P. 1
Vi khuan Bacillus cereus

Vi khuan Bacillus cereus

|Views: 706|Likes:
Được xuất bản bởiPhuongMai Le

More info:

Categories:Types, School Work
Published by: PhuongMai Le on Jul 05, 2010
Bản quyền:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PPT, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

05/10/2013

pdf

text

original

BÁO CÁO TI U LU N

:

VI KHU N BACILLUS CEREUS

1

N I DUNG
1. M
+

u - Gi i thi u Bacillus cereus

c i m Bacillus cereus + Tính ch t sinh hóa + Tính ch t gây b nh

2.

c t và c ch sinh
+ Gi i thi u chung v + C ch gây b nh

ct nh

c t Ba.cereus

3. Các ph
+ Ph + Ph

ng pháp xác

ng pháp truy n th ng ng pháp hi n i
2

GI I THI U BAC. CEREUS

Tr c khu n Gram d Thu c gi i bacteria

ng

Ngành (phylum) firmicutes L p (class) bacilli B (order) Bacillales H (family) Bacillaceaem Chi (genius) Bacillus
3

Loài (species) Cereus

GI I THI U BAC. CEREUS
Trong chi này, ngoài loài cereus, còn có m t s loài khác nh :
‡ ‡ ‡ ‡ ‡

Bacillus coagulans Bacillus subtilis Bacillus thuringiensis Bacillus natto Paenibacillus larvae
4

GI I THI U B. CEREUS

c phát hi n

u tiên c

trong m t ca nhi m

th c ph m vào n m 1955

Bacillus cereus là loài vi khu n hi u khí

Bào t d ng hình ovan có kh n ng sinh nha bào
Bacillus cereus trên kính hi n vi
5

GI I THI U BAC. CEREUS
Bacillus cereus Infections Bacillus cereus subsp. mycoides. Gram stain

6

GI I THI U BAC. CEREUS
Bacillus cereus Infections Leifson flagella stain. B cereus food poisoning is often associated with contaminated rice containing heat-resistant B cereus spores.

7

C I M BACILLUS CEREUS

Tr c khu n Gr+ T o n i bào t Kích th c 0.5-1.5 x 2-4 m

Không t o giáp mô, không có kh n ng di ng

Nhi t

t i thích: 35-400C
Mô hình c u t o B.cereus
8

pH t i thích: 4.5-9.3

C I M BACILLUS CEREUS

Trên MT NA hay TSA sau 24 gi t o khóm l n, nh n nheo, xù xì

Trên MT BA t o dung huy t r ng Trên MT MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin): khóm h ng chung quanh có vòng sáng

Trên MT Mossel (th ch cereus selective agar): khóm to h ng chung quanh có vòng sáng «
9

TÍNH CH T SINH HÓA B.CEREUS

Trên môi tr

ng

ng: lên

men glucose trong i u ki n hi u khí và k khí, không lên men mantose

Kh nitrat thành nitrit Phân gi i Tyroxin Catalase (+), Citrate (+)
10

TÍNH CH T GÂY

C

Vi khu n Bacillus cereus phân b nhi u trong t nhiên, nhi m vào các lo i th c n qua êm hay tr l nh lâu, th ng gây ng c th c ph m

11

CT

C A BACILLUS CEREUS
c th c ph m

Phát hi n

u tiên các v các m m b nh gây ng

do vk bac.cereus là t n m 1949 khi Hauge ã phân l p m u t x t vani sau khi có m t ca ng b nh vi n và b o qu n phân l p nhi u n nhi t c th c ph m gây tiêu ch y t i c n u tr n khi s d ng. c khi tiêu th kh ng nh Oslo, Norway. X t vani phòng cho

B. cerus là nguyên nhân gây ng n n ng

c, Hauge ã phát tri n m u

kho ng 4x106 ml-1 và cho vào 200ml

cocktail. Sau khi u ng13h, ông c m th y au b ng và i tiêu ra c, tri u ch ng này dai d ng kho ng 8h.
12

