Professional Documents
Culture Documents
Đề tài: Nuôi cấy tạo cây đơn bội từ tế bào sinh dục
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong chọn tạo giống cây trồng việc tạo ra được dòng đồng hợp tử tuyệt đối là một
vấn đề rất được quan tâm. Các dòng này đã được tạo ra bằng nhiều con đường khác nhau
như: tự phối, nuôi cấy tạo cây đơn bội từ tế bào sinh dục… Trong đó tạo cây đơn bội từ tế
bào sinh dục là một kĩ thuật mới có nhiều ưu điểm so với các kĩ thuật khác.
KHÁI NIỆM CHUNG VỀ THỂ ĐƠN BỘI
• Các thể đơn bội là những cá thể thường là của những loài nhị bội hay đa bội khác
nguồn mà trong tế bào soma của chúng số lượng nhiễm sắc thể bằng nửa số lượng NST
của loài khởi đầu, trong mỗi cặp NST tương đồng nó chỉ có một NST.
• Các cách hình thành thể đơn bội:
- Trinh sinh (gynogensis) và sinh sản đơn tính đực (androgensis).
- Loại trừ nhiễm sắc thể và giảm nhiễm sắc thể soma.
- Nuôi cấy thể đơn bội in vitro.
Một số đặc điểm của thể đơn bội.
• Trong cơ thể thực vật chỉ có thể giao tử (hạt phấn, noãn) là những tế bào đơn bội.
Nếu chúng phát triển thành cây thì cây đó có mức bội thể đơn bội (n).
• Ở thể đơn bội thì kiểu hình của cây phản ánh trung thực kiểu gen. Vì vậy thể đơn
bội là nguyên liệu lý tưởng cho công tác chọn giống cây trồng.
Khó khăn của việc tạo dòng thuần và hướng khắc phục.
• Trong chọn giống thực vật để tạo ra dòng thuần chủng người ta tiến hành tự thụ
phấn bắt buộc qua nhiều thế hệ, việc này tốn rất nhiều thời gian.
• Vì vậy vấn đề đặt ra là làm thế nào trong một thời gian ngắn, chúng ta có thể tạo
ra được dòng thuần chủng. Năm 1934, Stow đã phát hiện ra sự phát triển khác thường của
hạt phấn thành những cấu trúc giống túi phôi đã xảy ra ở một số loài thực vật ở
Hyacinthus. Hiện tượng này đã cho thấy các hạt phấn có khả năng phân chia để hình
thành các tế bào mới hoặc các mô khi được sinh trưởng trong các điều kiện thích hợp và
chúng tiếp tục phát triển thành cây đơn bội
Ưu thế của việc tạo dòng thuần chủng từ nuôi cấy bao phấn, hạt phấn.
• Tính đồng hợp tử có được chỉ sau một đời nuôi cấy trong khi đó chọn dòng thuần
thông thường phải mất 5 - 6 đời tự thụ phấn.
• Cây lưỡng bội hoá tính đồng hợp tử tuyệt đối, trong khi tự thụ phấn thông thường
qua nhiều đời mà vẫn còn tồn dư dị hợp tử.
• Sự đa dạng di truyền ở quần thể cây lưỡng bội hoá từ nuôi cấy bao phấn hạt phấn
lớn hơn quần thể tự thụ phấn tạo dòng thuần sau các đời tự thụ.
• Những gen lặn có thể bị che khuất ở các cây nhị bội dị hợp tử nhưng ở cây đơn
bội hoặc lưỡng bội hóa từ hạt phấn lại có cơ hội biểu hiện ngay ra thành kiểu hình.
• Cây đơn bội có thể dùng trong chọn lọc hồi quy để tạo giống chống bệnh.
• Cấy truyền liên tục các dòng callus từ nuôi cấy bao phấn có thể tạo ra biến dị
giao tử là nguyên liệu cho chọn giống.
Khả năng ứng dụng của cây đơn bội.
• Nghiên cứu di truyền về mối tương tác của các gen.
• Tạo đột biến ở mức đơn bội.
• Tạo dòng đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ cho công tác chọn giống cây trồng.
Sơ đồ các hướng ứng dụng đơn bội
Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn
Nguyên lý:
Dựa trên cơ sở của sự sinh sản đơn tính đực (androgensis), người ta nuôi cấy các
hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tách rời hay các bao phấn có chứa các hạt phấn đơn nhân
trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để kích thích hạt phấn phát triển thành cây
đơn bội.
Các phương thức sinh sản vô tính đực invitro tạo cây đơn bội
Sinh sản đơn tính trực tiếp (thuốc lá, cà độc dược).
Hạt phấn đơn nhân phôi 1n cây 1n
Sinh sản đơn tính đực gián tiếp (lúa, ngô)
Hạt phấn đơn nhân mô sẹo 1n chồi 1n cây1n
Sinh sản vô tính đực hỗn hợp: quá trình này diễn ra tương tự như sinh sản vô tính
đực gián tiếp, nhưng sự tạo thành mô sẹo ngắn, khó nhận biết. Ví dụ: cà chua.
Các phương pháp cơ bản
Có 2 phương pháp cơ bản được sử dụng trong nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là:
Phương pháp1: Các bao phấn được nuôi cấy trên môi trường có agar hoặc môi
trường lỏng và sự phát sinh phôi xảy ra trong bao phấn.
Kỹ thuật nuôi cấy
Kỹ thuật này bao gồm những bước chính như sau:
• Chọn bao phấn: Bao phấn thích hợp nhất có chứa hạt phấn bắt đầu từ thể tứ bào tử
đến ngay sau lần nguyên phân thứ nhất. Bao phấn của các hoa đầu tiên cho kết quả tốt
hơn bao phấn của hoa muộn.
• Xử lý nụ hoa: Cần xử lý ở nhiệt độ thích hợp các nụ hoa sau khi cắt khỏi cây và
trước khi tách bao phấn để nuôi cấy, nhằm kích thích sự phân chia của hạt phấn và từ đó
tạo cây đơn bội.
Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo cây đơn bội trong nuôi cấy bao phấn, hạt phấn in
vitro
Tình hình nghiên cứu, thành tựu và hiện trạng.
Tình hình nghiên cứu:
- 1964 Guka và Maheshwasi lài hai nhà khoa học Ấn Độ lần đầu tiên đã tạo thành
công cây đơn bội qua nuôi cấy bao phấn cây cà độc dược.
- Kĩ thuật đơn bội được ứng dụng rất rộng rãi ở hầu hết các nước có công nghệ
chọn giống trên thế giới.
- Công nghệ đơn bội đã được áp dụng đối với hầu hết các cây trồng quan trọng và
mang lai hiệu quả kinh tế cao. Đối với một số cây như lúa, ngô, đại mạch, măng tây…thì
đây là công nghệ không thể thiếu được trong chọn tạo giống.
- Ở nước ta từ năm 1975 đến nay đã tạo được nhiều loại cây trồng bằng nuôi cấy
đơn bội như ngô, bắp cải, thuốc lá.
Thành tựu:
Các cây đơn bội có nguồn gốc hạt phấn đã được tạo ra ở 216 loài thuộc 78 giống,
31 họ và nhiều loài khác cũng được nghiên cứu thành công (Hu và Zhang, 1985).
Thông qua nuôi bao phấn đã tạo các giống lúa thuần như Khao 85, Khao 1105,
VH2. Đặc biệt thông qua chọn dòng tế bào soma thu được các giống DR1, DR2, DR3
đang mở rộng ra qui mô sản xuất. Kết hợp biến dị tế bào soma với gây đột biến đã tạo
giống lúa KDM39. Trong nghiên cứu lúa lai đang áp dụng kỹ thuật lai xa, cứu phôi, đột
biến tạo dòng TGMS và CMS mới.
Trong lĩnh vực nông nghiệp, các kết quả nghiên cứu về công nghệ tế bào - mô
phôi thực vật giúp chúng ta nhanh chóng tạo ra các giống cây trồng thuần. Hàng loạt
dòng thuần ở lúa (ĐV2, MT4, DT26...) đã được tạo ra bằng kĩ thuật đơn bội nuôi cấy bao
phấn và nuôi cấy noãn. Đặc biệt, chúng ta đã sản xuất được dòng lúa thuần mang gene
quý như gen bất dục đực tế bào chất, bất dục đực nhân (gen TGMS, PGMS). Đối với ngô,
đã tạo được 5 dòng ngô thuần và hai tổ hợp ngô lai có triển vọng.
Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào phát triển nhanh và ngày càng hiện đại mở tiềm năng to
lớn cho cho nuôi cấy bao phấn hạt phấn tạo cây đơn bội từ đó tạo dòng thuần, đáng chú ý
là ở các đối tượng có tầm quan trọng như: lúa gạo, lúa mạch, đại mạch, thuốc lá, ngô,
khoai tây…
Ưu điểm của việc tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn và hạt phấn
• Nuôi cấy bao phấn:
Vì bao phấn có kích thước lớn nên thao tác dễ dàng.
Môi trường nuôi cấy đơn giản.
• Nuôi cấy hạt phấn:
Giống tạo ra có tính đồng hợp tử cao.
Phát sinh phôi dễ dàng trong quá trình nuôi cấy.
Tạo cây đơn bội thuận lợi cho việc nghiên cứu di truyền.
Tóm lại, nuôi cấy bao phấn, hạt phấn ra đời đã làm giảm thời gian, đồng thời làm
tăng vọt số lượng các cá thể đơn bội thu được.
TẠO CÂY ĐƠN BỘI BẰNG NUÔI CẤY NOÃN
CHƯA THỤ TINH
Khái niệm:
Tạo cây đơn bội từ nuôi cấy noãn chưa thụ tinh là sự kích thích tế bào trứng hay
các tế bào đối cực,tế bào kèm trong noãn phát triển và tái sinh thành cây đơn bội.Sự hình
thành từ noãn chưa thụ tinh được gọi là sự sinh sản đơn tính cái hay trinh nữ sinh
Đã có nhiều thành công trong nghiên cứu tạo các cây đơn bội bằng nuôi cấy bao
phấn. Nhưng ở một số loại cây như hành,hoa hướng dương hay củ cải đường… thì
phương pháp này tỏ ra không hiệu quả. Chính vì vậy trong những năm 70 các nhà nghiên
cứu đã tiến hành tạo cây đơn bội bằng noãn chưa thụ tinh và đã giành được một số kết
quả đáng kể.
