P. 1
Dinh Luong Protein

Dinh Luong Protein

|Views: 108|Likes:
Được xuất bản bởiRô Ron

More info:

Published by: Rô Ron on Mar 19, 2010
Bản quyền:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PPT, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

03/19/2010

pdf

text

original

§Þnh l-îng protein vµ c¸c ph-¬ng ph¸p x¸c ®Þnh 1) X¸c ®Þnh hµm l-îng protein trong mÉu

2) Ph©n tÝch amino acid 3) §¸nh dÊu phãng x¹ protein 4) §o hµm l-îng protein tæng b»ng so mµu 5) Gi¶i tr×nh tù aa (Edman degradation)

X¸c ®Þnh dung dÞch protein: ViÖc quan träng trong qu¸ tr×nh tinh chÕ protein lµ thu nhËn protein chóng ta ®· t¸ch. §iÒu ®ã cã thÓ thùc hiÖn ®-îc nhê: Ho¹t tÝnh enzyme, nÕu nã lµ mét enzyme. §¬n gi¶n lµ bÊt kú ph-¬ng ph¸p thuËn tiÖn nµo cña qua tr×nh ®Þnh l-îng c¸c thµnh phÇn mong muèn, nhElectrophoresis.

X¸c ®Þnh dung dÞch protein:
ViÖc quan träng thø hai ®Ó biÕt ®-îc tæng l-îng protein cã trong ph©n ®o¹n mµ ë ®ã chóng ta ®· thu ®-îc enzyme cña m×nh/protein ®Æc tr-ng.

C¸c b-íc so mµu (pectroscopic procedures) X¸c ®Þnh sù hÊp thô cña c¸c acid amin th¬m (aromatic amino acid)

Sö dông A280 ®Ó x¸c ®Þnh nång ®é protein HÊp thô ®o ®-îc ë 280 nm (A280) ®-îc sö dông ®Ó tinh nång ®é protein nhê so s¸nh víi ®-êng chuÈn hoÆc gi¸ trÞ ®é hÊp thô c«ng bè cho protein ®ã (A280). NÕu biÕt A280 cña protein: TÝnh nång ®é ch-a biÕt cña mÉu tõ hÊp thô quang phæ cña nã. Trong ph-¬ng tr×nh nµy A280 cã ®¬n vÞ lµ ml/mg cm vµ B cã ®é dµi lµ cm. A 280 Nång ®é (mg/ml) = ---------------E 280 x B

Sö dông A205 ®Ó x¸c ®Þnh nång ®é X¸c ®Þnh nång ®é protein nhê ®o ®é hÊp thô ë 205 nm (A205) lµ dùa trªn sù hÊp thô nhê liªn kÕt peptide. Nång ®é protein mÉu ®-îc x¸c ®Þnh tõ hÊp thô vµ ®é hÊp thô ë 205 nm (A205). Thö nghiÖm nµy cã thÓ sö dông ®Ó ®Þnh l-îng dung dÞch protein víi nång ®é protein 1 ®Õn 100 Qg/ml. Thö nghiÖm (A 280) cã thÓ sö dông ®Ó ®Þnh l-îng dung dÞch víi nång ®é protein 20 ®Õn 3000 Qg/ml.

NÕu biÕt A205 cña protein: sö dông ph-¬ng tr×nh 280 ®Ó tÝnh nång ®é protein cña mÉu trõ thay thÕ c¸c gi¸ trÞ t-¬ng øng cho A205 vµ A205. NÕu kh«ng biÕt 205: dù ®o¸n nång ®é cña mÉu protein tõ ®o sù hÊp thô sö dông: A205 Nång ®é (mg/ml) = ----------31 x B Trong ph-¬ng tr×nh nµy, gi¸ trÞ tÝnh hÊp thô, 31, cã ®¬n vÞ ml/mg cm vµ B cã ®é dµi lµ cm.

Sö dông sù ph¸t quang ®Ó x¸c ®Þnh nång ®é protein. Nång ®é protein cã thÓ ®-îc x¸c ®Þnh nhê ®o sù ph¸t quang bªn trong dùa trªn sù ph¸t ra quang nhê c¸c acid amin th¬m tryptophan, tyrosine vµ hoÆc phenylalanine. Th-êng sù ph¸t quang tryptophan ®-îc ®o. C-êng ®é ph¸t quang cña c¸c dung dÞch mÉu protein ®o ®-îc vµ nång ®é tÝnh tõ ®-¬ng cong chuÈn dùa trªn sù ph¸t quang cña c¸c dung dÞch chuÈn ®-îc chuÈn bÞ tõ protein tinh chÕ. Test nµy cã thÓ ®Þnh l-îng ®-îc dung dÞch protein cã nång ®é 5 ®Õn 50 Qg/ml.