CT

C A BACILLUS CEREUS

c t gây tiêu ch y (Diarrhoed toxin): Vi khu n s n sinh c t trên th t , rau qu , gia v . B n ch t là m t lo i protein gây h y ho i bi u bì và niêm m c ru t, gây tiêu ch y có th nguy hi m n tính m ng. c t gây nôn m a emetic toxin: Vi khu n nhi m trong g o, c m ngu i, u các lo i. B n ch t c t là phospholipit có tính n nh cao không b phân h y nhi t cao và d ch d dày. Ngoài ra vi khu n còn có enzyme hemolyzin là m t protein gây c m nh có th gây ch t ng i. c t này có th trung hòa b i cholesterol trong huy t thanh nh ng nó ã góp ph n cho s phát tri n c a vi khu n Bacillus cereus có th gây ra s nhi m trùng và nhi m c khác nhau nh : nhi m trùng máu, viêm màng não, và nhi m trùng m t.
13

TRI U CH NG TRÚNG

C

Th c n ch a m t gây c.

vi khu n: 105 vi khu n/g th c ph m

Bi u hi n: au b ng, bu n nôn và nôn sau 1-5 gi n ph i th c ph m nhi m vi khu n. B nh có th kéo dài 24 gi . Phòng: không n th c n ngu i qua êm, th c n luôn hâm nóng trên 800 C tr c khi n

14

TRI U CH NG TRÚNG

C

So sánh
c tính B nv i nhi t pH Tính nh y

c t type 1 và type 2
Type 1 45oC/30 phút n nh pH 4-11 Type 2 120oC/90 phút n nh pH 2-11

Nh y v i enzyme protease và trypsin

Kháng pepsin và trypsin

15

C CH SINH

CT

c t Emetic B ng 1-1 c i m c a b nh nôn m a và tính ch t c a tri u ch ng gây nôn m a do B. Cereus Tính ch t/ Ho t ng Mô t Li u nhi m c sl B.cereus: 105 - 108 tb/g th c ph m Kh i l ng c t 12 - 32 g/kg ct c s n sinh ra Trong th c ph m (25 ² 300C) Th i k b nh ½ n 5h Kho ng th i gian mang b nh 6 - 24h Tri u ch ng Bu n nôn, nôn m a Lo i th c ph m th ng g p nh t C m n u chin / chiên, mì ng, ph

16

C CH SINH
Emetic Syndrome

CT

B ng 1-1 c i m c a b nh nôn m a và tính ch t c a tri u ch ng gây nôn m a do B. Cereus Tên c a ct Cereulide C u trúc c a Chu i pp [D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val] Kh i l ng phân t 1.2 kDa Sinh kháng th Không (none) Ho t ng sinh h c trên ng i Gây nôn C quan nh n c m 5-HT3 Cytotoxic No Ho t ng trên t bào HEp-2 Ho t ng không bào Kh n ng ch u nhi t 90 phút 1210C nh h ng c a s phân gi i protein Không Vi c s n sinh ra c t nh th nào (not known, but probably enzymatically)

17

C CH SINH

CT

Cereulide (polypeptide) là tên c a m t c t quan tr ng gây ra tri u ch ng nôn m a do Bacillus cereus s n sinh ra. Bài báo này nghiên c u v quá trình sinh t ng h p c t d a trên s b t th ng c a depsipeptide t 13C li t kê ra trên 3 lo i ti n L- amino acid (Valin, Alanin, Leuzin) trên môi tr ng t ng h p trung gian. S phân tích này c th c hi n d a vào m c c u t o phân t c a amino hay oxy acid qua NMR và ESI ± MS c a ph ng pháp quang ph trên cereulide và s n ph m th y phân là các dipeptide c a nó. S h p nh t c a 13C là chi m n 95% trong OVal, O-Leu và L-Val, trong khi ó ch có 40% 13C là k t h p trong D-Ala c a Cereulide.