Quy trình tạo cây đơn bội bằng noãn chưa thụ tinh
Những nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy noãn chưa thụ tinh
Kĩ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh còn gặp nhiều khó khăn và phức tạp do việc
tách noãn khó và dễ gây tổn thương
Nhằm tăng hiệu quả của quá trình này người ta đang tập trung nghiên cứu các yếu
tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy để tạo cây đơn tính mong muốn
Kiểu gen của cây mẹ
• là một trong những nhân tố quan trọng nhất đối với quá trình nuôi cấy
• Người ta nhận thấy mỗi một kiểu gen có phản ứng khác nhau trong quá trình sinh
trưởng nên phải xác định quy trình riêng cho từng loại cây cụ thể của từng kiểu gen
• nhân tố này đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau như lúa,hoa đồng
tiền.
Giai đoạn phát triển của noãn
• Giai đoạn phát triển của noãn có ý nghĩa đặc biệt đối với việc tạo thể đơn bội
• Túi phôi thành thục là giai đoạn phù hợp cho hiệu quả cao trong nuôi cấy noãn
• Tuy nhiên việc xác định giai đoạn phát triển của thể giao tử cái là rất phức tạp vì
túi phôi nằm trong bầu quả do đó khó quan sát trực tiếp để xác định được thì phải sử
dụng các phương pháp tế bào học như tách túi phôi,nhuộm màu bằng lát cắ mỏng
Môi trường nuôi cấy
• Các môi trường như MS, B5, MF thừng được sử dụng làm môi trường nuôi cấy
noãn chưa thụ tinh
• Môi trường này chủ yếu ở dạng đặc
• Để cảm ứng được sự trinh sinh cần thiết thì phải bổ sung các chất điều tiết sinh
trưởng thực vật
• Ngoài ra nồng độ đường cũng là một yếu tố cần được quan tâm,nồng độ phải phù
hợp cho từng loại cây
• Trong nhiều trường hợp việc bổ sung thêm một số chất phụ gia như nước dừa có
tác dụng tạo callus phát sinh phôi và tái sinh cây
Điều kiện nuôi cấy
• Quá trình nuôi cấy thường được duy trì ở nhiệt độ ổn định 25-28 độ
• Đối với đa số loài thường ở giai đạn đầu của quá trình nuôi cấy tiến hành trong
điều kiện tối, giai đoạn tái sinh cây yêu cầu ánh sáng 2000-3000 lux
Những thành tựu đạt được trong phương pháp tạo cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh
Tỉ lệ tạo cây đơn bội theo phương pháp này có nhiều khả quan như ở hành
và củ cải đường :5-20%,ở dâu tằm là 3-6%
Cây tái sinh ít bị bạch tạng ngay ở cả họ hòa thảo,trong khi nếu nuôi cấy bằng bao
phấn và hạt phấn có tỉ lệ bạch tạng 60-90%
Ở các loại cây ngũ cốc ở VN thì biện pháp này tương đối đơn giản và dễ thành
công như ở cây ngô
So sánh
Giống nhau:
Đều dùng giao tử để tạo tế bào đơn bội.
Đều nhằm tạo ra những cây đơn bội qua sự cảm ứng phát sinh phôi từ những phân
chia lặp lại của các bào tử đơn bội,các tiểu bào tử, các hạt phấn non.
Khác nhau
Phương pháp nuôi cấy hạt phấn tách rời tạo tế bào đơn bội cần phải tách rời các
hạt phấn khỏi bao phấn khi nuôi cấy. Các hạt phấn này thường được nuôi cấy trên môi
trường lỏng kèm theo chế độ lắc hay nuôi cấy chìm trong môi trường bán lỏng.
Phương pháp nuôi cấy bao phấn được áp dụng trên nhiều đối tượng thực vật khác
nhau: ngô, lúa, thuốc lá… nhưng không áp dụng trên các cây hành, củ cải đường, hoa
hướng dương.
Phương pháp nuôi cấy noãn chưa thụ tinh chủ yếu trên các đối tượng hành, củ cải
đường, ngô, các cây ngũ cốc. Tuy nhiên kỹ thuật này còn gặp nhiều khó khăn và phức tạp
do việc tách vách tế bào trứng rất khó và dễ gây thương tổn do vậy người ta đang tập
trung nghiên cứu các yếu tố như kiểu gen cây mẹ, giai đoạn phát triển của túi phôi, chế
độ xử lý nhiệt độ, môi trường nuôi cấy…
Hiện trạng
Hiện tại người ta mới nuôi cấy hạt phấn trưởng thành để tạo cây đơn bội thành
công qua con đường phôi hoá, hoặc tạo thành mô sẹo, từ đó tạo cây đơn bội. Còn nuôi
cấy hạt phấn non chưa đạt được nhiều hiệu quả, hiện tại chỉ có một số kết quả về nuôi cấy
hạt phấn non thành công như nuôi cấy hạt phấn non cây Trillium electum (Saparov và
cs,1955), cây hành Allium cepa (Vasil,1959), ở cây Atropa belladonna (Bajaj,1974).
Hầu hết các cây ngũ cốc và các cây họ đậu nuôi cấy bao phấn rẩt khó thành công
hoặc tỉ lệ thành cây thấp, tỉ lệ cây bạch tạng cao.
Nhiều gen có khả năng thành cây thấp thường không được ứng dụng trong nuôi
cấy bao phấn nhưng có khi gen lại có giá trị kinh tế cao. Ví dụ cấy bao phấn giống lúa
Japonica dễ thành công hơn hơn giống lúa Indica, tuy nhiên giống Indica lại có vai trò
quan trọng hơn nhiều giống Japonica
Nuôi cấy bao phấn thuốc lá
Nguyên liệu và thiết bị:
– Nụ hoa thuốc lá (Nicotiana tabacum)
– Nước cất 2 lần vô trừng
– Etanol 90%
– Dung dịch hipoclorit natri 10% (V/v)
– Thuốc nhuộm acetocacmin
– Agar
– Đĩa petri
– Môi trường MS hoặc môi trường NN
– Kính hiển vi giải phẫu
– Dao, kéo, panh,... Dùng cho nuôi cấy
– Một số hóa chất để pha môi trường lỏng: saccarozo, KNO3,…
Tiến hành
• Thu hái các nụ hoa của thuốc lá khi chúng có tràng hoa dài 21-23mm (thời điểm
các hạt phấn thuốc lá hoàn thành phân bào nguyên phân đầu tiên)
• Xử lý lạnh các nụ hoa khoảng 12 ngày ở 7-8oC, sau đó khử trùng bề mặt nụ hoa
bằng etanol 90% trong 30s, sau đó chuyển chúng sang các đĩa petri đã chứa dung dịch
hipoclorit natri 10% trong 10 phút
• Rửa các nụ hoa vài lần trong nước cất 2 lần vô trùng. Dùng dao, kim và panh giải
phẫu cẩn thận nụ hoa và lấy ra các bao phấn (có thể sử dụng kính hiển vi giải phẫu để hỗ
trợ cho quá trình thao tác
• Lấy 1 bao phấn của mỗi nụ hoa và ép trong acetocacmin để xác định giai đoạn
phát triển của hạt phấn. Nếu hạt phấn ở giai đoạn phát triển thích hợp thì các bao phấn
còn lại của nụ hoa được dùng trong nuôi cấy
• Các bao phấn có thể được nuôi cấy theo 2 cách:
• Trên môi trường MS đặc (có 0,6-1,0%(W/v) agar)
• Nuôi cấy nổi trên môi trường lỏng gồm: KNO3-950(mg/l); NH4NO3- 825(mg/l);
MgSO4.7H2O- 185(mg/l); CaCl2- 220 (mg/l);KH2PO4-85 (mg/l); FeSO4.7H2O-27,8 (mg/l)
; Na2EDTA-37,3 (mg/l);saccarozo-20000 (mg/l)
6. Quá trình nuôi cấy được duy trì ở nhiệt độ 25oC trong tối hoặc ở ánh sáng yếu.
Cường độ ánh sáng thích hợp khoảng 300lux. Sau 4-6 tuần nuôi cấy, các cây con sẽ xuất
hiện từ một số bao phấn.
Khi mô bao phấn đạt 3mm thì tách cây con ra khỏi mô và chuyển sang môi trường
tạo rễ (có thể dùng môi trường MS với thành phần khoáng giảm 1 nửa). Cường độ ánh
sáng cao hơn thời gian chiếu sáng khoảng 10-12h/ngày
Đề tài: “Bảo quản nguồn gen thực vật in vitro”
MỤC LỤC
I. Mở đầu
II. Nội dung
1. Bảo tồn nguồn gen thực vật
2. Sõ lýợc về các phýõng pháp bảo tồn nguồn gen
3. Các cách bảo quản nguồn gen thực vật in vitro
4. Ýu thế và hạn chế của kỹ thuật bảo quản nguồn gen thực vật in vitro
5. Khả nãng ứng dụng của bảo quản nguồn gen thực vật in vitro
6. Phýõng pháp bảo quản nguồn gen invitro đối với giống hoa Lilium
Formolongo.
III. Kết luận
Mở đầu
Bảo quản nguồn gen thực vật là duy trì sự phong phú và đa dạng di truyền
trong loài, giữa các loài và trong hệ sinh thái nói chung nhằm đánh giá, khai thác sử
dụng các nguồn gen có giá trị để phục vụ lợi ích con ngýời.
Hiện nay có nhiều phýõng pháp bảo quản nguồn gen thực vật, song bảo quản
nguồn gen thực vật in vitro là giải pháp công nghệ có triển vọng, nhất là với các cây
nhân giống vô tính và các hạt mức sức nảy mầm ở nhiệt độ và ẩm độ thấp.
Vì vậy, chúng tôi tiến hành tìm hiểu đề tài: “Bảo quản nguồn gen thực
vật in vitro”
Nội dung
1.1. Mục đích
Bảo vệ sự đa dạng sinh học, thể hiện ở 3 mức:
+) Sự đa dạng của các hệ sinh thái
+) Đa dạng của các loài
+) Sự đa dạng di truyền hay sự đa dạng của các nguồn gen trong loài
Đánh giá, khai thác sử dụng các nguồn gen có giá trị để phục vụ con ngýời.
