P. 1
De Tai San Xuat Sinh Khoi Nam Duoc Lieu

De Tai San Xuat Sinh Khoi Nam Duoc Lieu

|Views: 715|Likes:
Được xuất bản bởihangtran9x

More info:

Published by: hangtran9x on Jul 25, 2010
Bản quyền:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

01/17/2013

pdf

text

original

1

Phần 1: MỞ ĐẦU
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ loại thượng dược. Cách đây hàng ngàn năm, nấm Linh chi đã được dùng để làm thuốc, các sách dược thảo của nhiều triều đại ở Trung Quốc đều ghi nhận Linh chi được sử dụng làm thuốc từ lâu đời. Giá trị dược liệu của Linh chi đã dược ghi chép trong các thư tịch cổ của Trung Quốc, cách nay hơn 4000 năm (Zgao, J.D., 1994). Từ những kinh nghiệm lưu truyền trong nhân gian, loài người đã biết sử dụng Linh chi theo nhiều cách khác nhau. Đến nay khoa học kỹ thuật phát triển, nấm Linh chi còn được các nhà khoa học trên thế giới chứng minh được tác dụng hữu ích trong việc điều trị bệnh: ung thư, cao huyết Theo chúng ta đã biết thì Linh chi là một trong được thảo thiên nhiên được xếp vào

Hiện nay Linh chi không còn khan hiếm như lúc trước do con người có thể áp mạnh trên thế giới và đạt đến quy mô công nghiệp. Trong hai thập niên gần đây, các nhà khoa học ở nước Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Singapore, Hongkong đã tăng cường nghiên cứu sản xuất nấm Linh Chi và mở rộng hiệu quả sử dụng dược liệu này. Tại thị trường Việt Nam, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi làm thuốc chữa bệnh ở trong nước cũng như xuất khẩu ngày càng tăng. Nhiều cơ sở đã tiến hành nghiên cứu nuôi

C

om pa

trồng, chế biến và thăm dò các hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi. Các thành phần hóa học có trong nấm Linh chi rất phong phú bao gồm các nhóm: acid béo, steroid, alcaloid, protein, polysaccharide… [19]. Trong đó thành phần có tác dụng dược lý quý báu, đặc trưng cho nấm Linh chi phần lớn thuộc nhóm triterpenoid [2]. Việt Nam với khí hậu nhiệt đới gió mùa và nguồn nguyên liệu cellulose dồi dào, đã tạo điều kiện cho nghề trồng nấm không ngừng phát triển. Hiện nay cả nước có 32/61 tỉnh Dựa vào tình hình ngày càng phát triển của ngành nấm ở Việt Nam và sự cho phép của bộ môn công nghệ sinh học của Trường Cao đẳng Kinh tế – Công nghệ TP. Hồ Chí

thành đã có cơ sở nuôi trồng nấm dược liệu (tháng 12/2001) [6].

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

ny

C

dụng kỹ thuật để nuôi trồng Linh chi trong môi trường nhân tạo và ngày càng phát triển

on

áp, tiểu đường, tim mạch, HIV, viêm gan siêu vi, suy nhược thần kinh… [3, 9]

fid

GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia

l

2

Minh chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối sợi nấm Ganoderma lucidum”. 1.2 MỤC ĐÍCH Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối tơ nấm Linh chi. Ø Xác định ảnh hưởng các yếu tố dinh dưỡng đến tốc độ tăng trưởng của sợi nấm Linh chi Ø Xác định ảnh hưởng các yếu tố pH đến tốc độ tăng trưởng của sợi nấm Linh chi Ø Xác định đường cong tăng trưởng của sợi nấm Linh chi Ø Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy sợi nấm Linh chi theo quy trình thực nghiệm Ø Phân tích thành phần hoạt chất có trong sợi nấm Linh chi 1.4 HẠN CHẾ ĐỀ TÀI

Chưa khảo sát hết các yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng đến tốc độ tăng sinh khối nấm Linh chi.

