You are on page 1of 5

Sự hình thành màng sinh học (biofilm) bởi một chủng

Bacillus subtilis sản sinh γ-polyglutamat.


Masaaki Morikawa, Shinji Kagihiro, Mitsuru Hakuri
Kazufumi Takano, Steve Branda, Roberto Kolter và Shigenori Kanaya
Bộ môn vật liệu và khoa học sự sống, trường kĩ thuật sau đại học,đại
học Osaka, Nhật Bản.
Bộ môn vi sinh vật học và di truyền học phân tử ,trường y khoa
Harvard, Boston, Hoa Kỳ.
Các chất gian bào được sản xuất bởi Bacillus subtilis B-1, một chủng
ngoài môi trường hình thành rất mạnh floating biofilms(màng sinh học
nổi), đã được tinh sạch và được xác định chứa chủ yếu γ-polyglutamat
(γ-PGA), một phân tử có khối lượng trên 1000 kDa. Cả sự hình thành
biofilm và sự sản xuất γ-PGA bởi Bacillus subtilis B-1 được tăng lên với
sự tăng nồng độ Mn2+ hoặc glixerol . γ-PGA được tổng hợp trong pha
sinh trưởng của nuôi cấy tĩnh,và biofilms floating cũng được hình thành.
Tuy nhiên trong điều kiện nuôi cấy lắc γ-PGA
được tạo ra trong một pha không sinh trưởng. Khi
B. subtilis B-1 được sinh trưởng trong một hệ
thống nuôi cấy vi hiếu khí, sự hình thành floating
biofilms và sự sản xuất γ-PGA giảm đáng kể.Điều
này cho thấy trong nuôi cấy tĩnh sự giảm nồng độ
oxy liên quan đến các bước đầu tiên trong sự tổng
hợp floating biofilms .Phân tích proteomic của
các protein màng chứng minh rằng flagellin, oligopeptide permease và tiền
protease Vpr là các protein chính được sản xuất bởi các tế bào trong một
floating biofilm và một khuẩn lạc.

GIỚI THIỆU
Biofilm hay màng sinh học là các quần xã vi khuẩn được nhúng vào chất gian bào và gắn vào một bề mặt.Sự
hình thành biofilm diễn ra trong rất nhiều trường hợp,và để phản ứng lại với các tín hiệu đa dạng của môi
trường (O’toole và cộng sự).Ví dụ biofilm có thể hình thành trên bề mặt rắn,hoặc trên bề mặt của môi trường
lỏng.Trong trường hợp sau floating biofilm còn được gọi là màng phim(pellicles).Các khuẩn lạc mà sinh trưởng
trên môi trường bán rắn cũng có thể được xem như một dạng của biofilm. Các quan sát vĩ mô và hiển vi các
biofilm vi khuẩn tiết lộ các cấu trúc có trật tự cao ,chúng biến mất khi các thành phần của chất gian bào bị loại
bỏ như là một ảnh hưởng của đột biến (Branda và cộng sự, 2005).
Các chất gian bào góp phần vào cơ chế ổn định của biofilm, cho phép nó chịu được đáng kể các lực kéo lớn, và
biofilm đã được chỉ ra là có chứa các polysaccharide,protein và axit nucleic (Branda và cộng sự, 2005).Trong số
các polysaccharide hiện diện trong biofilm thì : Pseudomonas aeruginosa chứa alginate, Pel và Psl ; Escherichia
coli và Salmonella typhimurium chứa cellulose;in Klebsiella pneumoniae và Enterobacteraerogenes chứa một
tetrasaccharide lặp lại của D-glucose, L-fucose và axit D-glucuronic ;Sphingomonas spp chứa gellan ; và
streptococci chứa levan (b-D-fructan) (Boyd & Chakrabarty, 1995; Danese cùng cộng sự., 2000; Friedman &
Kolter, 2004; Kiska & Macrina,1994; O’Neill cùng cộng sự., 1986; Yamazaki cùng cs., 1996).Biofilm của
Vibrio cholerae O1 đã được chỉ ra là chứa một polysaccharide cấu tạo bởi N-acetyl-D-glucosamine, D-
mannose, 6-deoxy-D-galactose và D-galactose (Wai và cs, 1998).