1.2. Ý nghĩa
Là một việc làm cấp thiết và thýờng xuyên để phục vụ nhiệm vụ trýớc mắt và
lâu dài của công tác cải thiện giống, vừa góp phần quan trọng vào công tác bảo tồn
thiên nhiên, bảo vệ sự đa dạng sinh học.
Bảo tồn nguồn gen ngăn chặn sự mất mát các gen, các phức hợp gen ngăn
chặn sự tuyệt chủng của các nòi địa lý, các xuất xứ và trong trýờng hợp cực đoan đó
là sự tuyệt chủng của loài.
2. Các phýõng pháp bảo tồn nguồn gen từ trýớc đến nay
2.1 Bảo tồn ngoại vi (ex - situ conservation)
Đây là hình thức bảo tồn chủ yếu hiện nay trên thế giới, một hình
thức bảo tồn ngoài phạm vi cý trú tự nhiên của các loài.
Gồm :
- Bảo quản hạt
- Trồng ngoài ruộng
- Bảo quản in vitro
2.1.1. Bảo quản hạt
Gồm:
Bảo quản ngắn hạn (hạt giống đýợc làm khô tới độ ẩm 9%, thời gian 5 năm)
Bảo quản trung hạn (độ ẩm hạt 7%, bảo quản trong dụng cụ bao gói và kho
chuyên dụng ở độ ẩm 10%, t0 là - 1 đến - 50C)
Bảo quản dài hạn (độ ẩm hạt 3%, đựng trong hộp kim loại, bảo quản trong
kho lạnh sâu, t0C là - 150C đến - 200C, thời gian từ 20 - 30 năm).
2.1.2. Bảo quản trên đồng ruộng
Đối týợng: cây lâu năm nhý cây ăn quả, cây công nghiệp, cây thuốc,
cây sinh sản vô tính, hữu tính khác…
Ýu điểm: Dễ tiếp cận nghiên cứu, đánh giá và sử dụng
Nhýợc điểm: Dễ mất mát do điều kiện không thuận lợi, đòi hỏi diện tích
đất đai lớn và nguồn nhân lực
2.1.3. Bảo quản in vitro
Đối týợng bảo quản in vitro:
- Vật liệu sinh sản vô tính (chuối, dứa, mít, khoai sọ, khoai lang…)
- Các loại cây có hạt recalcitrant - hạt khó bảo quản (xoài, mít, na, sầu riêng, nhãn,
vải và cây có múi…)
- Các vật liệu dùng để nhân nhanh phục vụ các chýõng trình chọn tạo và nhân
giống, hạt phấn và ngân hàng DNA…
2.1.3. Bảo quản in vitro
Gồm
Bảo quản ngắn hạn: Thực vật đýợc phát triển bình thýờng trong điều kiện vô
trùng của phòng thí nghiệm, vật liệu đýợc bảo quản để cung cấp cho các nhu cầu
chọn tạo giống và nghiên cứu của mỗi cõ sở.
Bảo quản trung hạn (bảo quản bằng sinh trýởng chậm) thì tốc độ sinh
trýởng của vật liệu đýợc làm giảm một cách đáng kể bằng cách giữ ở nhiệt độ ánh
sáng thấp hoặc giảm nồng độ oxy.
=> Cả 2 phýõng pháp này áp dụng cho vật liệu là: chồi, mô phân sinh và cây con.
2.1.3. Bảo quản in vitro
2.1.3. Bảo quản in vitro
- Bảo quản dài hạn: Bảo quản dài hạn là bảo quản trong hoặc trên bề mặt
nitõ lỏng (- 1760C đến - 196ºC), với điều kiện này mọi quá trình sống bị đình chỉ
hoàn toàn.
Đối týợng: mô sẹo, tế bào hạt phấn, phôi của một số loài thực vật…
2.2. Bảo tồn nội vi (bảo tồn tại chỗ, in-situ conservation)
Là bảo tồn nguồn gen trong môi trýờng sinh sống.
Đối týợng: bất kì thực vật nào, chủ yếu là các loài tổ tiên của cây trồng, các
loài hoang dại có quan hệ gần gũi với cây trồng.
Với 1 số giống địa phýõng đýợc hình thành do quá trình chọn lọc và trồng
trọt lâu đời tại 1 địa phýõng cũng có thể bảo quản tại chỗ trên đồng ruộng của nông
dân hoặc bảo quản dựa vào cộng đồng.
3. Các cách bảo quản nguồn gen thực vật in vitro
Đây là giải pháp công nghệ có triển vọng trong việc bảo quản nguồn gen thực
vật, nhất là với các cây nhân giống vô tính và cả hạt khó bảo quản có nhiệt độ và độ
ẩm thấp.
Trong vòng 20 năm gần đây, công nghệ này đã đýợc phát triển rộng và áp
dụng với hõn 1000 loài khác nhau (F.Engelmann, 1997).
Gồm:
+ Bảo quản sinh trýởng chậm
+ Biện pháp ngừng sinh trýởng tạm thời
3.1. Bảo quản sinh trýởng chậm
Gồm bảo quản ngắn hạn và trung hạn
Vật liệu thích hợp là chồi, mô phân sinh và cây con
Để giảm tốc độ sinh trýởng của cây trong ống nghiệm, ngýời ta đã thay đổi
một số yếu tố:
+ Hạ thấp nhiệt độ nuôi cấy, đýa thêm các chất ức chế sinh trýởng
+ Chất làm tăng áp suất thẩm thấu
+ Và làm nghèo thành phần dinh dýỡng trong môi trýờng nuôi cấy
Ýu điểm
Hạn chế khả năng mất nguồn gen, nhất là các nguồn gen có nguy cõ xói mòn
cao, các loài có nguy cõ bị tuyệt chủng
Với phýõng pháp bảo quản siêu lạnh có thể bảo quản đýợc lâu dài với số
lýợng lớn và độ ổn định
Khả năng tái tạo, phục hồi các nguồn gen đã biến mất trong tự nhiên
Hạn chế
Chýa có những đánh giá đầy đủ về mối týõng tác giữa yếu tố môi trýờng
(thành phần dinh dýỡng trong môi trýờng nuôi, nhiệt độ, chất ức chế sinh trýởng).
Có khả năng tạo ra biến dị Soma với tần số biến dị khác nhau và ít lặp lại
Chi phí bảo quản lớn, đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao và trang thiết bị hiện đại
Chýa xác định đýợc khoảng thời gian tối đa một cách an toàn trong quá
trình bảo quản bằng sinh trýởng chậm cho từng loài cây trồng
5. Khả nãng ứng dụng của bảo quản nguồn gen thực vật in vitro
Ngày nay ngýời ta phân biệt đýợc bốn nhóm đối týợng mà chúng có
thể bảo quản invitro có lợi
Nhóm vật liệu nuôi cấy bảo quản invitro bắt buộc bao gồm các nhân giống vô
tính, các loại cây có hạt recalcitrant…
Nhóm vật liệu bảo quản trong điều kiện invitro gồm các dòng độc nhất và
nguyên liệu đã đýợc làm sạch bệnh.
Vật liệu bảo quản invitro có thể có lợi trong từng thời điểm chẳng hạn nhân
nhanh một kiểu gen, phục vụ chýõng trình tạo giống hoặc khảo sát đánh giá trong
điều kiện invitro.
Vật liệu cần bảo quản invitro có liên quan đến kĩ thuật gen và sản xuất các
chất thứ cấp.
Ví dụ: Phýõng pháp bảo quản nguồn gen invitro đối với giống hoa Lilium x
formolongo
Đối týợng nghiên cứu: Lilium x formolongo
Phýõng pháp nghiên cứu:
- Thu thập mẫu
- Tách và nuôi cấy vảy củ
- Cấy chuyển và bảo quản nguồn gen
Môi trýờng nuôi cấy:
Trong thí nghiệm sử dụng môi trýờng vào mẫu là MS + 30g
saccarose/l + 6.5g agar/l, 1ml α NAA, pH là 5.7
Môi trýờng cấy chuyển: MS + 30g saccarose/l + 6.5g agar/l, pH là 5.7
Tiến hành:
Mẫu sau khi thu thập đýợc đýa về phòng thí nghiệm, tiến hành khử
trùng mẫu.
Hóa chất dùng để vô trùng : Clorua thủy ngân với nồng độ sử dụng là
0.1 – 1% (W/v) trong thời gian tử 10 – 15 phút
Sau khi mấu đýợc khử trùng, tiến hành vào mẫu
Thời gian từ khi vào mẫu tới khi cây ra rễ là 3 tuần
Cấy chuyển nhiều lần với môi trýờng MS + 30g saccarose/l + 6.5g
agar/l, pH là 5.7
Cấy chuyển tới khi cây đạt tiêu chuẩn nhất định, tăng nồng độ đýờng
tới 60g saccarorose + 6.5g agar/l, pH = 5.7
Kết quả:
Nhờ tăng nồng độ đýờng từ 30g/l đến 60g/l kết hợp với nhiệt độ phòng
nuôi thấp, thời gian và cýờng độ chiếu sáng thấp…, thời gian cấy chuyển giống
Lilium Formolongo đã tăng từ 4 tuần lên đến 10 tuần.
Vì protoplast thực chất là tế bào trần không có thành cho nên có thể tách được từ
nhiều nguồn khác nhau như các bộ phận của cây ( rễ, lá, hạt phấn), callus, tế bào đơn…
Xác định chất lượng tế bào trần
Sau khi phá vỏ tế bào vẫn có những mảnh thành tế bào còn xót lại làm ảnh hưởng
đến những nghiên cứu sau này
Cách tốt nhất để phát hiện thành tế bào là dùng calcofluor, một hóa chất sẽ bám
vào phân tử xenlulozo và gây ra phát ánh sáng huỳnh quang với màu xanh rực rỡ khi soi
dưới tia cực tím. Nếu các tế bào trần đã bị loại bỏ hoàn toàn thành tế bào hiển vi trường
có màu tối thẫm các tế bào trần sẽ không nhìn thấy được ngoại trừ sự tự phát ánh sáng
huỳnh quang đỏ của các lạp thể
Còn một phương pháp khác là dùng kính hiển vi huỳnh quang kết hợp với nhuộm xanh
Evan để xác định sức sống của tế bào trần. Những tế bào còn nguyên vẹn sẽ ngăn không
cho thuốc nhuộm xâm nhập vào nguyên sinh chất ngược lại các tế bào có màng sinh chất
bị mất chức năng sẽ bắt màu xanh và chúng không thể sinh trưởng được
5. Nuôi cấy tế bào trần
Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy
- Thành phần của môi trường nuôi cấy lỏng hay đặc tùy thuộc vào vật liệu thực
vật.Môi trường này có thêm Auxin và Xitokinin để giúp sự tái tạo vách và các lần phân
chia đầu tiên.