C

om pa

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

ny

C

on

fid

GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia

1.3 YÊU CẦU

l

3

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 NẤM LINH CHI [2, 5, 6, 12]

Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum, người miền Bắc xưa còn gọi là nấm lim. Trong thư tịch cổ nấm Linh chi còn được gọi với tên khác như Tiên thảo, Nấm trường thọ, Vạn niên nhung… Nấm Linh chi thường phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, chúng thường phát triển trên giá thể là gỗ mục hoặc các nguyên liệu có chất sơ. Hình thái quả thể nấm Linh chi được mô tả như sau: Tai nấm hóa gỗ, hình quạt hoặc thận. Mặt trên mũ có vân đồng tâm và bóng loáng, màu vàng cam cho đến màu đỏ nấm đặc và cứng, sậm màu và bóng loáng. đậm hoặc nâu đen. Mặt dưới phẳng, có nhiều lổ nhỏ li ti, là cơ quan sinh bào tử. Cuống Giá trị dược liệu của Linh chi đã được ghi chép trong các thư tịch cổ của Trung Quốc, cách nay hơn 4000 năm (Zgao, J.D., 1994). Trong sách “Thần nông bản thảo“ cách đây khoảng 2000 năm thời nhà Châu và sau đó được nhà dược học nổi tiếng Trung Quốc Lý Thời Trân phân ra thành “Lục Bảo Linh Chi“ thời nhà Minh với các khái quát công dụng dược lý khác nhau, ứng theo từng màu (Lý Thời Trân, 1590).

C

om pa

Theo Lý Thời Trân thì nấm Linh chi có 6 màu khác nhau: ü Xích chi (Linh chi đỏ còn gọi Hồng chi) ü Hắc chi (Linh chi đen còn gọi Huyền chi) ü Thanh chi (Linh chi xanh còn gọi Long chi) ü Bạch chi (Linh chi trắng còn gọi Ngọc chi) ü Tử chi (Linh chi tím) Cho đến nay Linh chi không còn giới hạn trong phạm vi đất nước Trung Quốc, mà ü Hoàng chi (Linh chi vàng còn gọi Kim chi)

mang tính toàn cầu. Hiện tại có khoảng 250 bài báo của các nhà khoa học liên quan đến dược tính và lâm sàng của Linh chi đã được công bố.

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

ny

C

on

fid

GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia

l

2.1.1 Khái quát chung

4

Cấu trúc độc đáo của Linh chi chính là thành phần khoáng vi lượng đủ loại, trong đó một số khoáng tố như germanium, vanadium, crôm... Chúng đã được sử dụng là nhân tố quan trọng cho nhiều loại phản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa, đông máu nội mạch, giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc của nhân tế bào với hàm Ở các nước Châu Á, đặc biệt là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan…, việc nghiên cứu phát triển và sử dụng Linh chi đang được công nghiệp hóa với quy mô lớn về phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào chế dược phẩm. Đồng thời nghiên cứu được các hoạt chất có tác dụng dược lý và phương pháp điều trị lâm sàng. Ở Việt Nam, trong các tài liệu lưu lại của Hải Thượng Lãn Ông, Lê Hữu Trác (1720-1791) cũng thấy đề cập đến Linh chi. Sau đó, Lê Quý Đôn còn khẳng định, đây là nguồn sản vật quý hiếm của đất rừng Đại Nam. Trong quyển “Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” (1991), giáo sư Đổ Tất Lợi còn mô tả chi tiết và trình bày về đặc tính trị liệu của loài nấm này, đồng thời cho rằng đây là loại Siêu thượng dược. Nấm Linh chi có vị trí phân loại được thừa nhận rộng rãi hiện nay: Ngành: Ngành phụ: Lớp: Lớp phụ: Bộ: Eumycota

C

om pa

Họ:

Họ phụ: Giống:

2.1.3 Đặc điểm hình thái và chu trình sống của nấm Linh chi 2.1.3.1 Đặc điểm hình thái nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại. Từ khi xác lập thành

một chi riêng là Ganoderma Karst (1881), đến nay tính ra có hơn 200 loài được ghi nhận, riêng Ganoderma lucidum đã có 45 loài. [3]
SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

ny

Basidiomycotina Hymenomycetes Hymenomycetidae Aphyllophorales Ganodermataceae Ganodermoidae Ganoderma

C

2.1.2 Vị trí phân loại [5, 7]

on

fid

en tia

lượng rất thấp

l

5

Nấm Linh chi là một trong những loại nấm phá gỗ, đặc biệt trên các cây thuộc bộ Đậu (Fabales). Nấm xuất hiện nhiều vào mùa mưa, trên thân cây hoặc gốc cây. Ở Việt Nam Nấm Linh chi được gọi là nấm Lim và được phát hiện ở miền Bắc bởi Patouillard N.T (1890 đến 1928).

