CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT

Đề tài: Nuôi cấy tạo cây đơn bội từ tế bào sinh dục
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong chọn tạo giống cây trồng việc tạo ra được dòng đồng hợp tử tuyệt đối là một
vấn đề rất được quan tâm. Các dòng này đã được tạo ra bằng nhiều con đường khác nhau
như: tự phối, nuôi cấy tạo cây đơn bội từ tế bào sinh dục… Trong đó tạo cây đơn bội từ tế
bào sinh dục là một kĩ thuật mới có nhiều ưu điểm so với các kĩ thuật khác.
KHÁI NIỆM CHUNG VỀ THỂ ĐƠN BỘI
• Các thể đơn bội là những cá thể thường là của những loài nhị bội hay đa bội khác
nguồn mà trong tế bào soma của chúng số lượng nhiễm sắc thể bằng nửa số lượng NST
của loài khởi đầu, trong mỗi cặp NST tương đồng nó chỉ có một NST.
• Các cách hình thành thể đơn bội:
- Trinh sinh (gynogensis) và sinh sản đơn tính đực (androgensis).
- Loại trừ nhiễm sắc thể và giảm nhiễm sắc thể soma.
- Nuôi cấy thể đơn bội in vitro.
Một số đặc điểm của thể đơn bội.
• Trong cơ thể thực vật chỉ có thể giao tử (hạt phấn, noãn) là những tế bào đơn bội.
Nếu chúng phát triển thành cây thì cây đó có mức bội thể đơn bội (n).
• Ở thể đơn bội thì kiểu hình của cây phản ánh trung thực kiểu gen. Vì vậy thể đơn
bội là nguyên liệu lý tưởng cho công tác chọn giống cây trồng.
Khó khăn của việc tạo dòng thuần và hướng khắc phục.
• Trong chọn giống thực vật để tạo ra dòng thuần chủng người ta tiến hành tự thụ
phấn bắt buộc qua nhiều thế hệ, việc này tốn rất nhiều thời gian.
• Vì vậy vấn đề đặt ra là làm thế nào trong một thời gian ngắn, chúng ta có thể tạo
ra được dòng thuần chủng. Năm 1934, Stow đã phát hiện ra sự phát triển khác thường của
hạt phấn thành những cấu trúc giống túi phôi đã xảy ra ở một số loài thực vật ở
Hyacinthus. Hiện tượng này đã cho thấy các hạt phấn có khả năng phân chia để hình
thành các tế bào mới hoặc các mô khi được sinh trưởng trong các điều kiện thích hợp và
chúng tiếp tục phát triển thành cây đơn bội
Ưu thế của việc tạo dòng thuần chủng từ nuôi cấy bao phấn, hạt phấn.
• Tính đồng hợp tử có được chỉ sau một đời nuôi cấy trong khi đó chọn dòng thuần
thông thường phải mất 5 - 6 đời tự thụ phấn.
• Cây lưỡng bội hoá tính đồng hợp tử tuyệt đối, trong khi tự thụ phấn thông thường
qua nhiều đời mà vẫn còn tồn dư dị hợp tử.
• Sự đa dạng di truyền ở quần thể cây lưỡng bội hoá từ nuôi cấy bao phấn hạt phấn
lớn hơn quần thể tự thụ phấn tạo dòng thuần sau các đời tự thụ.
• Những gen lặn có thể bị che khuất ở các cây nhị bội dị hợp tử nhưng ở cây đơn
bội hoặc lưỡng bội hóa từ hạt phấn lại có cơ hội biểu hiện ngay ra thành kiểu hình.
• Cây đơn bội có thể dùng trong chọn lọc hồi quy để tạo giống chống bệnh.
• Cấy truyền liên tục các dòng callus từ nuôi cấy bao phấn có thể tạo ra biến dị
giao tử là nguyên liệu cho chọn giống.
Khả năng ứng dụng của cây đơn bội.
• Nghiên cứu di truyền về mối tương tác của các gen.
• Tạo đột biến ở mức đơn bội.
• Tạo dòng đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ cho công tác chọn giống cây trồng.
Sơ đồ các hướng ứng dụng đơn bội
Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn
Nguyên lý:
Dựa trên cơ sở của sự sinh sản đơn tính đực (androgensis), người ta nuôi cấy các
hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tách rời hay các bao phấn có chứa các hạt phấn đơn nhân
trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để kích thích hạt phấn phát triển thành cây
đơn bội.
Các phương thức sinh sản vô tính đực invitro tạo cây đơn bội
 Sinh sản đơn tính trực tiếp (thuốc lá, cà độc dược).
Hạt phấn đơn nhân  phôi 1n cây 1n
 Sinh sản đơn tính đực gián tiếp (lúa, ngô)
Hạt phấn đơn nhân  mô sẹo 1n  chồi 1n cây1n
 Sinh sản vô tính đực hỗn hợp: quá trình này diễn ra tương tự như sinh sản vô tính
đực gián tiếp, nhưng sự tạo thành mô sẹo ngắn, khó nhận biết. Ví dụ: cà chua.
Các phương pháp cơ bản
Có 2 phương pháp cơ bản được sử dụng trong nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là:
 Phương pháp1: Các bao phấn được nuôi cấy trên môi trường có agar hoặc môi
trường lỏng và sự phát sinh phôi xảy ra trong bao phấn.
Kỹ thuật nuôi cấy
Kỹ thuật này bao gồm những bước chính như sau:
• Chọn bao phấn: Bao phấn thích hợp nhất có chứa hạt phấn bắt đầu từ thể tứ bào tử
đến ngay sau lần nguyên phân thứ nhất. Bao phấn của các hoa đầu tiên cho kết quả tốt
hơn bao phấn của hoa muộn.
• Xử lý nụ hoa: Cần xử lý ở nhiệt độ thích hợp các nụ hoa sau khi cắt khỏi cây và
trước khi tách bao phấn để nuôi cấy, nhằm kích thích sự phân chia của hạt phấn và từ đó
tạo cây đơn bội.
Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo cây đơn bội trong nuôi cấy bao phấn, hạt phấn in
vitro
Tình hình nghiên cứu, thành tựu và hiện trạng.
Tình hình nghiên cứu:
- 1964 Guka và Maheshwasi lài hai nhà khoa học Ấn Độ lần đầu tiên đã tạo thành
công cây đơn bội qua nuôi cấy bao phấn cây cà độc dược.
- Kĩ thuật đơn bội được ứng dụng rất rộng rãi ở hầu hết các nước có công nghệ
chọn giống trên thế giới.
- Công nghệ đơn bội đã được áp dụng đối với hầu hết các cây trồng quan trọng và
mang lai hiệu quả kinh tế cao. Đối với một số cây như lúa, ngô, đại mạch, măng tây…thì
đây là công nghệ không thể thiếu được trong chọn tạo giống.
- Ở nước ta từ năm 1975 đến nay đã tạo được nhiều loại cây trồng bằng nuôi cấy
đơn bội như ngô, bắp cải, thuốc lá.
Thành tựu:
 Các cây đơn bội có nguồn gốc hạt phấn đã được tạo ra ở 216 loài thuộc 78 giống,
31 họ và nhiều loài khác cũng được nghiên cứu thành công (Hu và Zhang, 1985).
 Thông qua nuôi bao phấn đã tạo các giống lúa thuần như Khao 85, Khao 1105,
VH2. Đặc biệt thông qua chọn dòng tế bào soma thu được các giống DR1, DR2, DR3
đang mở rộng ra qui mô sản xuất. Kết hợp biến dị tế bào soma với gây đột biến đã tạo
giống lúa KDM39. Trong nghiên cứu lúa lai đang áp dụng kỹ thuật lai xa, cứu phôi, đột
biến tạo dòng TGMS và CMS mới.
Trong lĩnh vực nông nghiệp, các kết quả nghiên cứu về công nghệ tế bào - mô
phôi thực vật giúp chúng ta nhanh chóng tạo ra các giống cây trồng thuần. Hàng loạt
dòng thuần ở lúa (ĐV2, MT4, DT26...) đã được tạo ra bằng kĩ thuật đơn bội nuôi cấy bao
phấn và nuôi cấy noãn. Đặc biệt, chúng ta đã sản xuất được dòng lúa thuần mang gene
quý như gen bất dục đực tế bào chất, bất dục đực nhân (gen TGMS, PGMS). Đối với ngô,
đã tạo được 5 dòng ngô thuần và hai tổ hợp ngô lai có triển vọng.
Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào phát triển nhanh và ngày càng hiện đại mở tiềm năng to
lớn cho cho nuôi cấy bao phấn hạt phấn tạo cây đơn bội từ đó tạo dòng thuần, đáng chú ý
là ở các đối tượng có tầm quan trọng như: lúa gạo, lúa mạch, đại mạch, thuốc lá, ngô,
khoai tây…
Ưu điểm của việc tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn và hạt phấn
• Nuôi cấy bao phấn:
 Vì bao phấn có kích thước lớn nên thao tác dễ dàng.
 Môi trường nuôi cấy đơn giản.
• Nuôi cấy hạt phấn:
 Giống tạo ra có tính đồng hợp tử cao.
 Phát sinh phôi dễ dàng trong quá trình nuôi cấy.
 Tạo cây đơn bội thuận lợi cho việc nghiên cứu di truyền.
 Tóm lại, nuôi cấy bao phấn, hạt phấn ra đời đã làm giảm thời gian, đồng thời làm
tăng vọt số lượng các cá thể đơn bội thu được.
TẠO CÂY ĐƠN BỘI BẰNG NUÔI CẤY NOÃN
CHƯA THỤ TINH
Khái niệm:
 Tạo cây đơn bội từ nuôi cấy noãn chưa thụ tinh là sự kích thích tế bào trứng hay
các tế bào đối cực,tế bào kèm trong noãn phát triển và tái sinh thành cây đơn bội.Sự hình
thành từ noãn chưa thụ tinh được gọi là sự sinh sản đơn tính cái hay trinh nữ sinh
 Đã có nhiều thành công trong nghiên cứu tạo các cây đơn bội bằng nuôi cấy bao
phấn. Nhưng ở một số loại cây như hành,hoa hướng dương hay củ cải đường… thì
phương pháp này tỏ ra không hiệu quả. Chính vì vậy trong những năm 70 các nhà nghiên
cứu đã tiến hành tạo cây đơn bội bằng noãn chưa thụ tinh và đã giành được một số kết
quả đáng kể.
Quy trình tạo cây đơn bội bằng noãn chưa thụ tinh
Những nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy noãn chưa thụ tinh
 Kĩ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh còn gặp nhiều khó khăn và phức tạp do việc
tách noãn khó và dễ gây tổn thương
 Nhằm tăng hiệu quả của quá trình này người ta đang tập trung nghiên cứu các yếu
tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy để tạo cây đơn tính mong muốn
 Kiểu gen của cây mẹ
• là một trong những nhân tố quan trọng nhất đối với quá trình nuôi cấy
• Người ta nhận thấy mỗi một kiểu gen có phản ứng khác nhau trong quá trình sinh
trưởng nên phải xác định quy trình riêng cho từng loại cây cụ thể của từng kiểu gen
• nhân tố này đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau như lúa,hoa đồng
tiền.
 Giai đoạn phát triển của noãn
• Giai đoạn phát triển của noãn có ý nghĩa đặc biệt đối với việc tạo thể đơn bội
• Túi phôi thành thục là giai đoạn phù hợp cho hiệu quả cao trong nuôi cấy noãn
• Tuy nhiên việc xác định giai đoạn phát triển của thể giao tử cái là rất phức tạp vì
túi phôi nằm trong bầu quả do đó khó quan sát trực tiếp để xác định được thì phải sử
dụng các phương pháp tế bào học như tách túi phôi,nhuộm màu bằng lát cắ mỏng
 Môi trường nuôi cấy
• Các môi trường như MS, B5, MF thừng được sử dụng làm môi trường nuôi cấy
noãn chưa thụ tinh
• Môi trường này chủ yếu ở dạng đặc
• Để cảm ứng được sự trinh sinh cần thiết thì phải bổ sung các chất điều tiết sinh
trưởng thực vật
• Ngoài ra nồng độ đường cũng là một yếu tố cần được quan tâm,nồng độ phải phù
hợp cho từng loại cây
• Trong nhiều trường hợp việc bổ sung thêm một số chất phụ gia như nước dừa có
tác dụng tạo callus phát sinh phôi và tái sinh cây
 Điều kiện nuôi cấy
• Quá trình nuôi cấy thường được duy trì ở nhiệt độ ổn định 25-28 độ
• Đối với đa số loài thường ở giai đạn đầu của quá trình nuôi cấy tiến hành trong
điều kiện tối, giai đoạn tái sinh cây yêu cầu ánh sáng 2000-3000 lux
Những thành tựu đạt được trong phương pháp tạo cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh
 Tỉ lệ tạo cây đơn bội theo phương pháp này có nhiều khả quan như ở hành
và củ cải đường :5-20%,ở dâu tằm là 3-6%
 Cây tái sinh ít bị bạch tạng ngay ở cả họ hòa thảo,trong khi nếu nuôi cấy bằng bao
phấn và hạt phấn có tỉ lệ bạch tạng 60-90%
 Ở các loại cây ngũ cốc ở VN thì biện pháp này tương đối đơn giản và dễ thành
công như ở cây ngô
So sánh
Giống nhau:
 Đều dùng giao tử để tạo tế bào đơn bội.
 Đều nhằm tạo ra những cây đơn bội qua sự cảm ứng phát sinh phôi từ những phân
chia lặp lại của các bào tử đơn bội,các tiểu bào tử, các hạt phấn non.
Khác nhau
 Phương pháp nuôi cấy hạt phấn tách rời tạo tế bào đơn bội cần phải tách rời các
hạt phấn khỏi bao phấn khi nuôi cấy. Các hạt phấn này thường được nuôi cấy trên môi
trường lỏng kèm theo chế độ lắc hay nuôi cấy chìm trong môi trường bán lỏng.
 Phương pháp nuôi cấy bao phấn được áp dụng trên nhiều đối tượng thực vật khác
nhau: ngô, lúa, thuốc lá… nhưng không áp dụng trên các cây hành, củ cải đường, hoa
hướng dương.
 Phương pháp nuôi cấy noãn chưa thụ tinh chủ yếu trên các đối tượng hành, củ cải
đường, ngô, các cây ngũ cốc. Tuy nhiên kỹ thuật này còn gặp nhiều khó khăn và phức tạp
do việc tách vách tế bào trứng rất khó và dễ gây thương tổn do vậy người ta đang tập
trung nghiên cứu các yếu tố như kiểu gen cây mẹ, giai đoạn phát triển của túi phôi, chế
độ xử lý nhiệt độ, môi trường nuôi cấy…
Hiện trạng
 Hiện tại người ta mới nuôi cấy hạt phấn trưởng thành để tạo cây đơn bội thành
công qua con đường phôi hoá, hoặc tạo thành mô sẹo, từ đó tạo cây đơn bội. Còn nuôi
cấy hạt phấn non chưa đạt được nhiều hiệu quả, hiện tại chỉ có một số kết quả về nuôi cấy
hạt phấn non thành công như nuôi cấy hạt phấn non cây Trillium electum (Saparov và
cs,1955), cây hành Allium cepa (Vasil,1959), ở cây Atropa belladonna (Bajaj,1974).
 Hầu hết các cây ngũ cốc và các cây họ đậu nuôi cấy bao phấn rẩt khó thành công
hoặc tỉ lệ thành cây thấp, tỉ lệ cây bạch tạng cao.
 Nhiều gen có khả năng thành cây thấp thường không được ứng dụng trong nuôi
cấy bao phấn nhưng có khi gen lại có giá trị kinh tế cao. Ví dụ cấy bao phấn giống lúa
Japonica dễ thành công hơn hơn giống lúa Indica, tuy nhiên giống Indica lại có vai trò
quan trọng hơn nhiều giống Japonica
Nuôi cấy bao phấn thuốc lá
Nguyên liệu và thiết bị:
– Nụ hoa thuốc lá (Nicotiana tabacum)
– Nước cất 2 lần vô trừng
– Etanol 90%
– Dung dịch hipoclorit natri 10% (V/v)
– Thuốc nhuộm acetocacmin
– Agar
– Đĩa petri
– Môi trường MS hoặc môi trường NN
– Kính hiển vi giải phẫu
– Dao, kéo, panh,... Dùng cho nuôi cấy
– Một số hóa chất để pha môi trường lỏng: saccarozo, KNO3,…
Tiến hành
• Thu hái các nụ hoa của thuốc lá khi chúng có tràng hoa dài 21-23mm (thời điểm
các hạt phấn thuốc lá hoàn thành phân bào nguyên phân đầu tiên)
• Xử lý lạnh các nụ hoa khoảng 12 ngày ở 7-8oC, sau đó khử trùng bề mặt nụ hoa
bằng etanol 90% trong 30s, sau đó chuyển chúng sang các đĩa petri đã chứa dung dịch
hipoclorit natri 10% trong 10 phút
• Rửa các nụ hoa vài lần trong nước cất 2 lần vô trùng. Dùng dao, kim và panh giải
phẫu cẩn thận nụ hoa và lấy ra các bao phấn (có thể sử dụng kính hiển vi giải phẫu để hỗ
trợ cho quá trình thao tác
• Lấy 1 bao phấn của mỗi nụ hoa và ép trong acetocacmin để xác định giai đoạn
phát triển của hạt phấn. Nếu hạt phấn ở giai đoạn phát triển thích hợp thì các bao phấn
còn lại của nụ hoa được dùng trong nuôi cấy
• Các bao phấn có thể được nuôi cấy theo 2 cách:
• Trên môi trường MS đặc (có 0,6-1,0%(W/v) agar)
• Nuôi cấy nổi trên môi trường lỏng gồm: KNO3-950(mg/l); NH4NO3- 825(mg/l);
MgSO4.7H2O- 185(mg/l); CaCl2- 220 (mg/l);KH2PO4-85 (mg/l); FeSO4.7H2O-27,8 (mg/l)
; Na2EDTA-37,3 (mg/l);saccarozo-20000 (mg/l)
6. Quá trình nuôi cấy được duy trì ở nhiệt độ 25oC trong tối hoặc ở ánh sáng yếu.
Cường độ ánh sáng thích hợp khoảng 300lux. Sau 4-6 tuần nuôi cấy, các cây con sẽ xuất
hiện từ một số bao phấn.
Khi mô bao phấn đạt 3mm thì tách cây con ra khỏi mô và chuyển sang môi trường
tạo rễ (có thể dùng môi trường MS với thành phần khoáng giảm 1 nửa). Cường độ ánh
sáng cao hơn thời gian chiếu sáng khoảng 10-12h/ngày
Đề tài: “Bảo quản nguồn gen thực vật in vitro”

