C«ng nghÖ thu chÕ phÈm enzyme

Unit 4. C«ng nghÖ thu nhËn enzyme

4.1 Nguån thu enzyme

4.2 C¸c ph­¬ng ph¸p thu nhËn enzyme th«
4.3 Ph­¬ng ph¸p thu nhËn enzyme tõ thùc vËt vµ ®éng vËt
4.4 C¸c ph­¬ng ph¸p thu nhËn enzyme tõ vi sinh vËt
4.5 C¸c ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy vi sinh vËt ®Ó thu nhËn enzyme
4.6 C¸c ph­¬ng ph¸p c¶i t¹o gièng vi sinh vËt ®Ó thu enzyme
1. Nguån nguyªn liÖu thu enzyme.

 Enzyme lµ nh÷ng chÊt kh«ng thÓ ®iÒu chÕ ®­îc

b»ng ph­¬ng ph¸p tæng hîp ho¸ häc.

 Thu nhËn chóng tõ :

 §éng vËt (8%)
 Thùc vËt (4%)
 Vi sinh vËt (>90%)
Enzyme ®éng vËt
Tuþ t¹ng: amylase, maltase, lipase, cholesterol
esterase, pectinase, nuclease, tripsin, chimotrypsin,
cacboxyl peptidase A, B, elastase,…

D¹ dµy: Pepsin A, B, C, D, gastrinsin, celullase

Ruét: enterokinase, latase, maltase, sacarase,

nuclease, phosphatase, aminopeptidase,…

Gan : Urease

TuyÕn n­íc bät: amylase, maltase, kalicrein

HuyÕt thanh: amylase, phosphatase, transaminase

Enzyme thùc vËt

§u ®ñ : papain
Døa : bromelin
Sung ; fixin
Malt ®¹i m¹ch: amylase
Gi¸ ®Ëu: Urease
MÇm h¹t thÇu dÇu : lipase
ChÌ : polyphenoxydase, protease, pectinase,
amylase, invertase
Enzyme vi sinh vËt

Nguån enzyme rÊt phong phó, ®a d¹ng, cã thÓ

thu nhËn víi sè l­îng rÊt lín.
HÖ enzyme vi sinh vËt cã thÓ thay ®æi b»ng
c¸ch thay ®æi c¸c ®iÒu kiÖn nu«i cÊy.
Vi sinh vËt cã kh¶ n¨ng ph¸t triÓn nhanh vµ sinh
tæng hîp víi tèc ®é nhanh
Enzyme vi sinh vËt cã ho¹t tÝnh m¹nh.
Mét sè quy tr×nh t¸ch, tinh chÕ
enzyme thùc vËt & ®éng vËt.
 T¸ch vµ tinh chÕ papain
Nhùa ®u ®ñ
0,001M EDTA
14% (NH4)2SO4
0,02M Cystein

Hoµ tan nhùa

1M NaOH

§­a pH=9
40% (NH4)2SO4

KÕt tña Hoµ tan kÕt tña KÕt tña SÊy kh«
0,1 photphat buffer 1M NACl
 T¸ch vµ tinh chÕ pepsin

Mµng nhµy d¹ dÇy

Röa s¹ch

NghiÒn
5%HCl, 42oC, 42 g

22% NACl
Ph©n huû Läc KÕt tña ChÕ phÈm
C¸c ph­¬ng ph¸p thu chÕ phÈm enzyme vi sinh
vËt

Qui tr×nh s¶n xuÊt chÕ phÈm enzyme vi sinh vËt bao
gåm c¸c giai ®o¹n chñ yÕu sau :

Ph©n l©p, tuyÓn chän vµ c¶i t¹o gièng vi sinh vËt

Nu«i cÊy vi sinh vËt sinh tæng hîp enzyme
T¸ch vµ tinh chÕ enzyme
C¶i t¹o gièng vi sinh vËt

§ét biÕn: ho¸ lý

C¸c t¸c nh©n vËt lý: UV, X-ray, to,…
C¸c t¸c nh©n ho¸ häc ; c¸c chÊt g©y ®ét biÕn

§ét biÕn b»ng ph­¬ng ph¸p sinh häc ph©n tö

§ét biÕn ®iÓm
Error-prone PCR
Suffling
 Ph­¬ng ph¸p biÕn n¹p
 Ph­¬ng ph¸p tiÕp hîp gene
 Ph­¬ng ph¸p t¶i n¹p
 C¸c ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy vi sinh vËt

Ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy trªn m«i tr­êng r¾n :

Vi sinh vËt ph¸t triÓn trªn bÒ mÆt m«i tr­êng
dinh d­ìng ë thÓ r¾n ®· ®­îc lµm Èm vµ v« trïng.