- Đảm bảo đủ các yếu tố dinh dưỡng: axit amin, polyamin, Hydrolysat Cazein, nước dừa,
mạch nha…
- Đảm bảo điều kiện nhiệt độ, PH, ánh sáng,áp suát thẩm thấu….
- Trong lần tự nhân đôi đầu tiên, môi trường phải có áp suất thẩm thấu cao,
Auxin, Xitikinin thích hợp, ánh sáng yếu. Sau đó cần giảm áp suất thẩm thấu bắng cách
pha loãng môi trường để giúp cho sự tăng trưởng tế bào.
Khi mô sẹo được hình thành cần chuyển chúng vào trong môi trường rắn chứa Auxin ở
nồng độ thấp hơn và Xitokinin cao hơn. Sau cùng kích thích ra rễ cần loại Xitokinin, tăng
nồng độ Auxin.
Nuôi cấy tế bào trần chia làm 2 giai đoạn
Giai đoạn 1
Từ tế bào trần tao thành tế bào, phân chia tạo thành microcallus.
Sau một thời gian nuôi cấy một đến hai tuần các tế bào trần tái tạo vỏ và phân
chia tạo nên các microcallus.
Điều kiện nuôi cấy
Nuôi trong môi trường lỏng lắc
Lớp nuôi trợ dưỡng: tế bào trần, lớp xốp có khả năng thấm từ dưới lên, callus từ
mô tế bào mà từ đó tách tế bào trần,agar.
Nuôi trong điều kiện ánh sáng yếu, nuôi tối.
Ánh sáng thẩm thấu đẳng trương.
Thời gian nuôi từ 1 đến 2 tuần.
Giai đoạn 2
Microcallus thành callus ổn định hình thành phát sinh cơ quan.
Chuyển các microcallus lên môi trường cứng, chúng sẽ tạo thành các mô sẹo. Từ
đó chuyển sang môi trường tái sinh chồi và cây hoàn chỉnh.
Điều kiện nuôi cấy.
Nuôi cấy trên môi trường đặc
Chú ý tới ánh sáng và quang chu kì
Có chất điều tiết sinh trưởng cho qua trình tái sinh cây
Loại bỏ chất gây ánh sáng thẩm thấu
Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của tế bào trần
Nuôi cấy tế bào trần thường yêu cầu 1 số thay đổi so với quy trình nuôi cấy mô
bình thường do bản chất của tế bào trần.
Các thay đổi thường liên quan đến sự điều chỉnh nồng độ muối vô cơ, thêm vào
các hợp chất hữu cơ, vitamin, đường để đảm bảo khả năng thẩm thấu và chất điều tiết
sinh trưởng để kích thích sự phân chia tế bào.
6. Dung hợp tế bào trần
Có thể nói việc dung hợp tế bào trần và tái sinh thành cây lai từ tế bào trần là 1
trong những thành tựu tuyệt vời của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào. Bằng phương pháp này
đẻ ra phương pháp lai xa giữa các loài điều mà không thể thực hiện bằng các phương
pháp lai hữu tính thông thường.
Tế bào trần là những tế bào không có thành tế bào. Chính vì thế chúng có thể hòa lẫn vào
nhau (dung hợp) và thành 1 tế bào lai mang trong mình vật chất di truyền của cả 2 tế bào.
Tế bào lai này được tái sinh và thành 1 cây lai. Quá trình này xảy ra ở tế bào nên
gọi là lai tế bào và thông qua tế bào soma nên gọi là lai soma hay lai vô tính tế bào
Sơ đồ chọn lọc các thể lai soma bằng cách ứng dụng sự mẫn cảm khác nhau của các
protoplast thịt lá đối với actinomycin D
Quá trình dung hợp sẽ được cải thiện hơn nếu xảy ra trong môi trường kiềm (pH
từ 8- 10) và khi có bổ sung CaCl2 (50-250 mM).
Sau khi xử lý bằng tác nhân dung hợp, các protoplast được nuôi cấy theo phương
thức chuẩn.
PEG có 2 tác dụng:
+ Cung cấp một câu nối để Ca2+ có thể liên kết các bề mặt màng với nhau
+ Dẫn đến sự rối loạn tích điện bề mặt màng trong suốt quá trình rửa giải.
Một ứng dụng đầy triển vọng khác của nuôi cấy tế bào trần là vi nhân giống thực vật. Sau
khi phân chia protoplast, thành tế bào được tái sinh để tăng sự phát triển callus và tiếp
theo là cây hoàn chỉnh nhờ đó thực vật có thể được nhân lên nhiều lần.
Nuôi cấy tế bào trần đòi hỏi sự sinh trưởng của protoplast trên môi trường đặc
hoặc lỏng. Từ đó các protoplast được phân lập có thể được sự dụng để:
Potrykus (1980) đã thảo luận rất kỹ về vấn đề này. Theo Potrykus có những chỉ
tiêu sau liên quan đến kết quả nuôi cấy và tái sinh từ protoplast tiềm lực in vitro.
1. Phân lập
- Cơ sở di truyền của tế bào (khả năng tiềm tàng của tế bào trong nuôi cấy in vitro).
- Tương tác tế bào trong cây.
- Sự phân hóa trong quá trình phát triển cơ thể.
- Nguồn gốc cơ quan và cây hoàn chỉnh.
- Trạng thái sinh lý của tế bào.
- Tác động của quá trình phân lập.
- Tác động của trạng thái phân lập.
2. Điều kiện nuôi cấy
- Nhu cầu dinh dưỡng.
- Nhu cầu về phytohormone.
- Điều kiện vật lý của nuôi cấy.
- Các yếu tố ức chế có thể xuất hiện.
- Tác động của mật độ quần thể tế bào
3. Sự phân bào
- Sinh tổng hợp thành tế bào.
- Điều khiển sinh tổng hợp thành tế bào.
- Chức năng của thành tế bào đối với phân bào.
- Điều khiển sự phản phân bào.
- Điều khiển sự phân chia nhân.
- Điều khiển phân bào.
4. Sự phân hoá
- Điều khiển phân hóa tế bào.
- Tương tác tế bào trong nuôi cấy.
- Điều khiển và cơ chế tạo kiểu mô.
- Điều khiển quá trình tạo cơ quan, phôi.
9. Quy trình cụ thể minh họa việc nuôi cấy và dung hợp tế bào trần
Quy trình nuôi cấy Protolast từ lá của cây thuốc lá.
9.1. Nguyên liệu thực vật
Lá cây:
Lá là nguồn nguyên liệu thông dụng và truyền thống cho kĩ thuật protoplast thực vật do
nó cho phép phân lập được một số lớn các tế bào tương đối đồng nhất.
Loại bỏ phần dịch nổi phía trên, tái huyền phù tiểu thể bằng 10ml dung dịch
tách (PI + 20% sucrose), thêm 1ml dung dịch rửa lên trên bề mặt dung dịch tách và
protoplast sao cho không làm hòa lẫn hai dung dịch, tốt nhất là tạo thành hai pha (nhỏ từ
từ dung dịch rửa bên thành tube tránh bắn tung toé lên dịch rửa bên dưới), ly tâm 50×g
trong 10 phút. Các protoplast sống sót sẽ nằm ở trên bề mặt dung dịch .
Dùng micropipette hút lớp protplast màu xanh lục nổi trên tube ly tâm và chuyển
nó sang một tube ly tâm sạch, thêm 10 ml dung dịch rửa và ly tâm lại. Protoplast sẽ lắng
xuống đáy tube và có dạng viên.
Rửa protoplast thêm một lần nữa trong 10 ml dung dịch rửa. Loại bỏ phần nổi trên
mặt và tái huyền phù protoplast trong khoảng chừng 1 ml môi trường nuôi cấy protoplast
(PC).
Đặt một giọt protoplast trên buồng đếm hồng cầu và ước lượng mật độ protoplast
(số lượng tế bào/số ô đếm ×10.000). Nuôi cấy protoplast bằng cách pha loãng 50.000 tế
bào/ml môi trường nuôi cấy protoplast và chuyển sang một đĩa petri vô trùng.
Bọc lại, ghi nhãn và nuôi cấy qua đêm trong tối ở 28oC.
Ngày thứ ba
Chuyển sang nuôi cấy ở ánh sáng yếu (10-20 µmol.sec/m2 hoặc bọc một lớp vải
thưa dưới đèn hùynh quang ánh sáng trắng, với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ, nuôi trong 2
ngày.
Ngày thứ năm
Chuyển sang nuôi cấy ở cường độ ánh sáng cao hơn (50-75 µmol/sec/m2) trong 2
ngày bằng cách bỏ lớp vải thưa ra.
Ngày thứ bảy
Ta có được kết quả của việc nuôi cấy protoplast, số tế bào phân chia từ tổng số tế
bào nuôi cấy ban đầu, trong một mẫu có 100-200 protoplast nuôi cấy. Có dấu hiệu của sự
nhiễm bẩn không.
KẾT LUẬN
Kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần đã bắt đầu được ứng dụng rộng rãi để
tạo ra các cây trồng mới hoặc có sản lượng hay chất lượng cao hơn, hoặc là có thêm khả
năng kháng bệnh. Việc giới thiệu về quy trình sử dụng enzyme để cô lập tế bào trần thực
vật (Cooking 1960) đã đưa ra một bộ mặt mới đầy hứa hẹn cho tế bào thực vật và nuôi
cấy mô, mở ra một lĩnh vực mới trong sinh học tế bào thực vật. Điều làm cho tế bào trần
có tác động mạnh như một hệ thống thí nghiệm đó là hệ enzyme phân hủy vách tế bào
làm lộ ra bề mặt màng tế bào như là một rào cản giữa môi trường bên ngoài và thành
phần bên trong tế bào. Sự tiếp cận đến màng sinh chất có ý nghĩa là thí nghiệm có thể
được thiết lập để nghiên cứu và thao tác trên các thuộc tính của màng tế bào điều mà
không thể thực hiện được khi bị bao phủ bởi vách tế bào. Tế bào trần được sử dụng rộng
rãi trong nhiều lĩnh vực thí nghiệm từ nghiên cứu những tính chất vật lý của màng sinh
chất (Ruesink 1973) đến những nghiên cứu nhập bào và hấp thu các phần tử (Willison et
al. 1971), các bào quan (Potrykus 1975) và vi sinh vật (Davey và Power 1975).
