khéc sé lim a. thay déi ding ké 3.2.6 D9 phiin gid 1 phan giai (R,) ty thude vao digu kign pha ding, pha tinh va dc tinh cia hop cht cdin phan tich ma ta c6 duge sic ky 3 véi nhiing mii pho 1én nhau hode tach hin nhau, Dé phan giai R, 1 mét théng sé ding 48 dénh gia mite d6 tach phé, kha nang tach cca cdc mili sic ky s® 06 y nghia quan trong trong vige phan tich mot edch dinh hugng. tr, ~try th 2 Phuong trinh trén thich hgp cho vige tinh R, khi 2 mii tich hin nhau (R, > 1,5). R, Trong trudng hep R, nhé hon, tire mai bj tring khé khan hon 1a Wi(1) va Wia(2) hic nay R, sé duge tinh theo: i vige xée dinh W; va W2 sé baat WH, Rs=118%. FanKhik’ x(a-tnv S) Ral é c6 thé phan tich m6t cach dinh lugng thi 2 mii ké nhau phai tach hin nhau, tire: R,> 1,3. Khi R, < 1 cn phai thay cdc théng sé thye nghigm dé lam ting R,, ‘Tom lai: khi tién hanh mét quy trinh phan tich bing sic ky long higu nang cao, thi cin cha ¥ téi kha nding phan téch cia cdc mii trén sic ky dé. Cé nhidu yéu té anh hudng én phép xéc dinh va ty theo yéu ciu can phan tich dinh tinh, dink Iuong hay bin dinh Iugng ma ching ta sé t6i wu hoa cc thng s6 the nghigm eiia pha tinh cing nhu pha Ong cho hgp chat cin nghién ciru. 3.3 GIO THIEU CAC BQ PHAN CUA THIET BI SAC KY LONG HIEU NANG CAO Thiét bj sic ky long higu ning cao bao gdm cac bé ph§n chinh: bom, b6 phéin tiém miu, c6t sic ky phan tich, diu dd, b6 phan diéu khién va xit ly 86 ligu. Hinh 10: Mé hink eo bén eta HPLC. ‘Nguyen ly hogt ¢6ng: miu sau ki duge tiém vo c6t s8 duge pha dong I6i kéo qua c6t. Dya vao kha nang tuong téc khde nhau gitta cdc chdt c6 trong nén mau voi pha tinh vv pha dng ma chiing duge tich ra khéi nhau va sau khi ra khOi c6t sé duge ghi nhén boi 'b9 do eu thé.18 Sie ky long cé thé ghép véi nhiéu logi dau dd khéc nhau nhu dau dd phé tir ngoai kha kién UV-Vis, dau dé huynh quang FLD, du dé chi s6 khiic xa RID, dau dé dign hoa ECD, dau dé khéi phd MS... Hign nay diu do khéi phé duge tmg dung rong rai trong phan tich vét va cae hgp chat nhn danh chinh xéc. Tiy theo tinh chat cla chat cdn khdo sat ma ta c6 thé chon Iya pha tinh, pha dong (bing 1). Logi eft Pha tinh Dung mdi (Chit edn phn tich cis Octyldecyl ‘ACN, MeOH, 10 Khong phan ewe cs Ooty ‘ACN, MeOH, Hs Khong phan ewe Phenyl | Styryl ‘ACN, MeOH, 10 ‘Ait bio, chit o6 lién két dBi Cyano | Cyanopropyl ACN.MeOH,Hs0, THE | Xeton, aklehyd ‘Amino | Aminopropyl ‘ACN, MeOH, 1:0, THF, | Duéng, anion CHC, CH:Ch Diol | Dinydroxyhesyl | ACN, MeOH, H,0, THE | Protein SAX | Aromatic Quaterany | Dém ‘Anion scx | Aromatic Dem Cation ‘Acid sulfonic ‘ACN, MeOH, #30 Diethyl | Alkyl ether Protein, anion aminoethyl | Diethylamine DEAE co Alkyl ether em Protein, cation ‘Acid acetic ACN, MeOH, 130 Sita | Si Hexane Hop chit hit co silanol chloroform Phin eve, dng pin Bang I: Loai e6t, pha tinh, pha ding va hop chit phan tich thong dung".19 Dé dinh hrgng anthocyanin trong cde dich trich bing phuong phap HPLC ngudi ta con két hop dau dé UV/Vis vi dau do ECD. Khéng giéng HPLC ban dinh lugng chi dé im sach, HPLC- UV/Vis- ECD ding dé phan tich. Chat phan tich duge tiém ty dong vi cing véi pha dng t6i e6t. Céc hop phan khic twong téc Khée nhau v6i pha tinh vi pha Ong. Chat phan tich sau khi duge rita gidi di dén detector mt cach riéng biét. Phuong phap HPLC-UV/Vis-ECD e6 mot s6 die diém sau: > Pha dng: Pha dgng trong HPLC duge dua lién tye vao hé thong. Pha déng cé thé theo chuong trinh gradient dong