Ph­¬ng ph¸p nu«i cÊy trong m«i tr­êng láng :

Vi sinh vËt ph¸t triÓn trong m«i tr­êng dinh d­ìng ë
tr¹ng th¸i láng

Xem tiÕp ë file kh¸c

 T¸ch vµ tinh chÕ enzyme

Khu tró cña enzyme :

-Enzyme ngo¹i bµo: enzyme ®­îc tiÕt ra m«i tr­

êng sèng cña sinh vËt.
- Enzyme néi bµo : enzyme n»m ë trong tÕ
bµo cña sinh vËt
- Enzyme periplasmic : enzyme n»m ë mµng
nguyªn sinh chÊt cña tÕ bµo.
 C¸c ph­¬ng ph¸p ph¸ vì tÕ bµo

1. Ph­¬ng ph¸p c¬ häc :

Ph¸ vì b»ng sãng siªu ©m : 18 kHz – 1MHz

Ph¸ vì b»ng m¸y ®ång ho¸ cao ¸p : 150 Mpa
Ph¸ vì b»ng m¸y nghiÒn : víi c¸c h¹t cã r = 0,1 – 0,2 mm
Ph¸ vì b»ng ph­¬ng ph¸p l¹nh ®«ng
2. Ph­¬ng ph¸p phi c¬ häc

Sèc thÈm thÊu : ®­êng 20%

Xö lý kiÒm: pH 11,5 –12,5
Sö dông chÊt tÈy röa : triton x100, tween 20, LAS
Ph©n gi¶i b»ng enzyme
 C¸c ph­¬ng ph¸p ®ång ho¸

TÕ bµo ®éng vËt (c¸c tæ chøc)

-Nã rÊt dÔ ®ång ho¸ v× kh«ng cã vá tÕ bµo (cell wall)
- CÇn ph¶i lo¹i bá mì vµ mµng tr­íc khi ®ång ho¸

Vi khuÈn vµ nÊm mèc

CÇn ph©n huû vá tÕ bµo b»ng enzyme (cã thÓ t¹o tÕ
bµo trÇn b»ng xö lý lysozyme hoÆc chitinase/3-
glucanase)
Thùc vËt
- Ph¸ huû kh«ng bµo cã thÓ lµm háng enzyme
 C¸c ph­¬ng ph¸p t¸ch

KÝch th­íc vµ khèi l­îng

Siªu ly t©m (300 000g)

-Mr lµ yÕu tè chÝnh ®Ó t¸ch
- Kh«ng hiÖu qu¶ ®Ó t¸ch enzyme tõ hçn hîp
enzyme: th­êng ®Ó t¸ch chÊt bÈn

Läc gel (Mr ~ hµng tr¨m ngµn)

- Sephadex, Bio-gel P, Sephacryl, Sepharose- ®¾t ®á vµ
tèn thêi gian.
- Th­êng trong c«ng ®o¹n cuèi cña qu¸ tr×nh tinh s¹ch.
ThÈm tÝch (Mr ~ hµng chôc ngh×n)
- Th­êng dïng ®Ó lo¹i muèi, dung m«i h÷u c¬,…

Siªu läc
-C¸c ph©n tö nhá ®­îc läc qua nhê ¸p lùc
- Dïng ®Ó c« ®Æc protein
 TÝnh ph©n cùc
S¾c ký trao ®æi ion

