USO Y CUIDADO DEL ESPECTROFOTMETRO DE

ABSORCIN UV-VISIBLE
OBTENCIN DEL ESPECTRO DE AZOSULFAMIDA
CURVA DE RINGBOWN
1.- OBJETIVOS
Operar correctamente el espectrofotmetro de absorcin UV-Visible
MODELO GENESYS 10S UV-VIS MARCA THERMO SCIENTIFIC.
Adquirir experiencia en la obtencin de espectros de absorcin.
Demostrar la interaccin de la energa radiante y la materia a travs de
los espectros de absorcin.
Determinar la longitud de onda ptima de la sustancia y sus aplicaciones
analticas.
Determinar la zona de trabajo y la concentracin ptima.
2. FUNDAMENTO
Las radiaciones ultravioleta y visible tienen en comn el que la absorcin en
ambas regiones provoca la excitacin de electrones a niveles de energa
superiores. Para excitar a los electrones fuertemente unidos se requiere, en
general fotones energticos (de longitud de onda corta), mientras que los
electrones unidos lbilmente (deslocalizados) pueden excitarse con radiacin
de longitud de onda ms larga.1
La mayor parte de los trabajos analticos se realizan con soluciones de manera
que vamos a desarrollar la relacin que existe entre la concentracin de la
solucin y su capacidad de absorber radiacin. 2
Para poder comprender e interpretar los espectros electrnicos de absorcin es
preciso tener en cuenta que tipo de transiciones electrnicas pueden tener
lugar cuando se absorbe radiacin ultravioleta o visible. En esta regin pueden
darse seis tipos de bandas de absorcin (sin tener en cuenta los espectros de
resonancia de carga y resonancia electrnica de los iones y radicales orgnicos
inestables) que se deben a las transiciones electrnicas siguientes: >> *;
n >> *; >> *; n >> *, de trasferencia de carga y transiciones de campo
ligando. Los distintos tipos de transiciones pueden identificarse claramente por
la zona del espectro donde aparecen, por sus intensidades relativas y, en
algunos casos por los desplazamientos observados al variar el disolvente. 3
Las intensidades de absorcin suelen expresarse en trminos de
absortividades molares.

 = A/bC
Siendo:
A= Absorbancia
b= camino ptico, en cm
C= concentracin molar
El valor de la absortividad molar depende del tamao de la especia absorbente
y de la probabilidad de la transicin Para que haya interaccin, el fotn debe
chocar con la molcula dentro de un espacio de dimensiones aproximadas al
tamao de la molcula y la probabilidad de la transicin es proporcional al
nmero de impactos que producen absorcin.3

Fundamento de la espectrofotometra de absorcin UV-VISIBLE

3. PARTE EXPERIMENTAL
MATERIALES:
Equipos y reactivos:

Espectrofotmetro UV Visible: Modelo GENESYS 10S UV- Visible

Cubeta de Cuarzo de 1cm
Solucin estndar de Azosulfamida 500g/ml
Pipetas de diferentes volmenes
Fiolas de diferentes volmenes
Agua destilada
Propipeta

4 CLCULOS
Con ayuda del espectrofotmetro GENESYS 10S UV-VISIBLE se determin el
%Transmitancia, mientras que para el clculo de las Absorbancias se us la
siguiente frmula: 2-log (%T), esto para graficar la curva espectral. La curva
espectral nos determina la longitud de onda mxima para nuestra sustancia. Se
complet el siguiente recuadro para una solucin de azosulfamida de diferentes
concentraciones:
Concentracin 1
(nm)
%T
450
43.3
455
41.3
460
38.3
465
34.7
470
30.9
475
27.1
480
23.6
485
20.5
490
17.9
495
15.5
500
13.7
505
12.2
510
11
515
10.1
520
9.5
525
9.3
530
9.2
535
9.5
540
10.3

A
0.364
0.384
0.417
0.460
0.510
0.567
0.627
0.688
0.747
0.810
0.863
0.914
0.959
0.996
1.022
1.032
1.036
1.022
0.987

Concentracin 2
(nm)
%T
450
62.2
455
61.2
460
59.6
465
57.5
470
55
475
52.5
480
49.8
485
47.3
490
44.8
495
42.5
500
40.5
505
38.8
510
37.3
515
36.2
520
35.4
525
35
530
35
535
35.4
540
36.4