Hình 2.1: Nấm Linh chi

Nấm Linh chi (quả thể) cây nấm gồm 2 phần cuống nấm và mũ nấm (phần phiến đối diện với mũ nấm). Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,5nâu đỏ, nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên mặt tán nấm. Mũ nấm khi non có hình trứng, lớn dần có hình quạt. Trên mặt mũ có vân gạch đồng tâm màu sắc từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tím nhẵn bóng như láng vecni. Mũ nấm có đường kính 2 - 15cm, dày 0,8 - 1,2cm, phần đính cuống thường gồ lên hoặc hơi lõm. Khi nấm đến tuổi trưởng thành thì phát tán bào tử từ phiến có màu nâu sẫm. 3cm. Cuống nấm ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo. Lớp vỏ cuống màu đỏ,

C

om pa

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

ny

C

on

fid
GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia

l

6

2.1.3.2 Chu trình sống của nấm Linh chi

Quả thể

Sợi nấm đơn nhân Đảm và bào tử đảm

2.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐẶC TÍNH DƯỢC LÝ CỦA NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM) Các phân tích của G-Bing Lin đã chứng minh các thành phần hóa được tổng quát của nấm Linh chi như sau : [18] Nước:

ny

C

om pa

Cellulose: Lignine: Lipid:

Monosaccharide: Polysaccharide:

C

Sterol:

Protein: Thành phần khác:

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

on

Hình 2.2: Chu trình phát triển của nấm Linh chi [5]

12 – 13% 54 – 56% 13 – 14% 1.9 – 2.0% 4.5 – 5.0% 1.0 – 1.2% (chống hoạt động khối u, tăng sức đề kháng và hệ miễn dịch cho cơ thể) 0.14 – 0.16% 0.08 – 0.12% K, Zn, Ca, Mn, Na, khoáng thiết yếu, nhiều vitamin, amino acid, enzyme và hợp chất alcaloid.
GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

fid

en tia
Phối nhân trong đảm

l

Sợi nấm song nhân

Đảm

7

Từ những năm 1980 đến nay, bằng các phương pháp hiện đại: phổ kế UV (tử ngoại), IR (hồng ngoại), phổ kế khối lượng - sắc ký khí (GC – MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân và đặc biệt là kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC) cùng phổ kế plasma (ICP), đã xác định chính xác gần 100 hoạt chất và dẫn xuất trong nấm Linh chi. [2]

lucidum) [19] Thành phần hoạt chất ARN **(Không định) xác Nhóm chất

Hoạt tính dược lý

Nucleic acid

Kích thích hệ miễn dịch

Alkaloid

Bổ tim

fid
chế tổng hợp

Chống virút

** Adenosine

Glycoprotein

on
Bổ tim Bảo vệ gan Ức cholesterol Ức chế ACE

Ức chế khối u Tăng sự lưu thông máu Thư giản cơ, giảm đau Chống khối u Kích thích hệ miễn dịch Giảm lượng đường huyết Chống dị ứng

Nucleotide

C

Beta – D - glucans

ny

Polysaccharide

om pa

Ganoderic Acids

Triterpenoid

C

Ganodermadiol

Triterpenoid

Giảm huyết áp

Adenosine

Nucleotide

Tăng sự lưu thông máu Thư giản cơ, Giảm đau

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia
Loại mô nấm Bào tử Quả thể Quả thể Quả thể Quả thể Quả thể Quả thể Hệ sợi nấm

Bảng 2.1: Các hoạt chất sinh học và dẫn xuất trong nấm Linh chi (Ganoderma

l

8

Chống khối u Beta – D -glucans Polysaccharide Kích thích hệ miễn dịch Tăng sản suất kháng thể Uridine, Uracil Cyclooctasulpher Nucleoside Phục hồi sự dẻo dai Chống dị ứng Hệ sợi nấm Hệ sợi nấm Hệ sợi nấm

Ling Zhi – 8

Protein

Chống dị ứng quang phổ Điều hoà huyết áp Bảo vệ gan Bảo vệ gan Ức chế

Ganoderic Acids Ganodermic Acid T –O Oleic Acid

Triterpenoid Triterpenoid Acid béo

fid
tổng hợp

Ganodosterone

Steroid

on
cholesterol

A và B, các ganoderic acid: A, B, E, F, H, K, Y và R. Trong đó kiểu Lanostane triterpene có thành phần chính là lipophilic. Có khoảng 130 hợp chất được ly trích từ quả thể, hệ sợi