hoge ding déng, nhumg pha dong cé dinh thudng mit thoi jan Iau va kh6 téch cfc moi, Hign nay thuimg ding nht 14 dang gradient. Khi nia gidi trong sic ky pha dao, lungng dung méi hitu co ting dan én. Tai hic tiém mau, mot lugng pha dng yéu hon di vao hé (it hgp phan hiru co hon). Sau d6 Igi ting ti 1é hitu co trong pha dOng lén dé rita giai tit ca nhimg chit bi gitr lai & pha tinh. > coe”: Cé nhiéu loi pha tinh khac nhau, dn dén co ché rita gidi cing khdc nhau. Trong nghién ctu nay sir dung ¢6t pha dio véi pha tinh khong phan cye va pha dong phan ee. Pha tinh chita céc hop phin ging RMe;SiCI v6i R 1a cdc nhém alkyl (CiyHsy hode (C.H.). Hop phan khéng phan cue c6 ai lye v6i pha tinh nén thir gian ru dai hon. Thai gian luu cé thé diéu chinh bang cach thay déi 46 phan cye cita pha dong. Duong kinh trong cua cét lén tao stre chia én, duge ding trong HPLC bin diéu ché dé lam sach anthocyanin, Ct phan tich ding trong HPLC-UV/Vis-ECD c6 durimg kinh trong ID nhé hon (Cis 250 x 4.6mm), 3.3.1. Dau dd UV: is db c6 gin dén UV (thudng 1a dén deuterim 190-360nm) vi din Vis (dén tungsten, 360-800nm). Vi vay cdc hop phan hap thu anh sang tir khodng 180- 800nm sé dugc dau dé phat hién. Chat phan tich sau khi rita giai ra khoi cOt chuyén qua 1 té bio cam bién hinh tru. Anh sng trong ving UV/Vis truyén qua té bao téi ming quang dign, Néu chat phan tich hp thu duge anh sing & 1 bude séng nio d6, ming quang dign sé phat hign ra sur thay20 i. Tin higu phat ra tir mang quang dign sé chuyén téi bo khuéch dai dén b6 ghi do va hé théng thu di ligu. Cuong 46 dong sang truyén qua cell do (I) ti Ig voi néng 46 cia chat phan tich theo dinh Iugt Lamber- Beer (¢- hg s6 hap thu phén tt, e- néng 49 (mol/L), I- chiéu dai duémg truyén quang (1 ludn 14 1 em), 1, 1 cutmg d§ cit tia séng t6 cell) Azexixe (J DientichECD FX B>Vyeq ® DientichuV axe, x1 Anthocyanin c6 2 bude séng hip thu & 530nm va 280nm, vi vay 06 thé sir dung dau dé UV/Vis. Trong HPLC dinh lugng, c6 thé ding UV/Vis két hgp voi ECD ho§e voi MS. 3.3.2. Dau dd ECD: 3.3.2.1 Tinh cht dign héa ctia anthocyanin: Hoat tinh chéng oxi héa cia céc hop chat thién nhién phy thude vio sé luong ede phan tir hign dign trong mau va cau trac cua chung, vi dy vj tri nhém -OH hay -OCHs. Anthocyanin cé dic tinh chéng oxi héa do cdc nhém -OH trén ving thom, Chat chéng ‘oxi hoa la mt chat khir khi tong tie vai cdc géc ty do, nghia la ching bj oxi héa trén bé ‘mit dign cye. Chat chéng oxi héa ngin sy hinh thinh va hoat déng cia oxi va nito. Ta cé thé thay & hinh 11, nhém catechol 6 vong B va cdc nhém resorcinol 6 vong ‘A cilia catechin e6 thé bj oxi héa, Vong A va B khong lién hop nhau nén sy oxi héa cfc nhém -OH ciia vong nay khéng anh hung t6i cde nhém -OH trén vong kia, Cau trac catechin c6 céc nhém -OH gin vao vong thom cé thé bj oxi héa. Vang B dé bj oxi héa hon vong A, vi véy khi dp thé 100+ 800mV thi céc -OH trén ving B #6 bj oxi hée, tén 1500mV vong A sé bi oxi héa.a1 catechin pine Hinh 11: Sw oxi héa cia cde nhém catechol. ‘Mét sé nghién citu cho th4y ede nhém -OH 6 vi tri meta (trén vong A) khé bi oxi héa hon vi tri para hoge ortho (trén vong B). Két qua la, anthocyanin sé bj oxi héa nhiéu bute céc thé ap khdc nhau, thy vao thtr ty oxi héa ciia cde nhém -OH khac nhau. So véi dau do UV/Vis, dau dd ECD nhay hon va chgn Ige hon déi véi anthocyanin ham lung nho. Co ché cia qué trinh oxi héa xay ra theo thit ty sau: 1. Sy oxi héa céc