LOGO

THC TP VI SINH
Chng trnh i hc

NI DUNG CHNH
Phn 1. CHUN B MI TRNG, THAO TC V
TRNG V BO QUN GING VI SINH VT
Phn 2. QUAN ST, PHT HIN VI SINH VT
Phn 3. NH LNG VI SINH VT

Phn 1. CHUN B MI TRNG, THAO

TC V TRNG V BO QUN GiNG VI
SINH VT
Bi 1. Phng php kh trng
Bi 2. K thut v trng
Bi 3. Pha ch mi trng
Bi 4. Cy chuyn v phn lp vi sinh vt
Bi 5. Bo qun ging vi sinh vt

Phn 2. QUAN ST, PHT HIN VI

SINH VT
Bi 6. Phng php quan st v pht
hin vi sinh vt di knh hin vi
Bi 7. Phng php nhum n v
nhum Gram

Phn 3. NH LNG VI SINH VT

Bi 8. Cc phng php nh lng vi sinh

vt

NH GI MN HC
1.
2.
3.
4.

Thc hnh ti lp: 20%

Bi thu hoch th nghim vi sinh: 10%
Bi tp tng hp: 20%
Thi cui mn hc: 50%

Bi 1. Phng php kh trng

Nguyn tc:
S dng cc tc nhn l ho: nhit , bc
x, lc, ho cht.
Kh trng mi trng, dng c bng
autoclave
Kh trng dng c thu tinh bng phng
php nhit kh

Bi 2. K thut v trng
Nguyn tc: Loi tr vi sinh vt tp nhim
Dng c
Thit b h tr
Thao tc

Bi 3. Pha ch mi trng
Nguyn tc:
- Dinh dng ph hp
- pH thch hp
- Khng c cht c hi
- V trng
Phn loi:
- Mi trng t nhin, tng hp, bn tng hp
- Mi trng lng, rn, rn mm
- Mi trng chn lc, kim nh
Thc hnh

Bi 3. Pha ch mi trng
Mi trng Hansen:
- Glucose: 50g
- Pepton : 10g
- K2HPO4 : 3g/l
- MgSO4 : 3g/l
- Agar
: 20 g/l (+/-)
- Nc ct 1 lt
pH= 6

Mi trng PGA
- Glucose: 50g
- Agar
: 20 g/l (+/-)
- Dch chit khoai ty/gi
1 lt
( 500 g khoai ty gt v/ ct
thi/ nu k vi 1 lt nc
trong 2h. Lc/ thm nc
cho va 1 lt)

Bi 4. Cy chuyn v phn lp vi sinh vt

CY CHUYN GING
1. Cy ging t mi trng lng sang mi
trng lng
2. Cy ging t ng thch nghing sang ng
thch nghing
3. Cy ging t ng thch nghing sang mi
trng lng

Bi 4. Cy chuyn v phn lp vi sinh vt

PHN LP GING: K THUT TO
KHUN LC N
1. K thut ria
2. K thut tri

Thao tc cy chuyn (lng lng)

13

Thao tc cy chuyn (lng lng)

14

Thao tc cy chuyn
(thch nghing thch nghing)

15

Thao tc cy chuyn
(thch a thch nghing)

16

PHN LP GING
Tch ring vi sinh vt thu ging thun
Nguyn tc: dn mng (pha long) hn hp vi
sinh vt sao cho c th thu c khun lc
thun
Thng dng thao tc cy ria
C th dng thao tc cy tri, a

17

Thao tc cy ria
(ng nghim-thch a)

18

Thao tc cy ria
(thch a-thch a)

19

ng di chuyn u que cy

20

t nng que cy

 ngui

a que cy vo trong ng ging v ly ging

Thao tc cy tri (cy trang)

0.1 ml

26

Bi 5. Bo qun ging vi sinh vt

1.
2.
3.
4.