C

om pa

và bào tử nấm Linh chi. Thành phần và hàm lượng triterpene phụ thuộc vào nguồn giống, yếu tố môi trường. Vai trò của triterpene có ý nghĩa quan trọng trong phòng chống căn bệnh HIV. [22]

Hàng loạt các nghiên cứu của Shufeng Zhou chứng minh rằng polysaccharide và

triterpene của nấm Linh chi có khả năng chữa trị bệnh viêm gan mãn tính. Ganopoly ức chế quá trình dịch mã của ADN polymerase của virút gây bệnh HBV, ngăn chặn sự hoạt động của virút. Ngoài ra polysaccharide và triterpene tác động hữu hiệu trong việc điều trị bệnh đái đường loại 2 (type II diabetes mellitus) cho các bệnh nhân. [14] Năm 1994, Lin Zhibin và Lei Lin Sheng đã xác định được trọng lượng phân tử của Polysaccharide từ G.lucidum là khoảng 7.100 – 9.300. Những tổng kết về vai trò sinh
SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

ny

Năm 2001, Masao Hattori đã ly trích được 10 triterpene mới, bao gồm lucidumol

C

Chống dị ứng

en tia
Hệ sợi nấm Hệ sợi nấm Hệ sợi nấm Hệ sợi nấm Hệ sợi nấm

l

9

dược học của nhóm polysaccharide ở các loài nấm Linh chi đã được giới thiệu tại Hội thảo Bắc Kinh với các báo cáo của các tác giả Đài Loan, Trung Quốc, Hoa kỳ. He, Y. et al (1992) đã khảo cứu các BN3B - gồm 4 polycaccharide đồng nhất có hoạt tính tăng miễn dịch. Trong đó BN3B1 được xác định là glucan (chỉ chứa glucose) và Hikino, H.et al từ 1985 đến 1989 chứng minh hoạt lực hạ đường huyết của nhiều polysaccharide. Đó là các heteroglycan có cả hoạt tính chống ung thư. Các ganoderan B có tác dụng làm tăng mức insuline trong huyết tương, giảm sinh tổng hợp glycogen và giảm hàm lượng glycogen trong gan. Đây chính là cơ sở trị liệu trên các bệnh nhân đái tháo đường.

Các phức hợp polysaccharide – protein có hoạt tính chống khối u và tăng tính miễn dịch. Năm 1994, Byong Kak Kim tiến hành lai hệ sợi nấm bằng phương pháp dung hợp Protoplast giữa chủng G.lucidum với G.applanatum, thậm chí với cả nấm hương (Lentinus edodes), qua đó tăng cường hoạt tính chống khối u sarcom 180 của các phức Lei L.S và Lin L.B (1993) đã chứng minh tác dụng tăng sinh tổng hợp IL – 2 (Interleukine-2) và hoạt tính ADN polymerase ở chuột già tuổi bởi polysaccharide, càng soi sáng thêm khả năng trẻ hóa, tăng tuổi thọ của các nấm Linh chi. Những nghiên cứu về polysaccharide không tan trong nước cũng chứng tỏ hiệu lực chống khối u rất rõ, thậm chí làm tan khối u với tỷ lệ ¾ ở các loài G.lucidum và Có lẽ đa dạng nhất và có tác dụng dược lý mạnh nhất là nhóm Saponine, polysaccharide – protein lên đáng kể.

C

om pa

G.applanatum (Takashi, 1985; Liu G.T, 1993). [2] triterpenoide và các acid ganoderic. Vai trò của các chất này chủ yếu là ức chế giải phóng histamine, ức chế Angiotensine Conversino emzyme (ACE), ức chế sinh tổng hợp Cholesterol và hạ huyết áp. [2, 3, 19] Linh chi được dùng như một thượng dược khoảng từ 4000 năm nay ở Trung Quốc

2.3 KHẢ NĂNG CHỮA BỆNH CỦA NẤM LINH CHI

và người ta chưa thấy tác dụng xấu hay độc tính của Linh chi. Chúng đã được khẳng định là nhân tố quan trọng cho nhiều loại phản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa,
SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

ny

C

on

fid

en tia

BN3B3 là một arabinogalactan mang các liên kết glycoside.

l

10

đông máu nội mạch, giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc của nhân tế bào. Tài liệu cổ nhất nói tương đối cụ thể về khả năng trị liệu của nấm Linh chi cũng của Lý Thời Trân (1595). Theo tác giả trong 6 loại Linh chi thì mỗi loại có đặc tính riêng.