MỤC LỤC
 I. Mở đầu
 II. Nội dung
1. Bảo tồn nguồn gen thực vật
2. Sõ lýợc về các phýõng pháp bảo tồn nguồn gen
3. Các cách bảo quản nguồn gen thực vật in vitro
4. Ýu thế và hạn chế của kỹ thuật bảo quản nguồn gen thực vật in vitro
5. Khả nãng ứng dụng của bảo quản nguồn gen thực vật in vitro
6. Phýõng pháp bảo quản nguồn gen invitro đối với giống hoa Lilium
Formolongo.
 III. Kết luận
Mở đầu
 Bảo quản nguồn gen thực vật là duy trì sự phong phú và đa dạng di truyền
trong loài, giữa các loài và trong hệ sinh thái nói chung nhằm đánh giá, khai thác sử
dụng các nguồn gen có giá trị để phục vụ lợi ích con ngýời.
 Hiện nay có nhiều phýõng pháp bảo quản nguồn gen thực vật, song bảo quản
nguồn gen thực vật in vitro là giải pháp công nghệ có triển vọng, nhất là với các cây
nhân giống vô tính và các hạt mức sức nảy mầm ở nhiệt độ và ẩm độ thấp.
Vì vậy, chúng tôi tiến hành tìm hiểu đề tài: “Bảo quản nguồn gen thực
vật in vitro”
Nội dung
1.1. Mục đích
 Bảo vệ sự đa dạng sinh học, thể hiện ở 3 mức:
+) Sự đa dạng của các hệ sinh thái
+) Đa dạng của các loài
+) Sự đa dạng di truyền hay sự đa dạng của các nguồn gen trong loài
 Đánh giá, khai thác sử dụng các nguồn gen có giá trị để phục vụ con ngýời.
1.2. Ý nghĩa
 Là một việc làm cấp thiết và thýờng xuyên để phục vụ nhiệm vụ trýớc mắt và
lâu dài của công tác cải thiện giống, vừa góp phần quan trọng vào công tác bảo tồn
thiên nhiên, bảo vệ sự đa dạng sinh học.
 Bảo tồn nguồn gen ngăn chặn sự mất mát các gen, các phức hợp gen ngăn
chặn sự tuyệt chủng của các nòi địa lý, các xuất xứ và trong trýờng hợp cực đoan đó
là sự tuyệt chủng của loài.
2. Các phýõng pháp bảo tồn nguồn gen từ trýớc đến nay
2.1 Bảo tồn ngoại vi (ex - situ conservation)
Đây là hình thức bảo tồn chủ yếu hiện nay trên thế giới, một hình
thức bảo tồn ngoài phạm vi cý trú tự nhiên của các loài.
Gồm :
- Bảo quản hạt
- Trồng ngoài ruộng
 - Bảo quản in vitro
2.1.1. Bảo quản hạt
Gồm:
 Bảo quản ngắn hạn (hạt giống đýợc làm khô tới độ ẩm 9%, thời gian 5 năm)
 Bảo quản trung hạn (độ ẩm hạt 7%, bảo quản trong dụng cụ bao gói và kho
chuyên dụng ở độ ẩm 10%, t0 là - 1 đến - 50C)
 Bảo quản dài hạn (độ ẩm hạt 3%, đựng trong hộp kim loại, bảo quản trong
kho lạnh sâu, t0C là - 150C đến - 200C, thời gian từ 20 - 30 năm).
2.1.2. Bảo quản trên đồng ruộng
Đối týợng: cây lâu năm nhý cây ăn quả, cây công nghiệp, cây thuốc,
cây sinh sản vô tính, hữu tính khác…
 Ýu điểm: Dễ tiếp cận nghiên cứu, đánh giá và sử dụng
 Nhýợc điểm: Dễ mất mát do điều kiện không thuận lợi, đòi hỏi diện tích
đất đai lớn và nguồn nhân lực
2.1.3. Bảo quản in vitro
Đối týợng bảo quản in vitro:
- Vật liệu sinh sản vô tính (chuối, dứa, mít, khoai sọ, khoai lang…)
- Các loại cây có hạt recalcitrant - hạt khó bảo quản (xoài, mít, na, sầu riêng, nhãn,
vải và cây có múi…)
- Các vật liệu dùng để nhân nhanh phục vụ các chýõng trình chọn tạo và nhân
giống, hạt phấn và ngân hàng DNA…
2.1.3. Bảo quản in vitro
Gồm
 Bảo quản ngắn hạn: Thực vật đýợc phát triển bình thýờng trong điều kiện vô
trùng của phòng thí nghiệm, vật liệu đýợc bảo quản để cung cấp cho các nhu cầu
chọn tạo giống và nghiên cứu của mỗi cõ sở.
 Bảo quản trung hạn (bảo quản bằng sinh trýởng chậm) thì tốc độ sinh
trýởng của vật liệu đýợc làm giảm một cách đáng kể bằng cách giữ ở nhiệt độ ánh
sáng thấp hoặc giảm nồng độ oxy.
=> Cả 2 phýõng pháp này áp dụng cho vật liệu là: chồi, mô phân sinh và cây con.
2.1.3. Bảo quản in vitro
2.1.3. Bảo quản in vitro
- Bảo quản dài hạn: Bảo quản dài hạn là bảo quản trong hoặc trên bề mặt
nitõ lỏng (- 1760C đến - 196ºC), với điều kiện này mọi quá trình sống bị đình chỉ
hoàn toàn.
Đối týợng: mô sẹo, tế bào hạt phấn, phôi của một số loài thực vật…
2.2. Bảo tồn nội vi (bảo tồn tại chỗ, in-situ conservation)
 Là bảo tồn nguồn gen trong môi trýờng sinh sống.
 Đối týợng: bất kì thực vật nào, chủ yếu là các loài tổ tiên của cây trồng, các
loài hoang dại có quan hệ gần gũi với cây trồng.
 Với 1 số giống địa phýõng đýợc hình thành do quá trình chọn lọc và trồng
trọt lâu đời tại 1 địa phýõng cũng có thể bảo quản tại chỗ trên đồng ruộng của nông
dân hoặc bảo quản dựa vào cộng đồng.
3. Các cách bảo quản nguồn gen thực vật in vitro
 Đây là giải pháp công nghệ có triển vọng trong việc bảo quản nguồn gen thực
vật, nhất là với các cây nhân giống vô tính và cả hạt khó bảo quản có nhiệt độ và độ
ẩm thấp.
 Trong vòng 20 năm gần đây, công nghệ này đã đýợc phát triển rộng và áp
dụng với hõn 1000 loài khác nhau (F.Engelmann, 1997).
 Gồm:
+ Bảo quản sinh trýởng chậm
+ Biện pháp ngừng sinh trýởng tạm thời
3.1. Bảo quản sinh trýởng chậm
 Gồm bảo quản ngắn hạn và trung hạn
 Vật liệu thích hợp là chồi, mô phân sinh và cây con
 Để giảm tốc độ sinh trýởng của cây trong ống nghiệm, ngýời ta đã thay đổi
một số yếu tố:
+ Hạ thấp nhiệt độ nuôi cấy, đýa thêm các chất ức chế sinh trýởng
+ Chất làm tăng áp suất thẩm thấu
+ Và làm nghèo thành phần dinh dýỡng trong môi trýờng nuôi cấy

3.2. Biện pháp ngừng sinh trýởng tạm thời

 Đây là phýõng pháp bảo quản dài hạn các vật liệu trong hoặc trên bề mặt
nitõ lỏng (- 1760C đến - 1960C ).
 Bảo quản đông lạnh trong, trên nitõ lỏng có thể đýợc chia ra các công đoạn
sau:
+ Tiền sinh trýởng, xử lý với 5 - 10 % proline, 3 - 6 % manitol.
+ Xử lý bảo vệ chống đóng băng.

3.2. Biện pháp ngừng sinh trýởng tạm thời

 Đýa vào bảo quản trong hoặc trên mặt nitõ lỏng (- 1960C – 1580C).
 Làm tan tuyết, xử lý ở nhiệt độ 35 – 400C trong điều kiện phòng thí nghiệm
bình thýờng.
 Phục hồi sinh trýởng, tái sinh cây.
3.2. Biện pháp ngừng sinh trýởng tạm thời
 Biện pháp ngừng sinh trýởng tạm thời áp dụng thành công cho các đối
týợng:
+ Mô sẹo
+ Tế bào hạt phấn
+ Mô phân sinh
 Ví dụ: ngýời ta đã nghiên cứu mô phân sinh của khoai tây và đýa vào bảo
quản đông lạnh cho tỉ lệ phục hồi tái sinh cao xấp xỉ 36%.
4. Ýu thế và hạn chế của kỹ thuật bảo quản nguồn gen thực vật in vitro
Ýu điểm:
 Đảm bảo độ an toàn và sạch bệnh cao, có khả năng tạo quần thể cây
đồng nhất với số lýợng lớn.
 Bảo quản đýợc lâu dài nguồn gen thực vật trong điều kiện môi trýờng bên
ngoài không cho phép nhằm phục vụ cho công tác chọn giống.
 Sử dụng các bộ phận nhỉ nhý hạt, chồi, mô,... nên có thể tiết kiệm đýợc không
gian bảo quản.

Ýu điểm

 Hạn chế khả năng mất nguồn gen, nhất là các nguồn gen có nguy cõ xói mòn
cao, các loài có nguy cõ bị tuyệt chủng
 Với phýõng pháp bảo quản siêu lạnh có thể bảo quản đýợc lâu dài với số
lýợng lớn và độ ổn định
 Khả năng tái tạo, phục hồi các nguồn gen đã biến mất trong tự nhiên

Hạn chế
 Chýa có những đánh giá đầy đủ về mối týõng tác giữa yếu tố môi trýờng
(thành phần dinh dýỡng trong môi trýờng nuôi, nhiệt độ, chất ức chế sinh trýởng).
 Có khả năng tạo ra biến dị Soma với tần số biến dị khác nhau và ít lặp lại
 Chi phí bảo quản lớn, đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao và trang thiết bị hiện đại
 Chýa xác định đýợc khoảng thời gian tối đa một cách an toàn trong quá
trình bảo quản bằng sinh trýởng chậm cho từng loài cây trồng
5. Khả nãng ứng dụng của bảo quản nguồn gen thực vật in vitro
Ngày nay ngýời ta phân biệt đýợc bốn nhóm đối týợng mà chúng có
thể bảo quản invitro có lợi
 Nhóm vật liệu nuôi cấy bảo quản invitro bắt buộc bao gồm các nhân giống vô
tính, các loại cây có hạt recalcitrant…
 Nhóm vật liệu bảo quản trong điều kiện invitro gồm các dòng độc nhất và
nguyên liệu đã đýợc làm sạch bệnh.
 Vật liệu bảo quản invitro có thể có lợi trong từng thời điểm chẳng hạn nhân
nhanh một kiểu gen, phục vụ chýõng trình tạo giống hoặc khảo sát đánh giá trong
điều kiện invitro.
 Vật liệu cần bảo quản invitro có liên quan đến kĩ thuật gen và sản xuất các
chất thứ cấp.
Ví dụ: Phýõng pháp bảo quản nguồn gen invitro đối với giống hoa Lilium x
formolongo
 Đối týợng nghiên cứu: Lilium x formolongo
 Phýõng pháp nghiên cứu:
- Thu thập mẫu
- Tách và nuôi cấy vảy củ
- Cấy chuyển và bảo quản nguồn gen
 Môi trýờng nuôi cấy:
Trong thí nghiệm sử dụng môi trýờng vào mẫu là MS + 30g
saccarose/l + 6.5g agar/l, 1ml α NAA, pH là 5.7
 Môi trýờng cấy chuyển: MS + 30g saccarose/l + 6.5g agar/l, pH là 5.7
 Tiến hành:
Mẫu sau khi thu thập đýợc đýa về phòng thí nghiệm, tiến hành khử
trùng mẫu.
Hóa chất dùng để vô trùng : Clorua thủy ngân với nồng độ sử dụng là
0.1 – 1% (W/v) trong thời gian tử 10 – 15 phút
Sau khi mấu đýợc khử trùng, tiến hành vào mẫu
Thời gian từ khi vào mẫu tới khi cây ra rễ là 3 tuần
Cấy chuyển nhiều lần với môi trýờng MS + 30g saccarose/l + 6.5g
agar/l, pH là 5.7
Cấy chuyển tới khi cây đạt tiêu chuẩn nhất định, tăng nồng độ đýờng
tới 60g saccarorose + 6.5g agar/l, pH = 5.7

 Tiến hành bảo quản trong phòng nuôi:

+ Nhiệt độ phòng nuôi: 100C
+ Thời gian chiếu sáng: 16h
+ Cýờng độ chiếu sáng: 1800lux
+ Độ ẩm phòng nuôi: 50 – 60%

 Kết quả:
Nhờ tăng nồng độ đýờng từ 30g/l đến 60g/l kết hợp với nhiệt độ phòng
nuôi thấp, thời gian và cýờng độ chiếu sáng thấp…, thời gian cấy chuyển giống
Lilium Formolongo đã tăng từ 4 tuần lên đến 10 tuần.

III. Kết luận

Bảo quản invitro đặc biệt có giá trị với những cây trồng sinh sản hữu
tính, nhýng hạt của chúng không thể bảo quản đýợc ở ẩm độ, nhiệt độ thấp và cây
trồng nhân giống vô tính, việc duy trì chúng trên đồng ruộng đang có nhiều nguy cõ
mất giống.
Ở nýớc ta, công tác bảo quản invitro đã býớc đầu tiến hành có kết quả
đối với một số cây trồng nhân giống vô tính trong nông nghiệp. Nhýng nhu cầu phát
triển sử dụng, bảo quản invitro rất lớn. Do đó cần phải lựa chọn một chiến lýợc bảo
quản thích hợp, sử dụng những thành tựu của công nghệ sinh học, phát triển những
giải pháp mới, nuôi cấy bảo quản invitro để hỗ trợ các phýõng pháp cổ truyền nhý
ngân hàng gen hạt và trên đồng ruộng nhằm bảo quản tốt hõn nguồn tài nguyên của
chúng ta.

Nuôi cấy tế bào trần

• Mở đầu
 Các tế bào thực vật có tính toàn năng,có thể nuôi cấy, điều khiển sự phát sinh hình
thái của chúng cho tới thành một cây hoàn chỉnh. Có thể nói, nội dung bên trong vỏ tế
bào trong đó vật chất chính là các thông tin di truyền chứa trong nhân của tế bào đã quyết
định mọi đường hướng của quá trình thực hiện tính toàn năng của tế bào. Vì thế,hoàn
toàn có thể nuôi cấy tạo cây hoàn chỉnh từ khối nguyên sinh chất chứa nhân của tế bào.
Từ đấy đưa đến khái niệm nuôi cấy tế bào trần thực vật.
Tế bào trần được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực thí nghiệm từ nghiên cứu
những tính chất vật lý của màng sinh chất đến những nghiên cứu nhập bào và hấp thu các
phần tử, các bào quan và vi sinh vật.
Protoplast
1.Khái niệm về Protoplast
Protoplast là các tế bào trong đó có thành tế bào được loại bỏ và màng tế bào chất
là lớp ngoài cùng nhất trong tế bào.
Protoplast có thể thu được bằng enzyme lytic cụ thể để loại bỏ vách dung hợp.
 Tế bào trần có thể được tạo ra bằng nhiều cách: từ dịch huyền phù tế bào, tế bào
mô sẹo hoặc từ mô tươi nguyên trạng như lá qua tác động của các enzym; Pectinase phân
hủy pectin, cellulas phân hủy hemicellulose. Các tế bào trần nếu để trên môi trường dinh
dưỡng thì sau 5-10 ngày sẽ tạo vách tế bào và phân chia.
Các tế bào trần, thậm chí khác loài,có thể kết hợp với nhau tạo tế bào lai và quan trình
này gọi là sự dung hợp tế bào trần.
2. Tại sao cần phải nuôi cấy tế bào trần ?
 Nuôi cấy tế bào trần sẽ mở ra 1 mô hình hấp dẫn để theo dõi quá trình sinh phôi
từ 1 tế bào cô lập. Đặc biệt biết được sự sắp xếp các sợi Xenluloz để xác định hướng kéo
dài tế bào, vị trí và hướng của mặt phẳng phân chia.
 So với các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào khác, nuôi cấy dung hợp tế bào trần giúp
tạo ra các cơ thể lai mang các đặc điểm di truyền của các bố mẹ có nguồn gen khác xa
nhau mà lai hữu tính không thể thực hiện được.
3.So sánh đặc điểm nuôi cấy tế bào trần với nuôi cấy các tế bào vẫn còn thành tế bào:
 So với quy trình nuôi cấy mô tế bào bình thường thì nuôi cấy tế bào trần thường
yêu cầu 1 số thay đổi do bản chất của tế bào trần. Các thay đổi thường liên quan đến sự
điều chỉnh nồng độ muối vô cơ, thêm vào các hợp chất hữu cơ, vitamin, đường để đảm
bảo khả năng thẩm thấu và chất điều tiết sinh trưởng để kích thích sự phân chia tế bào.
 Nuôi cấy tế bào trần có nhiều ưu thế hơn so với nuôi cấy các tế bào vẫn còn thành
tế bào
 Ưu thế của kĩ thuật nuôi cấy và tách tế bào trần là tế bào không có màng cứng, ở
trạng thái đơn bào, mật độ tế bào thu được trên một một đơn vị thể tích môi trường có thể
rất cao (đạt 106 tế bào/ 1ml môi trường).
 Tế bào trần ở một số cây trồng có khả năng tái sinh rất mạnh, ví dụ tế bào mô thịt
lá ở thuốc lá, cải dầu… Bằng thao tác di truyền ở tế bào trần có thể dễ dàng tạo ra các tế
bào biến đổi gen. Tế bào với kiểu gen biến đổi sẽ được bảo tồn khi tái sinh tế bào thành
cây hoàn chỉnh. Điều này rất khó thực hiện ở các tế bào vẫn còn thành tế bào.
 Nuôi cấy tế bào trần cho phép khả năng biến nạp các gen thuận lợi vào tế bào
thực vật mà trước kia thường bị vỏ tế bào ngăn cản.
 Nuôi cấy tế bào trần cho phép khả năng dung hợp tế bào – gắn hai tế bào trần lại
thành một tế bào với hai bộ thông tin di truyền của hai tế bào tạo nên một thể lai vô tính
mà không cần hiểu biết chính xác về sự liên hệ giữa các gen, ít tốn kém, nhanh,trực tiếp
và áp dụng các kĩ thuật chuyển gen( bơm AND, hóa thẩm, điện thẩm…)giúp loại trừ tính
bất thụ hữu tính, tạo cây lai hữu thụ; Giúp chuyển những đặc tính có lợi vào cây trồng, ít
đòi hỏi phương tiện phức tạp.
 Tế bào lai thu được từ việc dung hợp hai tế bào trần được tái sinh và thành một
cây lai. Quá trình này xảy ra ở tế bào nên gọi là lai tế bào và thông qua tế bào soma nên
gọi là lai soma hay lai vô tính tế bào. Từ phương pháp này đẻ ra phương pháp lai xa giữa
các loài- điều không thể thực hiện bằng phương pháp lai hữu tính thông thường.
 Tuy nhiên quá trình nuôi cấy protoplast còn tồn tại một số trở ngại đó là:
 Quá trình cô l ập nuôi c ấy ph ải hoàn thi ện.
 Chưa có phương pháp hi ệu qu ả đ ể tuy ển ch ọn các s ản ph ẩm phù h ợp.
4. Kĩ thuật tách tế bào trần:
 4.1. Phương pháp cơ học:
 Phương pháp này dựa trên cơ sở phá các mối liên kết của mô bằng các dao sắc
nhọn ( sharp-edged knife) và giải phóng các protoplast riêng rẽ. Phương pháp này cho
hiệu suất thấp.
 4.2. Phương pháp enzyme:
 Để phá vỡ thành tế bào người ta thường sử dụng các enzyme chiết xuất từ các
sinh vật chứa nhiều enzyme phân giải thành vách tế bào như: nấm, ốc và mối. Các
enzyme này đã được thương mại hóa theo các phương pháp khác nhau với mức độ tinh
khiết khác nhau
 Hỗn hợp enzyme thường dùng là enzyme celluloza và macerozim được chiết xuất
từ nấm Trichdearina virde và Aspergillus niger và đã được sản xuất công nghiệp. Nồng
độ dung dịch enzyme sử dụng tùy thuộc đối tượng. Các hỗn hợp enzyme thường được sử
dụng ở pH 5,5 – 5,8 trong 3-8h.
 Ngoài ra để protoplast không bị vỡ sau khi thành cellulose bị phân hủy người ta
phải bổ sung những chất tăng áp lực thẩm thấu vào dung dịch enzyme để duy trì cân bằng
thẩm thấu giữa nội bào và môi trường bên ngoài. Các dung dịch thường dùng là dung
dịch đường manitol, sorbitol. Nồng độ sử dụng khoảng 0,3 – 0,7M tùy theo đối tượng
thực vật.
 So với phương pháp cơ học thì phương pháp này có hiệu quả cao hơn rất nhiều.
Phương pháp enzyme cho phép tách được hàng gram protoplast. Có thể thu được từ 1
gam lá cỏ luzec hoặc khoai tây là 6-12 triệu tế bào trần.

 Vì protoplast thực chất là tế bào trần không có thành cho nên có thể tách được từ
nhiều nguồn khác nhau như các bộ phận của cây ( rễ, lá, hạt phấn), callus, tế bào đơn…
Xác định chất lượng tế bào trần
 Sau khi phá vỏ tế bào vẫn có những mảnh thành tế bào còn xót lại làm ảnh hưởng
đến những nghiên cứu sau này
 Cách tốt nhất để phát hiện thành tế bào là dùng calcofluor, một hóa chất sẽ bám
vào phân tử xenlulozo và gây ra phát ánh sáng huỳnh quang với màu xanh rực rỡ khi soi
dưới tia cực tím. Nếu các tế bào trần đã bị loại bỏ hoàn toàn thành tế bào hiển vi trường
có màu tối thẫm các tế bào trần sẽ không nhìn thấy được ngoại trừ sự tự phát ánh sáng
huỳnh quang đỏ của các lạp thể

Còn một phương pháp khác là dùng kính hiển vi huỳnh quang kết hợp với nhuộm xanh
Evan để xác định sức sống của tế bào trần. Những tế bào còn nguyên vẹn sẽ ngăn không
cho thuốc nhuộm xâm nhập vào nguyên sinh chất ngược lại các tế bào có màng sinh chất
bị mất chức năng sẽ bắt màu xanh và chúng không thể sinh trưởng được
5. Nuôi cấy tế bào trần
 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy
- Thành phần của môi trường nuôi cấy lỏng hay đặc tùy thuộc vào vật liệu thực
vật.Môi trường này có thêm Auxin và Xitokinin để giúp sự tái tạo vách và các lần phân
chia đầu tiên.
- Đảm bảo đủ các yếu tố dinh dưỡng: axit amin, polyamin, Hydrolysat Cazein, nước dừa,
mạch nha…
- Đảm bảo điều kiện nhiệt độ, PH, ánh sáng,áp suát thẩm thấu….
- Trong lần tự nhân đôi đầu tiên, môi trường phải có áp suất thẩm thấu cao,
Auxin, Xitikinin thích hợp, ánh sáng yếu. Sau đó cần giảm áp suất thẩm thấu bắng cách
pha loãng môi trường để giúp cho sự tăng trưởng tế bào.
Khi mô sẹo được hình thành cần chuyển chúng vào trong môi trường rắn chứa Auxin ở
nồng độ thấp hơn và Xitokinin cao hơn. Sau cùng kích thích ra rễ cần loại Xitokinin, tăng
nồng độ Auxin.
Nuôi cấy tế bào trần chia làm 2 giai đoạn
Giai đoạn 1
 Từ tế bào trần tao thành tế bào, phân chia tạo thành microcallus.
 Sau một thời gian nuôi cấy một đến hai tuần các tế bào trần tái tạo vỏ và phân
chia tạo nên các microcallus.
 Điều kiện nuôi cấy
 Nuôi trong môi trường lỏng lắc
 Lớp nuôi trợ dưỡng: tế bào trần, lớp xốp có khả năng thấm từ dưới lên, callus từ
mô tế bào mà từ đó tách tế bào trần,agar.
Nuôi trong điều kiện ánh sáng yếu, nuôi tối.
Ánh sáng thẩm thấu đẳng trương.
Thời gian nuôi từ 1 đến 2 tuần.
Giai đoạn 2
 Microcallus thành callus ổn định hình thành phát sinh cơ quan.
 Chuyển các microcallus lên môi trường cứng, chúng sẽ tạo thành các mô sẹo. Từ
đó chuyển sang môi trường tái sinh chồi và cây hoàn chỉnh.
 Điều kiện nuôi cấy.
 Nuôi cấy trên môi trường đặc
 Chú ý tới ánh sáng và quang chu kì
 Có chất điều tiết sinh trưởng cho qua trình tái sinh cây
 Loại bỏ chất gây ánh sáng thẩm thấu
Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của tế bào trần
 Nuôi cấy tế bào trần thường yêu cầu 1 số thay đổi so với quy trình nuôi cấy mô
bình thường do bản chất của tế bào trần.
 Các thay đổi thường liên quan đến sự điều chỉnh nồng độ muối vô cơ, thêm vào
các hợp chất hữu cơ, vitamin, đường để đảm bảo khả năng thẩm thấu và chất điều tiết
sinh trưởng để kích thích sự phân chia tế bào.
6. Dung hợp tế bào trần
 Có thể nói việc dung hợp tế bào trần và tái sinh thành cây lai từ tế bào trần là 1
trong những thành tựu tuyệt vời của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào. Bằng phương pháp này
đẻ ra phương pháp lai xa giữa các loài điều mà không thể thực hiện bằng các phương
pháp lai hữu tính thông thường.