II.4.1. Thụ phấn bằng phýõng pháp cắt ngắn vòi nhụy
Là phýõng pháp dễ và hiệu quả. Núm nhụy và 1 phần hoặc toàn bộ vòi nhụy của
hoa đýợc cắt ngắn, sau đó hạt phấn của cây bố đýợc thụ trực tiếp lên vòi nhụy đã cắt ngắn
và kết quả là có rất nhiều ống phấn đã kéo dài đýợc tới bầu nhụy.
Nhýợc điểm: số lýợng hạt trong 1 quả ít. Có thể do ống phấn gặp khó khăn trong
khi đâm xuyên qua vách bầu.
II.4.2. Thụ phấn bằng phýõng pháp ghép vòi nhụy
Hạt phấn cần thụ đýợc “gửi” trên 1 núm nhụy thích hợp và nảy mầm, 1 ngày sau
vòi nhụy và 1/3 bầu của hoa chứa hạt phấn đýợc cắt và ghép lên 3/4 bầu nhụy của hoa
cây mẹ cần thụ phấn.
Theo Vantuyl và cộng sự(1991) thì một ngày sau khi “gửi” hạt phấn vòi nhụy
đýợc cắt ngắn cách trên bầu 1-2mm và đýợc gắn lên bầu nhụy của hoa cây mẹ. Bầu và
vòi nhụy ngoài đồng ruộng đýợc kết hợp với nhau = ống nối còn trong invitro chỉ cần sử
dụng agar để cố định là đủ.
II.4.3. Thụ phấn cho giá noãn
Bầu đýợc cắt theo chiều dọc thành nhiều miếng vào ngày núm nhụy tiết ra dịch
nhầy hoặc 1-2 ngày sau đó. Mỗi 1 miếng sẽ chứa 1 giá noãn và 1 hàng noãn, có thể để lại
hoặc không để lại vách bầu. Một lýợng lớn hạt phấn cần thụ đýợc đặt theo giá noãn. Để
kích thích hạt phấn nảy mầm và đâm xuyên vào noãn có thể đặt vào môi trýờng nuôi cấy
1 hay 2 vòi nhụy.
Có thể nuôi cấy ngoài sáng hay trong tối. Noãn nảy mầm sau 5-7 tuần thụ phấn và
tiếp tục đýợc thụ phấn
Thụ phấn bên trong bầu (intraovarian pollionation): cả vòi nhụy hoặc 1 phần của
nó có thể đýợc tách ra và hạt phấn hoặc đýợc đặt trên bề mặt vết cắt bầu quả hoặc chuyển
qua lỗ trên thành vòi nhụy đến bầu quả
III. Kỹ thuật cứu phôi
Mục đích
Nuôi cấy phôi hữu tính
Các yếu tố ảnh hýởng
Ứng dụng
III.1. Mục đích
Khắc phục sự bất hợp sau thụ tinh.
Khắc phục sự bất hợp giữa nội nhũ và phôi khi lai xa.
Tạo cây đõn bội (lúa mì x ngô, lúa mỳ x yến mạch dẫn đến sự loại bỏ một bộ
nhiễm sắc thể).
Ngăn ngừa sự thui chột phôi ở những loại quả hạch chín (đào, mận, mõ…).
Phá ngủ nghỉ, rút ngắn chu kỳ tạo giống…
III.2. Nuôi cấy phôi hữu tính
Sự phát sinh phôi hữu tính:
-Xảy ra quá trình thụ tinh giữa hạt phấn và noãn hình thành hợp tử
-Hợp tử trải qua quá trình nguyên phân liên tiếp tạo thành phôi
Nuôi cấy phôi hữu tính gồm
-Tách phôi
-Nuôi cấy phôi để tạo cây.
III.2.1. Tách phôi
Phôi hữu tính đýợc hình thành trong môi trýờng vô trùng của noãn và mô bầu
hoa.
-Ở một số loài phôi có kích thýớc lớn, thuận tiện cho quá trình tách phôi (cây họ
đậu), nhýng một số loài hoa khó tách phôi (hoa lan_hạt có kích thýớc nhỏ, vỏ hạt tiêu
giảm và thiếu nội nhũ)
-Ở thực vật hoa dạng chùm, mô non thýờng xếp ở đỉnh của chùm hoa
Trong quá trình thu nhận phôi cần hạn chế sự tổn thýõng của dây treo phôi. Dây
treo phôi có kích thýớc nhỏ và cấu trúc mỏng manh nên khó tách nó nguyên vẹn cùng với
phôi để đýa vào nuôi cấy. Không có dây treo phôi làm giảm đáng kể tỉ lệ hình thành cây
con từ nuôi cấy phôi non
III.2.2. Thành phần môi trýờng nuôi cấy
Sau khi tách từ hạt phôi đýợc nuôi cấy trong môi trýờng chứa:
Muối khoáng
Chất điều hoà sinh trýởng
Nguồn carbon
Aminoaxit và thành phần hữu cõ phức hợp
Muối khoáng
Môi trýờng với hàm lýợng cao các ion K+, Ca2+ đảm bảo cho tỷ lệ sống cao của
phôi và khả năng thúc đẩy sinh trýởng tốt đối với phôi của một số loài thực vật.
Chất điều hoà sinh trýởng
Auxin và cytokinin không đýợc sử dụng nhiều trong nuôi cấy phôi do chúng cảm
ứng tạo callus.
Ở nông độ rất thấp (0.01 mg/ l) GA3 kích thích sự nảy mầm sớm của phôi.
Nguồn carbon
Đýờng: là thành phần không thể thiếu trong mọi môi trýờng nuôi cấy, vì nó
là nguồn cung cấp Cacbon chủ yếu. Trong nhiều trýờng hợp đýờng sucrose cho kết
quả tốt hõn các đýờng khác. Nồng độ sucrose có thể dùng từ 0.5% đến 18%.
Glucose và sucrose ngoài vai trò dinh dýỡng, còn có khả năng duy trì áp suất
thẩm thấu của môi trýờng. Phôi trýởng thành sinh trýởng khá tốt ở nồng độ thấp
nhýng phôi non đòi hỏi nồng độ sucarose cao hõn.
Aminoaxit và thành phần hữu cõ phức hợp
Glutamin là a.a hiệu quả nhất đối với nuôi cấy phôi nhiều loài thực vật.
Cazein thuỷ phân(CH) (Ziebur & Brink, 1951) là hỗn hợp các a.a đýợc sử dụng
rộng rãi trong nuôi cấy phôi. Làm tăng kích thýớc và tỷ lệ phân hoá phôi.
Ngoài ra một số chất tự nhiên nhý nýớc dừa (Overbeek, 1942), nýớc chiết malt
(Blackeslee & Satina, 1944), là những chất mà khi đýợc bổ sung vào môi trýờng nuôi cấy
sẽ đem lại hiệu quả cao hõn… vì trong các chất này có chứa nhiều vitamin, DNA, RNA,
và một số chất điều tiết sinh trýởng khác
III.3. Các yếu tố ảnh hýởng
pH môi trýờng
Nhiệt độ
Ánh sáng
III.3.1. pH môi trýờng
Các phôi tách rời sinh trýởng tốt trên môi trýờng có pH 5.0-7.5
Đây là phạm vi pH của dịch noãn (6.0)
III.3.2. Nhiệt độ
25±2°C thích hợp cho sinh trýởng và nảy mầm của phôi.
Nhiệt độ tối ýu cho nuôi cấy phôi có thể khác nhau giữa các genotype trong cùng
1 loài
VD: Loài Zamia, Phaseolus, bông: 27-30°C
Loài lai Brassica, lúa, lúa mạch: 17-22°C
III.3.3. Ánh sáng
Khi nuôi cấy phôi chýa trýởng thành của lúa mạch, lanh, các cá thể loài lai Allium
tiến hành trong tối trýớc khi chuyển sang điều kiện sáng để nảy mầm.
III.4. Ứng dụng của nuôi cấy phôi hữu tính
Thu nhận thể đõn bội
Kiểm tra nhanh sức nảy mầm của hạt
Nhân giống các cây hiếm
Thụ phấn trong ống nghiệm
III.4.1. Thu nhận thể đõn bội Nuôi cấy phôi hữu tính để thu nhận các thể
đõn bội thông qua quá trình loại bỏ trực tiếp NST sau khi lai xa. Tổ hợp giữa hai loài
càng khác xa nhau thì sự đào thải hoàn toàn NST đõn bội của một loài càng dễ xảy ra
-Hoa mẹ: giữ toàn bộ cõ quan sinh sản cái: bầu nhụy, vòi nhụy và núm nhụy. Chúng đýợc
đạt đứng thẳng trong ống nghiệm hoặc bình, trên nền môi trýờng thụ phấn
Thụ phấn invitro: có thể sử dụng
- Kỹ thuật thụ phấn cắt vòi nhụy: cắt hết vòi nhụy hạt phấn đýợc thụ ngay tại điểm cắt.
- Kỹ thuật ghép vòi nhụy: Hạt phấn bố đýợc thụ trên đầu núm nhụy của hoa bố, 1 ngày
sau vòi nhụy của bố đã thụ phấn đýợc cắt phía trên bầu 2mm và gắn vào bầu nhụy nhờ 1
miếng agar.
- Kỹ thuât thụ phấn giá noãn: Hạt phấn bố đýợc thu trực tiếp vào hàng giá noãn đýợc
tách từ bầu hoa mẹ.
IV.1.2. Thí nghiệm cứu phôi
Sau khi thụ phấn invitro cho các tổ hợp, tiến hành cứu phôi vào các thời điểm
khác nhau bằng kỹ thuật nuôi cấy lát cắt bầu nhụy. Quả đýợc cắt thành những lát mỏng
thành 2-3mm và nuôi cấy trên môi trýờng trên môi trýờng lát cắt bầu nhụy: MS bổ sung
thêm 1mg/l α -NAA và 90g/l sucrose.