Cy chuyn
Bo qun ging bng glyceron
Bo qun ging bng phng php lm kh
ng kh

Bi 6&7. Quan st v pht hin vi sinh

vt _Nhum Gram
Quan st di knh hin vi
Phng php nhum n
Phng php nhum Gram

LOGO

Bi 8. CC PHNG PHP
NH LNG VI SINH VT

Khi nim v nh lng vi sinh vt

nh lng vi sinh vt l xc nh s lng vi
sinh vt tng s hay s lng vi sinh vt ring
bit trn mt n v vt phm em nghin cu
(trn g hoc ml dung dch).

Cc phng php nh lng

2
4

Phng
php m Phng php
t bo qua
MPN
knh hin vi

Phng
php mng Phng php
Phng php
lc
m khun lc
o ATP

III.Cc phng php nh lng

6
7

Phng
php
o
c

Phng
php xc
nh sinh
khi

Phng
php
PCR

Phng php m t bo qua knh hin vi

L phng php trc tip m s t bo vi sinh vt

c trn tiu bn lm t vt phm nghin cu.
C hai cch m trc tip qua knh hin vi l m
mu c nh (mu kh) v s dng bung m.

m bng bung m hng cu

Nguyn tc :
- Bung m l nhng lam knh c khc rnh
phn thnh mng li, cc vung cc nh c
kch thc xc nh.
- Trn mi vung gia lam knh v lame l mt
th tch xc nh ,tuy nh nhng rt chnh xc.
- m s t bo trn cc di knh hin vi v
nhn vi th tch tng ng c th quy ra s t
bo vi sinh vt trong mt ml mu.
Tin hnh.

S tin hnh
Nc

Nh ln hai khoang

y l knh (dng tay n nh)

Nh ln cnh bung m

Thm nc d

Quan st qua knh

m s t bo trn 5 ln

Mu

PhaA long

Nc

Phng php m

Phng php m trc tip bng

bung m hng cu

x1

x4

L knh
x3

Vng cha
t bo VSV

Cu to bung m
hng cu

x2

x5

xi [50- 200]

Kt qu

a * 4000*b
x=
*1000
c
x : lng t bo trong mt ml
a : s lng t bo trong 5 ln.
b : t l pha long canh trng (nghch o nng pha
long)
c : s nh trong 5 ln (c=16x5=80)

Nhn xt
u im ca phng php m bng bung m
Nhanh chng
n gin

Nhn xt
Nhc im:
1.Khng phn bit c t bo sng v t bo
cht.
2.Ch thch hp vi t bo c kch thc ln (
nm men, nm mc.)
3.Kh t chnh xc cao
4.Cn c knh hin vi phn pha khi mu khng
c nhum.
5.Phng php ny khng thch hp trong
trng hp huyn ph mt thp

Phng php MPN

Phng php pha long ti hn cn c gi l phng
php s dng ch s xc sut cao nht ( most probable
number method).
Trong phng php ny, ngi ta s dng h s pha
long lien tip cp thp phn pha long huyn ph vi
sinh vt ban u ( h s pha long c chn l 10o, 10-1,
10-2, 10-3). ng vi mi h s pha long, ta tin hnh cy
mt lng munh nhau vo 3, 5 hoc 10 ng nghim
cha sn mi trng v trng thch hp cho s pht trin
ca loi vi sinh vt cn nh lng.
em tt c cc ng nghim sau khi cy trong t m
nhit thch hp. Sau mt khong thi gian xc nh, tin
hnh m s ng nghim c vi sinh vt pht trin tng
ng vi mi h s pha long.

Phng php MPN

nhn bit c s pht trin ca loi vi sinh vt cn
nh lng trong ng nghim hay khng, ngi ta
da vo c ca canh trng, s sinh kh hoc
sinh acid lm chuyn mu mi trng.
Da vo s ng nghim dng tnh cc h s pha
long khcnhau, s dng bng MPN, ta s suy ra
c kt qu.
Trong bng MPN ca Mac Crady ( tng c xy
dng trn c s x l xc sut thng k mt khi
lng ln cc kt qu th nghim), kt qu c
biu din di dng ch s xc sut cao nht vi
mc gii hn trn v mc gii hn di, tin cy
95 %.

Phng php MPN

u im ca phng php MPN l cho php
chng ta nh lng c vi sinh vt c nng
thp (nh hn 100 t bo/ ml hoc g).