Tế bào trần là những tế bào không có thành tế bào. Chính vì thế chúng có thể hòa lẫn vào
nhau (dung hợp) và thành 1 tế bào lai mang trong mình vật chất di truyền của cả 2 tế bào.
 Tế bào lai này được tái sinh và thành 1 cây lai. Quá trình này xảy ra ở tế bào nên
gọi là lai tế bào và thông qua tế bào soma nên gọi là lai soma hay lai vô tính tế bào
Sơ đồ chọn lọc các thể lai soma bằng cách ứng dụng sự mẫn cảm khác nhau của các
protoplast thịt lá đối với actinomycin D

Có 2 phương pháp dung hợp tế bào trần:

+ Dung hợp bằng hóa chất

+ Dung hợp bằng điện

Dung hợp bằng hóa chất
 Xử lý bằng NaNO3
 Năm 1970, Power và cộng sự đã dùng NaNO3 (0,25 M) kích thích dung hợp hai
protoplast. Carlson và cộng sự (1972) cũng dùng phương pháp này để sản xuất cây lai
soma đầu tiên (Nicotiana glauca × N. langsdorffii). Tuy nhiên, phương pháp này cho hiệu
suất thấp vì NaNO3 không thích hợp với tế bào bị không bào hóa mạnh như protoplast từ
nhu mô lá.
 Xử lý bằng PEG
Thường sử dụng poly ethylenglycol(PEG 5-25%) là chất có tác dụng dính kết tế
bào trần dể dung hợp chúng. Nồng độ và trọng lượng phân tử của PEG quyết định sự
thành công của thí nghiệm dung hợp. PEG có trọng lượng phân tử thấp (~ 100) không thể
tạo ra một sự dính
chặt chắc chắn, trong khi PEG trọng lượng phân tử 6000 cho hiệu quả dung hợp cao hơn.
Xử lý PEG cùng với pH/Ca2+ có hiệu quả tăng tần số dung hợp và khả năng sống của
các
protoplast.

Quá trình dung hợp sẽ được cải thiện hơn nếu xảy ra trong môi trường kiềm (pH
từ 8- 10) và khi có bổ sung CaCl2 (50-250 mM).
Sau khi xử lý bằng tác nhân dung hợp, các protoplast được nuôi cấy theo phương
thức chuẩn.
 PEG có 2 tác dụng:
+ Cung cấp một câu nối để Ca2+ có thể liên kết các bề mặt màng với nhau
+ Dẫn đến sự rối loạn tích điện bề mặt màng trong suốt quá trình rửa giải.

Dung hợp tế bào trần bằng xử lí PEG

Dung hợp bằng điện
 Phương pháp này đơn giản hơn, nhanh hơn và hiệu quả hơn dung hợp bằng hóa
chất. Điều quan trọng hơn cả là dung hợp bằng điện (electrofusion) không gây độc đối
với tế bào như thường thấy ở các protoplast hoặc các thể dị nhân được xử lý bằng PEG.
Người ta đã dùng các xung điện (electric pulses) để đưa trực tiếp DNA ngoại lai vào
trong tế bào thực vật, kỹ thuật này đã làm tăng sự quan tâm về việc ứng dụng dung hợp
bằng điện vào lĩnh vực di truyền tế bào soma.
Cách tiến hành
 Đưa dung dịch hỗn hợp tế bào trần(2 bản cực được thiết kế trong các hộp dung
hợp), các tế bào trần sẽ lần lượt sắp xếp thành chuỗi nằm giữa 2 bản cực. Khi có 1 xung
điện cao (750-1000V) trong 1 thời gian rất ngắn(1-200 mili giây) vùng tiếp xúc giữa 2
màng tế bào sẽ bị vỡ, 2 tế bào trần hòa nhập vào nhau-quá trình dung hợp sẽ xảy ra.
7. Triển vọng ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần và lai tế bào soma
Mặc dù những khó khăn về mặt kĩ thuật đã làm hạn chế tiềm năng sử dụng tế bào trần tuy
nhiên tế bào trần vẫn được ứng dụng trong một số lĩnh vực nghiên cứu:
Sau khi loại bỏ thành tế bào và được nuôi cấy trên môi trường thích hợp những tế
bào trần được tái tạo nhanh chóng thành tế bào mới và quá trình phát triển này đã đưa ra
một hệ thông lý tưởng cho nghiên cứu sinh tổng hợp thành tế bào (Willison và Cocking,
Grout 1973)
 Các tế bào trần có khả năng tiếp nhận các vật liệu từ bên ngoài đưa vào trong tế
bào do đó tế bào trần là đối tượng thích hợp cho các nghiên cứu đưa nhân lạp thể, ti
thể,DNA, Plasmit vào tế bào (Dodds và Bengochea 1985)
 Quần thể tế bào trần có thể được xem như một hệ thống tế bào đơn và bởi vậy các
thao tác tương tự như đối với các vi sinh vật qua đó có thể lựa chọn dòng đột biến và tách
dòng quần thể tế bào thực vật (Evans và Cocking 1977)
Một số ứng dụng khác :
 Sản xuất các dòng bố mẹ phục vụ sản xuất hạt lai.
 Sản xuất các hợp chất thứ cấp qua nhân sinh khối tế bào trong môi trường lỏng
(nuôi lắc, nuôi trong bioreactor).
 Công nghệ nuôi cấy tế bào trần ứng dụng cho những cây có giá trị kinh tế
cao,nhưng khó nhân giống bằng phương pháp thông thường.
 Công nhệ này làm nhân nhanh giống và kết hợp làm sạch virus. Nghiên cứu tạo
giống khoai tây kháng bệnh virus của GS.TS Nguyễn Quang Thạch trường ĐHNN Hà
Nội.
 Bảo quản nguồn gen.
 . Nhờ kỹ thuật dung hợp người ta có thể lai tạo giữa hai loài thực vật khác nhau,
thậm chí cả các loài thuộc những chi khác nhau. Điển hình nhất là việc dung hợp tế bào
cây khoai tây với tế bào cây cà chua. Kết quả là tạo ra được cây lai Pô-ma-tô mà trên mặt
đất cho quả cà chua còn dưới mặt đất cho củ khoai tây (!).
Đây là sự dung hợp 2 tế bào trần khác loài tạo tế bào lai chứa bộ NST của 2 tế bào gốc.
Tạo được cây lai từ tế bào khoai tây & cà chua.
 Nuôi 2 dòng tế bào sinh dưỡng khác loài trong cùng 1 môi trường, có sự kết dính
ngẫu nhiên của 2 hay 1 số tế bào khác loài của tế bào lai chứa bộ NST của 2 tế bào gốc
 Để tăng tỉ lệ kết dính; keo hữu cơ; xung điện cao áp.
Dùng hócmôn kích thích tế bào lai phát triển thành cây lai.
 Với phương pháp này có thể tạo ra những cơ thể có nguồn gen khác xa nhau mà
lai hữu tính không thực hiện được.
 Kỹ thuật dung hợp tế bào trần cho phép mở rộng nguồn gen của các loài thực vật
tạo ra các dòng tế bào sản xuất mới mang các đặc tính di truyền ưu việt của cả bố và mẹ
 Nhiều cây lai được tạo ra bằng phương pháp dung hợp tế bào đã có được năng lực
chống cỏ dại hoặc chống nấm bệnh.
Tạo điều kiện thuận lợi cho sự nghiên cứu về sinh lí tế bào: tính thấm của màng, vận
chuyển các chất hòa tan, ion, cơ chế hoạt động của hoocmon thực vật…

Một ứng dụng đầy triển vọng khác của nuôi cấy tế bào trần là vi nhân giống thực vật. Sau
khi phân chia protoplast, thành tế bào được tái sinh để tăng sự phát triển callus và tiếp
theo là cây hoàn chỉnh nhờ đó thực vật có thể được nhân lên nhiều lần.
 Nuôi cấy tế bào trần đòi hỏi sự sinh trưởng của protoplast trên môi trường đặc
hoặc lỏng. Từ đó các protoplast được phân lập có thể được sự dụng để:

• Biến đổi thông tin di truyền của tế bào thực vật

• Tạo ra cây lai vô tính thông qua dung hợp tế bào trần
• Nghiên cứu sự xâm nhiễm của virus ở thực vật và những vấn đề khác.

8. Tồn tại của kỹ thuật protoplast

 Kỹ thuật protoplast đã thu được thành công ở các loài thuộc họ cà (Solanaceae) và
một số họ khác, nhưng thành công ở họ hòa thảo (Poaceae) là họ của các cây trồng ngũ
cốc chính còn rất hạn chế.

 Potrykus (1980) đã thảo luận rất kỹ về vấn đề này. Theo Potrykus có những chỉ
tiêu sau liên quan đến kết quả nuôi cấy và tái sinh từ protoplast tiềm lực in vitro.
1. Phân lập
- Cơ sở di truyền của tế bào (khả năng tiềm tàng của tế bào trong nuôi cấy in vitro).
- Tương tác tế bào trong cây.
- Sự phân hóa trong quá trình phát triển cơ thể.
- Nguồn gốc cơ quan và cây hoàn chỉnh.
- Trạng thái sinh lý của tế bào.
- Tác động của quá trình phân lập.
- Tác động của trạng thái phân lập.
2. Điều kiện nuôi cấy
- Nhu cầu dinh dưỡng.
- Nhu cầu về phytohormone.
- Điều kiện vật lý của nuôi cấy.
- Các yếu tố ức chế có thể xuất hiện.
- Tác động của mật độ quần thể tế bào
3. Sự phân bào
- Sinh tổng hợp thành tế bào.
- Điều khiển sinh tổng hợp thành tế bào.
- Chức năng của thành tế bào đối với phân bào.
- Điều khiển sự phản phân bào.
- Điều khiển sự phân chia nhân.
- Điều khiển phân bào.
4. Sự phân hoá
- Điều khiển phân hóa tế bào.
- Tương tác tế bào trong nuôi cấy.
- Điều khiển và cơ chế tạo kiểu mô.
- Điều khiển quá trình tạo cơ quan, phôi.

9. Quy trình cụ thể minh họa việc nuôi cấy và dung hợp tế bào trần
Quy trình nuôi cấy Protolast từ lá của cây thuốc lá.
9.1. Nguyên liệu thực vật
Lá cây:
Lá là nguồn nguyên liệu thông dụng và truyền thống cho kĩ thuật protoplast thực vật do
nó cho phép phân lập được một số lớn các tế bào tương đối đồng nhất.

 Phương pháp cơ bản để tách protoplast từ lá cây:

 Khử trùng mẫu lá.
 Ngâm mẫu lá trong dung dịch thẩm thấu để tế bào co nguyên sinh chất.
 Tách lớp mặt dưới lá.
 Ngâm mẫu trong hỗn hợp enzyme.
 Tinh sạch tế bào trần.
 Nuôi cấy tế bào trần trong môi trường thích hợp hoặc dung hợp hay chuyển nạp
gene.
 Lá của cây thuốc lá in vitro được chọn dùng làm nguyên liệu tách protoplast. Sử
dụng các lá được tách trong ngày.

 Các bước phân lập protoplast từ lá cây

9.2. Chuẩn bị môi trường

 Dung dịch enzyme tách protoplast:

+ Onozuka cellulase R10 0,5 %
+ Onozuka macerozyme R10 0,1 %
+ Mannitol 13,0 %
 + pH môi trường ~ 5,8
 Dung dịch này được khử trùng bằng màng lọc Millipore loại có đường kính lỗ lọc
0,2-0,25 µm.
9.3. Tiến hành
 Ngày thứ nhất
 Các mẫu lá thuốc lá in vitro được loại bỏ hết gân lá và đặt lên đĩa petri thủy tinh
vô trùng. Dùng dao cấy băm nhỏ các mảnh lá.
 Cho các mảnh lá đã băm nhỏ vào cốc đong vô trùng loại 50 ml bổ sung 10 ml
dung dịch enzyme tách protoplast. Bọc cốc đong bằng giấy parafilm, ghi nhãn và đặt
trong tối qua đêm trên máy lắc ở tốc độ thấp (khoảng 40 vòng/phút).

 Ngày thứ hai

 Dùng micropipette chuyển dịch protoplast lên lưới lọc vô trùng (Φ = 65µm) đặt
trong cốc loại 50 ml.
 Bổ sung thêm 3 ml dung dịch rửa (PI + 10% mannitol) vào cốc chứa các mảnh lá
vụn, lắc mạnh, và lọc tiếp trên lưới lọc rồi chuyển vào hỗn hợp protoplast-enzyme của
bước trên.
 Bổ sung thêm 2 ml dung dịch rửa để rửa proptoplast hết khỏi lưới lọc l. Chuyển
hỗn hợp protoplast-enzyme (tổng cộng 15 ml) vào tube ly tâm loại 15 ml và ly tâm 50×g
trong 10 phút.

 Loại bỏ phần dịch nổi phía trên, tái huyền phù tiểu thể bằng 10ml dung dịch
tách (PI + 20% sucrose), thêm 1ml dung dịch rửa lên trên bề mặt dung dịch tách và
protoplast sao cho không làm hòa lẫn hai dung dịch, tốt nhất là tạo thành hai pha (nhỏ từ
từ dung dịch rửa bên thành tube tránh bắn tung toé lên dịch rửa bên dưới), ly tâm 50×g
trong 10 phút. Các protoplast sống sót sẽ nằm ở trên bề mặt dung dịch .

 Dùng micropipette hút lớp protplast màu xanh lục nổi trên tube ly tâm và chuyển
nó sang một tube ly tâm sạch, thêm 10 ml dung dịch rửa và ly tâm lại. Protoplast sẽ lắng
xuống đáy tube và có dạng viên.
 Rửa protoplast thêm một lần nữa trong 10 ml dung dịch rửa. Loại bỏ phần nổi trên
mặt và tái huyền phù protoplast trong khoảng chừng 1 ml môi trường nuôi cấy protoplast
(PC).
 Đặt một giọt protoplast trên buồng đếm hồng cầu và ước lượng mật độ protoplast
(số lượng tế bào/số ô đếm ×10.000). Nuôi cấy protoplast bằng cách pha loãng 50.000 tế
bào/ml môi trường nuôi cấy protoplast và chuyển sang một đĩa petri vô trùng.
Bọc lại, ghi nhãn và nuôi cấy qua đêm trong tối ở 28oC.

 Ngày thứ ba
Chuyển sang nuôi cấy ở ánh sáng yếu (10-20 µmol.sec/m2 hoặc bọc một lớp vải
thưa dưới đèn hùynh quang ánh sáng trắng, với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ, nuôi trong 2
ngày.
 Ngày thứ năm
 Chuyển sang nuôi cấy ở cường độ ánh sáng cao hơn (50-75 µmol/sec/m2) trong 2
ngày bằng cách bỏ lớp vải thưa ra.
 Ngày thứ bảy
Ta có được kết quả của việc nuôi cấy protoplast, số tế bào phân chia từ tổng số tế
bào nuôi cấy ban đầu, trong một mẫu có 100-200 protoplast nuôi cấy. Có dấu hiệu của sự
nhiễm bẩn không.

KẾT LUẬN
 Kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần đã bắt đầu được ứng dụng rộng rãi để
tạo ra các cây trồng mới hoặc có sản lượng hay chất lượng cao hơn, hoặc là có thêm khả
năng kháng bệnh. Việc giới thiệu về quy trình sử dụng enzyme để cô lập tế bào trần thực
vật (Cooking 1960) đã đưa ra một bộ mặt mới đầy hứa hẹn cho tế bào thực vật và nuôi
cấy mô, mở ra một lĩnh vực mới trong sinh học tế bào thực vật. Điều làm cho tế bào trần
có tác động mạnh như một hệ thống thí nghiệm đó là hệ enzyme phân hủy vách tế bào
làm lộ ra bề mặt màng tế bào như là một rào cản giữa môi trường bên ngoài và thành
phần bên trong tế bào. Sự tiếp cận đến màng sinh chất có ý nghĩa là thí nghiệm có thể
được thiết lập để nghiên cứu và thao tác trên các thuộc tính của màng tế bào điều mà
không thể thực hiện được khi bị bao phủ bởi vách tế bào. Tế bào trần được sử dụng rộng
rãi trong nhiều lĩnh vực thí nghiệm từ nghiên cứu những tính chất vật lý của màng sinh
chất (Ruesink 1973) đến những nghiên cứu nhập bào và hấp thu các phần tử (Willison et
al. 1971), các bào quan (Potrykus 1975) và vi sinh vật (Davey và Power 1975).

Kỹ thuật thụ phấn và nuôi cấy phôi invitro

 Thụ phấn (pollination) là sự tiếp nhận các hạt phấn từ bao phấn tới núm nhụy để
thực hiện thụ tinh ở hoa. Ở thực vật có hai phýõng thức thụ phấn là thụ phấn chéo và tự
thụ phấn
 Th ụ tinh (fertilization): Ở th ực v ật th ụ tinh là s ự k ết h ợp c ủa hai giao t ử đ
ực và cái (tinh trùng và noãn) thành h ợp t ử (phôi, bào t ử ho ặc h ạt) là đ ặc trýng cõ b
ản c ủa sinh s ản h ữu tính, sinh s ản lý ỡng tính. Ở th ực v ật h ạt kín có phýõng th ức th
ụ tinh kép.
 Phôi là một nhóm tế bào có khả năng phát triển tạo thành cõ thể hoàn chỉnh là pha
phát triển trung gian giữa hợp tử hay tế bào soma và bào tử thể.
 Có hai loại phôi: phôi hữu tính & phôi vô tính ( phôi soma)
 Phôi hữu tính : là phôi trong hạt đýợc tạo ra do thụ tinh giữa tế bào trứng và giao
tử đực (do lai hoặc tự thụ) còn gọi phôi hợp tử.
 Phôi soma: là phôi đýợc phát sinh từ tế bào sinh dýỡng 2n chỉ của bố hoặc mẹ và
tế bào ấy có cấu trúc nhý một phôi gọi là phôi vô tính ( phôi soma).
 Thụ phấn invitro là thực hiện quá trình thụ phấn trong ống nghiệm không phụ
thuộc vào cõ thể mẹ.
 Nuôi cấy phôi (cứu phôi) là sự tách rời và nuôi cấy invitro phôi hợp tử đã thành
thục hoặc chýa thành thục thành cây hoàn chỉnh.
II. Kỹ thuật thụ phấn invitro
 Mục đích
 Điều kiện có thể thụ phấn in vitro
 Các býớc tiến hành
 Các phýõng pháp thụ phấn in vitro
II.1. Mục đích phải tiến hành kỹ thuật này
 Để khắc phục sự bất hợp trýớc khi thụ tinh.
 Thụ phấn, thụ tinh ở điều kiện in vitro tạo ra cõ hội sản xuất các phôi lai giữa các
loài thực vật không thể lai bằng các phýõng pháp gây giống cây trồng truyền thống.
II.2. Điều kiện có thể thụ phấn in vitro
 Điều kiện cõ bản là phải nuôi cấy thành công bầu quả hay noãn phân lập (noãn
trần) của cây mẹ.
 Chủ động điều khiển quá trình nảy mầm của hạt phấn cây bố trong môi trýờng
nuôi cấy vô trùng.
 Tiến hành thụ phấn để sự thụ tinh diễn ra và nuôi cấy hợp tử phát triển thành phôi
lai trên môi trýờng dinh dýỡng vô trùng.
II.3. Các býớc tiến hành
 Lấy nụ của hoa mẹ ở thời điểm trýớc khi nở hoa 2 ngày, khử trùng, tách lấy
bầu quả hay lá noãn nuôi cấy invitro.
 Lấy nụ hoa của cây bố vào ngày nở hoa, khử trùng, tách lấy bao phấn và để
trong điều kiện vô trùng đến khi chúng tung phấn.
 Lấy hạt phấn rắc trực tiếp lên mặt cắt của bầu quả hay lá noãn để thụ phấn
in vitro.
 Khi noãn thụ tinh, chúng hình thành hợp tử và tạo phôi. Các phôi lai in vitro
thýờng bỏ qua giai đoạn ngủ, nghỉ và mọc thành cây in vitro
II.4. Các phýõng pháp thụ phấn in vitro