nhém -OH trén ving B & thé dong bé 2. Syroxi héa cde nhém -OH trén ving A 6 thé cao hon Thé oxi héa tity thude vao pH, khi pH ting lén sé lam giam thé oxi hoa. ‘Néi chung, ce nhém -OH 6 vj tri ortho trén vong B bj oxi héa 6 450mV. Nhém methoxyl va dudmg lim ting kha ning chéng oxi héa cia anthocyanin, Vong A va B khong lién hgp nhau nén sit oxi héa ela ede nhém -OH trén vong A khong anh hung dang ké t6i sy oxi héa cfc nh6m -OH & ving B va nguge Iai. Vi vay tir phuong phip quang phé c6 thé két lun ring vong A khéng anh hudng trén tinh chit phé cita cae géc tudo tirvong B. 3.3.2.2 Nguyén ly cia HPLC/ECD*"*2 Thiét ké may HPLC - ECD vé mat co ban khéng khdc gi HPLC truyén théng, ngoai trir dau dé quang hoc duge thay bing dau dd ECD. Dau dd ECD duge ding tir 1974. Luge dé vé co ché mé ta hé thong HPLC - ECD & hinh 14, Thiét bj gdm bom dé diy dung méi d6ng bing Ap suat hé théng. C6t phan tich chita vat ligu nhdi cGt (thudng 1a lép nén tro duge phi véi bé mit ki nude, chiing han cdc dan xudt cia hydrocacbon da yong) dé phan tich chat dya trén thoi gian Inu, Dau da dign héa ndi tryc tiép voi c6t. DE ty dong, b6 tao iéu khién thanh phan pha d6ng, tat ca cic hé théng nay déu phyc vy cho may tinh va may tinh thu phé siic ky dd. Dé Lim phong ph phan dit ligu, dau dd PDA néi true tigp va dat truéc diu do ECD. Thanh phan pha d6ng chita néng d6 chit dign ly cao dé suat va 46 lip Iai, mau duge tiém bing hé thong tiém thugn tign cho dong di qua diu dé ECD. Thuong pha déng & méi trutng acid chita LisPO, hoe NasPO,. LisPO, dé tan trong dung méi hitu co (MeOH hoge ACN) va vi khuan khong phat trién khi c6 mat Li nén Li,PO, thudng wa ding trong dung méi déng. ‘Cn Lim sach dung méi dong véi khi tro He dé loai oxi vi oxi can tré vige phat hign chat phan tich siéu nhay. Khi chat phan tich di qua dién cye lam vigc (dién hinh la dign cye Cacbon nhung thudmg 1 dién cue kim logi), phan img héa hoc xay ra nhé dé chat phan tich mat mot (hogc nhiéu) dign tit. Nhing dign tir nay duge phat hign bing mot dong chay qua dign ‘cue lim vige. Vi thé, tin higu héa hoc chuyén thanh tin higu dign tir ma khong cin chit mang tir tinh tring gian. Dong chy qua dign cye lim vige vio mot thoi diém nao 46 li ‘mot him tuyén tinh voi s6 phan tir bj oxi héa tai bé mat dign cye. Thé dign hoa cia dign cue lam vige ¢6 thé bin i 48 xée dinh m6t céch chon Ipc chat phan tich; bat ki chat nao xi héa duéi thé 4p vao thi diu do sé khéng phat hign duge, Do dé ECD cé mét chite nang chon Igc ndi tai ma cdc hé thong dau do khac khong 6. Thém vio d6, ECD cue ky nhay, giéi han phat hign nhé gip 10 + 1000 lin 49 nhay cia dau dé UV/Vis va gp 10 lan dau do huynh quang. ra khoi c6t slic ky ma khéng bi23 Hinh 12: He théng LC-UV-ECD tai phéng thi nghigm uid few x Y —_—) working electrode reference and ‘counter electrodes B f\ working electrode Hinh 13: Nguyén by hoat dng ciia dau dé ign hoa, A: ECD logi ampe gém dau dé gan vio thanh cia ranh hep, chat phan tich duge chuyén qua. Phin ing dign héa chuyén chat X thanh sin phdm bj oxi héa Y. B: ECD dang coulom dién héa higu qué hon va cai thign duge sy truyén khéi. mot dién cyc xép ma chat phan tich sé chuyén qua, phan ting Dau dé dign héa o hinh 13A 1a logi dau dé ampe. Day la dang co ban nhat cla ECD. Khi chat phan tich chiy qua dign cye lim vige (thudmg li Cacbon nhung cing c624 khi 1a kim logi), phan img héa hoc xay ra hic nay chat phan tich mat di m6t hoge nhigu ign