Phng php MPN

Khi s dng phng php MPN cn bit mt s
gi thuyt sau:
+ Cc vi sinh vt c phn b mt cch ngu
nhin trong mu.
+ T bo vi sinh vt tn ti dng ring l, khng tn
ti dng chm hoc dng chui.
+ Mi trng v iu kin nui cy cho php
chng ta pht hin c s sinh trng ca vi
sinh vt trong cc ng nghim cho d mu cy
ban u ch cha mt t bo.

Phng php MPN

C th thc hin phng php ny theo hai cch:
Vi mt nng pha long.
Vi vi nng pha long.

Phng php dung mt loi ng nghim vi mt nng

pha long duy nht ph hp hn khi mt vi khun
c nh gia mc thp nht v mc cao nht r rang l
khng chnh nhau n 100 ln v khi mt vi khun
c nh rt thp.
Chng hn khi kim tra mu nc thanh trng. Trong
nhng trng hp khc ngi ta thng dung vi nng
pha long khc nhau. Phng php ba nng c
dng ph bin nht.

Phng php MPN

Tin hnh nh sau:
Tin hnh pha long mu vi h s pha
long l 10o, 10-1, 10-2, 10-3
ng vi mi h s pha long, lc u v cy
mu vo ba ng nghim cha mi trng
dch th.
t cc ng nghim vo t m v nui
35oC.
Sau 48 gi, c kt qu. Nhng ng nghim
dng tnh c canh trng b vn c hoc
xut hin hin tng sinh kh.

Cc mu pha long

S ng dng tnh

S ng dng tnh

Khong tin cy

0.1

0.01

0.001

MPN/g

< 3.0

Khong tin cy

thp

cao

0.1

0.01

0.001

MPN/g

thp

cao

9.5

21

4.5

42

0.15

9.6

28

8.7

94

0.15

11

35

8.7

94

6.1

1.2

18

29

8.7

94

6.2

1.2

18

36

8.7

94

9.4

3.6

38

23

4.6

94

3.6

0.17

18

38

8.7

110

7.2

1.3

18

64

17

180

11

3.6

38

43

180

7.4

1.3

20

75

17

200

11

3.6

38

120

37

420

11

3.6

42

160

40

420

15

4.5

42

93

18

420

16

4.5

42

150

37

420

9.2

1.4

38

210

40

430

14

3.6

42

290

90

1000

20

4.5

42

240

42

1000

15

3.7

42

460

90

2000

20

4.5

42

1100

180

4200

27

8.7

94

>1100

420

3.nh gi :
Vi phng php ba nng pha long ta
ch cn lp dy s cc ng dng tnh v tra
theo bng bit gi tr MPN tng ng ca
mu th.
Phng php MPN c th dung nh
lng bt k loi vi sinh vt no vi iu kin
phi dng mi trng tng sinh chn lc
(mi trng lng) cho kt qu kh ph hp,
chng hn BGBL kt hp vi ch nhit
37oC cho Coliform, 45oC cho Coliforms phn,
Manitol Salt Broth cho Staphylococus

Phng php gin tip m

khun lc
Nguyn tc:
_ Bn cht ca phng php ny l cy mt th tch
xc nh mu huyn ph vi sinh vt ln mi
trng trng thch trong hp petri.
_ Sau mt khong thi gian nui cy, trn b mt
thch s xut hin khun lc v ta c th quan st
c bng mt thng.
_ Da vo s khun lc m c, th tch mu
cy v h s pha long, ta c th suy ra s khun
lc c trong 1ml mu kho st ban u.

