Lecture 3

Nu«i cÊy vi sinh vËt

Ph¸t triÓn vi sinh vËt – liªn quan
tíi tæng sè tÕ bµo, kh«ng liªn quan
tíi ®é lín cña tÕ bµo

C¸c ®ßi hái cho sù ph¸t triÓn

•VËt lý
•Ho¸ häc
 C¸c ®ßi hái vËt lý
• NhiÖt ®é
– ­a l¹nh (psychrophiles) (cold loving microbes )
• D¶i nhiÖt 0 oC - 20 oC
– a­ Êm (mesophiles) (moderate temp. loving
microbes)
• D¶i nhiÖt 20 oC - 40 oC
– Chiụ nhiệt (thermophiles) (heat loving
microbes)
• D¶i nhiªt 40 oC - 100 oC
 pH
• HÇu hÕt vi sinh vËt ph¸t triÓn trong pH 6.5 -
pH 7.5

• RÊt Ýt cã thÓ ph¸t triÓn d­íi pH 4.0

– NhiÒu thùc phÈm, nh­sauerkraut, d­a muèi, vµ pho
m¸t ®­îc b¶o qu¶n khái sù h­háng do acid ®­îc t¹o ra
trong qu¸ tr×nh lªn men
 ¸p suÊt thÈm thÊu
• HÇu hÕt vi sinh vËt nhËn ®­îc tÊt c¶ c¸c
chÊt dinh d­ìng trong dung dÞch tõ m«i tr­
êng n­íc xung quanh
• TÝnh c­¬ng (Tonicity)
– TÝnh c­¬ng võa (isotonic)
– TÝnh c­¬ng nhiÒu (hypertonic)
– TÝnh c­¬ng Ýt (hypotonic)
Cells
 C¸c ®ßi hái ho¸ häc
• Macro & Micro Elements
 Oxygen
• Vi sinh vËt cÇn ph¶i ®­îc ph©n lo¹i
dùa trªn c¸c ®ßi hái oxygen
1. Vi sinh vËt hiÐu khÝ (obligate Aerobe)
2. Vi sinh vËt kþ khÝ (obligate Anaerobe)
3. Vi sinh vËt hiÕu khÝ kh«ng b¾t
buéc & kþ khÝ kh«ng b¾t buéc
(Facultative Aerobe &Facultative
Anaerobes)
4. Vi sinh vËt cÇn rÊt Ýt khÝ
(Microaerophilic)
Oxygen lµm chÕt mét sè vi sinh vËt
TÊt c¶ vi sinh vËt sinh ra superoxide ( O2-)

Superoxide ®éc cho tÕ bµo (lÊy ®i c¸c ®iÖn tö)

Superoxide cÇn ph¶i ®­îc trung hoµ

 Superoxide dismutase
O2- + O2- + 2 H+ -------> H2O2 + O2

Hydrogen peroxide còng lµ ®éc tè cho tÕ bµo

vµ cÇn ph¶i trung hoµ nã
 Catalase
2 H2O2 --------> 2 H2O + O2

Vi sinh vËt hiÕu khÝ b¾t buéc khuyÕt:

•Superoxide dismutase ( SOD )
•Catalase
 M«i tr­êng nu«i cÊy
1. Thµnh phÇn ho¸ häc x¸c ®Þnh
•BiÕt ®­îc chÝnh x¸c thµnh phÇn ho¸ häc
•Sö dông ®Ó ph¸t triÓn c¸c vi sinh vËt khã tÝnh
2. M«i tr­êng hçn hîp (Complex Media)
•Kh«ng biÕt chÝnh x¸c thµnh phÇn ho¸ häc
•HÇu hÕt vi khuÈn vµ nÊm mèc ph¸t triÓn ®­îc
trªn m«i tr­êng nµy
C¸c kü thuËt nu«i cÊy ®Æc biÖt

1. Vi khuÈn kþ khÝ (Anaerobic Bacteria)

•a. Gi¶m bít m«i tr­êng (Reducing Media)
•b. Buång kþ khÝ (Anaerobic Container)
•c. Agar Stab
•d. Agar Shake (AGAR OVERLAY TECHNIQUE)
C¸c kü thuËt nu«i cÊy ®Æc biÖt
2.
Vi khuÈn Ýt hiÕu khÝ
(Microaerophilic Bacteria)
•Ph¸t triÓn tèt nhÊt ë O2 gi¶m bít vµ t¨ng møc

•Kh«ng khÝ b×nh th­êng 21 % O2

0 .3 ®Õn 0.03 % CO2
 Vi khuÈn Ýt kÞ khÝ
(Microaerophilic Bacteria)
A. B×nh nÕn (Candle Jar)