Trong vài năm gần đây Bacillus subtilis ,một trực khuẩn gram dương sinh bào tử,đã trở thành một sinh vật mô
hình cho các nghiên cứu sự hình thành biofilm .Người ta đã chỉ ra rằng các chủng hoang dại của Bacillus
subtilis thường hình thành floating biofilm mạnh hơn so với các chủng xuất phát từ chủng Bacillus subtilis 168
thuần hoá ở phòng thí nghiệm.
In the highly structured floating biofilms and colonies formed by the wild strain B. subtilis 3610,sporulation
displays a high degree of spatio-temporal organization, occurring predominantly at the tips of aerial projections.
Điều này cho thấy rằng sự hình thành biofilm có thể là một phần trong quá trình phát triển của sinh vật này.
Ở B. subtilis 3610,một thành phần chính của chất gian bào trong các khuẩn lạc và floating biofilm là các
exopolysaccharide (EPS) được sản xuất bởi các locus eps (Branda và cộng sự,2001, 2005).Tuy nhiên các đặc
tính vĩ mô của các khuẩn lạc và floating biofilm hình thành bởi các chủng hoang dại khác nhau của B. subtilis
có thể khác nhau đáng kể .Trong trường hợp khi chúng tôi so sánh B. subtilis 3610 với B. subtilis B-1,một
chủng ngoài môi trường được phân lập từ mỏ dầu (Morikawa và cs, 1992).Ở đây chúng tôi nhận thấy rằng γ-
PGA là một chất trùng hợp ngoại bào chính, và sự giảm sút nồng độ oxy là một tín hiệu cho sự hình thành
floating biofilm trong B. subtilis B-1. Chúng tôi cũng chứng minh rằng, flagellin, oligopeptide permease và tiền
protease Vpr là các protein màng chính được sản xuất bởi các tế bào của floating biofilm.
PHƯƠNG PHÁP
Môi trường nuôi cấy
Luria (L-) broth, chứa (l-1) 10 g Bacto tryptone (Difco), 5 g cao nấm men (Difco) và 10 g NaCl, được sử dụng
chung cho nuôi cấy các vi khuẩn khác nhau . L-agar là một môi trường bán rắn chứa 1-2% agar trong L-broth.
Môi trường E là một môi trường được sử dụng để kích thích sự sản xuất γ-PGA (Cromwick & Gross, 1995), nó
chứa (l-1): 20 g L-glutamic acid, 12 g citric acid, 80 g glycerol,7 g NH4Cl, 0-5 g MgSO4.7H2O, 0-5gK2HPO4,
0-15 g CaCl2.2H2O,40 mg FeCl3.6H2O và 148 mg MnSO4.H2O. PH của môi trường E được điều chỉnh đến
7.4 bằng NaOH 2M. Số lượng glycerol và MnSO4 được điều chỉnh như đã nêu
Hiển vi điện tử quét (SEM)
Pellicles được đặt nhẹ nhàng trên một tấm kính đã được phủ poly-L-lysine.Các mẫu vật đã được cố định với
glutaraldehyde và OsO4, loại nước trong ethanol, isoamyl acetate và phân đoạn CO2 ,và phủ với bạch kim
(Glauert, 1975)
Sự quan sát được thực hiên với một kính hiển vi điện tử quét Hitachi S800.
Chuẩn bị mẫu và phân tích chất gian bào
Tế bào B. subtilis B-1 (Morikawa et al., 1992) được nuôi qua đêm trong L-agar ,các khuẩn lạc được tách,huyền
phù trong NaCl 0.9%.Điều này giúp chúng tôi thu được gần như toàn bộ các chất trùng hợp ngoại bào tinh khiết
qua một quá trình 2 bước đơn giản : loại bỏ tế bào băng ly tâm (30 000 g ở 4 oC trong 30 phút), và kết tủa trong
ethanol bằng cách thêm vào 3 lần thể tích ethanol lạnh để nổi trên mặt.Bước kết tủa với ethanol được lặp lại 2
lần và sản phẩm thu được được làm khô trong chân không.
Một phần của vật liệu tinh sạch được thuỷ phân trong HCl 5M ở 100 oC trong 24 giờ,và các sản phẩm được
phân tách trên gel silica 60 hiệu suất cao bằng phương pháp sắc ký lớ mỏng (HPTLC) ,với một hỗn hợp dung
môi ethanol/nước (63 : 37).Các phần còn lại được hòa tan trong D2O (4% w / v), và phân tích bởi 1H-NMR và
13C-NMR(cộng hưởng từ hạt nhân) (UNITY-INIVA 600; Brucker).