Xc nh s t bo sng
bng phng php m khun lc

a, cy tri

Nhn xt
u im:
_ Ta nh lng nhng t bo sng c trong mu kho st ban
u.
_ c ng dng rng ri hn cc phng php khc, c bit
l kim tra thc phm,bnh phm, cht lng v sinh ca
nc.
_ nhy kh cao, cho php pht hin tng i chnh xc mc
nhim khun i vi sn phm.
Nhc im:
_ Thi gian di v tn km chi ph ho cht
_ Nhn cng nhiu hn so vi phng php khc

Phng php cy gt
_
Chun b mi trng thch trong erlen v i hp tit trng.
Sau khi lm ngui mi trng thch v nhit 50oC, mi
trng thch vo hp petri v khun. Cc hp c xp trn mt
phng nm ngang cho n khi thch ngui. Ngi ta bao gi v
lt p cc hp petri li ri em i bo qun trong t nhit
phng trong thi gian 2-3 ngy kim tra v trng ca mi
trng.
_
ng vi pha long, lc u mu v dng pipet v trng
ly chnh xc mt lng th tch mu cho ln b mt thch hp
petri. Th tch ly mu khng qu 0,1ml.

Phng php cy gt
_ Sau dng que cy gt v trng dn u mu trn b mt
thch. v trng que cy gt. Ta nhng que cy vo dung
dch cn 70o. Ta vy ro v a que cy ln ngn la n cn
lm chy i phn cn cn ng li trn qua. Ngay sau , ta
c th s dng que cy gt dn u mu trn b mt thch.
_ Ch cho b mt thch kh, tin hnh bao hp petri, lp p hp
v t chng vo t m. Nui cy trong 2-3 ngy nhit
thch hp.
_ i vi mi pha long, cn tnh hnh gieo cy t nht l
trong 2 hp petri. S dng 1 pipet v trng v 1 que cy gt
cho mi pha long.

Phng php hp
_ Chun b mi trng thch v hp tit trng. Mi ng nghim
cha 25ml mi trng thch. Trc khi em s dng, t cc
ng nghim vo b iu nhit nhit 50oC thch bn
trong ng tan chy tr li.
_ S dng cc hp petri c v khun trc. ng vi mi
pha long, dng pipet v trng ly chnh xc mt th tch
mu cho vo hp petri . Th tch mu c th dao ng t 0,11,0ml.
_ Lc u phn mi trng trong ng nghim v tip vo hp
petri. Xoay hp mu huyn ph vi sinh vt v mi trng
thch c trn u vi nhau.
_ Ch cho thch ng li ri tin hnh bao gi cc hp petri, lt
p hp ri t vo t m.

Phng php mng lc

Phng php mng lc (Membrane Filter Method)
thng c dng nh lng vi sinh vt (c
bit l vi sinh vt ch th) trong mu nc khi tin
hnh cc xt nghim mi trng ( ni c mt vi
sinh vt ni chung v vi sinh vt ch th ni ring
tng i thp).
Bn cht phng php ny l tp trung s vi sinh vt
t i trong mt mu nc c khi lng kh ln trn
mng lc khun v nh lng chng theo s khun
lc m c sau khi t mng lc ln mi trng
thch c thnh phn dinh dng thch hp cho loi vi
sinh vt cn kim. Da trn khi lng mu nc
ban u v quy c coi mi khun lc c hnh
thnh t mt vi khun ngi ta quy ra s lng vi
sinh vt c trong mt n v th tch nc.

Phng php mng lc

Phng php ny thc cht l s kt hp
ca hai phng php vn c s dng
rng ri trong cng tc kim nghim vi sinh
vt.
- phng php lc v khun (thng c
dung lc thanh trng mt s dung dch
km chu nhit, d b bin cht hoc thy
phn khi kh trng nhit cao)
- phng php m khun lc trn a.

Phng php mng lc

Hin nay ngi ta ch to c nhiu loi
mng lc khun khc nhau vi kch thc l
vo khong 0.2 1 m. Nhng vt liu
thng c dung ch to mng lc
khun l si thy tinh siu mnh, si
amiante, si polypropylene, l nhng vt
liu c kh nng chu c nhit v p
sut cao ca ni hp tit trng. Mng lc loi
ny thng c cung cp trong trng thi
v trng.