Bảng 2.2: Lục bảo Linh chi và tác dụng trị liệu (Lý Thời Trân, 1590) Tên gọi Thanh chi Màu sắc Xanh Đỏ Vàng Trắng Đen Đặc tính dược lý

Vị chua, tính bình, không độc chủ trị sáng mắt, bồ gan khí an thần, tăng trí nhớ.

Hồng chi Hoàng chi Bạch chi Hắc chi

dưỡng tim, bổ trung, chữa trị tức ngực. Vị ngọt, tính bình, không độc, an thần ích tì khí. Vị cay, tính bình, không độc, ích phổi, thông mũi, an thần, chữa ho nghịch. Vị mặn, tính bình, không độc, trị chứng bí tiểu

nấm Linh chi như sau: [1, 7, 8]

- Kiện não (làm sáng suốt, minh mẫn)

C

om pa

- Bảo can (bảo vệ gan)

- Cường tâm (thêm sức cho tim)

- Kiện vị (củng cố dạ dày và hệ tiêu hoá) - Cường phế (thêm sức cho phổi, hệ hô hấp) - Giải độc (giải tỏa trạng thái dị cảm)

- Trường sinh (tăng tuổi thọ)

Qua phân tích các hoạt chất về mặt dược lý và sử dụng nấm Linh chi, người ta thấy Đối với các bệnh tim mạch: Nấm Linh chi có tác dụng điều hoà, ổn định huyết áp.

Linh chi có tác dụng với một số bệnh:

Khi dùng cho người huyết áp cao, nấm Linh chi không làm tăng mà làm giảm bớt, dùng
SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

ny

Theo cách diễn đạt truyền thống của người phương Đông, các tác dụng lớn của

C

on

fid

Vị đắng, tính bình, không độc, tăng trí nhớ,

en tia

l

11

nhiều thì huyết áp ổn định. Đối với những người suy nhược cơ thể, huyết áp thấp thì nấm Linh chi có tác dụng nâng huyết áp lên gần mức dễ chịu nhờ cải thiện, chuyển hoá dinh dưỡng. Đối với bệnh nhiễm mỡ, xơ mạch, dùng nấm Linh Chi có tác dụng giảm cholesterol toàn phần, làm tăng nhóm lipoprotein tỷ trọng cao trong máu, làm giảm hệ số máu, giảm co tắc mạch, giải tỏa cơn đau thắt tim. Nhiều nghiên cứu đã phát hiện ra vai trò của các nguyên tố khoáng vết hiếm. Vanadium (V) có tác dụng chống tích đọng cholesterol trên thành mạch. Germanium giúp lưu thông khí huyết, tăng cường vận chuyển oxy vào mô. Hiện nay, chỉ số Ge trong các dược phẩm Linh chi được xem như là một chỉ tiêu quan trọng, có giá trị trong điều trị tim mạch và giảm đau trong trị liệu ung thư. [2, 3] Đối với các bệnh về hô hấp: nấm Linh chi đem lại kết quả tốt, nhất là với những ca điều trị viêm phế quản dị ứng, hen phế quản tới 80% có tác dụng giảm và làm nhẹ bệnh theo hướng khỏi hẳn.[7, 8] sinh bệnh. Nấm Linh chi làm giảm xu thế kết bờ của tiểu cầu, giảm nồng độ mỡ trong

phẫu với trị liệu nấm trên các bệnh nhân ung thư phổi, ung thư vú và ung thư dạ dày có thể kéo dài thời gian sống trên 5 năm cao hơn nhóm không dùng nấm. Nhiều thông tin ở Đài Loan cho biết nếu dùng nấm Linh chi trồng trên gỗ long não điều trị cho các bệnh nhân ung thư cổ tử cung đạt kết quả tốt - khối u tiêu biến hoàn toàn. Các nhà khoa học ở Đại học Haifa, Israel khẳng định nấm Linh chi - một loài nấm dại thường dùng trong Đông Y ở Trung Quốc (và Việt Nam) - có thể chữa ung thư tuyến tiền liệt. Ung thư tiền