Những phân tích cho thấy rằng các vật liệu thu hồi chủ yếu chứa duy nhất γ-PGA. Các đồng phân DL trong
thành phần của glutamic axit được xác định bởi phân tích HPLC (sắc ký lỏng cao áp)ngược pha,,sau khi dẫn
xuất hoá với tinh khiết Marfey (1% trong acetone) ở 40 oC trong 90 phút.
Cột sắc ký HPLC là một COSMOSIL 5C18-AR (i.d. 4-6 mm, dài
20 cm; Nacalai Tesque), và dung dịch thôi là methanol/20mM đệm natri axetat (PH 4)/acetonitrile (2:7:1).Các
phân đoạn được giám sát bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 340nm.Sự rửa thôi các vi trí và các vùng của
đỉnh hấp thụ được so sánh với D-glutamic acid and L-glutamic acid chuẩn.Khối lượng phân tử được xác định
bằng sắc ký lọc gel (TSKgel G4000SWxL )(i.d. 7-8mm, dài 30 cm; Tosoh) ,với 0-2 M đệm Natri phosphate
(PH 6-9) và 0-2 M Na2SO4.Sự tách γ-PGA được theo dõi bằng đo độ hấp thụ ở bước sóng 220 nm.Mức độ sản
xuất γ-PGA trong nuôi cấy được ước lượng dựa vào so sánh vùng đỉnh trong sắc ký lọc gel với các mẫu
chuẩn,hoặc bằng cách cân vật liệu khô sau khi tinh sạch.
Các thử nghiệm biofilm
Bề mặt rắn có sự hình thành biofilm được phát hiện bằng phương pháp nhuộm tím tinh thể (CV) với các cải
biến nhỏ(O’Toole và cs., 1999). Tóm tắt,một hỗn hợp nuôi cấy qua đêm được pha loãng sao cho OD600 nằm
trong khoảng 0-3,và 1µl được bổ sung thêm 99 µl môi trường E trong mỗi giếng của đĩa nhựa plastic chuẩn 96
giếng.Đĩa này được giữ yên ở 37 oC trong 8 giờ.Sau đó, các màng phim bề mặt và môi trường nuôi cấy được
cẩn thận loại ra khỏi giếng .Mỗi giếng được rửa nhẹ nhàng 2 lần với nước cất, các tế bào còn lại và chất gian
bào được nhuộm với 150 ml của dung dịch tím tinh thể 1 % trong 25 phút ở nhiệt độ phòng,sau khi rửa 2 lần
với nước cất,tím tinh thể bám vào biofilm được hoà tan trong 150 ml DMSO ,và định lượng bằng đo hấp thụ
của nó ở bước sóng 507 nm.
Chuẩn bị và phân tích protein màng
Các tế bào được thu hoạch, và rửa sạch và huyền phù trong đệm phosphate 10 mM (pH 7.0),sau khi sinh trưởng
trong nuôi cấy tĩnh ,lắc hoặc agar trong 14h ở 37oC.Trong nuôi cấy tĩnh ,tế bào hình thành floating biofilm trên
bề mặt (hình 1).Huyền phù tế bào được xử lý với lysozyme (1mg.ml-1) trong 3h ở 37oC ,sau đó để lắng 1 phút
trên đá. Sau khi loại bỏ tế bào nguyên vẹn bởi ly tâm 8.000 g trong 10 phút.Phần dịch nổi trên mặt được phân
đoạn tiếp bằng siêu ly tâm 9000 g trong 1h. Phần dịch nổi và kết tủa thu được lần lượt tương ứng là các thành
phần của tế bào chất và mẫu protein màng tế bào.Các mẫu protein màng tế bào được phân tách bằng điện di
trên gel polyacrylamide 12% có SDS 1%.Các băng protein được quan sát bằng phương pháp nhuộm với
Coomassie brilliant blue R-250.Bản gel chứa một băng protein được phân giải bởi trypsin ,sau đó phân tích
trình tự amino acid với phương pháp LC-MS/MS (sắc ký lỏng kết hợp khối phổ liên tục) (Taplin Biological
Mass Spectrometry Facility, Harvard Medical School, Boston, MA, USA) và Sequest (điện tử nhiệt).