16 % O2
4% CO2
Vi khuÈn it hiÕu khÝ
(Microaerophilic Bacteria)
B. CO2 Generating Packet
Agar Stab
 M«i tr­êng chän läc
øc chÕ sù ph¸t triÓn cña mét sè vi khuÈn trong
khi ®ã l¹i chän läc sù ph¸t triÓn cho c¸c vi
khuÈn kh¸c
VÝ dô:
•Brilliant Green Agar
•Mµu øc chÕ sù ph¸t triÓn vi khuÈn Gram (+)
•Chän läc cho vi khuÈn Gram (-)
•HÇu hÕt c¸c nhiÔm khuÈn ®­êng ruét g©y ra do vi
khuÈn Gram (-)
 M«i tr­êng chän läc
EMB (Eosin Methylene Blue)
•Mµu øc chÕ vi khuÈn Gram (+)
•Chän läc cho vi khuÈn Gram (-)
•HÇu hÕt c¸c nhiÔm khuÈn ®­êng ruét g©y
ra do vi khuÈn Gram (-)
 M«i tr­êng kh¸c biÖt
Sù kh¸c biÖt gi÷a c¸c sinh vËt kh¸c nhau
ph¸t triÓn trªn cïng mét ®Üa
VÝ dô:
• §Üa th¹ch m¸u (TSA cã 5% m¸u cõu)
• Sö dông sù kh¸c nhau ®Ó ph©n biÖt c¸c kiÓu
Streptococci
Alpha Hemolytic Streptococci

Incomplete lysis of RBC’s

Beta Hemolytic Streptococci

Complete lysis of RBC’s

Gamma Hemolytic Streptococci

No lysis of RBC’s
M«i tr­êng chän läc vµ kh¸c biÖt
Mannitol Salt Agar
•Sö dông ®Ó ph©n biÖt Staphylococcus aureus
Mannitol Salt Agar
•Nång ®é muèi cao (7.5%) øc chÕ hÇu hÕt c¸c vi
khuÈn
•§­êng Mannitol
•ChØ thÞ pH (ChuyÓn mµu vµng khi acid)
 M«i tr­êng chän läc vµ kh¸c biÖt
MacConkey’s Agar
•Sö dông ®Ó ph©n biÖt Salmonella
MacConkey’s Agar
•Bile salts vµ crystal violet (øc chÕ vi khuÈn
Gram (+))
•lactose
•ChØ thÞ pH
Many Gram (-) enteric non-pathogenic bacteria can ferment
lactose, Salmonella can not
Ph¸t triÓn vi sinh vËt – t¨ng sè l­îng tÕ bµo
Sù sinh s¶n nh©n ®«i (Binary Fission)

Thêi gian t¸i t¹o (Doubling Time)

• Thêi gian ®ßi hái cho tÕ bµo ®Ó nh©n ®«i
•Hçu hÕt trªn 1 giê ®Õn 3 giê.
•E. coli - 20 phót
•Mycobacterium tuberculosis - 24 giê.
Sù sinh s¶n nh©n ®«i - unchecked
E. coli – thêi gian t¸i t¹o lµ 20 phót.
20 thÕ hÖ (kho¶ng 7 giê.)
•1 triÖu tÕ bµo
30 thÕ hÖ (kho¶ng 10 giê.)
•1 tû tÕ bµo
72 thÕ hÖ (kho¶ng 24 giê.)
•1 x 1021
•1,000,000,000,000,000,000,000 tÕ bµo
C¸c yÕu tè h¹n chÕ trong m«i tr­êng
ThiÕu thøc ¨n, n­íc hoÆc chÊt dinh d­
ìng
Kh«ng gian
tÝch tô c¸c chÊt th¶i trao ®æi chÊt
ThiÕu oxygen
Thay ®æi pH
NhiÖt ®é
 C¸c pha ph¸t triÓn
1. Pha Lag
2. Pha Log
3. Pha Stationary
4. Pha Death
 1. Pha Lag
Vi khuÈn ®Çu tiªn ®­îc ®­a vµo m«i tr­êng
n«i cÊy
Vi khuÈn “checking out” m«i tr­êng xung
quanh
C¸ctÕ bµo ho¹t ®éng trao ®æi chÊt rÊt
tÝch cùc
Sè l­îng tÕ bµo thay ®æi rÊt Ýt
1 giê ®Õn vµi ngµy
2. Pha Log
TÕ bµo ph¸t triÓn nhanh (exponential growth)
QuÇn thÓ t¨ng gÊp ®«i sau mçi thÕ hÖ
Vi sinh vËt rÊt nhËy c¶m víi c¸c ®iÒu kiªn
bÊt lîi
•antibiotics
•anti-microbial agents
 3. Pha Stationary
• Tû lÖ chÕt = tû lÖ sinh s¶n
• C¸c tÕ bµo b¾t ®Çu ch¹m tr¸n víi c¸c ®iÒu
kiÖn bÊt lîi cña m«i tr­êng
– ThiÕu chÊt dinh d­ìng
– ThiÕu nøíc
– Kh«ng ®ñ kh«ng gian
– C¸c chÊt th¶i trao ®æi chÊt
– oxygen
– pH

B¾t ®Çu h×nh thµnh Endospore

 4. Pha Death

Tû lÖ chÕt > tû lÖ t¸i t¹o

Do c¸c yÕu tè h¹n chÕ trong m«i tr­êng
 §Õm vi khuÈn

§é ®ôc m«i tr­êng - 10 triÖu tÕ bµo vi khuÈn trªn ml

Pha lo·ng hµng lo¹t (Serial Dilution)