II.4.1. Thụ phấn bằng phýõng pháp cắt ngắn vòi nhụy
 Là phýõng pháp dễ và hiệu quả. Núm nhụy và 1 phần hoặc toàn bộ vòi nhụy của
hoa đýợc cắt ngắn, sau đó hạt phấn của cây bố đýợc thụ trực tiếp lên vòi nhụy đã cắt ngắn
và kết quả là có rất nhiều ống phấn đã kéo dài đýợc tới bầu nhụy.
 Nhýợc điểm: số lýợng hạt trong 1 quả ít. Có thể do ống phấn gặp khó khăn trong
khi đâm xuyên qua vách bầu.
II.4.2. Thụ phấn bằng phýõng pháp ghép vòi nhụy
 Hạt phấn cần thụ đýợc “gửi” trên 1 núm nhụy thích hợp và nảy mầm, 1 ngày sau
vòi nhụy và 1/3 bầu của hoa chứa hạt phấn đýợc cắt và ghép lên 3/4 bầu nhụy của hoa
cây mẹ cần thụ phấn.
 Theo Vantuyl và cộng sự(1991) thì một ngày sau khi “gửi” hạt phấn vòi nhụy
đýợc cắt ngắn cách trên bầu 1-2mm và đýợc gắn lên bầu nhụy của hoa cây mẹ. Bầu và
vòi nhụy ngoài đồng ruộng đýợc kết hợp với nhau = ống nối còn trong invitro chỉ cần sử
dụng agar để cố định là đủ.
II.4.3. Thụ phấn cho giá noãn
 Bầu đýợc cắt theo chiều dọc thành nhiều miếng vào ngày núm nhụy tiết ra dịch
nhầy hoặc 1-2 ngày sau đó. Mỗi 1 miếng sẽ chứa 1 giá noãn và 1 hàng noãn, có thể để lại
hoặc không để lại vách bầu. Một lýợng lớn hạt phấn cần thụ đýợc đặt theo giá noãn. Để
kích thích hạt phấn nảy mầm và đâm xuyên vào noãn có thể đặt vào môi trýờng nuôi cấy
1 hay 2 vòi nhụy.
 Có thể nuôi cấy ngoài sáng hay trong tối. Noãn nảy mầm sau 5-7 tuần thụ phấn và
tiếp tục đýợc thụ phấn
 Thụ phấn bên trong bầu (intraovarian pollionation): cả vòi nhụy hoặc 1 phần của
nó có thể đýợc tách ra và hạt phấn hoặc đýợc đặt trên bề mặt vết cắt bầu quả hoặc chuyển
qua lỗ trên thành vòi nhụy đến bầu quả
III. Kỹ thuật cứu phôi
 Mục đích
 Nuôi cấy phôi hữu tính
 Các yếu tố ảnh hýởng
 Ứng dụng
III.1. Mục đích
 Khắc phục sự bất hợp sau thụ tinh.
 Khắc phục sự bất hợp giữa nội nhũ và phôi khi lai xa.
 Tạo cây đõn bội (lúa mì x ngô, lúa mỳ x yến mạch dẫn đến sự loại bỏ một bộ
nhiễm sắc thể).
 Ngăn ngừa sự thui chột phôi ở những loại quả hạch chín (đào, mận, mõ…).
 Phá ngủ nghỉ, rút ngắn chu kỳ tạo giống…
III.2. Nuôi cấy phôi hữu tính
 Sự phát sinh phôi hữu tính:
-Xảy ra quá trình thụ tinh giữa hạt phấn và noãn hình thành hợp tử
-Hợp tử trải qua quá trình nguyên phân liên tiếp tạo thành phôi
 Nuôi cấy phôi hữu tính gồm
-Tách phôi
-Nuôi cấy phôi để tạo cây.
III.2.1. Tách phôi
 Phôi hữu tính đýợc hình thành trong môi trýờng vô trùng của noãn và mô bầu
hoa.
-Ở một số loài phôi có kích thýớc lớn, thuận tiện cho quá trình tách phôi (cây họ
đậu), nhýng một số loài hoa khó tách phôi (hoa lan_hạt có kích thýớc nhỏ, vỏ hạt tiêu
giảm và thiếu nội nhũ)
-Ở thực vật hoa dạng chùm, mô non thýờng xếp ở đỉnh của chùm hoa
 Trong quá trình thu nhận phôi cần hạn chế sự tổn thýõng của dây treo phôi. Dây
treo phôi có kích thýớc nhỏ và cấu trúc mỏng manh nên khó tách nó nguyên vẹn cùng với
phôi để đýa vào nuôi cấy. Không có dây treo phôi làm giảm đáng kể tỉ lệ hình thành cây
con từ nuôi cấy phôi non
III.2.2. Thành phần môi trýờng nuôi cấy
Sau khi tách từ hạt phôi đýợc nuôi cấy trong môi trýờng chứa:
 Muối khoáng
 Chất điều hoà sinh trýởng
 Nguồn carbon
 Aminoaxit và thành phần hữu cõ phức hợp
Muối khoáng
 Môi trýờng với hàm lýợng cao các ion K+, Ca2+ đảm bảo cho tỷ lệ sống cao của
phôi và khả năng thúc đẩy sinh trýởng tốt đối với phôi của một số loài thực vật.
Chất điều hoà sinh trýởng
 Auxin và cytokinin không đýợc sử dụng nhiều trong nuôi cấy phôi do chúng cảm
ứng tạo callus.
 Ở nông độ rất thấp (0.01 mg/ l) GA3 kích thích sự nảy mầm sớm của phôi.
Nguồn carbon
 Đýờng: là thành phần không thể thiếu trong mọi môi trýờng nuôi cấy, vì nó
là nguồn cung cấp Cacbon chủ yếu. Trong nhiều trýờng hợp đýờng sucrose cho kết
quả tốt hõn các đýờng khác. Nồng độ sucrose có thể dùng từ 0.5% đến 18%.
 Glucose và sucrose ngoài vai trò dinh dýỡng, còn có khả năng duy trì áp suất
thẩm thấu của môi trýờng. Phôi trýởng thành sinh trýởng khá tốt ở nồng độ thấp
nhýng phôi non đòi hỏi nồng độ sucarose cao hõn.
Aminoaxit và thành phần hữu cõ phức hợp
 Glutamin là a.a hiệu quả nhất đối với nuôi cấy phôi nhiều loài thực vật.
 Cazein thuỷ phân(CH) (Ziebur & Brink, 1951) là hỗn hợp các a.a đýợc sử dụng
rộng rãi trong nuôi cấy phôi. Làm tăng kích thýớc và tỷ lệ phân hoá phôi.
 Ngoài ra một số chất tự nhiên nhý nýớc dừa (Overbeek, 1942), nýớc chiết malt
(Blackeslee & Satina, 1944), là những chất mà khi đýợc bổ sung vào môi trýờng nuôi cấy
sẽ đem lại hiệu quả cao hõn… vì trong các chất này có chứa nhiều vitamin, DNA, RNA,
và một số chất điều tiết sinh trýởng khác
III.3. Các yếu tố ảnh hýởng
 pH môi trýờng
 Nhiệt độ
 Ánh sáng
III.3.1. pH môi trýờng
 Các phôi tách rời sinh trýởng tốt trên môi trýờng có pH 5.0-7.5
 Đây là phạm vi pH của dịch noãn (6.0)
III.3.2. Nhiệt độ
 25±2°C thích hợp cho sinh trýởng và nảy mầm của phôi.
 Nhiệt độ tối ýu cho nuôi cấy phôi có thể khác nhau giữa các genotype trong cùng
1 loài
 VD: Loài Zamia, Phaseolus, bông: 27-30°C
Loài lai Brassica, lúa, lúa mạch: 17-22°C
III.3.3. Ánh sáng
 Khi nuôi cấy phôi chýa trýởng thành của lúa mạch, lanh, các cá thể loài lai Allium
tiến hành trong tối trýớc khi chuyển sang điều kiện sáng để nảy mầm.
III.4. Ứng dụng của nuôi cấy phôi hữu tính
 Thu nhận thể đõn bội
 Kiểm tra nhanh sức nảy mầm của hạt
 Nhân giống các cây hiếm
 Thụ phấn trong ống nghiệm
III.4.1. Thu nhận thể đõn bội Nuôi cấy phôi hữu tính để thu nhận các thể
đõn bội thông qua quá trình loại bỏ trực tiếp NST sau khi lai xa. Tổ hợp giữa hai loài
càng khác xa nhau thì sự đào thải hoàn toàn NST đõn bội của một loài càng dễ xảy ra

III.4.2. Kiểm tra nhanh sức nảy mầm của hạt

Nuôi cấy phôi hữu tính đýợc dùng để kiểm tra nhanh khả năng nảy mầm
của hạt, đặc biệt là các hạt giống có sức sống kém và hạt sau thời gian bảo quản dài.
Phýõng pháp này cho độ chính xác cao
III.4.3. Nhân giống các cây hiếm
 Hạt của một số cây rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên, vì vậy
làm giảm khả năng sinh sản hữu tính của chúng. Bằng cách nuôi cấy phôi tách rời
đã thu đýợc rất nhiều cây con. Áp dụng với loài mà hạt có sức sống kém, hạt không
có nội nhũ hoặc ít nội nhũ.
VD: đối với các loài phong lan hạt của chúng rất nhỏ và không có nội
nhũ vì vậy khả năng này mần của hạt là rất thấp vì vậy bằng phýõng pháp nuôi cấy
phôi ta sẽ làm tăng tỉ lệ nảy mầm của phong lan.
III.4.4. Thụ phấn trong ống nghiệm
 Một số rào cản đối với quá trình thụ tinh:
 Hạt phấn không có khả năng nảy mầm trên núm nhụy loài khác
 Ống phấn không tiếp cận đýợc noãn vào thời điểm thích hợp
 Vỡ ống phấn trong vòi nhụy
 Những rào cản đó có thể đýợc výợt qua bằng kĩ thuật thụ phấn trong ống nghiệm
IV.1. Ví dụ về thụ phấn invitro và cứu phôi
Thụ phấn invitro cứu phôi trong lai tạo giống hoa Lily ở Việt Nam
 Hiện nay, ở Việt Nam lily đýợc xếp vào loại hoa cao cấp, tiềm năng thị trýờng rất
lớn.
 Tuy nhiên các giống hoa lily có mặt trên thị trýờng Việt Nam hiện nay chủ yếu là
nhập nội từ Trung Quốc, Nhật Bản và Hà Lan với giá thành cực cao, thêm vào đó một số
giống nhập nội từ Trung Quốc rất nhanh bị thoái hóa do chất lýợng giống kém…
 Vấn đề đặt ra là chúng ta phải nhanh chóng chủ động về giống đối với loại hoa
quý này.
IV.1.1. Thí nghiệm thụ phấn invitro
 Chọn nụ hoa trýớc khi nở 1-2 ngày, khử trùng: rửa sạch bụi đất bằng nýớc thýờng
trýớc khi đýa vào buồng cấy, khử trùng bằng cồn Ethanol trong 30giây, tráng lại = nýớc
cất vô trùng, tiếp tục khử= HgCl2. 0.1% trong 10 phút, lắc đều mẫu, tráng lại bằng nýớc
cất vô trùng 3 lần.
 Tách cánh hoa: -Hoa bố: tách lấy bao phấn giữ trong điều kiện vô trùng.

-Hoa mẹ: giữ toàn bộ cõ quan sinh sản cái: bầu nhụy, vòi nhụy và núm nhụy. Chúng đýợc
đạt đứng thẳng trong ống nghiệm hoặc bình, trên nền môi trýờng thụ phấn
 Thụ phấn invitro: có thể sử dụng
- Kỹ thuật thụ phấn cắt vòi nhụy: cắt hết vòi nhụy hạt phấn đýợc thụ ngay tại điểm cắt.
- Kỹ thuật ghép vòi nhụy: Hạt phấn bố đýợc thụ trên đầu núm nhụy của hoa bố, 1 ngày
sau vòi nhụy của bố đã thụ phấn đýợc cắt phía trên bầu 2mm và gắn vào bầu nhụy nhờ 1
miếng agar.
- Kỹ thuât thụ phấn giá noãn: Hạt phấn bố đýợc thu trực tiếp vào hàng giá noãn đýợc
tách từ bầu hoa mẹ.
IV.1.2. Thí nghiệm cứu phôi
 Sau khi thụ phấn invitro cho các tổ hợp, tiến hành cứu phôi vào các thời điểm
khác nhau bằng kỹ thuật nuôi cấy lát cắt bầu nhụy. Quả đýợc cắt thành những lát mỏng
thành 2-3mm và nuôi cấy trên môi trýờng trên môi trýờng lát cắt bầu nhụy: MS bổ sung
thêm 1mg/l α -NAA và 90g/l sucrose.
 H ạt đý ợc hình thành v ới t ỉ l ệ phôi trong h ạt cao. Sau đó phát tri ển thành cây
hoàn ch ỉnh.
IV.2. Thí nghiệm cứu phôi hữu tính khoai tây
1. Thu hái các quả khoai tây trýởng thành, khi quả còn màu xanh, khoảng 21 đến 28 ngày
sau khi thụ phấn
2. Khử trùng bề mặt quả bằng etanol 90% trong 30s
3. Ngâm quả trong hỗn hợp dung dịch hypoclorit canxi 5% và nýớc cất vô trùng trong 15
phút
4. Trong tủ cấy vô trùng, tiến hành tách hạt từ quả và chuyển sang đĩa petri
5. Bóc vỏ hạt và tách rời phôi
6. Cấy phôi vào đĩa petri đã chứa sẵn môi trýờng dinh dýỡng và nuôi ở nhiệt độ từ 18-
22ºC với ánh sáng yếu
7. Các phôi được tách tốt từ hạt sẽ phát triển dần thành cây khoai tây con sau đó có thể
chuyển ra trồng trong vườn ươm
Nhìn chung, nguồn gen khai thác từ các loài lily là vô cùng đa dạng, tạo điều kiện
thuận lợi cho quá trình chọn tạo giống. Việc phát triển các phýõng pháp thụ phấn và cứu
phôi thích hợp sẽ là công cụ hữu ích tạo ra nhiều giống mới với nhiều đặc tính quý.

“Biến dị dòng tế bào soma trong quá trình nuôi cấy invitro”
I. Một số khái niệm về biến dị dòng soma
 Biến dị
 Biến dị tế bào soma
 So sánh biến dị dòng soma với đột biến
II. Phân loại biến dị dòng soma
 Biến dị kiểu gen
 Biến dị kiểu hình