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Cấu trúc hóa học của các chất trùng hợp ngoại bào sản xuất bởi B. subtilis B-1
B. subtilis B-1,một chủng được phân lập từ mỏ dầu,đã phát hiện có hình thành màng phim (floating biofilm)
mạnh và biofilm liên kết bề mặt rắn trong nuôi cấy tĩnh.Nó cũng hình thành các cấu trúc trên khuẩn lạc trong
môi trường L-agar mà nổi bật là các mảng bám ở trung tâm của chúng.Ngược lại B. subtilis 168 hình thành các
khuẩn lạc nhẵn,và không hình thành màng phim (pellices) rõ rệt hoặc các biofilm liên kết bề mặt rắn trong môi
trường L- broth.Các quan sát hiển vi điện tử quét (SEM) của pellicle sản xuất bởi Bacillus subtilis B-1 chỉ ra
rằng các tế bào được đóng gói dày đặc bên cạnh và nhúng vào trong một chất nền (hình 2).Trình tự gen 16S
rRNA của Bacillus subtilis B-1 (EMBL/GenBank/DDBJ số định danh AB213262) giống với trình tự tương ứng
của Bacillus subtilis 168 tới 99.6%.
Các chất trùng hợp ngoại bào sản xuất bởi các khuẩn lạc của Bacillus subtilis B-1được tinh sạch bằng cách kết
tủa với ethanol,và cho kết quả âm tính đối với cả hai thử nghiệm axit uronic và anthrone,cho thấy rằng, nguyên
liệu không chứa một lượng đáng kể polysaccharide (May & Chakrabarty, 1994).Thêm vào đó ,sản phẩm tinh
sạch không chứa một lượng đáng kể protein hoặc axit nucleic,điều này được chứng minh bởi sự thiếu độ hấp
thụ ở các bước sóng 280 và 254 nm.Khi mẫu bị thủy phân ,phân tách với HPTLC và nhuộm bằng cách phun với
0-1% dung dịch ninhydrin ethanol ,sau đó sấy ở 100 oC.Mỗi điểm màu đỏ đơn được quan sát tại một vi trí tương
ứng của axit glutamic.Vật liêu sau đó được phân tích bằng 1H- và 13C-NMR.Bản chất hóa học của các đỉnh được
chỉ ra trong bảng 1.1. Tất cả các kết quả này chỉ ra rằng vật liệu chúng tôi phân tách được chứa chủ yếu γ-
PGA .Liên quan đến các vùng đỉnh glutamic acid ,sau khi phân tách bằng HPLC,đã chỉ ra rằng tỷ lệ của D- và
L- glutamic acid cấu thành các γ-PGA dao động từ 9:1 đến 4:1 sau 12h nuôi cấy ở 37 oC trong môi trường L-
broth.Khối lượng phân tử của γ-PGA phân tách được xác định trên 1000 kDa bằng phương pháp sắc ký lọc
gel .Cần chú ý rằng B. subtilis 3610 không sản xuất γ-PGA.
Sự sản xuất γ-PGA,và sự hình thành biofilm
Gần đây,stanley và lazazzera (2005),đã báo cáo rằng kèm theo sự chuyển gen quy định kiểm soát sự tổng hợp γ-
PGA từ một chủng hoang dại sang chủng thuần hóa B. subtilis 168,là khả năng có thể hình thành màng sinh
học (biofilm)
Tuy nhiên sự xóa bỏ ywsC,một gen mã hóa cho sự tổng hợp γ-PGA,trong chủng hoang dại B. subtilis RO-FF-1
không dẫn đến sự sụt giảm đáng kể sự hình thành màng sinh học liên kết bề mặt .
Kết quả này chứng minh rằng sự sản xuất γ-PGA là không cần thiết đối với sự hình thành biofilm bởi B.
subtilis.Từ các kết quả này,chúng tôi hướng sự quan tâm tới việc xác định một sự liên quan nếu có giữa sự sản
xuất γ-PGA và sự hình thành biofilm ở B. subtilis B-1.Các báo cáo của các tác giả khác đã chỉ ra rằng những
thay đổi trong nồng độ của MnSO4 và glycerol ảnh hưởng tới sự sản sinh γ-PGA bởi Bacillus licheniformis
ATCC 9945A (Cromwick & Gross, 1995; Ko & Gross, 1998).Chúng tôi đã tìm thấy các kết quả tương tự ở B.
subtilis B-1 (hình 3a,b) .Quan trọng hơn, điều này cho phép chúng tôi cho thấy rằng có một sự tương quan trực
tiếp giữa sự sản xuất γ-PGA và hình thành màng sinh học trong B.subtilis B-1 (Hình 3c),sự tương quan này
cũng được thấy ở một chủng B. subtilis khác, B. subtilis natto BEST 195,một chủng sản xuất γ-PGA cấp độ
bình thường (số liêu không được chỉ ra, Itaya & Matsui,1999).Chúng tôi đã tách dòng gen ywsC từ B. subtilis
B-1 và cố gắng tạo ra một chủng xuất phát từ chủng B-1 đã bị mất gen ywsC do đột biến,nhưng chúng tôi đã
không thể làm điều này.