A
0.206
0.213
0.225
0.240
0.260
0.280
0.303
0.325
0.349
0.372
0.393
0.411
0.428
0.441
0.451
0.456
0.456
0.451
0.439

545
550
555
560
565
570
575
580
585
590
595
600

11.3
12.9
15.2
18.2
22.1
26.7
31.9
37.6
43.5
49.3
54.9
60

0.947
0.889
0.818
0.740
0.656
0.573
0.496
0.425
0.362
0.307
0.260
0.222

545
550
555
560
565
570
575
580
585
590
595
600

37.7
39.7
31.8
45.3
48.7
52.4
56
59.6
53.2
66.3
69.2
70.5

0.424
0.401
0.498
0.344
0.312
0.281
0.252
0.225
0.274
0.178
0.160
0.152

La curva de Ringbown nos determina la concentracin ptima y la

concentracin mnima y mxima, es decir la zona de trabajo. Para ello se
calcul las Absortancias de la azosulfamida de diferentes concentraciones,
usando la frmula Absortancia = 100 - %T. Se complet el siguiente recuadro:
Diferentes concentraciones
[ ] g/ml
%T
A
0.1
95.6
4.4
0.5
98.9
1.1
1
90.1
9.9
2
83.5
16.5
4
60
40.0
6
61.1
38.9
8
85.4
14.6
10
44.2
55.8
15
28.9
71.1
20
24.6
75.4
30
12.7
87.3
40
8
92.0
50
2.4
97.6
80
0.3
99.7
100
0.1
99.9

5. RESULTADOS
Con los datos obtenidos se obtienen las siguientes grficas:

%T vs Longitud de onda

Curva Espectral De Azosulfamida

Absorbancia vs Longitud de onda

En esta grfica se observa que en la solucin de concentracin 2 existen 2

picos, mientras que en la solucin de concentracin 1 no observamos ningn
pico.
La aparicin de estos picos puede deberse a posibles causas:

interaccin del operador y el aparato de medicin

condiciones experimentales fluctuantes

variabilidad inherente en los instrumentos de medicin

una calibracin incorrecta del instrumento de medicin
un error consistente en el uso del instrumento
condiciones experimentales inadecuadas

Tambin podemos observar que en la solucines de concentracin 1 y 2 la

longitud de onda ptima es de 530nm.
Curva de Ringbown
Segn el grfico se determina una concentracin ptima de 9.5g/ml y una
zona de trabajo que va desde 1.6 a 50g/ml.

6. DISCUSION
El registro de la variacin del coeficiente de absortividad molar , o de la
absorbancia A, o de la transmitancia T, en funcin de la longitud de onda
da origen a lo que se denomina " espectro " o curva espectral de una
sustancia qumica e indica las caractersticas de absorcin de dicha
sustancia con relacin a la longitud de onda. En muchas ocasiones la curva
espectral se presenta como Absorbancia vs longitud de onda y el espectro se
denomina espectro de absorcin, o en funcin de la transmitancia,
denominndose el espectro, espectro de transmisin. 4
En esta prctica se realiz tanto el espectro de absorcin como el espectro de
transmisin de la azosulfamida, obteniendo a partir de ella la longitud de onda
ptima, la cual fue de 530nm; esto nos servir para el trazo de la curva de
Ringbown.
Para obtener el intervalo ptimo y adecuado de concentraciones con el menor
error por lectura primero se construye la curva de Ringbown que consiste en
construir una grfica de absortancia (100%-T) vs la concentracin. 5
Para la mayora de los sistemas la curva de Ringbom corresponde a una curva
en forma de S. La parte lineal de esta grfica permite obtener el intervalo de
concentraciones ptimo o el intervalo que presentara una relacin lineal entre
absorbancia y concentracin.5
En el caso de la curva de Ringbown se obtuvo como concentracin ptima
9.5g/ml aproximadamente, la concentracin mnima fue de 1.6g/ml y la
concentracin mxima fue de 50g/ml.
7. CONCLUSIONES

El buen manejo y cuidado del espectrofotmetro determina la efectividad

de nuestros resultados al momento de analizar las muestras. Es
indispensable antes de analizar una sustancia calibrar el instrumento,
usando el blanco (solvente) al 100% T.

Las diferentes sustancias tienen diferentes comportamientos frente las

radiaciones electromagnticas por lo cual al llevarlas al
espectrofotmetro este nos brinda las absorbancias de cada
concentracin de las sustancias.