18

C CH SINH
Diarrheal Syndrome

CT

- Na-Uy, hai l n b c phát ã x y ra v i r t nhi u ng i sau khi n th t h m v i khoai tây và rau. Li u l ng gây b nh x p x 104 ± 105. L n u tiên bùng phát (1992), 17 ± 24 ng i b ng c, 3 trong s các b nh nhân ph i nh p vi n t 1 ± 3 tu n, tri u ch ng b t u n ng 3 b nh nhân này khá mu n (>24h). L n th hai, b nh bùng phát vào tháng 2 n m 1995. - Tri u ch ng tiêu ch y do ít nh t hai lo i c t ng ru t s n sinh ra trong su t quá trình sinh tr ng c a B.cereus trong ru t non. S hình thành ct ng ru t y trong th c ph m d n n ng c v lý thuy t mà nói là có th , nh ng i v i th c ph m ph c v cho con ng i thì ây là i u không th ch p nh n. i u này x y ra khi, s l ng B.cereus t n t i trong th c ph m th p nh t là 106/g ho c /ml và l ng l n c a c t ng ru t ph i c hình thành ch ng ch u c v i pH c a d dày và enzyme 19 proteolytic c a tá tràng.

C CH SINH

CT

Diarrheal Syndrome
B ng 1-2 c i m b nh tiêu ch y gây ra b i ch ng vi khu n B. cereus c tính Li u gây nhi m 105/g ho c /ml ct c s n sinh ra Trong ru t non Lo i c t Protein Th i k b nh 8 ² 16h Kho ng th i gian mang b nh 12 ² 24h Tri u ch ng au b ng dai d ng, i tiêu nhi u n c, th nh tho ng bu n nôn

20

C CH SINH

CT

Bào t c a B. cereus t mô t u tiên trên (ph n gi i thi u chung) là c phân bi t cho th y r ng chúng có kh n ng bám vào các t bào Caco-2 (trên các t bào bi u mô c a ng i). Sau khi bám vào, các bào t này n y m m m t cách nhanh chóng (trong vòng 1h), hình thành t bào B. cereus sinh d ng trên nh c a các t bào bi u mô, ti p ó là s n sinh ra c t , n u c t này xu t hi n trong ng ru t, c t ng ru t s t p trung khoanh vùng vùng ngo i biên c a ng ru t s t ng cao h n trong lumen và vì v y gây nên m i nguy l n h n và gây b nh m t cách tr m tr ng. M t i u có th x y ra i v i c ch này là th i gian b nh s lâu h n nh ã quan sát.
21

CÁC PH

NG PHÁP XÁC

NH

- Các ph ng pháp truy n th ng: Ph ng pháp m khu n l c Ph ng pháp MPN - Các ph ng pháp hi n i: Ph ng pháp RPLA Ph ng pháp ELISA Ph ng pháp PCR

22

PH NG PHÁP TRUY N TH NG

23

u & nh
-

c i m
t ti n

u i m: Không ph i u t d ng c , thi t b - Nh c i m: nh y không cao Yêu c u k n ng thao tác T n nhi u hóa ch t Th i gian phân tích lâu T n nhi u nhân công

24

Các

c tính c a Bacillus nhóm 1
Loài c tính Gram Catalase Di ng B.cereus +(a) + +/-(b) + + + + + + + B.thuringiensis + + +/+ + + + + + + B.mycoides + + -(c) + +/+ + + + + B.anthracis + + + -(d) + + + + -(d) B.megaterium + + +/-(d) +/+ 25

Kh nitrate Phân h y tyrosine Kháng lysozyme Ph n ng v i lòng tr ng

Lên men glucose Ph n ng VP Sinh acid t manitol Tan máu (c u)

Ph

ng pháp truy n th ng
Ph ng pháp m khu n l c
M u ng nh t m u Phân l p Kh ng nh

m s khu n l c i n hình

Nhu m Gram

Test sinh hóa

26

Cách tính k t qu :
M t (CFU/ml)=AixDi/V

Ai:s khu n l c trung bình/ a Di: pha loãng a (ml) V: Dung tích huy n phù t bào cho vào m i

27

Ph

ng pháp truyên th ng
Ph ng pháp MPN
m

M u pha loãng vào peptone 9 ng môi tr Ch n ng ng TSP

c c y sang MYP

30oC/24-48h

Ch n khóm h ng có vòng sáng

TSA th ch nghiêng Nhu m Gram, th sinh hóa

28

Tra b ng MPN

Các th nghi m phân bi t các loài Bacillus nhóm 1

Th nghi m tính di B.thuringgiensis là di

ng: h u h t các ch ng B.cereus; ng, B.anthracis, B.mycoides không di ng

S hình thành r gi : B.cereus không t o c u trúc r gi , B.mycoides t o c u trúc r gi