C

om pa

liệt tuyến là một trong những dạng ung thư phổ biến nhất ở đàn ông, với hơn 543.000 Khả năng kháng HIV: Để khảo sát khả năng kháng HIV của các hợp chất trong

người được chẩn đoán mỗi năm trên toàn thế giới.

nấm Ganoderma lucidum, người ta đã sử dụng dịch chiết từ quả thể trong thử nghiệm kháng virút HIV – 1 trên các tế bào lympho T ở người. Sự nhân lên của virút được xác

định qua hoạt động phiên mã ngược trên bề mặt các tế bào lympho T đã được gây nhiễm HIV – 1. Kết quả cho thấy có sự ức chế mạnh mẽ hoạt động sinh sản của loại virút này

(Gau J.P, 1990; Kim, 1996). Do đó, nhiều quốc gia đã đưa Linh chi vào phác đồ điều trị
SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

ny

C

Hiệu quả chống ung thư: Bằng việc kết hợp các phương pháp xạ trị, hoá trị, giải

on

fid

en tia

l

12

tạm thời, nhằm tăng cường khả năng miễn dịch và nâng đỡ thể trạng cho các bệnh nhân trong khi AZT, DDI, DDC, còn hiếm và rất đắt. Các nghiên cứu tại Nhật Bản đã chứng minh các hoạt chất từ nấm Linh chi có tác dụng như sau: (Masao Hattori, 2001) ü Ganoderiol F và ganodermanontirol có hoạt tính chống HIV – 1 ü Ganoderderic acid B và lucidumol B có tác động ức chế hữu hiệu protease HIV – 1

ü Ganodermanondiol và lucidumol A ức chế phát triển tế bào Meth – A (mouse sarcoma) và LLC (mouse lung carcinoma).

Ngoài ra các ganoderma alcohol là lanostane triterpene với nhóm hydroxol (-OH)

Khả năng antioxydant: Nhiều thực nghiệm chỉ ra vai trò của các saponine và triterpenoid, mà trong đó Ganoderic acid được coi là hiệu quả nhất (Wang C.H, 1985). Những nghiên cứu gần đây đang đẩy mạnh theo hướng làm giàu Selenium - một yếu tố khoáng có hoạt tính antioxydant rất mạnh – vào nấm Linh chi. Chính vì vậy con người có thể chờ đợi vào một dược phẩm tăng tuổi thọ, trẻ hoá từ nấm Linh chi nói chung và Linh chi Việt Nam nói riêng. [2]

Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi có khả năng khử một số gốc tự do trong cơ chế chống não hóa, chống ung thư. Bảo vệ và chống ảnh hưởng của các tia chiếu xạ. Linh chi cũng có tác dụng giúp cơ thể thải loại nhanh các chất độc, kể cả các kim loại

C

om pa

năng như: Chì, Germanium.

2.4 MỘT SỐ ỨNG DỤNG LÂM SÀN Trị suy nhược thần kinh: Bệnh viện Hoa Sơn thuộc Viện Y học số 1 Thượng Hải

báo cáo: Dùng cả 2 loại Linh chi nhân tạo và Linh chi hoang dại chế thành viên ( mỗi viên

tương đương 1g thuốc sống), mỗi lần uống 3 viên, ngày 3 lần, một liệu trình từ 10 ngày

đến 2 tháng. Trị 225 ca, tỷ lệ kết quả 83,5 - 86,3%, nhận xét thuốc có tác dụng an thần, điều tiết thần kinh thực vật và tăng cường thể lực ( theo báo Tân y học, số phụ chuyên đề về bệnh hệ thống thần kinh 1976,3:140).

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

ny

C

on

fid

ở vị trí C25 có khả năng chống HIV – 1, Meth – A và LLC ở chuột. [2, 22]

GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia

l

13

Trị chứng cholesterol máu cao: Báo cáo của Sở nghiên cứu kháng khuẩn tố công nghiệp Tứ Xuyên, dùng liên tục từ 1 đến 3 tháng cho 120 ca thuốc có tác dụng hạ cholesterol huyết thanh rõ rệt, tỷ lệ kết quả 86% ( theo báo cáo đăng trên báo thông tin Trung thảo dược 1973,1:31). dùng siro Linh chi và đường Linh chi, trị 1.110 ca có kết quả và có nhận xét là thuốc có tác dụng đối với thể hen và thể hư hàn ( theo tờ báo cáo tư liệu Y dược Quảng Đông 1979,1:1). Trị viêm phế quản mạn tính: Tổ nghiên cứu Linh chi tỉnh Quảng Đông báo cáo