La longitud de onda mxima obtenida en las dos concentraciones de

azosulfamida fue de 530nm.

Determinando la curva de Ringbown podemos demostrar mediante

trazos y rectas en la grfica, que no todas las concentraciones cumplen
con la ley de Lambert- Beer; es decir, se halla la concentracin ptima y
la zona de trabajo ptima (concentraciones mnima y mxima).

8. CUESTIONARIO
1.- Describa cada uno
espectrofotmetro UV-V. 6

de

los

sistemas

que

componen

el

Los cinco componentes esenciales de la radiacin UV-VIS instrumentos son los

siguientes.

Una fuente de radiacin estable.

Selector de longitud de onda.
Portamuestras.
Detector o transductor de la radiacin.
Procesamiento de seales y dispositivo de salida.

Fuentes de radiacin
Una
fuente
de
radiacin
espectrofotomtrica debe proporcionar
una salida estable de alta energa en un
amplio intervalo de longitudes de onda.
No hay una fuente barata disponible que
puede proporcionar una salida estable
durante toda la gama de UV-visible (190
nm a 780 nm). Se utilizan normalmente
fuentes continuas para las mediciones
de
absorcin
molecular. Algunos
ejemplos
de
fuentes
continuas
comnmente utilizados estn:

(a) Lmpara de deuterio para el

rango UV. (b) Lmpara de tungsteno
para el rango visible.

Las lmparas halgenas de tungsteno, que tienen una temperatura

radiante T de 3000 K y por lo tanto tienen un espectro radiante mximo a
una longitud de onda de aproximadamente 1,2 m; son ampliamente
utilizados en el visible y por encima de los 330 nm.
Las lmparas de deuterio (lmparas de descarga de gas) que emiten
fuertemente en la regin UV por debajo de los 330 nm, el espectro
continuo de deuterio tiene lneas de emisin atmica en superposicin.
Las lmparas de arco de xenn que le dan un continuo que va desde
menos de 190 nm y por encima de 1000 nm.

Selectores de longitud de onda

En las mediciones espectrofotomtricas tenemos que usar una banda estrecha
de longitudes de onda de la luz. Esto mejora la selectividad y la sensibilidad del
instrumento. Instrumentos menos costosos usan un filtro para aislar la energa
radiante y proporcionar una amplia banda de longitudes de onda.
En muchas aplicaciones es necesario variar continuamente la longitud de onda
en un rango definido. Esto puede lograrse mediante el uso de
monocromadores.
Compartimientos de muestras
Muestras lquidas
Las muestras lquidas estn usualmente contenidas en
celdas fotomtricas y estas se ubican en
compartimientos o contenedores especiales. Los
contenedores pueden ser calentados o enfriados con
el fin de controlar la temperatura del lquido en la celda
de muestra.
Muestras gaseosas
Los gases y vapores se miden en celdas para gases
similares a los utilizados para lquidos. Generalmente,
el paso de luz a travs de la celda es mucho mayor.
Los gases a cualquier presin se encuentran en celdas
cerradas para su medicin.

Cubetas o celdas
comnmente
empleadas
en
espectrofotometra
UV-VIS.

Muestras slidas
Las
muestras
slidas
se
mantienen
en
compartimientos especiales. Cuando se miden sus
absorbancias, se experimentan dificultades, por
ejemplo en la adecuacin de la muestra y la longitud de los caminos de
referencia.
Detectores
Los detectores se utilizan para convertir una seal luminosa a una seal
elctrica que puede ser adecuadamente medida y transformada en una salida.
Los detectores usados en la mayora de los instrumentos generan una seal,
que es lineal en la transmitancia, es decir, que responden linealmente a la

potencia radiante que incide sobre ellos. Los valores de transmitancia se

pueden cambiar logartmicamente en unidades de absorbancia por una
disposicin elctrica o mecnica en la seal de lectura del dispositivo.
Adquisicin y procesamiento de datos
La seal elctrica procedente del transductor est convenientemente
amplificada o procesada antes de ser enviada a la grabadora para dar una
salida. La resta del espectro del disolvente del espectro de la solucin se hace
electrnicamente.
La grfica de salida entre la longitud de onda y la intensidad de absorcin es la
resultante del proceso de sustraccin y es caracterstico de la especie
absorbente.
2. En qu consiste el calibrado del instrumento?

