XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME GLUCOSE OXIDASE

1. Nguyên tắc
Hoạt tính enzyme Glucose oxidase được đo bằng cách xác định hàm lượng
hydrogen peroxide (H2O2) tạo thành trong phản ứng chuyển hoá đường glucose
thành gluconic acid trong phản ứng sau :

GOD
Glucose + O2 Gluconic acid + H 2 O2
POD
H2O2 + o-dianisidine (reduced) o-dianisidine (oxidized) + H2O
GOD = Glucose Oxidase
POD = Peroxidase
Đường cong chuẩn hydrogen peroxide (H2O2) được xây dựng để xác định
định hàm lượng Hydrogen peroxide (H2O2) trong phản ứng .
Một đơn vị hoạt tính là lượng enzyme cần để tạo ra 1µ mol gluconic acid và
H2O2 trong một phút ở điều kiện pH 5.1 và nhiệt độ 250C .
2. Dụng cụ - Hoá chất
2.1 Dụng cụ
− Ống nghiệm
− Pipets
− Quang phổ kế
− Cuvettes
2.2 Hoá chất & enzyme
− Dung dịch Hydrogen peroxide (H2O2) chuẩn
− Acid sulfuric (H2SO4)
− Thuốc thử o-dianisidine
− Enzyme Peroxidase (POD)
− Enzyme Glucose oxidase (GOD)
− Dung dịch Glucoses
3. Cách tiến hành
 Cho 0.1 ml (2mg/ml) glucose oxidase vào ống nghiệm chứa 2.9 ml dung dịch
glucose (1 – 20mM) được pha trong dung dịch đệm acetate (pH 5.1). Phản ứng
được thực hiện ở nhiệt độ 250C trong thời gian 1 – 3 phút .
Sau đó thêm vào 0.1ml (60U/ml) peroxidase (POD) và 2.4ml o-dianisidine
(0.21mM) − POD là chất xúc tác cho phản ứng giữa Hydrogen peroxide (H2O2) và
o-dianisidine ( chất tạo màu). Phản ứng được dừng lại bằng cách thêm vào 0.5ml
dung dịch acid sulfuric 2.5M
Đo mật độ quang OD 530nm (OD530) và xác định lượng hydrogen peroxide
(H2O2) tạo ra dựa trên đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD530 và nồng độ
chuẩn hydrogen peroxide (H2O2) .
4. Xây dựng đồ thị đường chuẩn H2O2
Pha loãng dung dịch hydrogen peroxide (H2O2) chuẩn theo các nồng độ khác
nhau. Có thể cho trong bảng sau :

Hoá chất Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5

Hydrogen 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

peroxide
(ml)
Nước cất 9,8 9,6 9,4 9,2 9,0
(ml)
Nồng độ 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Từ các ống nghiệm trên lấy 2.4ml ở mỗi ống nghiệm vào 5 ống nghiệm khác
và thêm vào mỗi ống 2.4ml o-dianisidine ( chất tạo màu) với 0.1ml (60U/ml)
peroxidase (POD) chất xúc tác phản ứng. Sau đó cho vào 0.5ml H2SO4 2.5M để
dừng phản ứng .
Đo mật độ quang OD 530nm (OD530) và xây dựng đường chuẩn H2O2 .
5. Tính kết quả
Từ phương trình đồ thị đường chuẩn tính được lượng H2O2 tạo thành trong
phản ứng enzyme .