III. Nguyên nhân gây biến dị dòng soma

IV. Cơ chế tạo biến dị soma
V. Ưu điểm và nhược điểm của biến dị dòng soma trong quá trình nuôi cấy invitro
VI. Chọn lọc biến dị dòng soma
VII. Khả năng ứng dụng và triển vọng
VIII. PHÂN LẬP VÀ CHỌN LỌC ĐỘT BIẾN DÂU TẰM BẰNG KỸ THUẬT NUÔI
CẤY INVITRO.
1.1 Biến dị:
 Biến dị là những biến đổi mới mà cơ thể sinh vật thu được do tác động của các
yếu tố môi trường và do quá trình tái tổ hợp di truyền.
 Biến dị tạo nên sự đa dạng vô cùng lớn ở các cá thể sinh vật, là nguyên nhân cơ
bản của tiến hoá và là nguồn nguyên liệu cho chọn giống.
1.2 Biến dị dòng soma
 Biến dị dòng soma (somaclonal variation) là khái niệm dùng để chỉ tất cả các biến
dị thể hiện ở các tế bào, mô nuôi cấy và cây có nguồn gốc từ nuôi cấy mô (Larkin và
Scowcropt, 1981).
 Biến dị dòng soma còn được gọi là biến dị dòng vô tính.
 Biến dị này đã được quan sát ở nhiều loài cây trồng như thuốc lá, khoai tây, cà
chua, mía, họ cải… bao gồm đây đủ các tính trạng nông học như chiều cao cây, số nhánh,
thời gian sinh trưởng cũng như các tính trạng hóa sinh khác.
 Biến dị kiểu gen (genetic or heritable variation)
 Biến dị kiểu hình (epigenetic hay phenotypic variation)
 Là các biến dị có khả năng di truyền, xảy ra với tỷ lệ rất thấp và không có tích
thuận nghịch
 Bao gồm 3 loại: Đột biến hệ gen, đột biến NST và đột biến gen (Larkin et all,
1989)
 Là các biến đổi về số lýợng NST. Loại phổ biến là sự sai khác về số lýợng NST
nhý đa bội, dị bội, hay thể khảm. Các loài có độ bội thể cao và nhiều về số lýợng NST
cao dễ bị biến đổi hőn các loài có mức độ bội thể thấp và ít NST. (Creissen and Karp,
1985). Biến đổi này xảy ra thýờng xuyên trong nuôi cấy tế bào, đặc biệt trong nuôi cấy tế
bào trần.
 Những biến đổi này có thể xảy ra ngay từ giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy, do
sự phân tách NST không bình thýờng ở những chu kỳ tế bào đầu tiên.
 Hiêňn týőňng khuyêěch đaňi gen cuŢng laĚm thay đôŇi hêň gen. Viě duň nhý őŇ
coŇ linh lăng đaŢ thu đýőňc doĚng têě baĚo coě mýěc khaěng thuôěc thuốc trừ cỏ
photphinotrixin tăng 20 lần so với bình thýờng. Thuốc này có tác động ức chế enzyme
glutaminsythetase. Phân tích cho thấy, gen kiểm tra ezyme này đýợc khuếch đại 4 -11
bản, làm tăng hoạt tính phiên mã lên 8 lần
 Là các biến đổi về cấu trúc NST, các thay đổi này có thể bao gồm các hiện tượng
như: Mất đoạn, đảo đoạn, thêm đoạn hay nhân đoạn (Tạo ra các NST lớn hơn), chuyển
đoạn và các biến đổi trong quá trình giảm phân.
 Những biến đổi này có thể ảnh hưởng tới kiểu hình ở R0 và các thế hệ tiếp theo.
 Là các biến đổi ở mức độ phân tử: sự thay đổi của một cặp base, thay đổi về số
lýợng bản sao của một trình tự đặc thù, sự thay đổi trong thể hiện của các nhóm đa gen
hay sự thể hiện của các gen nhảy(Transposable elements).Sự xuất hiện các đột biến này
về cő bản mang tính ngẫu nhiên
 Những tính trạng đột biến gen thu đýợc ở những cây tái sinh R0 và cũng đýợc di
truyền cho các đời sau.
 Các biến dị kiểu hình thýờng liên quan đến sự thay đổi trong quá trình thể hiện
của một gen nhất định. Điển hình là các quá trình khuếch đại và methyl hóa gen. Các biến
dị kiểu hình thýờng xuyên xuất hiện ở các cây tái sinh sau nuôi cấy nhý là kết quả của các
phản hồi về mặt sinh lý.
 Các thay đổi về kiều hình có thể là tạm thời, không có tính di truyền và có thể
phục hồi trạng thái ban đầu. Tuy nhiên chúng có thể duy trì trong suốt chu kỳ sống của
các cây tái sinh
 Nguyên nhân: Có liên quan đến một vài thay đổi trong quá trình biểu hiện gen.
 Ví dụ, hiện týợng tăng mạnh mẽ khả năng sinh trýởng của các cây tái sinh khi
trồng trên đất. Biều hiện này có thể liên quan đến việc trở lại của trạng thái trẻ hoá hoặc
quá trình loại bỏ virus khỏi nguồn mẫu cấy ban đầu
 Các ví dụ khác nhý: hiện týợng ra hoa sớm, bạch tạng, các thay đổi về hình
dạng, mầu sắc cánh hoa, hình dạng lá và chiều cao cây...
 Bất kì một yếu tố có khả năng có thể dẫn đến các thay đổi di truyền đều đýợc
xem nhý là một nguyên nhân gây ra các biến dị này.
 Các yếu tố này chia làm ba nhóm: sinh lý, di truyền, hoá sinh.
 Hai nguyên nhân chính gây biến dị dòng soma là:
 Tính không đồng nhất di truyền của các tế bào soma của mẫu cấy ban đầu (sự đa
dạng di truyền tự nhiên của các tế bào nuôi cấy ).
 Tác động của các yếu tố bên ngoài trong quá trình nuôi cấy in vitro (sinh lý, hóa
sinh).
 Các mẫu cấy có nguồn gốc từ một dòng đőn tính, từ hạt hay cây con đýợc xem
nhý là đồng nhất về mặt di truyền và khi lấy mẫu có thể có kiểu hình giống nhau. Tuy
nhiên các mẫu cấy này thực tế lại bao gồm nhiều loại tế bào khác nhau nhý là phloem,
xylem, nhu mô… Những tế bào này có mức độ bội thể khác nhau. Nói cách khác, có sự
đa dạng tế bào giữa các loại tế bào trong cùng một mẫu cấy. Sự đa dạng này đýợc gọi là
đa bội vô tính (Polysomatic).
 Ngoài ra nhiều thực vật tồn tại ở dạng thể khảm. Chúng chứa những lớp tế bào
hoặc mô có cấu trúc di truyên khác nhau đýợc phát triển từ meristem có chứa lớp hay bộ
phận mô bị đột biến. Hiện týợng này đặc biệt phổ biến ở cây thân gỗ.
 Loại mẫu cấy.
Các loại mẫu cấy khác nhau thường thể hiện mức độ biến dị khác nhau.
Các mẫu cấy có nguồn gốc từ các thể tiền chồi như chồi nách, chồi đỉnh hoặc meristem
thường có mức độ biến dị thấp hơn khi sử dụng các mẫu cấy có nguồn gốc không phải
đỉnh sinh trưởng như lá, rễ hay protoplast. Khả năng xảy các biến dị soma còn phụ thuộc
vào kiểu gen cũng như tuổi cây mẹ. Các dòng già hơn thường ẩn các biến dị sẵn có ở
mức cao hơn các dòng trẻ hơn. Các loài có độ bội càng cao và số lượng NST càng nhiều
thì có tính biến dị càng cao
 Phýőng thức nhân giống in vitro:
Các phýőng thức nhân giống khác nhau sẽ cho tỷ lệ xuất hiện các biến dị
vô tính khác nhau. Nhìn chung nếu chồi bất định đýợc tái sinh từ một tế bào thì cő hội để
xuất hiện các biến dị soma thýờng là lớn hőn rất nhiều từ các chồi đýợc tái sinh từ nhiều
tế bào. Các quá trình nuôi cấy callus, huyền phù hoặc protoplast do đó thýờng có nhiều
biến dị soma
3.2. Tác động của các yếu tố bên ngoài trong quá trình nuôi cấy
 Loại và nồng độ chất điều tiết sinh trýởng sử dụng
2,4 D hoặc 2,4,5 T thýờng gây ra các sai khác trong cây tái sinh. Ví dụ nhý
các cây dầu dừa tái sinh từ callus Cho các mô nuôi cấy dài ngày trong môi trýờng chứa
các auxin mạnh nhý nuôi cấy dài ngày trên môi trýờng có chứa 2,4 D có tỷ lệ rất lớn các
biến dị khi trồng trên đồng ruộng
 Thời gian nuôi và số lần cấy chuyển
Việc nuôi cấy dài ngày trong điều kiện in vitro cũng nhý tăng số lần cấy
chuyển cũng sẽ làm tăng khả năng xuất hiện các biến dị soma
Nguyên nhân: do sự thay đổi của các kiểu methyl hóa bình thýờng của
DNA genome.
5.1.Nhýợc điểm:
 Một số biến dị dòng soma không ổn định (có thể chỉ là do mức độ biểu hiện của
một gen) và không đýợc di truyền cho đời sau
 Một số biến dị dòng soma lại kết hợp với một hay một số tính trạng không mong
muốn nhý lệch bội, bất dục.
 Là một nhân tố cản trở của quá trình nhân giống vô tính.
5.1. Nhýợc điểm:
 Việc tái tạo cây hoàn chỉnh chỉ xảy ra ở một số kiểu gen nhất định và các kiểu gen
này có thể có ít ý nghĩa hoặc không có ý nghĩa đối với nhà chọn giống.
 Nếu sử dụng dòng tế bào để nuôi cấy lặp lại nhiều lần thì tỉ lệ tái sinh thành cây
giảm
5.2. Ýu điểm
 Cùng lúc khảo sát đýợc một khối lýợng lớn hàng triệu tế bào trong một không
gian môi trýờng hẹp, đồng nhất và cùng chịu một áp lực chọn lọc chủ định thích hợp, dễ
dàng tiến hành theo qui trình công nghiệp.
 Tạo giống mới có các đặc tính mong muốn một cách nhanh chóng thông qua nuôi
cấy mô kết hợp với chọn lọc dòng tế bào.
 Giúp nhà khoa học có thể nghiên cứu một loài nhiệt đới ở vùng ôn đới hoặc
ngýợc lại vì điều kiện môi trýờng đặc thù có thể tạo ra rất dễ dàng trong phòng thí
nghiệm ở bất cứ đâu.
5.2. Ýu điểm
 Có tiềm năng nhất định trong công tác cải tiến giống cây trồng, đặc biệt là các cây
lâu năm vốn bị cản trở bởi nền di truyền hẹp và chu kỳ tái sinh dài.
 Các biến dị sinh ra trong nuôi cấy mô không gặp phải những cản trở về mặt xã
hội, đạo đức nhý các cây trồng chuyển gen.
 Phân lập các biến dị có ích ở kiểu hình lý tưởng song còn thiếu một số tính trạng
mong muốn.
 Phân lập các biến dị có ích để sản xuất các hợp chất sơ cấp và thứ cấp.
 Phân lập các biến dị có ích với khả năng kháng bệnh, chống chịu stress tốt hơn.
 Tạo các biến dị di truyền không qua lai hữu tính ở những dòng ưu tú
 Các biến dị soma sinh ra do cảm ứng là con đường tốt nhất để cải tạo các cây lâu
năm.
Qui trình chung:
 Nuôi cấy TB xôma 2n NST trên môi trường nhân tạo có định hướng .
 Các TB phân chia thành nhiều dòng biến dị có bộ NST thay đổi và biểu hiện cao
hơn mức bình thường (biến dị dòng xôma).
 Chọn lọc và phát triển các dòng TB có biến dị theo mong muốn thành cơ thể mới
7.1. Nguyên tắc chọn lọc tế bào:
7.1.1. Chọn trực tiếp:
Thông qua ưu thế về sinh trưởng hay sự khác biêt thấy được về màu sắc có
thể chọn được từ quần thể tế bào.
Hệ thống tế bào hay được sử dụng là các tế bào dịch huyền phù hoặc khối
callus.
Điều kiện chọn lọc là các độc tố với nồng độ khác nhau gây tác động trực
tiếp lên sinh trưởng của tế bào. Thông thương người ta trộn tế bào và môi trường thạch
chứa độc tố và chọn những tế bào sống sót phân chia thành khuẩn lạc mô sẹo hoặc cấy
trực tiếp lên môi trường chọn lọc chứa độc tố
Ở đây, đặc điểm của dòng đýợc chọn là kết quả biểu hiện khuyết tật của tế
bào. Thí dụ điển hình là chọn dòng thiếu Enzyme nitrate reductase (NR). Trên môi trýờng
chứa ClO3- những tế bào có NR sử dụng ClO3- nhý NO3- và khử thành ClO2-, ClO2- tác
dụng nhý một độc tố cho nên chỉ có những tế bào không có NR mới sống sót trên môi
trýờng chọn lọc
7.1.3. Chọn tổng thể
Các tế bào dị dýỡng thực vật thýờng đýợc chọn bằng phýőng thức xử lý
đột biến và nuôi trên môi trýờng có chứa yếu tố dinh dýỡng cần thiết, các yếu tố này có
khi lại chính là yếu tố gây đột biến. VD: đột biến lặn chịu đýợc S-2-aminoethyi cysteine
xuất hiện sau khi xử lý phôi nuôi cấy.
7.2.1. Chọn lọc trong điều kiện không có tác nhân chọn lọc
Các tế bào và callus không xử lý sinh trýởng trong nuôi cấy in vitro ở các
thời kỳ khác nhau trên môi trýờng không chứa tác nhân chọn lọc (độc tố hoặc các chất ức
chế),đýợc cảm ứng để phân hóa các cây hoàn chỉnh. Các cây tái sinh sẽ đýợc trồng trên
đồng ruộng để chọn lọc các biến dị. Bằng phýőng thức này ngýời ta đã thu đýợc các biến
dị dòng soma của các cây trồng khác nhau.

Ví dụ:
1. Với Cây mía đýờng (Saccharum officinarum) ngýời ta đã chọn đýợc các
cây kháng bệnh mốc sýőng (downey mildew), bệnh Fiji (do virus apid – transmitted) trên
giống mía Pindar, hoặc cải thiện một số giá trị nông học của giống mía Q10 kháng bệnh
dốm mắt. (Do Helminthosporium sacchari).
2. Với cây khoai tây.
Shepard và cộng sự (1980) đã tái sinh một số lớn cây từ protoplast tế bào
thịt lá của giống “Russet burbank” và thông báo các biến dị thu được trong quần thể
protoclones. Một trong số chúng kháng được bệnh thối sớm (early bright do Alternaria
solani) hoặc thối muộn (late bright do phytophthora infestans)
3. Với cây cà chua
Evan và cs đã phân lập các dòng soma của cà chua bằng các biến dị hình
thái là các đột biến lặn của tính bất dục kháng nấm Fusarium oxysporium ở mắt cuống lá,
khả năng lục hóa của lá, màu sặc của quả và hoa.

Theo phýőng pháp này các dòng tế bào biến dị đýợc sàng lọc từ nuôi cấy nhờ vào
khả năng sống sót của chúng khi có mặt các độc tố/chất ức chế trong môi trýờng dinh
dýỡng, hoặc dýới các điều kiện stress của môi trýờng. Các biến dị có thể thu đýợc bằng
cách chọn lọc trực tiếp, gián tiếp. Sự phân lập đýợc tiến hành trong nuôi cấy dịch huyền
phù hoặc bằng cách dàn trải tế bào đőn/protoplast.
Các hýớng chọn lọc bao gồm:
7.2.2.1. Chọn lọc dòng kháng bệnh
 Sử dụng các yếu tố chọn lọc nhý phytotoxin để chọn lọc khả năng kháng với nấm,
vi khuẩn hoặc virus.
 Tuy nhiên, lại kéo theo những đặc tính không mong muốn khác. Ví dụ chọn lọc
liên tiếp với một phytotoxin làm cho khoai tây kháng bệnh nhýng củ khoai nhỏ đi và chất
lýợng dinh dýỡng của củ khoai kem hőn
 Thông thýờng ngýời ta sử dụng trực tiếp nấm, vi khuẩn làm yếu tố chọn lọc để
phát hiện dòng tế bào soma kháng bệnh, từ các dòng này tạo ra các cây kháng bệnh týőng
ứng.
7.2.2.2. Chọn dòng kháng thuốc diệt cỏ

 Nuôi cấy Protoplast trên môi trýờng có các chất diệt cỏ khác nhau đã cảm ứng đột
biến tạo ra các dòng tế bào chống chịu sau đó đã tái sinh thành cây
7.2.2.3. Chọn dòng chống chịu với các stress của môi trường
 Nhiều vùng có độ mặn, phèn, kim loại nặng khá cao  kìm hãm sự phát triển của
cây trồng  Cần tạo các dòng chống chịu.Đã tái sinh thành công cây thuốc lá kháng
NaCl và nhiều dòng tế bào của nhiều giống cây trồng khác nhau có thể chống chịu nồng
độ muối cao.
 Đã tạo các dòng chịu lạnh bằng cách nuôi cấy tế bào của cây Nicotiana sylvestris
trong điều kiện nhiệt dộ thấp.
Một số hướng chọn lọc quan trọng khác
 Chọn dòng kháng kháng sinh
 Chọn dòng kháng các đồng đẳng base của DNA
 Chọn dòng kháng các acid amin đặc hiệu
 Chọn dòng sản sinh các sản phẩm thứ cấp
Một số thành tựu
Giống lúa CR203 có nhiều gen quý như tính chống chịu rầy nâu Biotip 1
và 2, tính thích ứng rộng, năng suất ổn định và phẩm chất gạo khá..
Một số thành tựu
 Giống lúa DR2 ( năm 2000 ) được tạo ra từ dòng tế bào
 biến bị xôma của giống lúa CR203, dòng này được tách
 và tái sinh thành cây. Giống lúa DR2 có độ đồng đều rất
 cao, chịu khô hạn tốt, năng suất trung bình đạt 45-50 tạ/ha
Một số thành tựu
Giống lúa CM64 có nguồn gốc từ IR64, do Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu
Long cải tiến thông qua công nghệ sinh học nuôi cấy mô, tạo biến dị tế bào soma. Tên
gốc của nó là OM3005-6

Tạo giống lúa chịu hạn có năng suất cao của

Trường ĐH KH Huế
PHÂN LẬP VÀ CHỌN LỌC ĐỘT BIẾN DÂU TẰM BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY
INVITRO
(Nguyễn Văn Vinh)
I. Đặt vấn đề
 Phân lập và chọn lọc đột biến là một trong những công đoạn đòi hỏi mất nhiều
công sức, thời gian và tiền của
 Đối với các cây cho quả, hạt thông qua con đường gây đột biến thực nghiệm ,
chunhgs sẽ phân ly theo định luật di truyền Menden, vì thế phải qua nhiều thế hệ với
nhiều công đoạn như giao riêng rẽ từng dòng, trồng cấy biệt lập… mới hy vọng thu được
đột biến
I. Đặt vấn đề
 Bằng con đýờng phân lập và chọn lọc thông qua kỹ thuật nuôi cấy invitro, không
những thu hẹp đýợc không gian nghiên cứu mà thời gian thu nhận đột biến cũng ngắn
hőn nhiều so với con đýờng in vivo.
 Trong nghiên cứu gây tạo đột biến dâu tằm, ngoài xử lý cây invitro chúng tôi còn
xử lý cả hom và thông qua kỹ thuật phân lập và chọn lọc chúng tôi đã thu đýợc các đột
biến có giá trị.
II. ĐỐI TÝỢNG VÀ PHÝŐNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Đối týợng và vật liệu nghiên cứu
 Hom dâu hai giống Bầu đen và VA186 được xử lý 5 Krad dựa vào kết quả
xác định độ nhạy cảm bức xạ gama của cây dâu tằm, sau đó được trồng ngoài vườn thí
nghiệm. Khi hom mọc chồi, chúng tôi cắt và chuyển sang nuôi cấy invitro thông qua kết
quả nhân giống vô tính dâu tằm bằng phương pháp nuôi cấy invitro với môi trường tạo
cụm chồi có thành phần MS, NAA 0,5 – 1,5 mg/l và BAP 1,5 – 5 mg/l. Thành phần môi
trường tạo rễ gồm MS, IBA 1 - 3 mg/l và NAA 1 mg/l để phân lập và chọn lọc đột biến
2. Phýőng pháp nghiên cứu
 Nuôi cấy toàn bộ chồi hom từ hom dâu chiếu xạ từ M1V1 đến M1V4, theo dõi khả
năng sinh trưởng, tốc độ ra lá, hình dạng lá và các đặc điểm sinh học khác, so sánh và đối
chứng để tìm kiếm đột biến.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Sau khi chiếu xạ 500 hom dâu của mỗi giống bầu đen và VA186, nuôi cấy invitro
từ M1V1 đến M1V4, kết quả được trình bày ở các bảng sau:

Trong tổng số 12654 cây bầu đen liều 5 Krad, thế hệ M1V4 có 1654 cây đột biến , tần số
đột biến là 0,13. Ở đây ta thấy đột biến lá bạch tạng thấp nhất, có 112 cây, đạt tần số
0,009; đột biến lá xẻ thùy cao nhất, có 204 cây, đạt tần số 0,016. qua theo dõi quần thể
đột biến của giống bầu đen chiếu xạ liều 5 Krad, chúng tôi nhận thấy 3 dòng thấp cây:
B16, B17 và B18 có tiềm năng năng suất rất tốt

Qua bảng 2 cho thấy:

 Trong tổng số 11558 cây dâu giống VA186, liều 5 Krad có 1452 cây đột biến,
tổng tần số đột biến là 0,125. Trong số cây đột biến, dạng đột biến lá bạch tạng thấp nhất,
có 98 cây; dạng đột biến thấp cây cao nhất, có 231 cây.
 Trong số những cây đột biến thu được chúng tôi nhận thấy có 3 cây đột biến lá to
là VA12, VA15 và VA18 từ giống VA186 rất có triển vọng về tiềm năng năng suất cao
hơn giống đố chứng.
KẾT LUẬN
Với kết quả nghiên cứu đạt được, chúng tôi rút ra những kết luận sau:
 Bằng con dường phân lập và chọn lọc đột biến invitro trong phòng thí nghiệm và
vườn ươm đã rút ngắn thời gian nghiên cứu từ 6 năm xuống còn 2 năm.
 Đã chọn lọc được 3 dòng đột biến thấp cây là B16, B17 và B18 từ giống bầu đen
có tiềm năng kinh tế hơn so với đối chứng. Tương tự cũng thu được 3 dòng đột biến lá to
VA12, VA15 và VA18 từ giống VA186 rất có triển vọng về năng suất.
Thanks so much for listening!
Tiểu luận: Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
Đề tài:
Nuôi cấy huyền phù tế bào
ĐẶT VẤN ĐỀ
• Bản thân mỗi tế bào thực vật là một ðõn vị ðộc lập, nó chứa ðựng tất cả những
thông tin di truyền ðặc trýng của cõ thể từ ðó nó sinh ra. Cho nên mỗi tế bào có thể xây
dựng lại toàn bộ cõ thể mới nhờ tính toàn năng. Thýòc vâòt bâòc cao laÌ môòt nguôÌn
cung câìp caìc hõòp châìt hoìa hoòc vaÌ dýõòc liêòu râìt quan troòng. Tuy nhiên trong
nhýÞng nãm gâÌn ðây saÒn lýõòng caìc thýòc vâòt ðoì râìt khoì ðaÒm baÒo õÒ mýìc
ôÒn ðịnh do hâòu quaÒ cuÒa môòt sôì yêìu tôì nhý:
• - ÐiêÌu kiêòn týò nhiên không thuâòn lõòi.
• - Chi phiì lao ðôòng ngaÌy caÌng tãng.
• - Khoì khãn kyÞ thuâòt vaÌ kinh têì trong trôÌng troòt.
• Phýõng phaìp nuôi câìy huyền phù têì baÌo (dịch lỏng) của thýòc vâòt coì khaÒ
nãng goìp phâÌn giaÒi quyêìt nhýÞng khoì khãn trên.
NỘI DUNG
• Khái niệm nuôi cấy huyền phù tế bào
• Lịch sử nghiên cứu
• Các phýõng pháp nuôi cấy
• Đặc trýng của tế bào nuôi cấy huyền phù
• Các chỉ tiêu xác định tốc độ sinh trýởng
• Ứng dụng của nuôi cấy huyền phù tế bào
• Công trình nghiên cứu cụ thể
• Kết luận
I. KHÁI NIỆM
♣ Nuôi câìy huyêÌn phuÌ tế bào (cell suspension cultures): Phýõng thýìc nuôi têì
baÌo ðõn (single cell) hay cuòm nhiêÌu têì baÌo (cell aggregate) õÒ traòng thaìi lõ lýÒng
trong môi trýõÌng loÒng.
♣ Dịch huyền phù đýợc tạo ra do sự nuôi cấy một mảnh mô sẹo không có khả năng
biệt hóa, trong môi trýờng lỏng và đýợc chuyển động trong suốt thời gian nuôi cấy.
I. KHÁI NIỆM
♣ Các tế bào tách ra khỏi mô sẹo và phân tán trong môi trýờng lỏng.
♣ Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp các tế bào đõn, các cụm tế bào,
các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết.

II. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU

♣ 1949: Caplin và Steward đã nuôi cấy tế bào thực vật trên môi trýờng lỏng có
khuấy.
♣ Muis (1954) và Nickell (1956) cho thấy rằng các tế bào thực vật có thể sinh
trýởng đýợc nhý các cõ thể vi sinh vật.
♣ 1959, Melches và Beckman đã tách và nuôi cấy thành công tế bào đõn và huyền
phù tế bào.
III. CÁC PHÝÕNG PHÁP NUÔI CẤY
♣ Tùy điều kiện và mục đích mà có các phýõng pháp nuôi cấy tế bào huyền phù
khác nhau. Chủ yếu là phýõng pháp: Nuôi cấy dịch thể động.
Trong nuôi cấy dịch thể động có hệ thống cung cấp khí (thổi khí), các khí đều
đýợc “vô trùng”.
III. CÁC PHÝÕNG PHÁP NUÔI CẤY
3.1. Nuôi cấy dịch thể động
3.1.1. Nuôi cấy chìm liên tục
♣ Các tế bào đýợc tiếp xúc với môi trýờng dinh dýỡng do chúng đýợc ngâm hẳn vào
dung dịch môi trýờng.
♣ Sự thông khí đýợc thực hiện nhờ máy lắc chạy ở tốc độ 100 - 150 vòng/phút. Khí
đýa vào phải đảm bảo vô trùng. Quá trình thông khí còn ngăn chặn và làm giảm sự kết
dính của các tế bào với nhau.
III. CÁC PHÝÕNG PHÁP NUÔI CẤY
♣ Theo Thomas và Davey (1975), nuôi cấy huyền phù tế bào có dung tích 25 ml, tốc
độ phù hợp nhất của máy lắc là 100 – 120 vòng/phút.
♣ Thể tích của môi trýờng lỏng cũng phải phù hợp với kích thýớc bình nuôi cấy,
thýờng chiếm 20% thể tích bình.
III. CÁC PHÝÕNG PHÁP NUÔI CẤY
♣ Các nuôi cấy quy mô nhỏ và trong những thời gian ngắn, có thể sử dụng máy
khuấy từ ở tốc độ 250 vòng/phút và thời gian cho quá trình nuôi cấy thýờng từ 10 – 15
ngày.
♣ Sau đó, các mẫu nuôi cấy phải đýợc cấy chuyển sang môi trýờng mới để đảm bảo
sự sinh trýởng và phát triển của các tế bào.
III. CÁC PHÝÕNG PHÁP NUÔI CẤY
3.1.2. Nuôi cấy chìm tuần hoàn
♣ Các tế bào đýợc nhúng chìm vào môi trýờng dịch thể, xen kẽ với những khoảng
thời gian đýợc đýa ra ngoài môi trýờng.
♣ Quá trình đýợc thực hiện nhờ sự chuyển động “bập bênh” của các bình nuôi cấy.
III. CÁC PHÝÕNG PHÁP NUÔI CẤY
♣ Khi chuyển động:
 Khối tế bào ở đầu này đýợc đýa vào môi trýờng.
 Khối tế bào ở đầu kia tiếp xúc với không khí.
♣ Steward và cộng sự (1952) cũng đã thiết kế những bình nuôi cấy đặc biệt theo phýõng
pháp nuôi cấy chìm tuần hoàn.
III. CÁC PHÝÕNG PHÁP NUÔI CẤY
3.2. Nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào bằng Bioreactor:
♣ Hệ thống nuôi cấy đýợc thông khí hoặc đýợc trao đổi khí.
♣ Môi trýờng nuôi cấy có thể dễ dàng thay mới theo từng thời kỳ.
♣ Tế bào thực vật nhạy cảm với stress hõn vi khuẩn nên hệ thống bioreactor cho
nuôi cấy tế bào thực vật yêu cầu thýờng xuyên cải thiện hệ thống thông khí và hệ thống
trộn môi trýờng.
♣ Tế bào thực vật cần ánh sáng cho quang hợp nên cần có sự liên kết giữa bioreator
với hệ thống chiếu sáng.
Tổng hợp lýợng lớn sinh khối tảo
III. CÁC PHÝÕNG PHÁP NUÔI CẤY
♣ Takayama và Miasawa là những ngýời đầu tiên sử dụng bioreactor vào nhân
giống cây trồng: nhân củ siêu nhỏ khoai tây, củ giống hoa ly, hoa lan hồ điệp.
♣ Công nghệ này cho phép nhân nhanh vô hạn các giống cây trồng nhờ thiết bị
bioreactor hoàn toàn tự động hóa.
VD: 1 bioreactor vibro-mixer trang bị với các ống silicone có khả năng sản xuất
100.000 phôi vô tính của cây trạng nguyên trong 1lit dịch huyền phù nếu nhý dung dịch
đó đýợc đặt trên 1tấm giấy lọc và phát triển trong 4 tuần
III. CÁC PHÝÕNG PHÁP NUÔI CẤY
♣ Bioreactor sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật đýợc cải tiến từ các loại
bioreactor trong nuôi cấy tế bào vi sinh.
III. CÁC PHÝÕNG PHÁP NUÔI CẤY
♣ Thuận lợi:
 Thể tích nuôi cấy tăng giúp sản xuất nhiều hõn mà không cần những kĩ thuật cao
cấp.
 Hầu hết các bình bioreactor đýợc thiết kế với cõ chế khuấy bằng cõ học hay thổi
khí để duy trì nuôi cấy gần nhý đồng dạng.
III. CÁC PHÝÕNG PHÁP NUÔI CẤY
 Khi thao tác nuôi cấy liên tục, môi trýờng nuôi cấy và môi trýờng vật lí có thể
đýợc kiểm soát thích hợp cho sinh trýởng. Điều này không thể thực hiện với hệ thống
nuôi cấy bình tam giác.
♣ Nhýợc điểm: đòi hỏi thiết bị hiện đại và đắt tiền, vận hành phức tạp đặc biệt là khâu
chống nhiễm cho huyền phù nuôi cấy.
IV. ĐẶC TRÝNG CỦA TẾ BÀO TRONG
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ
♣ Nuôi cấy huyền phù tế bào cần một lýợng mô sẹo khá lớn, xấp xỉ 2 – 3 g/100ml
dung dịch môi trýờng (Helgeson, 1979).

♣ Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp các tế bào đõn, các cụm tế bào,
các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết.
IV. ĐẶC TRÝNG CỦA TẾ BÀO TRONG
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ
♣ Mức độ tách rời của các tế bào phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và
có thể đýợc điều chỉnh bởi thành phần môi trýờng.
VD: trong nhiều trýờng hợp, tăng tỷ lệ Auxin/Cytokinin sẽ sản sinh nhiều khối tế
bào xốp.
♣ Theo King và Street (1977), không có một quy trình chuẩn nào cho nuôi cấy huyền
phù tế bào.
IV. ĐẶC TRÝNG CỦA TẾ BÀO TRONG
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ
♣ Sinh trýởng và phát triển của tế bào nuôi cấy:
 Pha lag: bắt đầu khi đýa mô sẹo vào môi trýờng, kéo dài cho tới lần phân bào đầu
tiên.
 Pha tăng tốc: các tế bào bắt đầu phân chia và số lýợng tế bào tăng dần.
 Pha hàm số mũ: số lýợng tế bào tăng theo hàm số mũ.
 Pha ổn định: số lýợng tế bào đạt cực đại và không đổi theo thời gian, số tế bào
sinh ra (do phân bào) xấp xỉ số tế bào chết đi.
IV. ĐẶC TRÝNG CỦA TẾ BÀO TRONG
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ
IV. ĐẶC TRÝNG CỦA TẾ BÀO TRONG
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ
♣ Để duy trì quá trình nuôi cấy, các tế bào cần đýợc cấy truyền vào giai đoạn sớm
của pha ổn định.
 Thời điểm cấy truyền cụ thể dựa vào kinh nghiệm, nói chung là nên bắt đầu khi
mật độ tế bào cực đại.
 Mật độ tế bào cực đại trong khoảng 18 – 25 ngày, với huyền phù sinh trýởng
mạnh có thể ngắn hõn, từ 6 – 9 ngày.
IV. ĐẶC TRÝNG CỦA TẾ BÀO TRONG
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ
♣ Ở lần cấy truyền đầu tiên, dịch nuôi cần đýợc lọc nhằm loại bỏ cụm tế bào lớn,
các mảnh từ mẫu cấy ban đầu, sau đó dùng pipet để lấy dịch cấy truyền.
♣ Lýợng tế bào đem cấy truyền phải đủ lớn để đảm bảo mật độ tế bào, vì khi thấp
quá các tế bào sẽ không sinh trýởng đýợc.
VD: đối với tế bào cây sung dâu (Acer pseudoplatanus) mật độ thích hợp 9 –
3
15.10 tb/ml.
IV. ĐẶC TRÝNG CỦA TẾ BÀO TRONG
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ
♠ Theo King (1980), những tế bào trải qua quá trình nuôi cấy, sinh trýởng và trao
đổi chất trong dịch huyền phù gọi là dòng tế bào. Đặc điểm của dòng tế bào:
 Khả năng tách tế bào cao.
 Hình thái tế bào đồng nhất.
 Nhân rõ ràng và tế bào chất đậm đặc.
 Nhiều hạt tinh bột.
IV. ĐẶC TRÝNG CỦA TẾ BÀO TRONG
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ
 Týõng đối ít các yếu tố mạch.
 Có khả năng nhân đôi trong 24 – 72h.
 Mất tính toàn năng.
 Quen với chất sinh trýởng.
 Tăng mức đa bội thể.
V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ
SINH TRÝỞNG
5.1. Số lýợng tế bào
♣ Trýớc khi đếm, xử lý những cụm tế bào qua acid chromic, đun nóng 700C trong 5
– 10 phút, sau đó làm nguội và lắc mạnh trong vài phút.
♣ Pha loãng dịch, nhuộm và đếm trên buồng đếm hồng cầu.
♣ Kết quả: số lýợng tế bào/ml dung dịch nuôi cấy.
V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ
SINH TRÝỞNG
5.2. Thể tích tế bào
♣ Lấy ngẫu nhiên một thể tích dịch nuôi cấy, đem ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút
trong thời gian 5 phút.
♣ Thu tế bào và đem xác định thể tích.
♣ Kết quả:
 Số ml tế bào/thể tích môi trýờng nuôi cấy.
 Tỷ lệ %.
V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ
SINH TRÝỞNG
5.3. Khối lýợng týõi và khối lýợng khô tế bào
♣ Khối lýợng týõi:
 Thu thập tế bào trong một thể tích dịch xác định.
 Rửa bằng nýớc cất vô trùng
 Làm khô trong chân không.
 Cân để xác định khối lýợng.
♣ Khối lýợng khô:
 Lấy một thể tích mẫu xác định.
 Loại bỏ phần nổi, rửa phần tế bào trên giấy lọc Whatman.
 Sấy khô trong 12h ở 800C đến khối lýợng không đổi.
V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ
SINH TRÝỞNG
5.4. Xác định thành phần Protein
♣ Thu thập tế bào, chuyển lên lọc qua giấy Whatman.
♣ Rửa tế bào trong ethanol 70% đang sôi.
♣ Làm khô với Aceton rồi chuyển vào dung dịch NaOH 1M.
♣ Đun nóng đến 850C trong 1.5h.
♣ Lọc và xác định Protein thủy phân trong dịch theo phýõng pháp Lowry và cs
(1951).
V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ
SINH TRÝỞNG
5.5. Xác định chỉ số nguyên phân
♣ Huyền phù tế bào đýợc cố định trong hỗn hợp Aceto-orcein : Acid Acetic (3:1)
sau đó chuyển sang lam kính.
♣ Nhỏ 1 giọt Aceto-orcein lên mẫu, hõ trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội trong 5
phút.
♣ Đậy mẫu bằng Lamel, làm khô mẫu, quan sát dýới kính hiển vi quang học ở vật
kính 100.
♣ Xác định các kỳ trong khoảng 1000 tế bào.
♣ Tỷ lệ % các tế bào đang phân bào gọi là chỉ số nguyên phân.
VI. ỨNG DỤNG
6.1. Sản xuất sinh khối tế bào và
các hợp chất thứ cấp
♣ Sản phẩm của nuôi cấy huyền phù tế bào thýờng đặc trýng là những chất có giá trị
cao và cần ở lýợng nhỏ.
♣ Có thể chia thành các nhóm dựa theo công dụng:
 Hợp chất thứ cấp trong y học.
 Hợp chất thứ cấp trong hóa mỹ phẩm.
 Hợp chất thứ cấp trong công nghiệp.
VI. ỨNG DỤNG
♣ Tại sao phải nuôi cấy huyền phù tế bào thu sinh khối?
 Tàn phá môi trýờng và sự xói mòn di truyền.
 Sự cung cấp nguồn nguyên liệu không đều đặn, không vững chắc, chất lýợng
không ổn định.
 Nhiễm bẩn do thuốc trừ sâu, bệnh hại, chất phóng xạ hay kim loại nặng …
♣ Nuôi cấy huyền phù tế bào khắc phục đýợc các nhýợc điểm trên.
VI. ỨNG DỤNG
Ngoài ra, nuôi cấy huyền phù tế bào còn có một số ýu điểm sau:
 Sản xuất một cách có định hýớng, theo quy mô công nghiệp, khối lýợng sản phẩm
lớn, không phụ thuộc vào mùa vụ.
 Tỷ lệ % khối lýợng khô các hợp chất thứ cấp cao hõn so với nguyên liệu thực vật
thu hái trong tự nhiên.
 Không tốn nhiều diện tích gieo trồng.
 Thu sinh khối tế bào lớn trong thời gian ngắn.

VI. ỨNG DỤNG

♣ Một số hợp chất thứ cấp đã đýợc sản xuất từ nuôi cấy huyền phù tế bào thực
vật:
 Diosgenin: Tác dụng chống viêm; chữa sốt, đái buốt, đái vàng, thấp khớp, đau
lýng, đau dây thần kinh.
- Việc nuôi cấy Dioscorea deltoidea Wall ex Griseb (cây Củ nâu) trong bioreactor
đã thu đýợc năng suất diosgenin cao hõn so với hiệu suất có đýợc từ nguyên liệu tự
nhiên.
- Trong nuôi cấy tế bào, diosgenin chiếm 7.8 % khối lýợng khô, trong khi chỉ
chiếm 2 % với nguyên liệu thực vật thu hái trong tự nhiên.
VI. ỨNG DỤNG
 Codein: Giảm đau và giảm ho.
- Papaver somniferum là nguồn của 2 hợp chất rất quan trọng trong y học là
morphine và codein.
- Sản xuất morphin đã đýợc thực hiện bằng việc nuôi cấy huyền phù tế bào tế bào
Papaver somniferum.
VI. ỨNG DỤNG
 Steviol:
- Chất tạo vị ngọt đýợc biết đến rộng rãi, thu nhận từ cây Stevia rebaudiana.
- Nuôi cấy callus là giai đoạn tiền đề để nuôi cấy huyền phù tế bào trong tích lũy
steviol.
- Trong nuôi cấy callus, hiệu suất đạt tới 36.4 %.
VI. ỨNG DỤNG
 Taxol:
- Là một nhóm chất trong hóa trị liệu ung thý, điều trị ung thý buồng trứng, ung thý vú,
ung thý phổi, khối u ác tính, và các dạng u býớu khác.
- Nuôi cấy tế bào các loài Taxus đýợc xem nhý là một phýõng pháp ýu thế để cung cấp
ổn định nguồn taxol và dẫn xuất taxane của nó (T. cuspidata, T. baccata, T. mairei).
VI. ỨNG DỤNG
 Scopolamine và hyoscyamine:
- Là 2 loại tropane alkaloid đýợc sử dụng để trị co thắt và gây mê.
- Có nhiều trong các cây thuộc họ Solanaceae.
- Nuôi cấy huyền phù tế bào Scopolia japonica có bổ sung tropic acid (nhý 1 tiền
chất) thì có thể tăng hàm lýợng alkaloid lên 15 lần.
VI. ỨNG DỤNG
 Saponin và sapogenin:
- Là một dýợc phẩm quý giá, có nhiều trong rễ cây nhân sâm (Panax ginseng), có
tác dụng chữa bệnh rối loạn tiêu hóa, chống suy nhýợc cõ thể, tăng cýờng sinh lực.
- Nuôi cấy huyền phù tế bào cây P. ginseng đang tiến hanh trên quy mô công
nghiệp.
- Đây là một trong các đối týợng đýợc các nhà khoa học trên thế giới tập trung
nghiên cứu nhiều nhất.

VI. ỨNG DỤNG

 Betalaine:
- Là một nhóm các chất nhuộm màu thực phẩm.
- Bao gồm betaxanthine (màu vàng) và betacyane (màu đỏ).
- Thành tựu nuôi cấy cõ quan cây Beta vulgaris, nuôi cấy callus và huyền phù của
Portulaca americana.
VI. ỨNG DỤNG
6.2. Trong công tác chọn giống cây trồng:
♣ Sử dụng để chọn lọc các dòng tế bào mong muốn qua các test thanh lọc.
♣ Sau đó tái sinh các tế bào đã chọn lọc thành cây hoàn chỉnh.
♣ Cây hoàn chỉnh sẽ trở thành vật liệu khởi đầu quan trọng trong công tác giống.
♣ Ngoài ra, tách protoplast hoặc là nguồn để sản xuất các phôi vô tính.
VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
♣ Nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù cây Bắt ruồi Drosera indica L.
cho mục tiêu thu nhận Plumbagin. (Quách Diễm Phýõng).
♣ Nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù cây Bèo đất Drosera burmalni
Vahl cho mục tiêu thu nhận 1 hợp chất Anthraquinone. Quách Diễm Phýõng (đề tài
NCCB của ĐH Quốc gia TP HCM)
VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
♣ Nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù cây Mãn Đình Hồng Althaea
rosea L. nhằm thu nhận Rutin trong điều trị tim mạch. (Quách Diễm Phýõng).
♣ Nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào họ cây Drosera.sp để thu nhận
các hợp chất Quinone có hoạt tính sinh học. (Quách Ngô Diễm Phýõng).
VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
♣ Thành công trong quy trình tạo sinh khối tế bào rễ sâm Ngọc Linh bằng ứng dụng
công nghệ Biomass – Học viện Quân Y.
♣ Các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học (Viện khoa học và Công nghệ Việt
nam) đã hoàn chỉnh quy trình nhân nhanh sinh khối mô của cây Hoàng Liên gai
(Berberis Wallichiarna DC) bằng công nghệ tế bào thực vật để làm nguồn dýợc liệu sản
xuất thuốc becberin.

Tuy nhiên, do những khó khăn trong việc tìm kiếm tài liệu nên nhóm chúng em không
đýa ra đýợc một quy trình sản xuất dựa trên nuôi cấy huyền phù tế bào, mà chỉ đýa ra
đýợc một công trình nghiên cứu ở giai đoạn đầu:
VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
ẢNH HÝỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRÝỞNG THỰC VẬT VÀ
ĐÝỜNG SACCHAROSE LÊN DỊCH
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO
DỪA CẠN CATHARANTHUS ROSEUS
Tác giả:
Bùi Văn Lệ, Trýờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
Nguyễn Ngọc Hồng, Trýờng Đại học Bán công Tôn Đức Thắng

VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU

1. ĐẶT VẤN ĐỀ
♣ Dừa cạn Catharanthus roseus.G.Don thuộc họ Trúc đào Apocynaceae là một
trong những dýợc liệu chứa nhiều alkaloid.
♣ Từ dừa cạn ngýời ta chiết đýợc chất chữa ung thý nhý vinblastin và chữa cao
huyết áp nhý ajmalicin, serpentin.
♣ Tuy nhiên hàm lýợng của những chất này có trong cây là rất thấp. Việc nuôi cấy
tế bào cây dừa cạn để nâng cao hàm lýợng alkaloid mong muốn đã đýợc nhiều nýớc trên
thế giới nghiên cứu và ứng dụng vào sản xuất.
VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
2. VẬT LIỆU VÀ PHÝÕNG PHÁP
♣ Mô sẹo màu xanh đýợc nuôi trong điều kiện chiếu sáng từ lá dừa cạn in vitro 4
tháng tuổi đýợc chuyển vào 100 ml môi trýờng cảm ứng trong erlen 250 ml.
♣ Môi trýờng cảm ứng gồm môi trýờng MS + Vitamin Morel + Hormon tăng trýởng
thực vật (NAA hoặc 2,4-D và Kin hoặc BAP) + 30g/l đýờng sucrose.
♣ Sau đó đặt vào máy lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ 25± 2oC trong điều kiện chiếu
sáng liên tục 16 giờ/ngày.
VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
♣ Xác định sinh khối bằng phýõng pháp cân.
♣ Chiết tách alkaloid toàn phần từ sinh khối tế bào Dừa cạn theo phýõng pháp của
Kutney và cộng sự (1983).
♣ Xác định alkaloid toàn phần bằng phýõng pháp acid-baz - khan theo dýợc điển
Việt Nam và dýợc điển Anh.
VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát ảnh hýởng của sự thay đổi nồng độ cytokinin đến sự tạo sinh khối
Kết luận:
 Ở bảng trên cho thấy môi trýờng chỉ bổ sung NAA có sự tạo sinh khối thấp hõn
so với môi trýờng bổ sung NAA kết hợp với Kin.
 Môi trýờng K4 (MS + NAA (1mg/l) + Kin (0.5 mg/l) và K8 (MS + NAA (1mg/l)
+ BAP (0.5 mg/l) cho sinh khối týõi và khô đều cao hõn các môi trýờng khác.
3.2. Ảnh hýởng của các chất điều hòa sinh trýởng đến việc tạo sinh khối
Kết luận:
 Môi trýờng có bổ sung 2,4-D tạo sinh khối týõi nhiều hõn so với môi trýờng bổ
sung NAA nhýng trọng lýợng khô lại rất thấp. Môi trýờng K3 và K4 có trọng lýợng týõi
thấp hõn môi trýờng K1 và K2 nhýng cho sinh khối khô nhiều hõn. Môi trýờng K3 cho
sinh khối týõi và khô đều cao hõn môi trýờng K3 nhýng xét về mặt thống kê, hai môi
trýờng này không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa α = 0.01.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Ảnh hýởng của các chất điều hòa sinh trýởng đến việc tạo sinh khối
Kết luận:
 2,4-D kích thích sự phân chia tế bào nhanh nhýng lại phá hủy cấy trúc chặt chẽ của tế
bào làm cho tế bào xốp và giảm đi việc tạo các sản phẩm thứ cấp. Cytokinin cần thiết cho
sự hình thành các hợp chất thứ cấp, khi kết hợp cytokinin với NAA giúp duy trì sự tăng
trýởng cũng nhý tạo ra alkaloid cao.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Ảnh hýởng của đýờng sucrose đến việc tạo sinh khối
Kết luận:
 Nồng độ đýờng tăng dần từ 20 - 60 gam/l sinh khối týõi và khô thu đýợc trong
môi trýờng tăng dần theo. Môi trýờng tối ýu cho thí nghiệm về ảnh hýởng của nồng độ
đýờng lên sự tạo sinh khối là môi trýờng Đ5.
 Tuy nhiên khi tăng nồng độ đýờng lên cao hõn là 70 - 80 gam/lít thì trọng lýợng
týõi và khô giảm dần. Nồng độ đýờng có ảnh hýởng đến sự tạo thành các sản phẩm thứ
cấp trong nuôi cấy tế bào. Ở nồng độ đýờng sucrose cao vừa phải khoảng 50 –60 gam/lít
sẽ kích thích tạo sinh khối và alkaloid.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.4. Định lýợng alkaloid vinblastin và vincristin có trong lá cây không qua nuôi cấy in
vitro và trong dịch huyền phù tế bào
Kết luận:
 bằng phýõng pháp nuôi cấy dịch huyền phù có bổ sung 2,4-D thì lýợng vincristin và
vinblastin không có trong mẫu alkaloid toàn phần còn dịch huyền phù NAA + Kin cho
lýợng vinblastin thấp hõn so với cây trồng ngoài tự nhiên nhýng cho lýợng vincristin khá
cao trong khi cây trồng ngoài tự nhiên trong thí nghiệm này lại không có.
VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
4. KẾT LUẬN:
♣ Tìm đýợc nồng độ hormon phù hợp: Ở nồng độ 1 mgl-1 α -naphthaleneacetic
acid (NAA) và 0,5 mgl-1 kinetin (Kin) thu nhận đýợc sinh khối và alkaloid toàn phần cao
nhất trong khi cũng ở môi trýờng này nhýng thay thế NAA bằng 2,4-
dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) ở cùng nồng độ thu đýợc sinh khối và alkaloid toàn
phần thấp.
♣ Nồng độ đýờng tối ýu cho việc nuôi dịch huyền phù tế bào dừa cạn: ở nồng độ 60
gl-1 cho lýợng sản phẩm là cao nhất.
VIII. KẾT LUẬN
• Tuy nhiên, do cõ sở vật chất cõ bản cho một phòng thí nghiệm nuôi cấy huyền
phù tế bào còn cao nên ở Việt Nam, hýớng nuôi cấy huyền phù tế bào chỉ dừng lại ở mức
nghiên cứu.