La calibracin de espectrofotmetros consiste en realizar un conjunto de

operaciones que tienen como finalidad determinar la magnitud de los errores
que comete el instrumento al realizar las mediciones, dichos errores son
obtenidos al comparar los resultados de cada medicin con los valores
certificados de un material de referencia, tomando en cuenta que las
mediciones son realizadas bajo las mismas o similares condiciones y
empleando la misma metodologa. De la calibracin se obtiene la
incertidumbre, de esta y de la tolerancia se derivan los factores de correccin
que el instrumento requiere, lo que resulta ser un indicativo de s el instrumento
demanda o no un ajuste.
Calibracin de la longitud de onda: Es la determinacin de la exactitud en la
escala de longitud de onda.
Calibracin de la escala fotomtrica: Similarmente a la calibracin de la
escala de longitud de onda, es posible utilizar un patrn para la calibracin de
la escala fotomtrica, es decir la escala de transmitancia o de absorbancia del
instrumento.
Linealidad de la escala fotomtrica: Esta prueba determina la exactitud de
los instrumentos para medir absorbancias con el incremento de la
concentracin, evidentemente, los problemas de linealidad en los
espectrofotmetros producen resultados incorrectos.
Ruido fotomtrico: El ruido fotomtrico es una medicin de la relacin
Seal/Ruido de un instrumento. Esta prueba es monitoreada como una funcin
del tiempo, determina la variacin entre la absorbancia a travs de un periodo
corto tiempo en una longitud de onda establecida.
Estabilidad fotomtrica: Este parmetro provee una indicacin de cun
estable es el espectrofotmetro en un amplio tiempo de medicin. Es la
diferencia entre el pico mnimo y el pico mximo en un periodo no menor de 1
hora.

Lnea base plana: Esta prueba determina las variaciones del valor fotomtrico
a lo largo de toda la distribucin espectral o en el intervalo deseado con el
compartimiento de muestras vaco.
Ancho de banda espectral: Se compara el ancho de banda espectral
seleccionado por el instrumento y el ancho de banda determinado por clculo,
cuyo valor corresponde a la diferencia de longitudes de onda del punto medio
de la banda.
Luz extraviada: La luz extraviada es cualquier radiacin que llega al detector y
que no posee una longitud de onda similar a la seleccionada. El detector no
puede diferenciar entre la luz extraviada y la luz proveniente de la muestra y
por tanto une ambas seales, dando indicaciones incorrectas.
3. Qu es la precisin fotomtrica?

Se denomina precisin fotomtrica a la medida de la dispersin de una serie de

mediciones de transmitancia o absorbancia alrededor de la media y se expresa
como coeficiente de variacin porcentual.
4. A qu se debe la diferencia de los espectros de la sustancia
estudiada?
Uno de los principales factores que determinan la diferencia de un espectro y
otro es la concentracin, ya que en nuestro caso se analiz la misma sustancia
pero a dos concentraciones diferentes. Existe una relacin directa entre la
concentracin de la sustancia y la absorbancia, efectivamente esto se observa
en nuestra grfica en la cual podemos deducir que aquel espectro que tiene
una absorbancia mayor es la que se encontraba a una concentracin mayor.
5. Si se traza la curva espectral de tres soluciones de concentraciones
distintas de una misma sustancia variar la longitud de onda de mxima
absorcin? Explique con un ejemplo.
No vara la longitud de onda de mxima absorcin, un ejemplo claro est en los
espectros obtenidos en nuestra prctica con azosulfamida, en ella se ve
claramente que la longitud de onda mxima se mantiene; mientras que solo se
evidencia una diferencia en la absorbancias, esto ya se explic anteriormente
por la relacin directa que existe entre la concentracin de la sustancia y la
absorbancia.
6. Ubique la zona de trabajo y la concentracin ptima de lectura.
La concentracin ptima obtenida en nuestra grfica de azosulfamida fue de
9.5g/ml aproximadamente.
La zona de trabajo vara de 1.6 a 50g/ml.