Phng php mng lc

Phng php mng lc

Phng php mng lc

Phng php m khun lc

trn mng lc

Phng php mng lc

y ngi ta dng nhng mng lc c in
thnh cc vung bng mt loi vt liu k nc.
Nhng ng k k nc ny c tc dng ngn cn
s mc lan ca cc khun lc v nh vy chia b
mt mng lc thnh nhng u nhau c kch
thc xc nh. S vung c khun lc mc c
m v qui v s c xc sut ln nht (MPN) ca
lng vi sinh vt c trong mt th tch mu theo
cng thc:
MPN=N.ln(N/N-x)
Trong N l tng s cc vung, x l s vung
c khun lc mc.

Phng php o ATP

Nguyn tc:
_ Adenosine-triphosphate(ATP) l cht tr ngun nng
lng c bn cho mi c th (trong mi t bo sng). ATP
b thu phn trong vng 2h sau khi t bo cht. Lng
ATP trong t bo n nh 10-18 n 10-17 mole/ t bo
tng ng 4*104mole ATP/ 105 cfu.
_ Nn xc nh c hm lng ATP ni bo trong mu
huyn ph vi sinh vt cho php chng ta phng on c
hm lng cc t bo vi sinh vt sng c trong mu.
_ xc nh hm lng ATP ni bo, trc tin ta cn ph
v thnh t bo trch ly ATP. Ngi ta thng s dng
nhng enzyme c hiu xc tc phn ng phn hy cc
i phn t tham gia cu to nn thnh t bo. Ta da vo
phn ng pht quang sinh hc gia ATP v luciferin, s
dng xc tc l luciferase nh lng ATP.

C ch phn ng pht quang sinh hc ATP

Hot ha: phn t ATP v luciferin s cng to phc vi phn t enzyme, sau ATP s chuyn thnh AMP v gii phng ra
pyrophosphate.

Oxy ha: nu c mt oxy, luciferin s b oxy ha to thnh mt phn t nc.

Decarboxy ha: giai on ny, s gii phng ra mt phn t CO2, AMP v mt photon.

Cng nh sng pht ra t phn ng trn t l thun vi hm lng ATP tham gia phn ng. Bng cch dng th ng
chun, ta c th nh lng hm lng ATP trong mu phn tch.

Nhn xt:
u im:
_ n gin
_ Nhanh gn
Nhc im:
_ Tn ho cht
_ Ch nh gi tnh trng v sinh b mt

Cch tin hnh:

Xc nh ng chun biu din mi quan h gia nng ATP v cng nh
sng pht ra t phn ng pht quang sinh hc.
_

Pha long dung dch ATP chun thu c cc dung dch ATP c nng thay i t 10-8
n 10-4 mol/l.
_ ng vi mi pha long, ly 50l mu cho vo ng nghim cha 2.5ml dung dch biofax
A2. Khuy trn trn my vortex trong thi gian 30 giy.
_ Ly 200l hn hp trn cho vo mt ng nghim khc. Thm vo 10l dung dch luciferin v
khuy trn trn my vortex trong thi gian 30 giy.
_ c kt qu cng nh sng ca mu o. Kt qu o c biu din di dng n v nh
sng tng i. Tin hnh c 3 ln, mi ln cch nhau 10 giy. Ly gi tr cao nht trong ba
gi tr o c tnh kt qu.
_ Thc hin mt mu i chng thay dung dch ATP bng nc ct. Cng nh sng ca
cc mu ATP chun RLUATP s c tnh theo cng thc:
RLUATP= RLUATP* - RLUH2O
Trong :
RLUATP*-gi tr o c ca mu cha ATP trn thit b o cng nh sng.
RLUH2O -gi tr o c ca mu nc ct trn thit b o cng nh sng.

Cch tin hnh:

Xc nh hm lng ATP tng trong mu huyn ph vi sinh vt

_ Lc u mu huyn ph vi sinh vt v dng micropipet ly 50l mu cho vo mt

ng nghim cha sn 400l dung dch biofax A1. khuy trn trn my Vortex
trong thi gian 30 giy.
_ Thm tip 2,5ml dung dch biofax A2 vo ng nghim ri khuy trn tip trn my
Vortex trong thi gian 30 giy.
_ Ly 200l hn hp trn cho vo ng nghim khc. Thm tip vo 10l dung dch
luciferin ri khuy trn trn my Vortex trong thi gian 30 giy.
_ c kt qu cng nh sng ca mu o. Tin hnh c 3 ln, mi ln cch
nhau 10 giy. Ly gi tr cao nht trong 3 gi tr o c tnh kt qu.
_ Thc hin mt mu vi nc ct.
_ Cng nh sng ca mu kho st RLUtng s l:
RLUtng= RLUtng* - RLUH2O
RLUtng* - gi tr o c ca mu kho st trn thit b o cng nh sng.
RLUH2O - gi tr o c ca mu nc ct trn thit b o cng nh sng