Trị viêm gan mạn tính: Tác giả dùng polysaccarit Linh chi chiết xuất từ Linh chi

viêm gan mạn kéo dài và xơ gan gồm 367 ca, có nhận xét phần lớn triệu chứng chủ quan được cải thiện, men SGOT, SGPT giảm tỷ lệ 67,7% ( Tạp chí Bệnh gan mật 1985,4:242). Trị chứng giảm bạch cầu: dùng polysaccarit chế thành viên (mỗi viên có 250mg thuốc sống) cho uống, theo dõi 165 ca, ghi nhận tỷ lệ có kết quả 72,57% ( Báo cáo của Trị bệnh xơ cứng bì, viêm da cơ, bệnh liput ban đỏ, ban trọc: dùng Linh chi chế thành dịch, tiêm bắp và viên uống. Trị xơ cứng bì 173 ca, tỷ lệ kết quả 79,1%, viêm da cơ 43 ca, có kết quả 95%, Liput ban đỏ 84 ca có kết quả 90%, ban trọc 232 ca, có kết quả 78,88% ( Thông tin nghiên cứu Y học 1984,12:22). Theo sách Trung dược ứng dụng lâm sàng: thuốc có tác dụng đối với bệnh loét Lưu Chí Phương đăng trên tạp chí Trung hoa huyết dịch bệnh 1985,7:428).

C

om pa

bao tử, rối lọan tiêu hóa kéo dài, thường dùng phối hợp với Ngũ bội tử, Đảng sâm, Bạch truật, Trần bì, Kê nội kim, Sa nhân, Sinh khương. Trị xơ cứng mạch, cao huyết áp, tai biến mạch não: thường phối hợp với Kê huyết đằng, Thạch xương bồ, Đơn bì, Cẩu tích, Đỗ trọng, Thỏ ty tử, Hoàng tinh. Thuốc Dùng giải độc các loại khuẩn: phối hợp với cam thảo, gừng, táo. Ngoài ra sách Những cây thuốc và vị thuốc Việt nam của Đỗ Tất Lợi có ghi:

còn dùng chữa bệnh động mạch vành, đau thắt ngực.

Thuốc chữa bệnh phụ nữ thời kỳ mãn kinh, giúp thông minh và trí nhớ, dùng lâu ngày

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

ny

C

on

fid

hoang dại chế thành thuốc bột hòa nước uống, trị các loại bệnh viêm gan mạn hoạt động,

GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia

l

14

giúp cho nhẹ người, tăng tuổi thọ. Nhiều người mua nấm Linh chi về nấu canh, nấu súp làm món ăn cao cấp.

2.5 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ HOẠT CHẤT CÓ TRONG NẤM LINH CHI Có trên 200 loại polysaccharide được ly trích và thu nhận từ nấm Linh chi nhưng polysaccharid gồm 2 loại chính: GL-A: Gal: Glu: Rham: Xyl (3,2: 2,7: 1,8; 1,0) GL-B: Glu: Rham: Xyl (6,8: 2,0: 1,0)

chính là Glu, nên gọi là Glucan.

b (1-3) -D-glucan, khi phức hợp với một protein, có tác dụng chống ung thư rõ rệt (Kishida & al., 1988). . Hầu hết các GLPs hình thành từ 3 chuỗi monosaccharide, có cấu trúc xoắn ốc 3 lượng khung sườn từ 100,000 – 1000,000, đa số chúng tồn tại phía trong vách tế bào (CWM). Một phần polysaccharide phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan trong nước nóng. Ngoài polysaccharide từ quả thể, polysaccharide cũng được thu nhận từ quá trình nuôi