tir (tie 18 ch4t phan tich bj oxi héa). Nhiing dign tir ndy duge phat hign duéi hin thite dong dign chay qua dign cye lim vige. Do dé théng tin héa hoc vé chat phan tich dugc chuyén thanh tin higu dign ma khéng céin chat mang tir tinh hoge quang hoe trung héa 6 bat ki thai diém nao déu tuyén tinh véi sé mol duge gian, Dong chay qua pin oxi héa trén bé mit pin tai thai diém d6, Thé dign héa cua dign eye lim vige e6 thé bién di cho phép xéc dinh chat phan tich chon loc hon dya trén th 15a; bat ki hop cl nao di ra khdi ct ma khéng oxi héa dudi thé ap vio cell do thi du 6 s€ khéng nhdn ra Do vay ddu dd ECD cé mét chire ning chon lgc ndi tai ma cée ddu dd quang hoc khong c6. Tuy nhién, loai dau do nay it nhiéu khong higu qua vi chi c6 5 - 10% chat phan tich cue va thy hign qua trink ign ha. Do dang hinh hoc cia dau dd nén chi cho phép sur oxi héa tai 1ép phan céch (boundary), chi m6t phan chat phén tich truyén qua dau do duge oxi héa. Logi dau do coulom tét hon (hinh 13B), loai nay c6 matrix xép, thudng la Cacbon. Dign cyc so sanh va dign cue bd try (counter) dang kim loai (thudng 1a Paladium). ‘véi dung dich loang, dau dé coulom gin nhur day hét chat phan tich chuyén héa trén dign eye duéi thé 4p ctia diu dd, Dang duge huéng tryc tigp vao dau dd chit khong phai truyén qua. Dign tich bé mat dign cyc ting dang ké, dong chuyén déng manh nén pha tron lép dung dich & phan bién giap céc digu kign dugc théa min. Vi vay, diu dd nhay hon 10 - 20 lin dau dé ampe vi cai thign duge sy truyén khdi. Trong thyc hanh dau do ampe va dau do coulom khéng khac nhau nhiéu vé 46 nhay nhung nhin chung dau do culong duge ua chudng hon, 3.3.2.3 Co ché Cac chat c6 thé Khir hoc oxi héa trai qua phan img oxi héa trén bé mat dign eye, tao sy thay di dong va duge dau dé ECD ghi nhn. Hinh 14 n hoa: 1 ta co ché ciia pin dign ip dign cue duge dat vio trong pin va dp thé doc theo dign cue. Khi thé di Ion, phan img dién ra va xudt hign dong dign. Cuong a9 dong I duge ghi do theo thdi gian, dign tich peak img v6i ting dign tich Q tra déi gitta dign eye va chit c6 host tinh dign héa, duge tinh theo cdng thie sau: Dign tich peak= Q= fi: dt25 Dinh luat dign phan Faraday lién két Q voi ndng 46 chat hoat dong dign cwe qua phuong trinh: Q=nx Fr tien V6i mea = [C]> Veen > Q= 0 [C]> VaemF Trong may Dionex ching t6i biéu dién theo higu dign thé V thay vi cuéng 46 1, in d6i thanh higu thé biing cach nhan véi dign tro R_ cutmg d6 dong nay duge = Dign tich peak = Rx fidt = B xm [C] Viem x F Voi: R: i dign tra cita thiét bj (cé thé tinh ton hoge biét duge tir nha san xuat), cdn goi lang sé B. i: dong do durge béi dau dé dign hoa. n; sé electron trao déi lién quan téi qua trinh dign cyc. C: ndng d6 cita chat hoat dng dign cuc. ‘Viiem? thé tich tiém (pL) F: hing s6 Faraday = 96500 (C/mol). Thien 1a s6 mol chat phan tich duge tiém vo may. ‘Néu biét duge sé electron trao déi n trong hgp chat cé tinh dign hoa, sé biét duge néng 46 chat phan tich tir dign tich peak 6 sic ky dé HPLC- ECD. [ee non sso | tot SEs] RS Iaa ot26 Hinh 14: So dé cia hé HPLC- ECD. Busing mii tén dm la pha dong. Duing diet nét chi ‘méi lién he gitta cdc thiét bj. Hink 15: (a) mo phing phan tng trén pin dign héa (2 dién cue dét trong dung dich chia hop chat cé hoat tinh dign ha); (b) pin dién héa thdt- dign cure bd trg (A) dp thé 6 dink bai Amp.1, thé duge chon loc tie may dign thé (P) ket noi voi nguén dign. Dang chay qua dién owe