Để kiểm tra xem liệu sự hình thành pellicle là một nguyên nhân hay một kết quả của sự sự sản xuất γ-
PGA,động học tăng trưởng và sự sản xuất γ-PGA bởi B.subtilis B-1 được so sánh trong nuôi cấy tĩnh và nuôi
cấy lắc.Các tế bào không hình thành pellicle trong nuôi cấy lắc là do các tác động của stress do lực cắt liên
tục.Sự sản sinh γ-PGA trong nuôi cấy tĩnh bắt đầu 6h sau khi cấy giống,khi mà sự hình thành pellicle vẫn chưa
bắt đầu.Hơn nữa , γ-PGA cũng được sản xuất trong nuôi cấy lắc,mặc dù sau một pha lag khá dài,khoảng 12h
sau khi cấy giống.Cuối cùng ,sau 24h mức sản xuất γ-PGA là tương tự nhau giữa nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy
lắc.Các kết quả này chỉ ra rằng sự hình thành pellicle không phải là một yêu cầu của sự sản sinh γ-PGA ở B-1.
Sự giảm sút nồng độ oxy hòa tan và sự hình thành biofilm
Chúng ta biết rằng sự sục khí mạnh có hiệu quả cho sản lượng γ-PGA cao (Cromwick và cs., 1996).Để kiểm tra
ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan đối với việc tổng hợp γ-PGA trong khi pellicle đang hình thành, một hệ
thống nuôi cấy vi hiếu khí (MACS), thu được bằng cách sử dụng các ống Teflon microporous Poreflon
(Sumitomo Electric Polymer Mỹ) được sử dụng (hình 5b).MACS cho phép chúng tôi làm thông khí của môi
trường mà không thấy được sự sủi bong bóng.Khi MACS được sử dụng,các tế bào sinh trưởng trong pha lỏng
trong khoảng 9 tiếng mà không hình thành pellicle.Kết quả này trái ngược với sự quan sát thấy tế bào bắt đầu
hình thành pellicle khoảng 6 tiếng sau khi cấy giống trong hệ thống nuôi cấy tĩnh,và hầu như không có tế bào
sinh trưởng trong pha lỏng sau đó (hình 5a).Những quan sát này chỉ ra rằng sự suy giảm oxy trong nuôi cấy tĩnh
liên quan đến các bước đầu tiên trong sự hình thành floating biofilm bởi B.subtilis B-1.
Phân tích các protein màng trong biofilm và các tế bào phù du (planktonic cell)
Để có cái nhìn sâu hơn nữa về sự khác biệt sinh lý giữa biofilm và các tế bào phù du,các protein màng được
chuẩn bị từ các pellicle,tế bào phù du và các khuẩn lạc được phân tích tương đối bởi điện di SDS,sau đó nhuộm
với Coomassie brilliant blue (hình 6).Rõ ràng là các mẫu protein của biofilm và khuẩn lạc đơn giản hơn so với
protein của tế bào phù du.Các protein với kích thước 77 (P77), 57 (P57) và 36 kDa (P36) được sản xuất chủ yếu
bởi các tế bào của pellicle và các khuẩn lạc khi so sánh với các tế bào phù du .Phân tích bởi Sequest ,dựa trên
một phần trình tự amino acid của các protein này,chỉ ra rằng P77,P57 và P36 tương ứng là một tiền protease
ngoại bào nhỏ (Vpr;P29141) ,một oligopeptide permease (OppA; CAA39787/Spo0K, AAA62687),và một
flagellin hoàn chỉnh (Hag; P02968).Con đường phát tín hiệu ComX-ComP-ComA là một con đường phản ứng
chính tối thiểu trong B. subtilis, và nó điều khiển sự tổng hợp γ-PGA(Comella & Grossman, 2005; Stanley
&Lazazzerra, 2005).Sự tích lũy pheromon ComX kích thích enzyme histidine kinase màng ComP,kết quả là sự
tự phosphoryl hóa.Sự phosphoryl hóa ComP nhường nhóm phosphat cho chất điều hòa đáp ứng ,dẫn tới sự hoạt
hóa ComA phụ thuộc chất hoạt hóa.CSF (yếu tố kích thích khả năng,xuất phát từ sản phẩm của gen phrC) là
một pheromon khác cũng kích thích sự hoạt hóa ComA(Lazazzera, 2000).CSF ức chế RapC,một yếu tố điều