Th nghi m làm tan máu: B.cereus làm tan máu m nh, t o vùng tan máu hoàn toàn ( ) 2-4µm, B.thuringiensis và B.mycoides c ng làm tan máu, B.anthracis th ng không làm tan máu trong 24h ct ,
29

S t o

c t protein d ng tinh th :B.thuringiensis t o tinh th ct

B.cereus và các Bacillus khác không t o tinh th

Tiêu chu n vi sinh cho phép trong th c ph m , B y t 4/1998
G i h n cho phép (CFU/g ho c CFU/ml th c ph m) Nhóm th c ph m Nhóm th t yTh t t i, th t ông, th t xay nh , th t nghi n, th t ch bi n yS n ph m ch bi n t th t: th t hun khói, patê, xúc xích S n ph m ch bi n t ng c c, khoai c , u : yC n x lý nhi t tr c khi dùng: b t, mi n, mì s i yDùng tr c ti p không x lý nhi t: bánh b t Nhóm th c n khô và ch a dinh d ng cho tr em, th c n thay th c bi t yPh i x lý nhi t tr c khi s d ng yDùng tr c ti p, không qua x lý nhi t B.cereus 102

10 102 10

10 10

30

M T S HÌNH NH

B.Cereus trên kính hi n vi i n t

Khu n l c B.cereus trên môi tr ng th ch máu c u
31

B.Cereus không t o c u trúc r gi

B.mycoides t o c u trúc r gi
32

Khu n l c B.cereus trên môi tr ng Mossel

Khu n l c B.cereus trên môi tr ng MYP

33

PH

NG PHÁP HI N

I

BCET ² RPLA (B.cereus enterotoxin Reverse Passive Latex Agglutination )

BDE - ELISA (Bacillus Diarrheal Enterotoxin Visual ImmunoAssay )

PCR

34

PH

NG PHÁP BCET ² RPLA

Nguyên t c:

Ph Ph

ng pháp LA (latex agglutination) ng pháp RPLA (Reverse Passive Latex Agglutination)

35

PH

NG PHÁP AGGLUTINATION

Kháng th Kháng nguyên d ng h t

36

PH
B

NG PHÁP RPLA : KIT BCET ± RPLA (OXOID TEST KIT)

H t latex (polystyrene 0.81 µm) g n kháng th c hi u IgG (th ) kháng nguyên

Kháng nguyên hoà tan

H t latex t l i

37

B Kit BCET ± RPLA (Oxoid test kit)
2 1

38

PH

NG PHÁP

ELISA-VIA
ng pháp Elisa sandwich:

Nguyên t c ph

39

40

B BDE - Tecra kit test

41

K t qu :

42

PH

NG PHÁP

PCR

43

Marie-Hélène Guinebretìere et al,.2002; Marcela Vylet lová, Juraj Banykó,« ).

Ph

ng pháp PCR

B.cereus PCR kit test (Takara): xét nghi m 2 lo i gen y CRS (cereulide ± emetic toxin) c a B.cereus y LE (lecithinase ezyme gen) c a các loài Bacillus
Chu n b m u Ph n ng PCR l p l i 40 l n Chu kì b t u 94oC / 30s

55oC/ 30s 72oC / 30s Ch y i n di
44

K t qu :
1) Cereulide synthetic enzyme (CRS) gene: 426 bp 2) Lecithinase (LE) gene: 227bp 3) Internal Control (I.C.): 106 bp

45

Detection Real Time qPCR Kit

dNTPs DNA

primer buffer SYBR Green

Tag

46

Ph

ng pháp Real Time qPCR

o

u i m: d s d ng, nh y, hi n th và theo dõi tr c ti p quá trình

nhân b n DNA ang di n ra o Nh c i m: do SYBR liên k t v i b t k m t DNA m ch kép nào n k t qu cao h n so v i n ng ích.
47