am vige duge aiéu Khién bang 66 ampe thir 2 (Amp.2) va dit liu di ra huxéng vio déu doc hove 1g thOng quinn Wy dit ligus (0) he dién cue culong sit dung dign etre earbon graphite Ib xbp, tren ‘mdi dom vj dign eve e6 1 dign ewe carbon Ib xép, wrén edi 2 mat cb gain dign ewe so sénh va dign care bd tre. Khi dp sudt doc theo dign ce Khé nha, etc dom vi dién cye cé thé két ndt lai thank chuéi, tao mang array. ‘M6t pin dign héa co ban can 3 dign cye: dign cye lam vige (6 diy sé dién ra qua trinh oxi héa hog khit), dign cue bé tre va dign cyc so sinh (ding din chay qua rit bé, nén ct 48 dung héa bat ki sy thay déi trong 46 pha d6ng). Pin dién hoa duge sit dung c6 46 nhay cao, bé mat rong dim bao 100% chat phan tich hoat tinh dign cye sé bi ‘oxi héa hoge khir, Dong do 6 dau ra cé don yj mV (U = don vj la mA, R c6 don vi li ©). x R, U cé don vj li mV, I 06 ‘Viée tra déi dign tir xay ra tai ranh gidi cua dién cue lam viée va chat hoat déng trong dung dich dign dan. Ty 1g trao déi dign tit, tite 49 lem ctia dong chuyén qua, chinh 1a téc 4} phan img tai thé ap. Ty 1€ nay ciing thy thudc vao téc 46 cita chit khao sat dén be mat dign cye bing khuéch tén va d6i lu. Sé electron trao déi n cia cde chat dign hoat c6 thé duge xac dinh bing phuong phap vol-ampe. Nguyén tic cita phuong php duge mé ta nhu sau:27 920, % — Cfch xée djnh sé electron trao déi bing vol-ampe Cac phuong phap dign héa sit dung trong hé sinh hoc mé phéng ban chat chéng ‘oxi héa dya trén mdi lién hé ct ché gitta kha nding oxi héa khir ciia héa chat trong dung dich va hogt tinh dign héa tai bé mit dign cyc, cudng dé cita chit chéng oxi héa trong ‘méi trong va thé dp dé ching bi khir trén bé mat dién cue (chit khir cang manh thé ép cang it duong). Thye té mt chat chéng oxi héa la cht khir trong tuong tac voi géc ty do, lie nay ching sé bi oxi héa, tuy nhién khong phai lie ndo cling vay. Nhiing chit chéng oxi hoa khde nhau phan tmg v6i cic géc tyr do va cae chat oxi héa khic nhau 6 nhiéu mite 49, ciing nhur ching s€ hoat déng trén cfc b& mat dign cue khic nhau véi mire 46 Khée nhau, Di bién déi nhu vay nhung ching cing cho phép djnh danh va djnh Ingng. Majic hdc, chit chéng oxi héa ngin su hinh thanh va kha ning hoat dong cia nitrogen va oxygen tir nhiing dang hoat dong khic. Trong phuong phap vol-ampe, thé ap ca dién cue lam vige thay déi tuyén tinh voi thai gian, bat dau tir thé E ma & db khong xay ra phan img dign héa dén gia tri E xay ra sy khiv/oxi héa chit nghién ciru. Sau khi di ngang qua ving thé cé mt hoac hai phan ing ign héa xay ra, huéng quét tuyén tinh dao lai, cdc san phdm cing nhu san phim trung sgian tao ra tir Lin quét du sé thye hign phan tmg dign héa va duge ghi nhdn. Khoang thai gian thi nghiém (chinh 1a van téc quét va thé E nghién citu) cé thé bién d4i 10’-10°s mac dit cdc phan img dinh lugng thudng gidi han 10-10%s. Chat dign ly bé tro c6 mat dé kim ‘ham sy di chuyén cua céc dign tich. Cée thi nghigm duge thye dung dich duge suc khi argon 5-10 phiit dé dudi oxi trrée méi lin do, thé tich cell 1a 1OmL. Quét thé tir -200 t6i 1200mV va -200 t6i 600mV. Dign cue so séinh Ta calomen bio héa cach biét véi dung dich bai céu néi, bén trong cau néi cd cing dung méi va chat ign ly bé tro. Dién eye bé tre c6 dang xoiin dién tich bé mit lem’, 1A 1 soi platium dai ‘véi dong argon, Khoang Sem duéng kinh Imm, Dign cue lim vige gém nhing dia thu duge tir mat cit ngang cia sgi day bing vang ¢6 cdc dutmg kinh khéc nhau dt bén trong vat ligu thity tinh, Gitta cdc Lin chay, dign eye lam vige duge dinh bong bing bot alumina trong 3 phut 8 loai bé céc san phim oxi héa hdp thy manh trén bé mat dign eye, nhimg sén phim nay sé can tre bé mat dign cuc, anh hung toi Lin thé thir 2 di la 6 pH ndo, Dign cue lam vige28 ciing cé thé lam biing Cacbon dung kinh 3mm ho§e cé dang dia quay dung kinh 2mm nam gitta 1di Teflon, hoat déng & van téc géc «@ = 105rad/s, quét thé 20mV/s dam bio ‘rang thai 6n dnb. 