§Þnh l­îng protein vµ c¸c ph­¬ng ph¸p x¸c ®Þnh

1) X¸c ®Þnh hµm l­îng protein trong mÉu

2) Ph©n tÝch amino acid
3) §¸nh dÊu phãng x¹ protein
4) §o hµm l­îng protein tæng b»ng so mµu
5) Gi¶i tr×nh tù aa (Edman degradation)
 X¸c ®Þnh dung dÞch protein:
ViÖc quan träng trong qu¸ tr×nh tinh chÕ protein lµ
thu nhËn protein chóng ta ®· t¸ch. §iÒu ®ã cã thÓ thùc
hiÖn ®­îc nhê:
 Ho¹t tÝnh enzyme, nÕu nã lµ mét enzyme.
§¬n gi¶n lµ bÊt kú ph­¬ng ph¸p thuËn tiÖn nµo cña qua
tr×nh ®Þnh l­îng c¸c thµnh phÇn mong muèn, nh­
 Electrophoresis.
 X¸c ®Þnh dung dÞch protein:

ViÖc quan träng thø hai ®Ó biÕt ®­îc tæng l­îng

protein cã trong ph©n ®o¹n mµ ë ®ã chóng ta ®·
thu ®­îc enzyme cña m×nh/protein ®Æc tr­ng.
C¸c b­íc so mµu (pectroscopic
procedures)
 X¸c ®Þnh sù hÊp thô cña c¸c acid amin
th¬m (aromatic amino acid)
Sö dông A280 ®Ó x¸c ®Þnh nång ®é protein
HÊp thô ®o ®­îc ë 280 nm (A280) ®­îc sö dông ®Ó tinh nång
®é protein nhê so s¸nh víi ®­êng chuÈn hoÆc gi¸ trÞ ®é hÊp
thô c«ng bè cho protein ®ã (A280).
NÕu biÕt A280 cña protein: TÝnh nång ®é ch­a biÕt cña mÉu
tõ hÊp thô quang phæ cña nã.
Trong ph­¬ng tr×nh nµy A280 cã ®¬n vÞ lµ ml/mg cm vµ B
cã ®é dµi lµ cm.
A 280
Nång ®é (mg/ml) = ----------------
E 280 x B
Sö dông A205 ®Ó x¸c ®Þnh nång ®é
X¸c ®Þnh nång ®é protein nhê ®o ®é hÊp thô ë 205 nm
(A205) lµ dùa trªn sù hÊp thô nhê liªn kÕt peptide. Nång
®é protein mÉu ®­îc x¸c ®Þnh tõ hÊp thô vµ ®é hÊp thô
ë 205 nm (A205). Thö nghiÖm nµy cã thÓ sö dông ®Ó
®Þnh l­îng dung dÞch protein víi nång ®é protein 1 ®Õn
100 g/ml.
Thö nghiÖm (A 280) cã thÓ sö dông ®Ó ®Þnh l­îng dung
dÞch víi nång ®é protein 20 ®Õn 3000 g/ml.
NÕu biÕt A205 cña protein: sö dông ph­¬ng tr×nh 280
®Ó tÝnh nång ®é protein cña mÉu trõ thay thÕ c¸c
gi¸
trÞ t­¬ng øng cho A205 vµ A205.
NÕu kh«ng biÕt 205: dù ®o¸n nång ®é cña mÉu
protein tõ ®o sù hÊp thô sö dông:
A205
Nång ®é (mg/ml) = -----------
31 x B
Trong ph­¬ng tr×nh nµy, gi¸ trÞ tÝnh hÊp thô, 31, cã
®¬n vÞ ml/mg cm vµ B cã ®é dµi lµ cm.
Sö dông sù ph¸t quang ®Ó x¸c ®Þnh nång ®é protein.

Nång ®é protein cã thÓ ®­îc x¸c ®Þnh nhê ®o sù ph¸t quang

bªn trong dùa trªn sù ph¸t ra quang nhê c¸c acid amin th¬m
tryptophan, tyrosine vµ hoÆc phenylalanine.

Th­êng sù ph¸t quang tryptophan ®­îc ®o. C­êng ®é ph¸t quang

cña c¸c dung dÞch mÉu protein ®o ®­îc vµ nång ®é tÝnh tõ ®­
¬ng cong chuÈn dùa trªn sù ph¸t quang cña c¸c dung dÞch
chuÈn ®­îc chuÈn bÞ tõ protein tinh chÕ. Test nµy cã thÓ
®Þnh l­îng ®­îc dung dÞch protein cã nång ®é 5 ®Õn 50 g/ml.
 Ph©n tÝch Amino acid

Sö dông ph©n tÝch ®Þnh l­îng amino acid ®Ó x¸c ®Þnh

tÝnh chÊt c¸c mÉu protein th­êng bá qua ë nhiÒu phßng
thÝ nghiÖm.

§©y lµ ph­¬ng ph¸p chÝnh x¸c ®Ó x¸c ®Þnh l­îng protein

trong mÉu.