H ạt đý ợc hình thành v ới t ỉ l ệ phôi trong h ạt cao. Sau đó phát tri ển thành cây
hoàn ch ỉnh.
IV.2. Thí nghiệm cứu phôi hữu tính khoai tây
1. Thu hái các quả khoai tây trýởng thành, khi quả còn màu xanh, khoảng 21 đến 28 ngày
sau khi thụ phấn
2. Khử trùng bề mặt quả bằng etanol 90% trong 30s
3. Ngâm quả trong hỗn hợp dung dịch hypoclorit canxi 5% và nýớc cất vô trùng trong 15
phút
4. Trong tủ cấy vô trùng, tiến hành tách hạt từ quả và chuyển sang đĩa petri
5. Bóc vỏ hạt và tách rời phôi
6. Cấy phôi vào đĩa petri đã chứa sẵn môi trýờng dinh dýỡng và nuôi ở nhiệt độ từ 18-
22ºC với ánh sáng yếu
7. Các phôi được tách tốt từ hạt sẽ phát triển dần thành cây khoai tây con sau đó có thể
chuyển ra trồng trong vườn ươm
Nhìn chung, nguồn gen khai thác từ các loài lily là vô cùng đa dạng, tạo điều kiện
thuận lợi cho quá trình chọn tạo giống. Việc phát triển các phýõng pháp thụ phấn và cứu
phôi thích hợp sẽ là công cụ hữu ích tạo ra nhiều giống mới với nhiều đặc tính quý.
“Biến dị dòng tế bào soma trong quá trình nuôi cấy invitro”
I. Một số khái niệm về biến dị dòng soma
Biến dị
Biến dị tế bào soma
So sánh biến dị dòng soma với đột biến
II. Phân loại biến dị dòng soma
Biến dị kiểu gen
Biến dị kiểu hình
Ví dụ:
1. Với Cây mía đýờng (Saccharum officinarum) ngýời ta đã chọn đýợc các
cây kháng bệnh mốc sýőng (downey mildew), bệnh Fiji (do virus apid – transmitted) trên
giống mía Pindar, hoặc cải thiện một số giá trị nông học của giống mía Q10 kháng bệnh
dốm mắt. (Do Helminthosporium sacchari).
2. Với cây khoai tây.
Shepard và cộng sự (1980) đã tái sinh một số lớn cây từ protoplast tế bào
thịt lá của giống “Russet burbank” và thông báo các biến dị thu được trong quần thể
protoclones. Một trong số chúng kháng được bệnh thối sớm (early bright do Alternaria
solani) hoặc thối muộn (late bright do phytophthora infestans)
3. Với cây cà chua
Evan và cs đã phân lập các dòng soma của cà chua bằng các biến dị hình
thái là các đột biến lặn của tính bất dục kháng nấm Fusarium oxysporium ở mắt cuống lá,
khả năng lục hóa của lá, màu sặc của quả và hoa.
Theo phýőng pháp này các dòng tế bào biến dị đýợc sàng lọc từ nuôi cấy nhờ vào
khả năng sống sót của chúng khi có mặt các độc tố/chất ức chế trong môi trýờng dinh
dýỡng, hoặc dýới các điều kiện stress của môi trýờng. Các biến dị có thể thu đýợc bằng
cách chọn lọc trực tiếp, gián tiếp. Sự phân lập đýợc tiến hành trong nuôi cấy dịch huyền
phù hoặc bằng cách dàn trải tế bào đőn/protoplast.
Các hýớng chọn lọc bao gồm:
7.2.2.1. Chọn lọc dòng kháng bệnh
Sử dụng các yếu tố chọn lọc nhý phytotoxin để chọn lọc khả năng kháng với nấm,
vi khuẩn hoặc virus.
Tuy nhiên, lại kéo theo những đặc tính không mong muốn khác. Ví dụ chọn lọc
liên tiếp với một phytotoxin làm cho khoai tây kháng bệnh nhýng củ khoai nhỏ đi và chất
lýợng dinh dýỡng của củ khoai kem hőn
Thông thýờng ngýời ta sử dụng trực tiếp nấm, vi khuẩn làm yếu tố chọn lọc để
phát hiện dòng tế bào soma kháng bệnh, từ các dòng này tạo ra các cây kháng bệnh týőng
ứng.
7.2.2.2. Chọn dòng kháng thuốc diệt cỏ
Nuôi cấy Protoplast trên môi trýờng có các chất diệt cỏ khác nhau đã cảm ứng đột
biến tạo ra các dòng tế bào chống chịu sau đó đã tái sinh thành cây
7.2.2.3. Chọn dòng chống chịu với các stress của môi trường
Nhiều vùng có độ mặn, phèn, kim loại nặng khá cao kìm hãm sự phát triển của
cây trồng Cần tạo các dòng chống chịu.Đã tái sinh thành công cây thuốc lá kháng
NaCl và nhiều dòng tế bào của nhiều giống cây trồng khác nhau có thể chống chịu nồng
độ muối cao.
Đã tạo các dòng chịu lạnh bằng cách nuôi cấy tế bào của cây Nicotiana sylvestris
trong điều kiện nhiệt dộ thấp.
Một số hướng chọn lọc quan trọng khác
Chọn dòng kháng kháng sinh
Chọn dòng kháng các đồng đẳng base của DNA
Chọn dòng kháng các acid amin đặc hiệu
Chọn dòng sản sinh các sản phẩm thứ cấp
Một số thành tựu
Giống lúa CR203 có nhiều gen quý như tính chống chịu rầy nâu Biotip 1
và 2, tính thích ứng rộng, năng suất ổn định và phẩm chất gạo khá..
Một số thành tựu
Giống lúa DR2 ( năm 2000 ) được tạo ra từ dòng tế bào
biến bị xôma của giống lúa CR203, dòng này được tách
và tái sinh thành cây. Giống lúa DR2 có độ đồng đều rất
cao, chịu khô hạn tốt, năng suất trung bình đạt 45-50 tạ/ha
Một số thành tựu
Giống lúa CM64 có nguồn gốc từ IR64, do Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu
Long cải tiến thông qua công nghệ sinh học nuôi cấy mô, tạo biến dị tế bào soma. Tên
gốc của nó là OM3005-6
Trong tổng số 12654 cây bầu đen liều 5 Krad, thế hệ M1V4 có 1654 cây đột biến , tần số
đột biến là 0,13. Ở đây ta thấy đột biến lá bạch tạng thấp nhất, có 112 cây, đạt tần số
0,009; đột biến lá xẻ thùy cao nhất, có 204 cây, đạt tần số 0,016. qua theo dõi quần thể
đột biến của giống bầu đen chiếu xạ liều 5 Krad, chúng tôi nhận thấy 3 dòng thấp cây:
B16, B17 và B18 có tiềm năng năng suất rất tốt
♣ Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp các tế bào đõn, các cụm tế bào,
các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết.
IV. ĐẶC TRÝNG CỦA TẾ BÀO TRONG
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ
♣ Mức độ tách rời của các tế bào phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và
có thể đýợc điều chỉnh bởi thành phần môi trýờng.
VD: trong nhiều trýờng hợp, tăng tỷ lệ Auxin/Cytokinin sẽ sản sinh nhiều khối tế
bào xốp.
♣ Theo King và Street (1977), không có một quy trình chuẩn nào cho nuôi cấy huyền
phù tế bào.
IV. ĐẶC TRÝNG CỦA TẾ BÀO TRONG
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ
♣ Sinh trýởng và phát triển của tế bào nuôi cấy:
Pha lag: bắt đầu khi đýa mô sẹo vào môi trýờng, kéo dài cho tới lần phân bào đầu
tiên.
Pha tăng tốc: các tế bào bắt đầu phân chia và số lýợng tế bào tăng dần.
Pha hàm số mũ: số lýợng tế bào tăng theo hàm số mũ.
Pha ổn định: số lýợng tế bào đạt cực đại và không đổi theo thời gian, số tế bào
sinh ra (do phân bào) xấp xỉ số tế bào chết đi.
IV. ĐẶC TRÝNG CỦA TẾ BÀO TRONG
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ
IV. ĐẶC TRÝNG CỦA TẾ BÀO TRONG
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ
♣ Để duy trì quá trình nuôi cấy, các tế bào cần đýợc cấy truyền vào giai đoạn sớm
của pha ổn định.
Thời điểm cấy truyền cụ thể dựa vào kinh nghiệm, nói chung là nên bắt đầu khi
mật độ tế bào cực đại.
Mật độ tế bào cực đại trong khoảng 18 – 25 ngày, với huyền phù sinh trýởng
mạnh có thể ngắn hõn, từ 6 – 9 ngày.
IV. ĐẶC TRÝNG CỦA TẾ BÀO TRONG
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ
♣ Ở lần cấy truyền đầu tiên, dịch nuôi cần đýợc lọc nhằm loại bỏ cụm tế bào lớn,
các mảnh từ mẫu cấy ban đầu, sau đó dùng pipet để lấy dịch cấy truyền.
♣ Lýợng tế bào đem cấy truyền phải đủ lớn để đảm bảo mật độ tế bào, vì khi thấp
quá các tế bào sẽ không sinh trýởng đýợc.
VD: đối với tế bào cây sung dâu (Acer pseudoplatanus) mật độ thích hợp 9 –
3
15.10 tb/ml.
IV. ĐẶC TRÝNG CỦA TẾ BÀO TRONG
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ
♠ Theo King (1980), những tế bào trải qua quá trình nuôi cấy, sinh trýởng và trao
đổi chất trong dịch huyền phù gọi là dòng tế bào. Đặc điểm của dòng tế bào:
Khả năng tách tế bào cao.
Hình thái tế bào đồng nhất.
Nhân rõ ràng và tế bào chất đậm đặc.
Nhiều hạt tinh bột.
IV. ĐẶC TRÝNG CỦA TẾ BÀO TRONG
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ
Týõng đối ít các yếu tố mạch.
Có khả năng nhân đôi trong 24 – 72h.
Mất tính toàn năng.
Quen với chất sinh trýởng.
Tăng mức đa bội thể.
V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ
SINH TRÝỞNG
5.1. Số lýợng tế bào
♣ Trýớc khi đếm, xử lý những cụm tế bào qua acid chromic, đun nóng 700C trong 5
– 10 phút, sau đó làm nguội và lắc mạnh trong vài phút.
♣ Pha loãng dịch, nhuộm và đếm trên buồng đếm hồng cầu.