• Trong những năm gần đây, Việt Nam đã thành công trong những quy trình áp
dụng các phýõng pháp của nuôi cấy huyền phù tế bào để sản xuất ra các chế phẩm sinh
học, y học …

Trýờng Đại học Nông Nghiệp Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học
Nuôi cấy meristem tạo cây sạch bệnh virus
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
• Bệnh virus trên cây là một bệnh hại phổ biến, nghiêm trọng và gây thiệt hại lớn
đối với ngýời trồng.
• Những phýõng pháp phòng chữa bệnh cây nhiễm virus thông thýờng ít có hiệu
quả
• Phýõng pháp meristem tạo cây trồng sạch bệnh có nhiều ýu điểm và đýợc sử dụng
phổ biến.
II. NỘI DUNG
• Tác hại của bệnh virus đối với cây trồng.
• Các biện pháp kĩ thuật và cõ sở tạo cây sạch bệnh virus.
• Các kỹ thuật nuôi cấy meristem.
• Các phýõng pháp kiểm tra, đánh giá bệnh virus biện pháp đánh giá bệnh virus trên
đồng ruộng
• Quy trình sản xuất cây có múi sạch bệnh virus nhờ kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh
trýởng.
1. Tác hại của bệnh virus:
 Virus có thể làm giảm năng suất, chất lýợng và sức sinh trýởng của cây trồng.
Ví dụ: virus gây bệnh cuốn lá khoai tây, cà chua (Tomato yellow leaf curl
virus) và virus Y có thể làm giảm 95% năng suất của cây trồng.
1. Tác hại của bệnh virus:
 Virus lây lan rất nhanh chỉ trong một khoảng thời gian ngắn có thể xâm nhiễm cả
một vùng rộng lớn gây thiệt hại và có thể thất thu hoàn toàn.
 Virus có lây truyền qua các thế hệ thông qua các cõ quan đã nhiễm virus nhý củ,
hạt giống, các bộ phận sinh dýỡng sử dụng làm giống.
 Virus là một loại bệnh không chữa đýợc. Không có các loại thuốc hay hoá chất
đặc hiệu cho việc phòng trừ các loại bệnh gây ra bởi virus.
 Chính vì thế chọn giống sạch bệnh virus đang đýợc nghiên cứu rộng rãi trong đó
có kỹ thuật chọn giống cây trồng sạch bệnh virus nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trýởng
meristem.
1. Tác hại của bệnh virus:
1. Tác hại của bệnh virus:
Papaya ringspot virus
1. Tác hại của bệnh virus:
Dễ lây lan, lây lan rất nhanh.
Papaya ringspot virus
1. Tác hại của bệnh virus:
 Virus là một loại bệnh không chữa đýợc. Không có các loại thuốc hay hoá chất
đặc hiệu cho việc phòng trừ các loại bệnh gây ra bởi virus.
 Không có cấu tạo tế bào.
 Sống kí sinh bắt buộc.
 Chính vì thế chọn giống sạch bệnh virus là vấn đề bức thiết và đýợc quan tâm
nhiều.
1. Tác hại của bệnh virus:
1. Tác hại của bệnh virus:
1. Tác hại của bệnh virus:
Trong nuôi cấy mô có hai cách để chọn giống sạch bệnh virus:
 Cách 1: Dùng các phýõng pháp chuẩn đoán bệnh virus.
 Cách 2: Dùng kĩ thuật làm sạch virus bằng nuôi cấy meristem.
2. Các biện pháp kĩ thuật làm sạch virus trong nuôi cấy mô:
 Dùng các phýõng pháp chuẩn đoán bệnh virus để thanh lọc các mẫu nhiễm bệnh
trýớc khi đýa vào nuôi cấy, sử dụng biện pháp nhân nhanh invitro để nhân nhanh mẫu
sạch
 Làm sạch virus ở mẫu đã bị nhiễm, sau khi đã tạo mẫu sạch thì tiếp tục sử dụng
biện pháp nhân nhanh invitro để nhân mẫu sạch.
Mô phân sinh (meristem)
2.1. Nguyên lý của kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trýởng meristem:
 Virus sống ký sinh và tồn tại trong mọi tế bào sống, tuy nhiên những nghiên cứu
của White (1934), Limasset và Cornuet (1950) và Martin (1952) đã cho thấy những tế
bào càng gần đỉnh sinh trýởng thì càng chứa ít virus hõn.
Giả thiết về sự không tồn tại virus ở meristem:
The Mathews, Wang et al Hu đã đýa ra giả thuyết về sự không tồn tại của virus ở
meristem nhý sau:
 Virus vận chuyển trong cây nhờ hệ thống dẫn, tuy nhiên hệ thống này không có
trong mô phân sinh đỉnh
 Trong sự phân chia, các tế bào phân sinh đỉnh không cho phép sao chép các thông
tin di truyền của virus
 Hệ thống vô hiệu hoá ở vùng meristem mạnh hõn các vùng khác trong cây
 Nồng độ auxin, cytokinin cao ở đỉnh sinh trýởng có thể ngăn cản quá trình sao
chép thông tin của virus.

2.2. Các kĩ thuật làm sạch virus in vitro

• Nuôi cấy meristem.
• Nuôi cấy meristem kết hợp xử lý nhiệt.
• Nuối cấy meristem kết hợp xử lý hóa chất.
• Vi ghép.
2.2.1. Nuôi cấy meristem
Tách chính xác meristem có kích thýớc nhỏ hõn 0,3 mm, nuôi cấy chúng trên môi
trýờng dinh dýỡng phù hợp để tái sinh thành cây nguyên vẹn. Sau đó kiểm tra độ sạch
virus ở cây tái sinh bằng các phýõng pháp khác nhau để thu nhận đýợc cây sạch bệnh
virus.
Sõ đồ tạo cây bằng nuôi cấy meristem
Tách meristem
2.2.2. Nuôi cấy meristem kết hợp với xử lý nhiệt
• Cõ sở: Ở nhiệt độ cao 36 – 370C thì một số loài virus không có khả năng nhân lên.
• Ýu điểm: Biện pháp này cho phép có thể tách meristem ở kích thýớc lớn hõn (0,5
– 1mm) giúp cho việc tách và tái sinh cây thuận lợi hõn so với phýõng pháp tách ở kích
thýớc 0,3 – 0,5mm.
Sõ đồ làm sạch bệnh virus cho cây khoai tây bằng nuôi cấy meristem kết hợp với xử lý
nhiệt
2.2.3. Nuôi cấy meristem kết hợp với xử lý hóa chất
 Có thể nuôi cấy meristem với kích thýớc lớn (0,5 – 1 mm) kết hợp với việc bổ
sung vào môi trýờng nuôi cấy các chất kháng virus để tạo môi trýờng sạch bệnh.
 Chất kháng virus nhý: 2-thiouracil, ribavirin, vidarabin làm tăng khả năng kháng
của tế bào, mô thực vật và ức chế sự nhân bản của virus.
 Phýõng pháp này có hiệu quả cao trong việc tạo cây sạch bệnh ở thuốc lá, khoai
tây, loa kèn.
2-thiouracil
• là dẫn xuất của pirimidin
• có tác dụng làm rối loạn sự tổng hợp bình thýờng của các axít nucleic của virus
Ribavirin
• có cấu tạo týõng tự adenosine, guanosine
• gấy đột biến trong quá trình tái bản RNA của virus
• Ribavirin 5'-mono(di, tri) phosphate ức chế RNA polymerase của virus

Vidarabine
• có hoạt tính chống virus herpes, poxviruses, rhabdoviruses, hepadnarviruses
• can thiệp vào sự tổng hợp của DNA của virus
• týõng tự nucleoside, đýợc phosphoryl hoá tạo ara-ATP cạnh tranh với dATP trong
quá trình tổng hợp DNA của virus

2.2.4. Vi ghép
- Là kỹ thuật ghép các mô phân sinh đỉnh lên cây gốc sạch và kháng bệnh trong điều kiện
in vitro để sản xuất cây sạch virus.
- Kỹ thuật này thýờng sử dụng với các cây thân gỗ, đặc biệt là họ cam, chanh vì meristem
của chúng không thể sinh trýởng và tái sinh chồi khi nuôi cấy trực tiếp trên môi trýờng
nhân tạo.
2.3. Nhân nhanh và duy trì tình trạng sạch bệnh.
1. Cây trồng nên đýợc trồng trong nhà cách ly (nhà màn, nhà kính) không chứa các nguồn
bệnh và các vector truyền bệnh hay ở tự nhiên không có các mang virus.
2. Cần loại trừ thýờng xuyên các nguồn lây nhiễm, cần phòng trừ các vật mang bệnh (côn
trùng, tuyến trùng…).
2.3. Nhân nhanh và duy trì tình trạng sạch bệnh.
3. Phòng tránh sự lây nhiễm cõ giới trong quá trình chăm sóc cây trồng
4. Thýờng xuyên chọn lọc, có thể bằng mắt và qua các phân tích chẩn đoán
5. Để hoàn toàn chắc chắn, nên duy trì vật liệu sạch bệnh invitro.
3. Các phýõng pháp chẩn đoán bệnh virus
• Chẩn đoán bằng mắt.
• Phýõng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử.
• Chẩn đoán bằng cây chỉ thị.
• Phýõng pháp huyết thanh.
• Phýõng pháp kính hiển vi điện tử.
• Phýõng pháp ELISA.
• Phýõng pháp phân tích DNA.
3.1. Phýõng pháp chuẩn đoán bằng mắt
Đây là các phýõng pháp chẩn đoán dựa trên các triệu chứng bệnh của cây.
 Ýu điểm:
Đõn giản, ít tốn kém.
 Nhýợc điểm:
• Phải có kinh nghiệm không dễ lẫn với các triệu chứng khác không phải là bệnh
• Phýõng pháp này gặp khó khăn khi cây bị nhiễm tổ hợp virus.
• Phụ thuộc vào ngoại cảnh, tuổi cây, đặc điểm của giống.
3.2. Chuẩn đoán bằng cây chỉ thị
• Cây chỉ thị là cây khi bị nhiễm virus sẽ xuất hiện các triệu chứng đặc trýng.
Phýõng pháp này đã đýợc tiến hành từ những năm 1940.
• Phýõng pháp thử bằng cây chỉ thị luôn đýợc coi là phýõng pháp xác định đầu tiên
và cũng là phýõng pháp nhạy cảm nhất, tuy nhiên kết quả xét nghiệm cũng còn phụ thuộc
các yếu tố khác nữa.
3.2. Chuẩn đoán bằng cây chỉ thị
 Ýu điểm:
Nhạy và chính xác có thể phát hiện ở nồng độ virus thấp.
 Nhýợc điểm:
• Thời gian chẩn đoán dài, cần quá trình ủ bệnh.
• Phụ thuộc vào điều kiện thí nghiệm.
• Phýõng pháp lây nhiễm phức tạp.
• Tốn công chăm sóc cây chỉ thị, môi giới truyền bệnh, chi phí đầu tý cao.
• Một số bệnh virus không tiến hành đýợc
3.3. Chuẩn đoán bằng kính hiển vi
Kính hiển vi điện tử đã mang lại những kết quả đáng tin cậy đối với xét nghiệm hàng
loạt.
 Ýu điểm:
• Chính xác, tin cậy.
• Đõn giản, nhanh chóng.
 Nhýợc điểm:
• Chi phí cao số lýợng mẫu hạn chế.
• Loại virus đýợc chứng minh cũng chỉ là loại hình đũa và hình sợi. Nếu virus tồn
tại dạng cầu thì rất khó phát hiện vì nó khá giống các cõ quan tử của tế bào thực vật bình
thýờng.
3.4. Phýõng pháp huyết thanh
 Ýu điểm :
• Tính đặc hiệu cao xác minh nhanh sự tồn tại của virus và phân loại chúng. Kết
quả thu đýợc chậm nhất là sau 48 giờ.
• Chi phí cho xét nghiệm thấp.
• Độ chính xác cao.
 Nhýợc điểm:
• Chýa sản xuất đýợc kháng thể đối với tất cả các loài virus và kể cả khi có huyết
thanh rồi cũng chýa có thể nói rằng kết quả xét nghiệm hoàn toàn bảo đảm.
• Không thể xác minh đýợc đặc tính gây bệnh của từng loài virus đối với thực vật
chủ
Có nhiều phýõng pháp huyết thanh khác nhau đã đýợc ứng dụng phýõng pháp kết
tủa giọt, xét nghiệm khuyếch tán agar gel hai chiều, xét nghiệm latex,xét nghiệm miễn
dịch hýớng tâm...
3.5. Phýõng pháp ELISA ( Enzymed linked immuno sorbent assay)
• Enguall-Permann đề xuất năm 1971-1972 cho lĩnh vực nhân y.
• Clarkm, Adams, Barbara (1976) đề xuất cho chuẩn đoán bệnh virus thực vật.
Nguyên lý chung:
Dựa vào phản ứng kháng nguyên – kháng thể nhýng ở đây kháng thể đýợc liên kết với
một enzyme (enzymed linked). Phức kháng nguyên – kháng thể - enzyme dễ dàng nhận
biết màu do chính enzyme đó xúc tác.
3.5. Phýõng pháp ELISA
• Enzym thông dụng là phosphataza kiềm.
• Cõ chất của phản ứng là 4- nitrophenylphophat. Khi bị tách phosphat sẽ thành α-
nitro phenol có màu vàng.
• Ýu điểm:
- Mỗi enzyme xúc tác cho hàng ngàn phân tử cõ chất nên tín hiệu đýợc khuếch đại
rất rõ.
- Có thể định tính, định lýợng.

3.6. Phýõng pháp phân tích ADN

• Xác định trực tiếp sự có mặt lõi ARN (hoặc ADN) của virus.
• Phýõng pháp này cho kết quả chính xác nhýng đắt tiền, yêu câu phải có trình độ
kĩ thuật cao.
• Sõ đồ nguyên lý:
 Chiết tách ARN virus  cDNA  Phản ứng lai với ARN virus Nhận biết khi cDNA
gắn phản xạ hoặc enzyme.
4. Ứng dụng thực tế của kĩ thuật nuôi cấy meristem
• Nhân nhanh giống khoai tây sạch bệnh: các cán bộ thuộc bộ môn Sinh lý Thực vật
của Viện Sinh học Nông nghiệp, trýờng ĐH Nông nghiệp Hà Nội nghiên cứu hoàn thiện
sản xuất khoai tây giống sạch bệnh.
• Diện tích trồng khoai tây ở nýớc ta đã có thời gian đạt trên 11 vạn
4. Ứng dụng thực tế của kĩ thuật nuôi cấy meristem
• Tạo giống huệ sạch bệnh: Đầu tháng 12/2006, một giống huệ sạch bệnh từ phòng
thí nghiệm của trýờng Đại học Cần Thõ đã cho hoa đảm bảo chất lýợng.
4. Ứng dụng thực tế của kĩ thuật nuôi cấy meristem
4. Ứng dụng thực tế của kĩ thuật nuôi cấy meristem
5. Quy trình tạo cây có múi sạch bệnh từ nuôi cấy meristem
1. Tạo cây đầu dòng sạch bệnh (cây So) bằng kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trýởng:
Nguyên tắc: dựa vào đặc điểm lây lan của bệnh vàng lá greening (VLG) và các
bệnh virus, viroid của cây có múi:
- Bệnh chỉ lan truyền trong cây theo mạch dẫn.
- Bệnh không lây lan qua hạt.
5. Quy trình tạo cây có múi sạch bệnh từ nuôi cấy meristem
2. Chuẩn bị gốc ghép lần 1:
- Xử lý hạt để gieo làm cây gốc ghép: lấy hạt của các giống cam 3 lá và býởi chua,
đýợc bóc sạch vỏ và khử trùng bằng dung dịch Javel 1% trong 5 phút.
- Hạt đýợc gieo trên môi trýờng thạch có chứa chất dinh dýỡng (môi trýờng MS) ở
trong ống nghiệm và đặt trong buồng tối nhiệt độ 28oC.
- Tiêu chuẩn cây gốc ghép: chiều cao 10 - 12 cm, đýờng kính thân 1,5 - 2 mm.
5. Quy trình tạo cây có múi sạch bệnh từ nuôi cấy meristem
3. Chuẩn bị đỉnh sinh trýởng:
• Đỉnh sinh trýởng đýợc lấy từ các chồi non của những cây giống gốc đã đýợc
tuyển chọn trên výờn sản xuất hay trong nhà lýới cách ly. Sau khi thu chồi non, tỉa những
lá to xung quanh, chỉ giữ lại phần ngọn của chồi dài khoảng 1 - 1,5 cm.
5. Quy trình tạo cây có múi sạch bệnh từ nuôi cấy meristem
4. Kỹ thuật vi ghép ( ghép lần 1):
- Cây giống cần làm sạch. Tỉa lá xung quanh. Cắt đỉnh sinh trýởng. Vị trí đặt đỉnh
sinh trýởng bệnh. Sau 10 ngày tỉa lá, ở gốc ghép các chồi non mọc ra.
- Cây gốc ghép 15 ngày tuổi đýợc lấy ra khỏi ống nghiệm, cắt ngọn ở phía trên
cách cổ rễ 2 - 2,5 cm; rễ cọc cũng đýợc cắt bớt chỉ để lại 4 - 5 cm.
- Dùng dao vi ghép và kính lúp soi nổi để mở miệng ghép trên gốc ghép, phải thận
trọng để tầng sinh gỗ không bị tổn thýõng.
5. Quy trình tạo cây có múi sạch bệnh từ nuôi cấy meristem
- Đỉnh sinh trýởng là phần mô phân sinh dài khoảng 100 - 150 nm, dùng dao lýỡi
mỏng cắt và đặt nhanh vào vị trí ghép trên gốc ghép.
- Cây con sau vi ghép đýợc đặt trong ống nghiệm có sẵn môi trýởng lỏng (môi
trýờng MS + đýờng saccaro). Cây đýợc bảo quản ở nhiệt độ 28oC, cýờng độ ánh sáng
1000 lux trong 16 giờ hàng ngày bằng đèn huỳnh quang.
- Sau 1 tuần dùng kính lúp để kiểm tra xem chồi ghép có sống không. Nếu chồi
ghép sống, chỉ 1 tháng sau đã có thêm 2 lá mới, đạt tiêu chuẩn ghép lần thứ 2.
5. Quy trình tạo cây có múi sạch bệnh từ nuôi cấy meristem
5. Kỹ thuật ghép lần 2:
- Sau khi ghép lần 2, cây đýợc bao chùm túi nilon khoảng 3 tuần. Nếu cây ghép sống,
chuyển cây ra chậu to và bảo quản trong nhà lýới chống côn trùng.
- Những cây sau vi ghép đýợc chăm sóc đầy đủ và đýợc giám định bệnh bằng kỹ
thuật PCR, ELISA.
III. Kết luận:
• Meristem với những ýu điểm của nó đã đýợc các nhà khoa học áp dụng vào thực
tiễn sản xuất.
• Trên thực tế đã tạo đýợc nhiều cây sạch bệnh virus nhằm tăng năng suất và chất
lýợng sản phẩm
•
Đề tài: Nhân giống vô tính invitro
Khái niệm về nhân giống invitro
• Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù chung cho tất cả các loại nguyên liệu
nuôi cấy thực vật hoàn toàn sạch vi sinh vật trên môi trường nhân tạo, trong điều kiện vô
trùng.
• Nhân giống vô tính invitro là quá trình sản xuất một lượng lớn cây hoàn chỉnh từ
các bộ phận cơ quan như: Chồi, mắt ngủ, vảycủ, thân lá …của cây mẹ ban đầu thông qua
kỹ thuật nc in vitro.
2. Tính cấp thiết của phương pháp nhân giống vô tính in vitro:
• T ừ xa xưa ông cha ta đã bi ết nhân gi ống cây tr ồng b ằng phương pháp vô tính
truy ền th ống giâm, chi ết, ghép, …
• Nhưng các biện pháp đó ngày càng bộc lộ nhiều hạn chế : giống được nhân nhiều
lần bị thoái hóa giống, mắc nhiều bệnh hơn, năng suất giảm, phân ly …
• Bằng biện pháp nhân giống invitro, với công nghệ vô trùng cao đã khắc phục
được những hạn chế trên, nâng cao năng suất chất lượng của giống cây trồng cả về giá trị
nông học và giá trị thương phẩm.
• Vì vậy việc nghiên cứu, phát triển nhân giống invitro ngày nay là rất quan trọng
cần được chú trọng đầu tư.
3. Ưu điểm của phương pháp nhân giống invitro
• Có hệ số nhân rất cao
• Có thể nhân giống ở quy mô công nghiệp, đặc biệt đối với các đối tượng khó nhân
bằng các phương pháp thông thường.
• Chủ động giống trong sản xuất
• Tạo ra các giống cây trồng sạch bệnh
• VD: khoai tây, dứa…
4. Nhược điểm của phương pháp invitro
• Chi phí cao hơn so với các phương pháp nhân giống vô tính khác nên khó cạnh
tranh.
• Một số cây rất dễ bị biến dị khi nhân giống invitro.
• Nhân giống invitro không thể áp dụng trên tất cả các đối tượng.
II. Cơ sở khoa học
• Dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật.
• Theo quan điểm của sinh học hiện đại: tính toàn năng của tế bào thực vật tế bào là
tế bào chứa đầy đủ lượng thông tin di truyền cần thiết của cơ thể thực vật.
• Sự hình thành và phát triển của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết
quả của những phát hiện sau đây trong lĩnh vực sinh lý thực vật và di truyền học phân
tử:
• 1. Tính toàn thể (potipotency) của mô và tế bào thực vật cho phép tái sinh được
cây hoàn chỉnh từ mô, thậm chí từ một tế bào nuôi tách rời;
• 2. Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn, từ đó tạo các dòng đồng
hợp tử tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình lai tạo;
• 3. Khả năng hấp thu ADN ngoại lai vào tế bào thực vật và khả năng
chuyển gen để gây biến đổi (transformation) ở thực vật do ADN ngoại lai nhờ công
nghệ gen (genetic engineering).
• 4. Khả năng nuôi cấy các tế bào thực vật như nuôi cấy vi sinh vật dẫn đến khả
năng ứng dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao để phục vụ cho công tác tạo
giống;
• 5. Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng dung hợp protoplast, tái sinh cây
hoàn chỉnh từ protoplast lai (cybrid);
• 6. Khả năng loại trừ virus bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tạo các
dòng vô tính sạch bệnh ở các cây nhân giống vô tính.
• 7. Khả năng dùng chồi nách, các thể chồi protocorm vào nhân giống vô tính
với tốc độ cực nhanh một số cây trồng;
• 8. Khả năng sử dụng phương pháp nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất
thụ khi lai xa;
• 9. Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm;
• 10. Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài và ở nhiệt độ
thấp mà không mất tính toàn thể của tế bào.
• III. CÁC BƯỚC THỰC HIỆN
Bước o: chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
• Cây mẹ phải là cây sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng
mạnh.
• Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc
và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng
khả năng sống, sinh trưởng của mẫu nuôi cấy
Bước 1: nuôi cấy khởi động
• Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro.
• Yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống ccao, mô tồn tại, sinh trưởng phát triển tốt.
• Cần chý ý chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây: mô non, ít
chuyên hóa (đỉnh chồi, mắt ngủ…)
• Cần xác định chế độ khử trùng mẫu thích hợp. Thường dùng các chất: Hgcl2
0.1% xử lý trong 5 – 10 phút.
Bước 2: nhân nhanh
• Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng
thông qua: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định, và tạo phôi vô tính.
• Chú ý xác định điều kiện môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để hiệu
quả là cao nhất: Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều xytokinin sẽ kích thích tạo
chồi, nhiều auxin sẽ kích thích ra rễ.
Bước 3: tạo cây in vitro hoàn chỉnh
• Để tạo rễ cho chồi phải cấy chuyển từ môi trường nhân nhanh sang môi trường ra
rễ.
• Môi trường ra rễ thường bổ sung 1 lượng nhỏ auxin. Tuy nhiên có một số chồi có
thể phát sinh rễ ngay chuyển từ môi trường nhân nhanh sang môi trường không chứa chất
điều tiết sinh trưởng.
• Đối với cac phôi vô tính thường chỉ gieo trên môi trường không chứa chất điều
tiết sinh trưởng hoặc có nồng độ xytokinin thấp để phôi phát triển thành cây.
Bước 4: thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
• Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm có tỷ lệ sống cao cần phải chú ý một số
điểm:
• Cây đạt tiêu chuẩn hình thái nhất định: số lá, chiều cao cây, bộ rễ…)
• Có giá thể sạch, tơi xốp, thích hợp để tiếp nhận cây con in vitro.
• Chủ động điều chỉnh hàm lượng dinh dưỡng, ẩm độ, ánh sáng trong vườn ươm.
THAO TÁC CẤY
IV. CÁC PHƯƠNG THỨC NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH
2. Tạo chồi bất định
• - Thực hiện quá trình phản phân hoá và tái phân hoá tế bào để bắt các tế bào soma
hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo.
• - Ở cây 1 lá mầm: lan, dứa, hoa loa kèn,…
3. Tạo phôi vô tính
• Tương tự như tạo chồi bất định, nhưng phôi vô tính có cấu trúc lưỡng cực bao
gồm cả chồi mầm và rễ mầm.
• Phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh hoặc sử dụng làm nguyên liệu
sản xuất hạt giống nhân tạo.
 Sự hình thành phôi vô tính có 2 bước:
Bước 1: phân hóa tế bào có khả năng phát sinh phôi ( thường là các tế bào nhỏ, nhân lớn
nhiều hạch nhân,không có không bào, tế bào chất đậm đặc, giàu protein và mRNA. Cần
môi trường giàu auxin.
Bước 2: sự phát triển của những tế bào phôi mới hình thành. Môi trường nghèo hoặc
không có auxin ( nồng độ auxin cao kích thích hình thành phôi vô tính nhưng ức chế quá
trình phân hóa và phát triển tiếp theo của phôi.
• Từ việc tạo phôi vô tính người ta đã sản xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính
• Nguyên liệu:

 Các Polyme sinh học

 Phôi vô tính
 Môi trường dinh dưỡng tạo hạt nhân tạo
Thường sử dụng polyme tự nhiên Alginate để tạo hạt nhân tạo.
• Cách thực hiện:
• + Dùng polyme bao gói 1 phôi vô tính với 1 thể tích nhất định chất dinh dưỡng để
tạo hạt.
• Quy trình cụ thể như sau:
• Tạo huyền phù phôi vô tính trong môi trường dinh dưỡng với mật độ phù hợp và
bổ sung Na – alginate dược làm tan trong nước với nồng độ 2-4%.
• Dùng pipet nhỏ 100 – 150 µl huy ền phù nêu trên có ch ứa 1 phôi soma và dung d
ịch Cacl2 (2-5%). Khi đó s ẽ sinh ra ph ản ứng trao đ ổi ion Na – Ca và h ạt nhân t ạo đư
ợc hình thành, có đ ủ đ ộ c ứng thích h ợp. ngâm trong nư ớc làm c ứng h ạt.
• Dùng Ca – alginate thường hạt luôn luôn ẩm ướt bề mặt, hiện nay người ta dùng 1
loại polymer Elvax (4260) để bao lớp alginate.
• Giai đoạn kế tiếp là làm khô hạt để giúp hạt nhân tạo dễ dàng bảo quản và nảy
mầm khi cần thiết. Kitto và Janick, đặt hạt cây cà rốt trên khay có chứa 25%
polyoxyethylene để làm mất nước và khi làm ướt lại thì hạt được tái sinh thành cây hoàn
chỉnh.
Chú ý
• Hệ thống sản xuất hạt nhân tạo phải được cơ giới hóa và không phụ thuộc vào
những thiết bị đắt tiền và nhất là thỏa mãn yêu cầu vô trùng.
• 4. Ngoài ra còn có phương pháp nhân giống qua tạo củ in vitro.

Những công nghệ nới trong vi nhân giống cây trồng

1. Công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng.
Nghiên cứu tập trung vào vấn đề nuôi cấy mô trên môi trường không có
đường nhưng được điều khiển chủ động chế độ ánh sáng và cung cấp CO2
VD: Phòng công nghệ tế bào viện sinh học nhiệt đới đã tiến hành nuôi cấy mô quang tự
dưỡng thành công theo 2 phương pháp:
1. Trao đổi khí tự nhiên (khí trao đổi bằng cách khuếch tán qua màng millipore hoặc nút
giấy)
2. Bơm khí trực tiếp (khí được bơm trực tiếp vào hộp nuôi cấy)
• Ưu điểm:
- Tốc độ sinh trưởng, chất lượnh và tỉ lệ sống của mô thực vật được nâng cao ở tất cả các
bước trong điều kiên tự dưỡng.
- Thiệt hại do sự nhiễm mẫu được hạn chế.
- Tỉ lệ đột biến có thể được giảm.
- Tự động hóa =>giảm chi phí lao động.
• Nhược điểm:
- Chi phí cao cho việc điều khiển môi trường.
- Chi phí cao cho hệ thống bình nuôi chuyên dụng và chuẩn bị giá thể.
2. Bioreactor
• Bioreactor là một hệ lên men hay nồi phản ứng sinh học.
• Là thiết bị mà trong đó sự biến đổi hóa sinh được tiến hành bởi các tế bào sống
hoặc các thành phần tế bào invivo. Thường dùng để lên men lien tục, bán lien tục hay
gján đoạn.
• Có thể dùng để nuôi cấy huyền phù tế bào thu sinh khối.
• Cũng có thể dùng trong nuôi cấy mô để nhân nhanh các giống cây

• - Takayama và Miasawa là những người đầu tiên sử dụng bioreactor vào nhân
giống cây trồng: nhân củ siêu nhỏ khoai tây, củ giống hoa ly, hoa lan hồ điệp.
• - Công nghệ này cho phép nhân nhanh vô hạn các giống cây trồng nhờ thiết bị
bioreactor hoàn toàn tự động hóa.
• VD: 1 bioreactor vibro-mixer trang bị với các ống silicone có khả năng sản xuất
100.000 phôi vô tính của cây trạng nguyên trong 1lit dịch huyền phù nếu như dung dịch
đó được đặt trên 1tấm giấy lọc và phát triển trong 4tuần.
Bioreactor sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật được cải tiến từ các loại bioreactor
trong nuôi cấy tế bào vi sinh
• Thuận lợi;
- Thể tích nuôi cấy tăng => sản xuất nhiều phôi, chồi hơn mà không cần những kĩ thuật
cao cấp.
- Hầu hết các bình bioreactor được thiết kế với cơ chế khuấy bằng cơ học hay thổi khí để
duy trì nuôi cấy gần như đồng dạng.
- Khi thao tác nuôi cấy liên tục, môi trường nuôi cấy và môi trường vật lí có thể được
kiểm soát thích hợp cho sinh trưởng. Điều này không thể thực hiện với hệ thống nuôi cấy
bình tam giác.
• Nhược điểm: đòi hỏi thiết bị hiện đại và đắt tiền, vận hành phức tạp đặc biệt là
khâu chống nhiễm cho huyền phù nuôi cấy.

Tổng hợp lượng lớn sinh khối tảo

Pg166 bioreactor

• CÂY GỖ NGHIẾN
• CÂY XOAN
• NUÔI CẤY VÔ TÍNH CÂY DỨA (THƠM)
V. Ứng dụng
1. Trong nông nghiệp
• Sản xuất nhanh chóng các giống cây trồng đáp ứng được nhu cầu về cây giống
cao trong trồng trọt.
• Giống là một khâu rất quan trọng trong sản xuất nông nghiệp. Công tác giống chủ
yếu bao gồm các khâu thu thập nguồn gen, bảo quản quỹ gen, lai tạo, tuyển chọn, thử
nghiệm giống và nhân giống.

• Nhờ phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nên ngày nay phần lớn các công
việc này được thực hiện một cách khá thuận lợi và nhanh chóng
• VD: chu ối, khoai tây…
• Nhân gi ống ổn đ ịnh ch ất lư ợng, năng su ất cao ph ẩm ch ất t ốt
• VD: Các cây tr ồng chuy ển gen, con lai F1…
• T ạo gi ống s ạch b ệnh ch ống ch ịu v ới môi trư ờng
• VD: khoai tây s ạch virus, hoa lily s ạch b ệnh…

• 2. Trong công nghiệp

• Dây chuyền sản xuất nhân nhanh các giống hoa cây cảnh phục vụ cho thị trường.
• VD: Nhờ nuôi cấy mô vào sản xuất các giống hoa như: tuylip, đồng tiền, hoa ly ở
Hà Lan. Sản xuất hoa lan ở Trung Quốc, đồng tiền ở Việt Nam, Cẩm Chướng …
• Cây hoa cẩm chướng đang ra hoa trong ống nghiệm - in vitro flowering of
Dianthus caryophyllus L
• Dây chuyền sản xuất giống cây con cung cấp cho thị trường, giảm giá thành sản
phẩm.
• VD: sản xuất cây giống lâm nghiệp theo quy mô công nghiệp: Bạch đàn, keo…
• 3. Trong y học
• Ứng dụng sản xuất nhanh sinh khối các cây dược liệu bằng thu sinh khối callus
hoặc thể huyền phù.
• VD: nhân nhanh
sâm Triều Tiên…
nhân sâm Ngọc Linh

4. Trong nghiên cứu khoa học

• Phục tráng các giống cây quý hiếm nằm trong sách đỏ
VD: Cây sưa - Dallbergia tonkinensis:
cây lan hài đỏ quí nhất Việt Nam
• Nuôi cấy mô tế bào thực vật không chỉ góp phần giải quyết một cách có hiệu quả
công tác giống cây trồng mà còn mở ra một chân trời mới trong nghiên cứu di truyền
thực vật, các cơ chế sinh tổng hợp ở thực vật, sinh lý phát triển, vai trò của phytohormone
trong đời sống thực vật và nhiều vấn đề sinh học cơ bản khác
• Khắc phục các hiện tượng bất thụ trong lai xa
• Bảo quản nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm
• Tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài ở nhiệt độ thấp mà không mất
tính toàn thể của tế bào.
• Làm cơ sở cho các kỹ thuật di truyền khác là khâu cuối cùng cho các công tác
đánh giá giống.
 Các tồn tại của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô:
+ Hạn chế của vi nhân giống
+ Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất cả
cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống.
+Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng
nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen.
+ Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn
chưa được giải đáp.
• Chi phí sản xuất cao: Vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo.
Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp truyền thống như chiết,
ghép và nhân giống bằng hạt.
• Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây con nuôi cấy mô có thể sai khác
với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả là cây con không giữ
được các đặc tính quý của cây mẹ.

• Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều
hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng.
Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây
giống đồng nhất về mặt di truyền.
• Ngoài ra còn xảy ra hiện tượng nhiễm mẫu.
VI. Quy trình cụ thể
• Quy trình nhân giống hoa Lan bằng phương pháp nuôi cấy in-vitro
• Lan là loại hoa vương giả, với vẻ đẹp vương giả, quý phái nên khắp nơi trên thế
giới ngày càng có nhiều người thích chơi hoa Lan. Chính vì vậy, hoa Lan là sản phẩm
trồng trọt luôn có giá trị kinh tế cao.
• Bắt kịp thị hiếu này, ngày nay đã xuất hiện nhiều cơ sở kinh doanh hoa Lan với
nhiều chủng loại, giá cả khác nhau. Do đó, việc nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô in-
vitro tạo ra hàng loạt cây con ổn định về mặt di truyền và đáp ứng giá cả phải chăng là vô
cùng hữu ích.
• Sau đây, chúng tôi xin giới thiệu quy trình cơ bản nhân giống Lan bằng phương
pháp nuôi cấy mô in-vitro:
• Quy trình trên được tiến hành qua các giai đoạn sau:
• 1. Chọn mẫu và khử trùng mẫu cấy:
• Tách các vảy hành ra từ cây, bóc lần các lá già cho đến khi xuất hiện các mầm
chồi bên mang đỉnh sinh trưởng.
• Cắt bỏ gốc của mỗi mầm, sau đó khử trùng bằng cách ngâm trong cồn 70% trong
30 giây, rửa sạch bằng nước cất vô trùng ngâm trong dung dịch Ca(OCl)2 2% trong 25
phút, việc khử trùng được tiến hành trong tủ cấy. Mô được rửa lại với nước cất vô trùng 4
- 5 lần
• Mỗi mầm được đặt trong đĩa petri vô trùng và cẩn thận tách các lá non.
• Sau mỗi lần tách, nhúng mầm vào cồn 700 trong 1 giây và rửa với nước cất vô
trùng.
• Chuyển sang một đĩa petri vô trùng khác, tách các lá mầm bằng dao nhọn vô
trùng. Dùng kìm nhọn tách các lớp lá, cắt đỉnh sinh trưởng ra khỏi mô và cấy vào môi
trường nhân giống ban đầu.
• Nhiệt độ lý tưởng để nhân giống Lan là 220C - 260C và tuỳ vào mỗi loài.
• Sau 4-8 tuần, đỉnh sinh trưởng chuyển sang màu xanh lục và tạo ra các khối tròn
gọi là thể chồi.
• Thể chồi được lấy ra khỏi môi trường cấy ban đầu, dùng dao nhọn cắt làm 4-6
miếng tuỳ kích thước của chồi.
• Lát cắt được chuyển vào môi trường duy trì (môi trường phát triển chồi). Mỗi
đỉnh sinh trưởng sẽ phát triển ra một thể chồi mới sau khoảng 4 tuần, có thể cắt tiếp và
cấy chuyền sang môi trường mới.
2. Nhân giống:
• Môi trường nhân giống thường là môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) có bổ
sung các chất điều hoà tăng trưởng (auxin, cytokinin,…) với tỷ lệ phù hợp tùy loài nhằm
tạo điều kiện cho quá trình nhân chồi.
• Nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng nên giảm dần trong các lần cấy chuyển
sau đó. Các chất chiết trái cây cũng được đề nghị dùng như nước cốt cà chua, nước dừa,
nước chuối, nước khoai tây... Nhưng chúng chỉ có hiệu quả trong các lần cấy chuyển và
thể tích cũng không quá 10% thể tích môi trường.
• 3. Tái sinh cây hoàn chỉnh in-vitro:
• Khi đạt đến số cây giống cần thiết, ta chuyển thể chồi sang môi trường tạo rễ (môi
trường có lượng auxin tăng lên để kích thích ra rễ).
• Sau 4 -5 tháng, các thể chồi sẽ phát triển thành cây con.
• 4. Chuyển cây ra vườn ươm:
• Cây con cao 5-7 cm và có từ 3-4 lá có thể chuyển sang cấy vào bầu đất mùn vô
trùng có bổ sung các chất dinh dưỡng.
Sau một thời gian cây phát triển ổn định ta đem chuyển vào chậu. Sau khi chuyển chậu
khoảng một tuần mới được bón phân, lúc này cây đã có đủ sức chống chọi với bệnh tật.
• Như vậy, từ một mô hoa Lan được chọn nuôi cấy cho đến ra cây con có 3-4 lá
chuyển ra vườn trồng mất thời gian khoảng từ 8 đến 11 tháng.
• Với phương pháp nhân giống vô tính như trên sẽ đảm bảo tạo ra cây con mang
đặc tính giống hoàn toàn với cây cha mẹ (cây con ổn định về mặt di truyền), cây con
không nhiễm bệnh và tạo được một số lượng lớn cây con trong thời gian ngắn.
• Tuy nhiên, việc cấy mô phải được thực hiện thật nghiêm túc và tỉ mỉ theo đúng
quy trình, phải có điều kiện về trang thiết bị đầy đủ, môi trường nhân tạo thích hợp, đặc
biệt là điều kiện vô trùng phải được đảm bảo nghiêm ngặt.
• Cần chú ý thêm, đối với các loài không phải là cây bản địa, phải được thuần hoá
tại vùng mới chọn mẫu đem nuôi cấy, có như vậy mới đảm bảo hiệu quả từ khâu nuôi cấy
trong phòng thí nghiệm đến trồng ngoài vườn ươm.
Những số liệu thực tế
• Cuối tháng 10 vừa qua, Viện Di truyền nông nghiệp cũng đã công bố nhân giống
công nghiệp và bán công nghiệp thành công đối với một số loài hoa và cây lâm nghiệp có
giá trị kinh tế cao; tuyển chọn được 18 giống hoa lyly, 10 giống hồng môn với những sắc
màu, kiểu dáng đa dạng có giá trị kinh tế cao và trên 15 vạn cây giống sa nhân, tếch, trầm
hương...
• Nuôi cấy mô tạo giống cây mới tại Viện Công nghệ sinh học.
• Ông Đỗ Năng Vịnh - Phó Viện trưởng Viện Di truyền nông nghiệp - cho biết:
"Tạo phôi vô tính, hạt nhân tạo là công nghệ tiên tiến trên thế giới, lần đầu được nghiên
cứu ở nước ta. Phát hiện này đã được nhiều công ty giống tiếp nhận để phổ biến trong hệ
thống sản xuất nông nghiệp công nghệ cao".
• Theo các nhà khoa học Việt Nam, đến nay, đã có trên 200 loài cây trồng đã được
nhân giống bằng công nghệ phôi vô tính. Nhân bản vô tính có thể tạo hạt nhân tạo, đây là
yếu tố thuận lợi cho cơ giới hoá và tự động hoá nhân giống công nghiệp. Ví dụ, với cây
cà phê, từ 1 gam sinh khối, trong vài tháng người ta có thể tạo được 60 vạn phôi vô tính
có tỉ lệ tái sinh đến 47%.