Ph©n tÝch Amino acid

Sö dông ph©n tÝch ®Þnh l-îng amino acid ®Ó x¸c ®Þnh tÝnh chÊt c¸c mÉu protein th-êng bá qua ë nhiÒu phßng thÝ nghiÖm. §©y lµ ph-¬ng ph¸p chÝnh x¸c ®Ó x¸c ®Þnh l-îng protein trong mÉu. L-îng protein yªu cÇu ®Ó ph¸t hiÖn vµ ph©n tÝch b¸n ®Þnh l-îng cÇn ph¶i thÊp h¬n 0.05 nmol, hoÆc 2.5 Qg.

§un mÉu trong 10N HCL ë 120oC qua ®ªm. §¸nh dÊu c¸c amino acid gi¶i phãng ra tr-íc vµ sau cét víi mµu t-¬ng øng (nh- sù ph¸t quang). chóng ta cÇn thiÕt bÞ hiÖn ®¹i ®Ó thùc hiÖn ph-¬ng ph¸p nµy.

§¸nh dÊu phãng x¹ protein - HÇu hÕt sö dông ®¸nh dÊu phãng x¹ víi 125I hoÆc 131I ( nöa cuéc sèng lµ 8 ngµy so víi 60 ngµy cña 125I). Ièd ho¸ ë tyrosine hoÆc histidine Peptide hoÆc protein cã thÓ ®-îc ®¸nh dÊu b»ng 14C hoÆc 3H - Cã hai ph-¬ng ph¸p s½n cã ®Ó ®¸nh dÊu peptide khång lµm thay ®æi cÊu tróc cña nã: §¸nh dÊu 3H nhê khö xóc t¸c (catalytic reduction) cña 127I (kh«ng phãng x¹) - peptide ®¸nh dÊu vµ tæng hîp peptide de novo sö dông d¹ng ®¸nh dÊu phãng x¹ bÊt cø amino acid

§Þnh l-îng protein b»ng so mµu Biuret assay, Lowry assay, bis- cinchinonic acid (BCA) assay, vµ Bradford assay. Ph-¬ng ph¸p Biuret: Assay ®-îc dùa trªn sù b¸m cña c¸c ion ®ång nªn chuçi peptide (colored chelate) trong kiÒm m¹nh. C¸c thµnh phÇn gåm cã hai hoÆc nhiÒu liªn kÕt peptide ph¶n øng víi c¸c ion ®ång (Cu 2+ ) trong dung dÞch kiÒm ®Ó h×nh thµnh phøc mÇu n©u sÉm ( reddish-purple colour). Ho¸ chÊt: alkaline Copper sulphate §é nhËy: -1 mg (very low) Peptide bonds (A = 550nm)

Ph-¬ng ph¸p Lowry: ChÊt ph¶n øng Lowry-Folin-Ciocalteau gåm Phosphomolybdate vµ phosphotungstate víi c¸c thµnh phÇn kim lo¹i «xy ho¸. Assay lµ thö nghiÖm t¹o mµu dùa trªn c¸c ion ®ång vµ chÊt Folin-Ciocalteau ®èi víi c¸c gèc phenolic. (A = 650 nm) C¸c chÊt tham gia ph¶n øng ë c¸c amino acid nhËy c¶m trong protein, e.g., gèc phenolic cña Tyr; Indole cña Trp; -SH cña Cys V× thÕ, thephosphomolybdate ± phosphotungstate bÞ khö thµnh c¸c muèi mµu xanh (³molydenum blue´-type salts). HÇu hÕt protein chøa Ýt Trp hoÆc Cys. Do vËy, mµu ë ®©y phÇn lín lµ do hµm l-îng Tyr. §é nhËy: 5 ± 10 Qg nh-ng rÊt kh¸c nhau víi c¸c protein kh¸c nhau.

Bis-cinchoninic Acid (BCA) Reagent for Proteins:
Bis-cinchinonic acid (BCA) assay cho tÊt c¶ protein lµ spectophotometric assay dùa trªn sù khö kiÒm (alkaline reduction) cña ion ®ång thµnh ion cã tÝnh ®ång (cuprous ion) nhê protein, sau ®ã lµ qu¸ tr×nh chelation vµ ph¸t triÓn mµu nhê chÊt BCA. (A = 562 nm) C¸c ion Cu2+ khö thµnh ion Cu1+ nhê amino acid th¬m trong protein. C¸c ion Cu1+ + Bicinchoninic Acid -> phøc chÊt víi hÊp thô lín nhÊt ë 562 nm.

Ph-¬ng ph¸p Bradford:
Assay dùa trªn sù ®o ®¹c mµu liªn kÕt Coomassie (Brilliant blue G250). (A = 595 nm)

§é nhËy cao nhÊt vµ dÔ sö dông h¬n Biuret, Lowry, Vµ BCA nhËy c¶m h¬n cho c¸c thµnh phÇn kh¸c.

TÝnh tin cËy cña colorimetric assays:
Coomassie (Bradford)(A = 595 nm)

Ph-¬ng ph¸p Lowry (A = 650 nm)

Ph-¬ng ph¸p BCA (A = 562 nm)

You're Reading a Free Preview

Tải về
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->