'S6 electron trong phan img dign héa cé thé duge xde dinh bing nhiéu céch. Phuong phap phé bién nhat ding phép do dign hrgng coulometry, xée dinh sé lugng cia chat dign phan giai phong trong théi gian dign phan bang cach do sé culong da sir dung, Tuy nhién khi sir dung gid tri n tir phuong phap culong dé giai thich pho CV thudng gap tro ngai, vi khoang thi gian va céc diéu kién phan img tuong déi khdc nhau. Trong phép do dign lugng coulometry thi gian la 1 gig va lép phan img la dung dich géc ciia cell do, con trong phuong php CV théi gian ngin hon 1 gidy va Iép phan img khodng mot vai mm tinh tir bé mat dign cue. Cac bai bao truée day thudng ding mét phuong phép rat phd bién dé xdc dinh n trong CV la: chdt chudn, thutng la ferrocene (n = 1), durge thém vao cling véi mau trong cell do CV, réi so sénh trye tiép cutmg d6 peak ciia chudn va chat nghién ciru. Tuy nhién ‘viée so sanh nay dwa trén gid thiét hé sé khuéch tan cua chudn va miu ld nhu nhau (thurdng hg khuéch tin rat kh6 biét trute). Ngoai ra cing phai tinh dén cdc phn img hoa hge dong thé va dj thé c6 thé anh hwéng t6i hinh dang va chiéu cao cia séng dign thé. Do 6 phuong php nay Iudn thiéu chinh xée. Tuy nhién, néu do ludmg tir Ky thudt tthe thas Tyansient =X D'? x F x Ax o°x (nx T? = fannie ti 1G voi nx D'? ‘Véi Ty: thoi gian khio sit riéng, A: dign tich bé mat dign eye. F: hang sé Faraday = 96500. D: hé s6 khuéch tan bé mat. °: néng 46 cia dung dich. Két hop véi phép do dign long voltametry trang théi tinh (do ding Faraday di qua dung dich dign phan khi ép thé thich hgp vao dign eye Lim vige)29 ingadystte =X D x AF x €°X ty => istaty tate HIG vi n x D. D: h@ sé khuéch tan cau. 1g: ban kinh. =n, lde nay hé sé khuéch tin D duge gian luge. khée nhau cho phép do tite thai va trang théi tinh, edn digu chinh ding do duge vi ¢6 higu tmg dign tich dign eve. Tuy vay ching ta e6 thé trénh, ‘vic chudn héa nay néu cdc phép do giéng nhau thyc hign trén cling dign eye va cing mot chat chun a biét n va D gidng nhu ferrocene. 3.3.3 Gidi thigu vé LC/MS/MS" Sie ky long ghép khéi phd 1a mét thiét bi ly tuéng cho cdc phéng thi nghiém. LC/MS a phuong phap duge ding trong phan tich vét va cdc hgp chat cin nh§n danh chinh xdc vi trong nhiing didu kign van hanh nhét dinh ngoai thdi gian Iwu dic trung, hoa chat con duge nhgn danh bing khoi pho cita né. BG nhgy LC/MS tity thuge vio hyp chat cn phan tich va giao dign str dung. Trong sic ky lng ghép khdi phd, hén hgp chit phan tich sau khi téch ra khoi cOt sé di qua m§t dudmg truyén dén dau do khéi phd. Cét sic ky Jong cho phép téch chit cin quan tam, khéi phd cho phép tich ion can quan tim va cho biét phan tir Iugng ciia chat phin tich, M6t hé thing LC/MS/MS sé phan manh ion me thinh céc ion con va téch ee ion con dé dinh danh va dinh Iueng, ‘M6t hé LC/MS co ban gdm hé théng bom sic ky long, bd phan tiém mau, cét sie ky, dau dé khéi phd. ‘Nhigm vu cia dau dé khéi