♣ Kết quả: số lýợng tế bào/ml dung dịch nuôi cấy.
V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ
SINH TRÝỞNG
5.2. Thể tích tế bào
♣ Lấy ngẫu nhiên một thể tích dịch nuôi cấy, đem ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút
trong thời gian 5 phút.
♣ Thu tế bào và đem xác định thể tích.
♣ Kết quả:
Số ml tế bào/thể tích môi trýờng nuôi cấy.
Tỷ lệ %.
V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ
SINH TRÝỞNG
5.3. Khối lýợng týõi và khối lýợng khô tế bào
♣ Khối lýợng týõi:
Thu thập tế bào trong một thể tích dịch xác định.
Rửa bằng nýớc cất vô trùng
Làm khô trong chân không.
Cân để xác định khối lýợng.
♣ Khối lýợng khô:
Lấy một thể tích mẫu xác định.
Loại bỏ phần nổi, rửa phần tế bào trên giấy lọc Whatman.
Sấy khô trong 12h ở 800C đến khối lýợng không đổi.
V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ
SINH TRÝỞNG
5.4. Xác định thành phần Protein
♣ Thu thập tế bào, chuyển lên lọc qua giấy Whatman.
♣ Rửa tế bào trong ethanol 70% đang sôi.
♣ Làm khô với Aceton rồi chuyển vào dung dịch NaOH 1M.
♣ Đun nóng đến 850C trong 1.5h.
♣ Lọc và xác định Protein thủy phân trong dịch theo phýõng pháp Lowry và cs
(1951).
V. CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ
SINH TRÝỞNG
5.5. Xác định chỉ số nguyên phân
♣ Huyền phù tế bào đýợc cố định trong hỗn hợp Aceto-orcein : Acid Acetic (3:1)
sau đó chuyển sang lam kính.
♣ Nhỏ 1 giọt Aceto-orcein lên mẫu, hõ trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội trong 5
phút.
♣ Đậy mẫu bằng Lamel, làm khô mẫu, quan sát dýới kính hiển vi quang học ở vật
kính 100.
♣ Xác định các kỳ trong khoảng 1000 tế bào.
♣ Tỷ lệ % các tế bào đang phân bào gọi là chỉ số nguyên phân.
VI. ỨNG DỤNG
6.1. Sản xuất sinh khối tế bào và
các hợp chất thứ cấp
♣ Sản phẩm của nuôi cấy huyền phù tế bào thýờng đặc trýng là những chất có giá trị
cao và cần ở lýợng nhỏ.
♣ Có thể chia thành các nhóm dựa theo công dụng:
Hợp chất thứ cấp trong y học.
Hợp chất thứ cấp trong hóa mỹ phẩm.
Hợp chất thứ cấp trong công nghiệp.
VI. ỨNG DỤNG
♣ Tại sao phải nuôi cấy huyền phù tế bào thu sinh khối?
Tàn phá môi trýờng và sự xói mòn di truyền.
Sự cung cấp nguồn nguyên liệu không đều đặn, không vững chắc, chất lýợng
không ổn định.
Nhiễm bẩn do thuốc trừ sâu, bệnh hại, chất phóng xạ hay kim loại nặng …
♣ Nuôi cấy huyền phù tế bào khắc phục đýợc các nhýợc điểm trên.
VI. ỨNG DỤNG
Ngoài ra, nuôi cấy huyền phù tế bào còn có một số ýu điểm sau:
Sản xuất một cách có định hýớng, theo quy mô công nghiệp, khối lýợng sản phẩm
lớn, không phụ thuộc vào mùa vụ.
Tỷ lệ % khối lýợng khô các hợp chất thứ cấp cao hõn so với nguyên liệu thực vật
thu hái trong tự nhiên.
Không tốn nhiều diện tích gieo trồng.
Thu sinh khối tế bào lớn trong thời gian ngắn.
Tuy nhiên, do những khó khăn trong việc tìm kiếm tài liệu nên nhóm chúng em không
đýa ra đýợc một quy trình sản xuất dựa trên nuôi cấy huyền phù tế bào, mà chỉ đýa ra
đýợc một công trình nghiên cứu ở giai đoạn đầu:
VII. CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
ẢNH HÝỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRÝỞNG THỰC VẬT VÀ
ĐÝỜNG SACCHAROSE LÊN DỊCH
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO
DỪA CẠN CATHARANTHUS ROSEUS
Tác giả:
Bùi Văn Lệ, Trýờng Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
Nguyễn Ngọc Hồng, Trýờng Đại học Bán công Tôn Đức Thắng
• Trong những năm gần đây, Việt Nam đã thành công trong những quy trình áp
dụng các phýõng pháp của nuôi cấy huyền phù tế bào để sản xuất ra các chế phẩm sinh
học, y học …
Vidarabine
• có hoạt tính chống virus herpes, poxviruses, rhabdoviruses, hepadnarviruses
• can thiệp vào sự tổng hợp của DNA của virus
• týõng tự nucleoside, đýợc phosphoryl hoá tạo ara-ATP cạnh tranh với dATP trong
quá trình tổng hợp DNA của virus
2.2.4. Vi ghép
- Là kỹ thuật ghép các mô phân sinh đỉnh lên cây gốc sạch và kháng bệnh trong điều kiện
in vitro để sản xuất cây sạch virus.
- Kỹ thuật này thýờng sử dụng với các cây thân gỗ, đặc biệt là họ cam, chanh vì meristem
của chúng không thể sinh trýởng và tái sinh chồi khi nuôi cấy trực tiếp trên môi trýờng
nhân tạo.
2.3. Nhân nhanh và duy trì tình trạng sạch bệnh.
1. Cây trồng nên đýợc trồng trong nhà cách ly (nhà màn, nhà kính) không chứa các nguồn
bệnh và các vector truyền bệnh hay ở tự nhiên không có các mang virus.
2. Cần loại trừ thýờng xuyên các nguồn lây nhiễm, cần phòng trừ các vật mang bệnh (côn
trùng, tuyến trùng…).
2.3. Nhân nhanh và duy trì tình trạng sạch bệnh.
3. Phòng tránh sự lây nhiễm cõ giới trong quá trình chăm sóc cây trồng
4. Thýờng xuyên chọn lọc, có thể bằng mắt và qua các phân tích chẩn đoán
5. Để hoàn toàn chắc chắn, nên duy trì vật liệu sạch bệnh invitro.
3. Các phýõng pháp chẩn đoán bệnh virus
• Chẩn đoán bằng mắt.
• Phýõng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử.
• Chẩn đoán bằng cây chỉ thị.
• Phýõng pháp huyết thanh.
• Phýõng pháp kính hiển vi điện tử.
• Phýõng pháp ELISA.
• Phýõng pháp phân tích DNA.
3.1. Phýõng pháp chuẩn đoán bằng mắt
Đây là các phýõng pháp chẩn đoán dựa trên các triệu chứng bệnh của cây.
Ýu điểm:
Đõn giản, ít tốn kém.
Nhýợc điểm:
• Phải có kinh nghiệm không dễ lẫn với các triệu chứng khác không phải là bệnh
• Phýõng pháp này gặp khó khăn khi cây bị nhiễm tổ hợp virus.
• Phụ thuộc vào ngoại cảnh, tuổi cây, đặc điểm của giống.
3.2. Chuẩn đoán bằng cây chỉ thị
• Cây chỉ thị là cây khi bị nhiễm virus sẽ xuất hiện các triệu chứng đặc trýng.
Phýõng pháp này đã đýợc tiến hành từ những năm 1940.
• Phýõng pháp thử bằng cây chỉ thị luôn đýợc coi là phýõng pháp xác định đầu tiên
và cũng là phýõng pháp nhạy cảm nhất, tuy nhiên kết quả xét nghiệm cũng còn phụ thuộc
các yếu tố khác nữa.
3.2. Chuẩn đoán bằng cây chỉ thị
Ýu điểm:
Nhạy và chính xác có thể phát hiện ở nồng độ virus thấp.
Nhýợc điểm:
• Thời gian chẩn đoán dài, cần quá trình ủ bệnh.
• Phụ thuộc vào điều kiện thí nghiệm.
• Phýõng pháp lây nhiễm phức tạp.
• Tốn công chăm sóc cây chỉ thị, môi giới truyền bệnh, chi phí đầu tý cao.
• Một số bệnh virus không tiến hành đýợc
3.3. Chuẩn đoán bằng kính hiển vi
Kính hiển vi điện tử đã mang lại những kết quả đáng tin cậy đối với xét nghiệm hàng
loạt.
Ýu điểm:
• Chính xác, tin cậy.
• Đõn giản, nhanh chóng.
Nhýợc điểm:
• Chi phí cao số lýợng mẫu hạn chế.
• Loại virus đýợc chứng minh cũng chỉ là loại hình đũa và hình sợi. Nếu virus tồn
tại dạng cầu thì rất khó phát hiện vì nó khá giống các cõ quan tử của tế bào thực vật bình
thýờng.
3.4. Phýõng pháp huyết thanh
Ýu điểm :
• Tính đặc hiệu cao xác minh nhanh sự tồn tại của virus và phân loại chúng. Kết
quả thu đýợc chậm nhất là sau 48 giờ.
• Chi phí cho xét nghiệm thấp.
• Độ chính xác cao.
Nhýợc điểm:
• Chýa sản xuất đýợc kháng thể đối với tất cả các loài virus và kể cả khi có huyết
thanh rồi cũng chýa có thể nói rằng kết quả xét nghiệm hoàn toàn bảo đảm.
• Không thể xác minh đýợc đặc tính gây bệnh của từng loài virus đối với thực vật
chủ
Có nhiều phýõng pháp huyết thanh khác nhau đã đýợc ứng dụng phýõng pháp kết
tủa giọt, xét nghiệm khuyếch tán agar gel hai chiều, xét nghiệm latex,xét nghiệm miễn
dịch hýớng tâm...
3.5. Phýõng pháp ELISA ( Enzymed linked immuno sorbent assay)
• Enguall-Permann đề xuất năm 1971-1972 cho lĩnh vực nhân y.
• Clarkm, Adams, Barbara (1976) đề xuất cho chuẩn đoán bệnh virus thực vật.
Nguyên lý chung:
Dựa vào phản ứng kháng nguyên – kháng thể nhýng ở đây kháng thể đýợc liên kết với
một enzyme (enzymed linked). Phức kháng nguyên – kháng thể - enzyme dễ dàng nhận
biết màu do chính enzyme đó xúc tác.