hòa âm sự phiên mã của ComA.CSF được sản xuất từ tiền CSF sau khi được xử lý bởi protease serine ngoại bào
như Vpr, Epr và Apr (subtilisin E) (Lazzazerra,2006).CSF được vận chuyển vào trong tế bào bởi một hệ thống
vận chuyển băng liên kết với ATP (ABC) chứa oligopeptide permease (OppA/Spo0K).Sự quan sát
OppA/Spo0K (P57) và tiền Vpr (P77) chủ yếu biểu hiện trong mẫu pellicle và khuẩn lạc cho thấy rằng một hệ
thống quorum-sensing có các chức năng tích cực trong các tế bào này .Điều thú vị là P36 được tìm thấy chính là
flagellin,và nó được sản xuất với một lượng đáng kể bởi các tế bào trong pellicle và trong khuẩn lạc.Mặc dù
Chagneau và Saier đã chứng minh rằng lông roi là cần thiết cho sự hình thành biofilm,một phân tích DNA
microarray của biofilm B. subtilis đã chỉ ra rằng sự biểu hiện của gen mã hóa cho flagella bị ức chế (Chagneau
& Saier, 2004; Stanley và cs., 2003).Một báo cáo khác đã chỉ ra rằng không có sự khác biệt đáng kể trong mức
độ biểu hiện của gen mã hóa cho flagellin trong các tế bào của biofilm,khi so sánh với các tế bào phù du (Ren
và cs,2004).Những mâu thuẫn này vẫn còn tồn tại để chờ được giải quyết.Tuy nhiên,sự tồn tại của lông roi
trong các tế bào của biofilm cũng đã được xác nhận bởi quan sát hiển vi điện tử sau khi nhuộm uranyl
acetate(không chỉ ra).Từ các kết quả của chúng tôi có thể cho rằng lông roi trong các tế bào trong biofilm của
chủng B-1 được sản xuất cho một mục đích khác ngoài giúp tế bào bơi .Trong trường hợp của Aeromonas
hydrophila AH-3,sự sản sinh roi bên được chỉ ra là gia tăng đặc biệt trên các môi trường bán rắn và bề mặt,và
quan trọng đối với sự dính bám và sự hình thành biofilm (Canals và cs., 2006).
LỜI CẢM ƠN
Các tác giả rất biết ơn Giáo sư M. Itaya (Keio University) đã vui lòng cung cấpB. subtilis natto BEST 195, và
E. Oiki (Đại học Osaka) đã hỗ trợ tuyệt vời trong quan sát hiển vi điện tử quét SEM.Đề tài này được hỗ trợ bởi
sự tài trợ từ Institute for Fermentation, Osaka, và J-Power, , và Học viện Y tế quốc gia .
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Boyd, A. & Chakrabarty, A. M. (1995). Pseudomonas aeruginosa biofilms: role of the alginate
exopolysaccharide. J Ind Microbiol 15,162–168.
Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R. &Kolter, R. (2001). Fruiting body formation
by Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 11621–1626.
Branda, S. S., Vik, S. L., Friedman, L. & Kolter, R. (2005). Biofilms:the matrix revisited. Trends Microbiol 13,
20–26.
Canals, R., Altarriba, M., Vilches, S., Horsburgh, G., Shaw, J. G.,Tomas, J. M. & Merino, S. (2006). Analysis
of the lateral flagellar gene system of Aeromonas hydrophila AH-3. J Bacteriol 188, 852–862.
Chagneau, C. & Saier, M. H., Jr (2004). Biofilm-defective mutants of Bacillus subtilis. J Mol Microbiol
Biotechnol 8, 177–188.
Comella, N. & Grossman, A. D. (2005). Conservation of genes and processes controlled by the quorum
response in bacteria: characterization of genes contolled by the quorumsensing transcription factor ComA in
Bacillus subtilis. Mol Microbiol 57, 1159–1174.
Cromwick, A. M. & Gross, R. A. (1995). Effects of manganese (II) on Bacillus licheniformis ATCC 9945A
physiology and gamma-poly(glutamic acid) formation. Int J Biol Macromol 17, 259–267.

You might also like