phé: > han danh héa chat: ‘Mét mii trén sic ky 48 véi thoi gian hru xac dinh dc trung cho héa chat, te nay chinh 1a théi gian tir lde hoa chat bit ddu vao cOt va ra khdi e6t dé vao dau dd khéi phé.30 Mii nay biéu dién téng cudng 49 cdc ion sinh ra tir phan tir héa chat théng qua ky thugt ion héa xac dinh. Tong cae mii nay trén sac dé hgp thanh sic d6 tong ion (total ion chromatogram), ‘Mii nay cing cé thé biéu di&n cudng 46 cia mot loai ion sinh ra tir sy phan manh_ ‘cia phan tir héa chat hode tir sy phan manh ciia mét loai ion cula héa chit. Khéi phd tuong img ciia héa chit hoge khdi phd biéu dién cudng 46 cdc ion sinh ra tir mét ion nhat dinh. Nhu thé vige nhgn danh théng qua vira théi gian Iuu vira khoi phd sé chinh xéc hon la chi dua vao thei gian Iuu. > Dinh lugng ndng d6 ciia héa chat trong mau. > Céc bé phan chinh cia khéi phd gdm: bé tao ion, bé tich ion, bé dé ion. So sinh 2 ky thuat ion héa APCI va ESI: Gidng nhau: 3 Déu thude Logi ion héa mém, it tao su phan manh, trong nhiéu trudmg hop con thay dugc phan tir ban dau. = Néu e6 sw phan minh ion thi céch phan manh cing don gidn, giéip dodn nhan céu trie chat ban dau dé dang hon. - Ca hai ky thuat déu cé thé tgo ion im ho§e durong tiy theo cau tric hyp chat khao sitKhe nhau: Ky thugt phun ion (ESI: electrospray ionization) ~ Ton tgo trong pha dung dich - Thich hop cho cht khong bén niet = C6 thé tao sy phan mank it hon APCI - Thich hop cho chat kha phan eye . Thich hgp cho chit ¢6 phan tir khéi Jon Ky thugt ion héa héa hoc 6 dp suat thuong (APC: atmospheric pressure chemical ionization) Ton tgo trong pha hoi Thich hgp cho chat khéng bén nhigt C6 thé tao sur phin minh nhiéu hon ESI Thich hgp cho chat ft phan eye Thich hgp cho chat c6 phan tis khdi nhd> KS thudt APCI: khi phan tir chét phan tich vi dung moi di qua mot 1d sy sé héa hoi, cic phan tir hoi duge khi No phun ra va di vao ving phéng dign (corona discharge). Hign tuyng ion héa xy ra: + Co-ché tg0 ion duong: Ny +64 Ny +20 H,0 + ¢ + HO" #2¢ 1,0 +H,0° + H,0"+ OH M+ 1,0" > MH" +H,0 * Co ché tgo ion am: véi nhiing phan tir cé H linh dng, trong ving phong 4ign, c6 sy ion h6a eta phan tir bing efch mat di H”, phin cin Igi ld mot anion: OH +M— (M-Hy + 1,0 > Ky thuft phun ion ESI: = Ce phan tir héa chat va dung méi ra khdi edt sie ky duge dua vio m@t ng mao quan bing kim loai cao thé va sau 46 duge phun min bing khi N2 thodt ra chung quanh éng mao quan. “ Dusi tac dung ciia dign thé cao, 6 sy tao thanh nhiing hat nhuyén mang dign tich thodt ra tir dau éng mao quan. ~ Sau d6 ede phan ti dung mdi tr tir bée hoi. Céc hat mang dign ¢6 thé tich nho din ‘va do su day nhau giita cdc dign tich cing dau, ching sé bé ra thinh nhimg het nhé mang. ign tich. = Sau d6 ede ion duwong hod 4m tgo thinh duuge dua vo b9 phn téch ion qua mot cira rit nh6, Dung m6i va khi N; bi bom hiit ra ngodi33 = Bign thé duong & dau kim tgo ion duong, dign thé Am thi tgo ion Am va durge quyét djnh tay theo chit khao sat. = Cc chit c6 tinh acid tgo ion am & pH cao, con chit c6 tinh baz tao ion duong & pH 3.3.4 Gidi thigu thiét bj khdi pho FINNIGAN LCQ deca"” (hang Thermo Quest Finnigan). ‘Thiét bj HPLC (TPS Spectra system) bao gdm bO ly mau ty dng (spectra system A$3000), bom P4000 gradient pump (spectra system P4000) vi bé loai khi chan khong, dau dd UV 6000 (spectra system SN4000) LP flow cell Sem néi véi diu dd MS (LCQ Deca). Thé tich anthocyanin khodng 10uL tiém vio c6t