Cch tin hnh:

Xc nh hm lng ATP ngoi bo trong mu huyn ph vi sinh vt

_ Lc u mu huyn ph vi sinh vt v dng micropipet ly 50l mu cho vo mt

ng nghim cha sn 2,5mll dung dch biofax A2. khuy trn trn my Vortex
trong thi gian 30 giy.
_ Ly 200l hn hp trn cho vo ng nghim khc. Thm tip vo 10l dung dch
luciferin ri khuy trn trn my Vortex trong thi gian 30 giy.
_ c kt qu cng nh sng ca mu o. Tin hnh c 3 ln, mi ln cch
nhau 10 giy. Ly gi tr cao nht trong 3 gi tr o c tnh kt qu.
_ Thc hin mt mu vi nc ct.
_ Cng nh sng ca mu kho st RLUngoi bo s l:
RLUngoi bo = RLUngoi bo* - RLUH2O
RLUngoi bo * - gi tr o c ca mu kho st trn thit b o cng nh sng.
RLUH2O - gi tr o c ca mu nc ct trn thit b o cng nh sng

Cch tin hnh:

Xc nh hm lng ATP ni bo trong mu huyn ph vi sinh vt
_ Cng nh sng do cc phn t ATP ni bo trong mu huyn ph vi sinh vt
c xc nh bng cng thc sau:
RLUni bo= RLUtng RLUngoi bo
_ Vi gi tr RLUni bo tnh c, da vo th ng chun CATP=f(RLUATP), ta s
suy ra nng ATP ni bo c trong mu kho st.

nh lng vi sinh vt trong mu phn tch thng qua hm lng ATP ni bo

_ Ta phi xy dng ng chun biu din mi quan h gia hm lng ATP ni
bo v nng t bo hoc biu din mi quan h gia hm lng ATP ni bo v
lng cht kh ca t bo c trong mu kho st.
_ T , nu bit c gi tr nng ATP ni bo cn phn tch, da vo th
chun, ta s xc nh c nng t bo hoc lng cht kh ca t bo trong
mu.

PHNG PHP O C
Khi mt pha lng c cha nhiu phn t khng
tan => to thnh mt h huyn ph v c c
bi cc phn t hin din trong mi trng lng
cn nh sng, lm phn tn chm nh sng ti
T bo vi sinh vt l mt thc th nn khi hin
din trong mi trng cng lm mi trng c
Xc lp quan h t l tuyn tnh gia mt t
bo vi sinh vt v c
nh lng gin tip thng qua c
Da vo ng chun

o mt quang (OD)

B phn x lxut kt qu

Ngun sng

Dch lng
cha VSV

T bo quang in

PHNG PHP XC NH SINH KHI

Mc hin din ca vi sinh vt c th c
nh lng bng sinh khi tch ly ca vi sinh vt
Phng php ny mang tnh c lng,
chnh xc khng cao

Gi s c bit mt t bo nhn
ging nm men S. cerevisiae nm
trong khong 2.109 -3.109 t bo/ml.
Xc nh mc pha long thch hp
p dng phng php nh lng
bng bung m

Xc nh mt t bo nm men S.
cerevisiae trong giai on nhn ging bng
phng php m trc tip ghi nhn c
5 ln i din nh sau:
[1: 74 _ 2: 86 _ 3: 88_ 4: 75 _ 5:81].
Bit nng pha long huyn ph nm men
bia l 10-2.
Hy trnh by cc bc cn tin hnh xc
nh t l t bo sng trong huyn ph nu
trn.