7. De acuerdo a la curva de Ringbown, explique y fundamente a qu se

debe la formacin de mesetas, inferior y superior? 9
Para obtener el intervalo ptimo de concentraciones primero se construye la
curva de Ringbom, que consiste en construir una grfica de absorbancia (100%T) vs. Log Concentracin. Para la mayora de los sistemas la curva de
Ringbom corresponde a una curva en forma de S con una meseta superior y
una meseta inferior. La parte lineal de esta grfica permite obtener el intervalo
de concentraciones ptimo o el intervalo que presentara una relacin lineal
entre absorbancia y concentracin. En esta grfica, se trazan lneas paralelas
en las mesetas superior e inferior, permitiendo realizar los cruces de la parte
recta (la intermedia), con la parte baja y con la parte alta, los cuales pueden
servir para determinar un valor para los lmites de deteccin mnimo y mximo,
respectivamente.
8. Investigue sobre los principales errores en la lectura de absorbancia
relacionados con la concentracin. (Error relativo C/C) y error absoluto
T y la curva de Crackford.
Los errores indeterminados que se producen en la lectura de las escalas de
transmitancia o absorbancia son errores instrumentales siempre presentes y
deben ser tomados en cuenta por todos los usuarios de espectrofotmetros
cuando realizan mediciones cuantitativas. Pequeos errores en la lectura de la
transmitancia o de la absorbancia pueden ocasionar errores grandes en la
concentracin cuando se opera en los extremos de la escala.
El error absoluto cometido en la determinacin de la concentracin, para una
cierto error de lectura de transmitancia, es pequeo, pero al ser pequea la
concentracin, el error relativo puede ser grande. Esto es, el error absoluto en
una concentracin es pequeo, ahora bien el error relativo (el error absoluto
dividido por la concentracin a determinar) ser elevado, dando lugar de nuevo
a poca precisin en la medida de la concentracin, intuitivamente se puede
concluir que parece razonable aceptar que los valores intermedios de la
transmitancia son los que darn una precisin ptima, esto explica la
importancia de la grfica de la curva de Ringbown.
Curva de Crackford:
Si:
(C/C) / T = 0.4343 / T. logT.
A partir de esta ltima relacin se construye la curva del error o curva de
Crawford graficando el valor absoluto de (D C/C) / D T vs. T, tomando
transmitancia entre cero y uno.
Esta grfica indica que el error depende en forma compleja de la medida de la
transmitancia y para valores muy bajos o muy altos de transmitancia, el error
en la concentracin crece exponencialmente, mientras que para valores

intermedios el error permanece aproximadamente constante, presentndose un

mnimo error en la concentracin para la transmitancia correspondiente a 0.368
o 36.8 %T.
9. BIBLIOGRAFIA
1. Olsen E. Mtodos pticos de anlisis. Espectrofotometra ultravioleta y
visible. Reverte. Barcelona, 1990. Pg. 87-88.
2. Brunatti C, Martn A. Introduccin a la Espectroscopa de Absorcin
Molecular Ultravioleta, Visible e Infrarrojo Cercano. Medicin de
Transmitancia y Absorbancia. Pg 2.
3. Olsen E. Mtodos pticos de anlisis. Espectrofotometra ultravioleta y
visible. Reverte. Barcelona, 1990. Pg. 91.
4. Universidad Nacional de Colombia. Establecimiento de un mtodo
espectrofotomtrico.URL:
http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/2001184/lecciones/Cap10/
01_01_01.htm
5. Skoog Douglas, Principios de anlisis instrumental. 6ta edicin.
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6. Datateca.unad. [internet]. Instrumentacin de la espectrofotometra UVVIS.
[Citado
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enero
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Disponible
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http://datateca.unad.edu.co/contenidos/401539/exe-2%20de
%20agosto/leccin_5_instrumentacin_de_la_espectrofotometra_uvvis.htm
l
7. Chacn S. Caracterizacin de un espectrofotmetro Ultravioleta Visible
para ser utilizado en la certificacin de materiales de referencia.
[Internet],
2002.
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Rica.
Disponible
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http://www.lacomet.go.cr/documentosweb/quimica/2011/Publicaciones/sa
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8. Claudio Duymovich, Rosana Acheme, Sandra Sesini, Daniel Mazziotta.
Espectrofotmetros y Fotocolormetros Gua prctica de actualizacin.
[Internet], 2005. Disponible en: http://www.scielo.org.ar/scielo.php?
script=sci_arttext&pid=S0325-29572005000400014
9. Blogspot.pe. Grficas de Ringbown [internet], 2010. [Actualizado 10 de
junio de 2010; Citado 28 de enero de 2016]. Disponible en:
http://rocioeevelyn.blogspot.pe/