L­îng protein yªu cÇu ®Ó ph¸t hiÖn vµ ph©n tÝch b¸n

®Þnh l­îng cÇn ph¶i thÊp h¬n 0.05 nmol, hoÆc 2.5 g.
§un mÉu trong 10N HCL ë 120oC qua ®ªm. §¸nh
dÊu c¸c amino acid gi¶i phãng ra tr­íc vµ sau cét víi
mµu t­¬ng øng (nh­sù ph¸t quang).  chóng ta cÇn
thiÕt bÞ hiÖn ®¹i ®Ó thùc hiÖn ph­¬ng ph¸p nµy.
 §¸nh dÊu phãng x¹ protein
- HÇu hÕt sö dông ®¸nh dÊu phãng x¹ víi 125I hoÆc 131I (
nöa cuéc sèng lµ 8 ngµy so víi 60 ngµy cña 125I).
 Ièd ho¸ ë tyrosine hoÆc histidine
Peptide hoÆc protein cã thÓ ®­îc ®¸nh dÊu b»ng 14C
hoÆc 3H
- Cã hai ph­¬ng ph¸p s½n cã ®Ó ®¸nh dÊu peptide khång
lµm thay ®æi cÊu tróc cña nã:
§¸nh dÊu 3H nhê khö xóc t¸c (catalytic reduction) cña 127I
(kh«ng phãng x¹) - peptide ®¸nh dÊu vµ tæng hîp peptide
de novo sö dông d¹ng ®¸nh dÊu phãng x¹ bÊt cø amino acid
 §Þnh l­îng protein b»ng so mµu
Biuret assay, Lowry assay, bis- cinchinonic acid (BCA)
assay, vµ Bradford assay.
Ph­¬ng ph¸p Biuret:
Assay ®­îc dùa trªn sù b¸m cña c¸c ion ®ång nªn chuçi
peptide (colored chelate) trong kiÒm m¹nh.
C¸c thµnh phÇn gåm cã hai hoÆc nhiÒu liªn kÕt
peptide ph¶n øng víi c¸c ion ®ång (Cu 2+ ) trong dung
dÞch kiÒm ®Ó h×nh thµnh phøc mÇu n©u sÉm
( reddish-purple colour).
Ho¸ chÊt: alkaline Copper sulphate
§é nhËy: -1 mg (very low)
Peptide bonds (A = 550nm)
Ph­¬ng ph¸p Lowry:
ChÊt ph¶n øng Lowry-Folin-Ciocalteau gåm
Phosphomolybdate vµ phosphotungstate víi c¸c thµnh phÇn
kim lo¹i «xy ho¸.
Assay lµ thö nghiÖm t¹o mµu dùa trªn c¸c ion ®ång vµ chÊt
Folin-Ciocalteau ®èi víi c¸c gèc phenolic. (A = 650 nm)
C¸c chÊt tham gia ph¶n øng ë c¸c amino acid nhËy c¶m
trong protein, e.g., gèc phenolic cña Tyr; Indole cña Trp;
-SH cña Cys V× thÕ, thephosphomolybdate –
phosphotungstate bÞ khö thµnh c¸c muèi mµu xanh
(“molydenum blue”-type salts). HÇu hÕt protein chøa Ýt
Trp hoÆc Cys. Do vËy, mµu ë ®©y phÇn lín lµ do hµm l­îng
Tyr.
§é nhËy: 5 – 10 g nh­ng rÊt kh¸c nhau víi c¸c protein kh¸c
nhau.
Bis-cinchoninic Acid (BCA) Reagent for Proteins:

Bis-cinchinonic acid (BCA) assay cho tÊt c¶ protein lµ

spectophotometric assay dùa trªn sù khö kiÒm (alkaline
reduction) cña ion ®ång thµnh ion cã tÝnh ®ång (cuprous
ion) nhê protein, sau ®ã lµ qu¸ tr×nh chelation vµ ph¸t
triÓn mµu nhê chÊt BCA. (A = 562 nm)
C¸c ion Cu2+ khö thµnh ion Cu1+ nhê amino acid th¬m
trong protein.
C¸c ion Cu1+ + Bicinchoninic Acid -> phøc chÊt víi hÊp thô
lín nhÊt ë 562 nm.
BCA assay cã sù kÕt hîp tèt víi ®é nh¹y vµ ®¬n gi¶n
Ph­¬ng ph¸p Bradford:
Assay dùa trªn sù ®o ®¹c mµu liªn kÕt Coomassie
(Brilliant blue G250).
(A = 595 nm)

 §é nhËy cao nhÊt vµ dÔ sö

dông h¬n Biuret, Lowry,
Vµ BCA nhËy c¶m h¬n cho c¸c
thµnh phÇn kh¸c.
TÝnh tin cËy cña colorimetric assays:
Coomassie (Bradford)(A = 595 nm)
Ph­¬ng ph¸p Lowry (A = 650 nm)
Ph­¬ng ph¸p BCA (A = 562 nm)