3.5. Phýõng pháp ELISA
• Enzym thông dụng là phosphataza kiềm.
• Cõ chất của phản ứng là 4- nitrophenylphophat. Khi bị tách phosphat sẽ thành α-
nitro phenol có màu vàng.
• Ýu điểm:
- Mỗi enzyme xúc tác cho hàng ngàn phân tử cõ chất nên tín hiệu đýợc khuếch đại
rất rõ.
- Có thể định tính, định lýợng.
• - Takayama và Miasawa là những người đầu tiên sử dụng bioreactor vào nhân
giống cây trồng: nhân củ siêu nhỏ khoai tây, củ giống hoa ly, hoa lan hồ điệp.
• - Công nghệ này cho phép nhân nhanh vô hạn các giống cây trồng nhờ thiết bị
bioreactor hoàn toàn tự động hóa.
• VD: 1 bioreactor vibro-mixer trang bị với các ống silicone có khả năng sản xuất
100.000 phôi vô tính của cây trạng nguyên trong 1lit dịch huyền phù nếu như dung dịch
đó được đặt trên 1tấm giấy lọc và phát triển trong 4tuần.
Bioreactor sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật được cải tiến từ các loại bioreactor
trong nuôi cấy tế bào vi sinh
• Thuận lợi;
- Thể tích nuôi cấy tăng => sản xuất nhiều phôi, chồi hơn mà không cần những kĩ thuật
cao cấp.
- Hầu hết các bình bioreactor được thiết kế với cơ chế khuấy bằng cơ học hay thổi khí để
duy trì nuôi cấy gần như đồng dạng.
- Khi thao tác nuôi cấy liên tục, môi trường nuôi cấy và môi trường vật lí có thể được
kiểm soát thích hợp cho sinh trưởng. Điều này không thể thực hiện với hệ thống nuôi cấy
bình tam giác.
• Nhược điểm: đòi hỏi thiết bị hiện đại và đắt tiền, vận hành phức tạp đặc biệt là
khâu chống nhiễm cho huyền phù nuôi cấy.
• CÂY GỖ NGHIẾN
• CÂY XOAN
• NUÔI CẤY VÔ TÍNH CÂY DỨA (THƠM)
V. Ứng dụng
1. Trong nông nghiệp
• Sản xuất nhanh chóng các giống cây trồng đáp ứng được nhu cầu về cây giống
cao trong trồng trọt.
• Giống là một khâu rất quan trọng trong sản xuất nông nghiệp. Công tác giống chủ
yếu bao gồm các khâu thu thập nguồn gen, bảo quản quỹ gen, lai tạo, tuyển chọn, thử
nghiệm giống và nhân giống.
• Nhờ phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nên ngày nay phần lớn các công
việc này được thực hiện một cách khá thuận lợi và nhanh chóng
• VD: chu ối, khoai tây…
• Nhân gi ống ổn đ ịnh ch ất lư ợng, năng su ất cao ph ẩm ch ất t ốt
• VD: Các cây tr ồng chuy ển gen, con lai F1…
• T ạo gi ống s ạch b ệnh ch ống ch ịu v ới môi trư ờng
• VD: khoai tây s ạch virus, hoa lily s ạch b ệnh…
• Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều
hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng.
Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây
giống đồng nhất về mặt di truyền.
• Ngoài ra còn xảy ra hiện tượng nhiễm mẫu.
VI. Quy trình cụ thể
• Quy trình nhân giống hoa Lan bằng phương pháp nuôi cấy in-vitro
• Lan là loại hoa vương giả, với vẻ đẹp vương giả, quý phái nên khắp nơi trên thế
giới ngày càng có nhiều người thích chơi hoa Lan. Chính vì vậy, hoa Lan là sản phẩm
trồng trọt luôn có giá trị kinh tế cao.
• Bắt kịp thị hiếu này, ngày nay đã xuất hiện nhiều cơ sở kinh doanh hoa Lan với
nhiều chủng loại, giá cả khác nhau. Do đó, việc nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô in-
vitro tạo ra hàng loạt cây con ổn định về mặt di truyền và đáp ứng giá cả phải chăng là vô
cùng hữu ích.
• Sau đây, chúng tôi xin giới thiệu quy trình cơ bản nhân giống Lan bằng phương
pháp nuôi cấy mô in-vitro:
• Quy trình trên được tiến hành qua các giai đoạn sau:
• 1. Chọn mẫu và khử trùng mẫu cấy:
• Tách các vảy hành ra từ cây, bóc lần các lá già cho đến khi xuất hiện các mầm
chồi bên mang đỉnh sinh trưởng.
• Cắt bỏ gốc của mỗi mầm, sau đó khử trùng bằng cách ngâm trong cồn 70% trong
30 giây, rửa sạch bằng nước cất vô trùng ngâm trong dung dịch Ca(OCl)2 2% trong 25
phút, việc khử trùng được tiến hành trong tủ cấy. Mô được rửa lại với nước cất vô trùng 4
- 5 lần
• Mỗi mầm được đặt trong đĩa petri vô trùng và cẩn thận tách các lá non.
• Sau mỗi lần tách, nhúng mầm vào cồn 700 trong 1 giây và rửa với nước cất vô
trùng.
• Chuyển sang một đĩa petri vô trùng khác, tách các lá mầm bằng dao nhọn vô
trùng. Dùng kìm nhọn tách các lớp lá, cắt đỉnh sinh trưởng ra khỏi mô và cấy vào môi
trường nhân giống ban đầu.
• Nhiệt độ lý tưởng để nhân giống Lan là 220C - 260C và tuỳ vào mỗi loài.
• Sau 4-8 tuần, đỉnh sinh trưởng chuyển sang màu xanh lục và tạo ra các khối tròn
gọi là thể chồi.
• Thể chồi được lấy ra khỏi môi trường cấy ban đầu, dùng dao nhọn cắt làm 4-6
miếng tuỳ kích thước của chồi.
• Lát cắt được chuyển vào môi trường duy trì (môi trường phát triển chồi). Mỗi
đỉnh sinh trưởng sẽ phát triển ra một thể chồi mới sau khoảng 4 tuần, có thể cắt tiếp và
cấy chuyền sang môi trường mới.
2. Nhân giống:
• Môi trường nhân giống thường là môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) có bổ
sung các chất điều hoà tăng trưởng (auxin, cytokinin,…) với tỷ lệ phù hợp tùy loài nhằm
tạo điều kiện cho quá trình nhân chồi.
• Nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng nên giảm dần trong các lần cấy chuyển
sau đó. Các chất chiết trái cây cũng được đề nghị dùng như nước cốt cà chua, nước dừa,
nước chuối, nước khoai tây... Nhưng chúng chỉ có hiệu quả trong các lần cấy chuyển và
thể tích cũng không quá 10% thể tích môi trường.
• 3. Tái sinh cây hoàn chỉnh in-vitro:
• Khi đạt đến số cây giống cần thiết, ta chuyển thể chồi sang môi trường tạo rễ (môi
trường có lượng auxin tăng lên để kích thích ra rễ).
• Sau 4 -5 tháng, các thể chồi sẽ phát triển thành cây con.
• 4. Chuyển cây ra vườn ươm:
• Cây con cao 5-7 cm và có từ 3-4 lá có thể chuyển sang cấy vào bầu đất mùn vô
trùng có bổ sung các chất dinh dưỡng.
Sau một thời gian cây phát triển ổn định ta đem chuyển vào chậu. Sau khi chuyển chậu
khoảng một tuần mới được bón phân, lúc này cây đã có đủ sức chống chọi với bệnh tật.
• Như vậy, từ một mô hoa Lan được chọn nuôi cấy cho đến ra cây con có 3-4 lá
chuyển ra vườn trồng mất thời gian khoảng từ 8 đến 11 tháng.
• Với phương pháp nhân giống vô tính như trên sẽ đảm bảo tạo ra cây con mang
đặc tính giống hoàn toàn với cây cha mẹ (cây con ổn định về mặt di truyền), cây con
không nhiễm bệnh và tạo được một số lượng lớn cây con trong thời gian ngắn.
• Tuy nhiên, việc cấy mô phải được thực hiện thật nghiêm túc và tỉ mỉ theo đúng
quy trình, phải có điều kiện về trang thiết bị đầy đủ, môi trường nhân tạo thích hợp, đặc
biệt là điều kiện vô trùng phải được đảm bảo nghiêm ngặt.
• Cần chú ý thêm, đối với các loài không phải là cây bản địa, phải được thuần hoá
tại vùng mới chọn mẫu đem nuôi cấy, có như vậy mới đảm bảo hiệu quả từ khâu nuôi cấy
trong phòng thí nghiệm đến trồng ngoài vườn ươm.
Những số liệu thực tế
• Cuối tháng 10 vừa qua, Viện Di truyền nông nghiệp cũng đã công bố nhân giống
công nghiệp và bán công nghiệp thành công đối với một số loài hoa và cây lâm nghiệp có
giá trị kinh tế cao; tuyển chọn được 18 giống hoa lyly, 10 giống hồng môn với những sắc
màu, kiểu dáng đa dạng có giá trị kinh tế cao và trên 15 vạn cây giống sa nhân, tếch, trầm
hương...
• Nuôi cấy mô tạo giống cây mới tại Viện Công nghệ sinh học.
• Ông Đỗ Năng Vịnh - Phó Viện trưởng Viện Di truyền nông nghiệp - cho biết:
"Tạo phôi vô tính, hạt nhân tạo là công nghệ tiên tiến trên thế giới, lần đầu được nghiên
cứu ở nước ta. Phát hiện này đã được nhiều công ty giống tiếp nhận để phổ biến trong hệ
thống sản xuất nông nghiệp công nghệ cao".
• Theo các nhà khoa học Việt Nam, đến nay, đã có trên 200 loài cây trồng đã được
nhân giống bằng công nghệ phôi vô tính. Nhân bản vô tính có thể tạo hạt nhân tạo, đây là
yếu tố thuận lợi cho cơ giới hoá và tự động hoá nhân giống công nghiệp. Ví dụ, với cây
cà phê, từ 1 gam sinh khối, trong vài tháng người ta có thể tạo được 60 vạn phôi vô tính
có tỉ lệ tái sinh đến 47%.