Phenomenex (Torrance, California, USA) Luna C18 (150mm x 2.0mm, kich thurde hat 3}1m), chuong trinh ria giai 6 bang 3. Hink 16: Hé thdng LC-UV-MS tai phong thi nghim ‘Diu dd MS la mot bay ion LCQ-Deca (ThermoFinnigan) v6i giao dign ion héa phun dign tir chay 6 dang ion duong. Ap thé duong +3 — +4kV vao kim silica, dung moi tao ‘gigt bay én, khi Helium day cdc hat khi va gitip phén nhd, ede hat khi niy va cham nhau, dong dign 80mA, thé mao quan 23mV, nhiét 4 mao quan 225°C, thdu kinh (tube lens) cai34 4431 6 higu thé -SV, sheath gas (He) 1.2 L/phiit va kh bé trg (He) 6 Liphit DAD dit 6 buse song 200 16i 800nm. Bay ion chay 6 dang quét sean MS/MS tiy thude dit ligu, Hin quét dau cdi dat & khoding m/2= 200-1200. Lin quét thit hai khai béo ion ¢6 cudmg 46 cao nbat tir lan quét dau va thu phé MS lan hai, twong ty Kin quét 3 MS’ khai bio ion cudng 46 cao 6 lin 2. Nang lugng va cham 28%, thi gian kich hoat 30ms. Sau khi durge , ion con €6 dign tich lin hom dign tich eiia phan tir me, ESI 1 ky thugt ion hoa tach nh fm, chi cn vai gidy dé thye hign sy phan man \ Hinh 17: So dé ctia giao din ESI" Nhin chung, 1 chit di vio méy MS trai qua 3 buée: . ‘Dau tién, phan tir durge bin pha béi dong electron ning hrong cao, chuyén phan tir thanh ion. Ion phan tir ting téc dén tring tinh dign. . Tiép theo, trong trudng tinh din hay nam cham dign, cdc ion gia te duge phan tich tty theo ti Ig khéi lugng/dign tich, . Cudi cing, cde ion c6 ti 1¢ khdi Iuong/dign tich dae trumg duge phat hign. Dong ra ciia diu do duge khuéch dai va ghi do. ‘Chat phan tich tir sic ky long hoge bom xy lanh chuyén qua kim phun, tgo cde gigt tich dign 6 cudi diu kim. Dong He khdng tich dign trung hda cht ling va gitip dung moi bay hoi thanh giot. Khi dung m6i bay hoi, cdc phan tir chit phan tich bj dy gin nhau hom,35 ching dy Hin nhau va cée gigt bj v8 ra. Qué tink nay do lye khang culong gitta céc ion fy ra. Qua trinh nay s& dimg Igi khi cée phan tir khdng cdn lién két v6i dung moi va tro thinh céc ion rigng r&, Sau d6 ching duge phét hign. Anthocyanin 6 dang ion dong, vi ‘vay chang khéng can ion héa ma tryc tiép di vio may MS sau khi bay hoi dung méi. Qua trinh nhu sau: (1) —>M" (g) ‘Thi nghigm khdi tandem mass chinh la cdc bude Iya chon khdi phd véi cae dang vo xuit hign gira cae qué trinh, Trong thi nghiém tandem mass, théng tin vé cau trac duge tim thy qua e4e minh vé lin 2 vi 3 (MS?, MS"), V6i anthocyanin, Khi cde nhom duimg mit i, tay vao khéi lung phan tr bi mat, c6 thé xde dinh d6 18 dudng hexose hay pentose, Sau khi mat géc dudng, st nhdn biét nhém aglycone. Logi aglycone duge nhin danh khi so sinh véi nhimg nhém da biét. '- ¥ ome thre sues Precursor Product Hinh 18: Mé ti plucamg phép tandem mass tao ra cde minh vi ion tc MS? trong thie bi triple quadropole. Trong ion trap, céc ion bj loai ra khéi by ngoai trix ion cdin durge bin pha & Lin 2. Thiét bj dp mot tin s6 sng radio svéi tn s6 cng huéng bing véi vin téc gée @ cia ion trong bliy. Nh tin s6 song nay, ning lkeng dong Ive duge chuyén vio ion va ion bit diu Juan chuyén trong ion trap ¢ mt ban kinh lén hon, Bunce mx 1% OF36 Ton cé nguén ning lugng dng hoc nay sé va cham véi mt trong cae nguyén tir He -vén 6 sin trong ion trap, lic nay qué trinh ban pha xudt hign. Nang lvgng d6ng hge nay tly ‘vao d@ khuéch dai cia tin higu sng radio va duge higu chinh bi s6 % do b6 vin hinh MS, ‘rong miy LC-UV-MS tai truig Roskidle khong 25-50%,