-TÝnh chÊt tÜnh ®iÖn

-ChÈy qua ë nång ®é muèi thÊp vµ pH t­¬ng øng
-Khö hÊp phô khi thay ®æi nång ®é muèi vµ pH
-Enzyme cã thÓ t¸ch nhê ®iÒu kiÖn gradient
-Cã thÓ ë quy m« lín
-Th­êng t¨ng ®é tinh s¹ch 10 lÇn.
§iÖn di
-T¸ch nhê chuyÓn ®éng cña c¸c ph©n t­tÝch ®iÖn
-§iÖn di mao dÉn (<100 micromet)

TËp trung ®¼ng ®iÖn (isoelectric focusing)`

S¾c ký t­¬ng t¸c kþ n­íc (hydrophobic)

- Phôc thuéc vµo bÒ mÆt cña c¸c aa kh«ng ph©n cùc cña enzyme
- Octyl- hoÆc phenyl-Sepharose cã lùc ion cao
- Khö hÊp phô nhê lùc ion thÊp hoÆc bæ sung dung m«i h÷u c¬
TÝnh tan
* Thay ®æi pH
- Enzyme Ýt tan ë pI bëi v× kh«ng cã lùc ®Èy gi÷a enzyme
- Enzyme kh«ng bÞ bÊt ho¹t ë d¶i pH

*Thay ®æi trong lùc ion

- C¸c ph©n tö cã ®iÖn tÝch lín rÊt Ýt tan trong n­íc tinh
khiÕt; bæ sung c¸c ion lµm t¨ng tính hoµ tan (Salting in)
- ¶nh h­ëng cña lùc ion, c¸c ph©n tö tÝch ®iÖn bÞ kÕt tña
nhanh (Salting out)
- Ammonium sulphate ®­îc ­a dïng
- T¨ng 10 lÇn møc ®é tinh s¹ch
Gi¶m h»ng sè l­ìng ®iÖn (dielectric constant)

-Bæ sung dung m«i h÷u c¬ cã thÓ trén víi n­íc

(ethanol, acetone)
-Gi¶m h»ng sè l­ìng ®iÖn
-§«i khi bÊt ho¹t enzyme
-TiÕn hµnh ë nhiÖt ®é thÊp
-Th­êng xö dông PEG ~ Mr 4000 – 6000
VÞ trÝ liªn kÕt ®Æc biÖt

-S¾c ký ¸i lùc
- C¬ chÊt hoÆc chÊt øc chÕ liªn kÕt víi gi¸ thÓ
- Ph¶n hÊp phô nhê sù ®Èy c¬ chÊt hoÆc thay ®æi pH, lùc ion

S¨c ký ¸i lùc
C¸c protein hçn hîp (fusing protein)
-Glutathione-S-transferase: glutathione
- Maltose binding protein:maltose
-Hexahistidine:Ni2+ (t¸ch röa nhê imidazole hoÆc
thrombine vÞ trÝ c¾t ®­îc bæ sung sau His-tag.
 C¸c lo¹i s¾c ký kh¸c
¸i lùc t¸ch röa
- Sau khi xuÊt hiÖn ë b­íc ph¶n hÊp thô
- Cã thÓ gi¶i quyÕt mét sè vÊn ®Ò cña s¾c ký ¸i lùc
vµ dÔ n©ng cÊp.
S¾c ký dye – ligand
-Cibacron Blue F3G-A cã thÓ g¾n víi nhiÒu lo¹i
dehydrogenase vµ kinase
- Procion Red He-3B g¾n tèt víi NADP+ -tuú thuéc
vµo dehydrogenase.
S¾c ký hËp phô miÔn dÞch
- Cè ®Þnh kh¸ng thÓ vµo Sepharose xö lý CNBr
- §¹t ®­îc tinh s¹ch cao
S¾c ký covalent
- T¸ch cysteine chøa protein sö dông thiol-Sepharose 4B
 C¸c d¹ng chÕ phÈm enzyme

ChÕ phÈm th«: lµ chÕ phÈm ch­a ®­îc tinh chÕ.

ChÕ phÈm kü thuËt : lµ chÕ phÈm ®· ®­îc tinh
chÕ s¬ bé.
ChÕ phÈm enzyme tinh khiÕt : ®· lo¹i protein vµ
enzyme t¹p, chØ cßn mét enzyme mong muèn.
Ph©n ®o¹n & tinh chÕ enzyme
(xem ë ch­¬ng tinh chÕ)