trong ph n ng nên d n

Gen HblA
Chu n b m u

Gen BceT
Chu n b m u

Gen entFM
Chu n b m u

Ph n ng PCR

Ph n ng PCR

Ph n ng PCR

Du i xo n DNA 94oC / 30s

Du i xo n DNA 94oC / 45s

Du i xo n DNA 94oC / 45s

G n m i 58oC/ 45s/30 l n

G n m i 65-55oC/ 45s/30 l n

G n m i 52oC/ 45s/30 l n

Kéo dài 72oC / 1ph

Kéo dài 72oC / 45s

Kéo dài 72oC /1ph

Ch y i n di

Ch y i n di

Ch y i n di

48

PH

NG PHÁP PCR

Multiplex

PCR:

y y

H n h p PCR có nhi u c p m i Ph ng pháp phát hi n nhanh nhi u o n gen trong

cùng m t ph n ng
y

u i m: Gi m th i gian phân tích m u

49

BCETRBLA test kit

Tecra BDE test kit
( ELISA VIA)

PCR

50

51

52

53

54

B. cereus group ± Bal gen ± PCR test . Lane M: 100 bp DNA ladder, Lane 1: B. cereus NCIM 2106, Lane 2: B. subtilis NCIM 2545, Lane 3: Salmonella Dublin ATCC 15480, Lane 4: E. coli MCIM 2068, Lanes 5-10: B. cereus isolates, Lane 11: Staphylococcus aureus NCIM 2079, Lanes 12-15: B. cereus isolates.

55

NH N XÉT:

ELISA-BDE cho k t qu d ng tính v i các dòng B.cereus có c t NHE (Omnii & Nduhiu, 2005; Marcela Vylet lová, Juraj Banykó, ) v i nh y 1ng/ml d ch th c ph m b nhi m. BCET ± RPLA cho k t qu d ng tính v i dòng có c t HBL, ch y PCR ki m tra có s hi n di n c a gen hblA (Sanjoy Das et al.,2007;Mantynen & Lindstrom, 1998,..), có nh y cao v i protein L2/HBL (Douglas J.Beecher et al.,1994), 2ng/ml 81% dòng B.cereus sinh c t NHE, 53% dòng sinh c t HBL, 18% dòng cho c 2 lo i c t này trên t ng 96 loài (Omnii & Nduhiu, 2005) 65% cho k t qu d Williams, 1998). ng tính v i Tecra test, 51% v i BCET-RPLA test (Beattie & i o n gen 533bp c hi u cho nhóm B.cereus (Sanjoy

Primer BalF/BalR khuy ch Das et al.,2007)

56

cT

Thành ph n ct

Protein L2

Gen mã hoá hblC hblD

Ph

ng pháp phát hi n

BCET-RPLA test kit (B.cereus enterotoxin Reverse Passive Latex Agglutination Oxoid test kit) phát hi n protein L2/HBL Tecra BDE ( ELISA - VIA) Bacillus Diarrheal Enterotoxin visual immunoassay - Tecra kit test) phát hi n protein NheA 45kDa / NHE

Hemolytic enterotoxin (HBL)

L1

B

hblA nheA

Diarrhoel enterotoxins Nonhemolytic
enterotoxin (NHE)

NheA

NheB

nheB

PCR

NheC Enterotoxin T cytK-1 cytK-2 entFM

nheC bceT cytK-1 cytK-2 entFM Ces ( CRS)

Cytoxin K
Enterotoxin FM

Emetic toxin (Cereulide)

Cereulide

Sperm motility test (Swensson et al.,2005;«)

57

Marie-Hélène Guinebretìere et al,.2002; Marcela Vylet lová, Juraj Banykó,« ).

K T LU N

B.cereus có 2 lo i
y

ct : b nh dài 8-16h, gây ng 56oC/30phút, s ng ct ng t loài

Diarrhoeal enterotoxin,th i gian Clostridium perfringens, b t h at

pH 4-11. ct ng t loài

y

Emetic toxin (cereulide), th i gian

b nh ng n 1-6h , gây ng pH 2-11.

Staphylococcus, b t h at 120oC/90ph, s ng

Ph
y y

ng pháp mi n d ch : ELISA-BDE d BCET-RPLA d ng tính v i ng tính v i c t NHE c t HBL Diarrhoel enterotoxins ngu i d b

B.cereus phát tri n

35-40oC. Các th c ph m sau khi n u chín

nhi m b.cereus, c n b o qu n th c ph m trên 60oC.
58

59

You're Reading a Free Preview

Tải về
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->