C

om pa

cấy trong môi trường dịch lỏng và rắn, chúng vẫn có hoạt tính sinh học trong việc chữa trị. Polysaccharid có nguồn gốc từ Linh chi dùng điều trị ung thư đã được công nhận

sáng chế (patent) ở Nhật. Năm 1976, Cty Kureha Chemical Industry sản xuất chế phẩm

trích từ Linh Chi có tác dụng kháng carcinogen. Năm 1982, Cty Teikoko Chemical Industry sản xuất sản phẩm từ Linh chi có gốc glucoprotein làm chất ức chế neoplasm. Bằng sáng chế Mỹ 4051314, do Ohtsuka & al. (1977), sản xuất từ Linh chi chất

mucopolysaccharid dùng chống ung thư. 2.5.2 Ganoderic Acid

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

ny

C

chiều, giống cấu trúc của ADN và ARN. Cấu trúc xoắn này tựa trên khung sườn cacbon,

on

fid

GL-A có thành phần chính là Gal, nên gọi là Galactan, còn GL-B có thành phần

GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia
M= 23.000 Da M= 25.000 Da

2.5.1 Ganoderma polysaccharide (GLPs) [15, 16]

l

15

Ganoderic acid được định hướng là một cyclopropene hoặc cyclopentene. Hàm lượng G.acid thay đổi theo giống Linh chi, môi trường nuôi trồng, giai đoạn bào tử ganodermal. Chính sự thay đổi này làm cho mức độ đắng bị ảnh hưởng. Hàm lượng G.acid cao thì có nhiều vị đắng. [18, 19] Triterpenoid là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren. Các triterpen có

bộ khung chính từ 27 – 30 nguyên tử carbon (C38H48) rất thường gặp trong thực vật. Các triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một số nhóm chức như: -OH; -Oac; eter -O-; Carbanil C=O; nối đôi C=C. Đặc tính chung là có tính thân dầu (tan tốt trong eter dầu hỏa, hexan, eter ethyl, cloroform), ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành glycosid. [10, 11]

Bảng 2.3: Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) (Lê Xuân Thám, 1996) Hoạt chất Ganoderic acid R,S

Ganoderic acid B, D, F, H, K, S, Y Ganodermaldiol

ny

Ganodermic acid Mf

om pa

Ganodermic acid T.O Ganodermic acid

Triterpenoid đặc biệt là acid ganoderic có tác dụng chống dị ứng, ức chế sự giải

phóng histamin, tăng cường sử dụng oxy và cải thiện chức năng gan. Hiện nay, đã tìm thấy trên 80 dẫn xuất từ acid ganoderic. Trong đó ganodosteron được xem là chất kích thích hoạt động của gan và bảo vệ gan. 2.5.3 Ganoderma Adenosine [18, 19]

C

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

C

on
Hạ huyết áp Hạ huyết áp

Ức chế giải phóng histamin

Ức chế tổng hợp cholesterol Ức chế tổng hợp cholesterol Ức chế tổng hợp cholesterol

fid
Hoạt tính

GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia

l

16

Adenosine thuộc nhóm purine và là thành phần chính trong cấu trúc nucleic acid. Nấm Linh chi có nhiều dẫn xuất adenosine, tất cả chúng đều có hoạt tính dược liệu mạnh. Chức năng của adenosine: ü Giảm độ nhớt máu ü Ngăn chặn hình thành cục nghẽn ü Ức chế kết dính tiểu cầu

ü Tăng lượng lipoprotein 2 – 3 phosphricglycerin ü Lọc máu và tăng tuần hoàn máu trong cơ thể 2.5.4 Alcaloid [10, 11]

ü Gia tăng khả năng vận chuyển oxygen, tăng lượng máu cung cấp cho não

Alcaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, chúng có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng. Các alcaloid ở dạng tự do hầu như không tan trong nước, thường tan trong dung môi hữu cơ: cloroform, eter diethyl, alcol bậc thấp. Các muối của alcaloid thì tan trong Chính vì thế, tính hòa tan của các alcaloid đóng vai trò quan trọng trong việc ly trích alcaloid ra khỏi nguyên liệu và trong kỹ nghệ dược phẩm điều chế dạng thuốc để uống. Alcaloid là những chất có hoạt tính sinh học, nhiều ứng dụng trong ngành y dược và nhiều chất rất độc. Các alcaloid có tác dụng rất khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc của

C

om pa

alcaloid.

ü Tác dụng lên hệ thần kinh

ü Tác dụng lên huyết áp

ü Tác dụng trị ung thư

2.5.5 Hợp chất Saponin [21, 23] Saponin là một loại glycosid, có cấu trúc gồm hai phần: phần đường gọi là glycon

và phần không đường gọi là aglycon. - Saponin triterpenoid: Phần aglycon của saponin triterpenoid có 30 cacbon, cấu tạo bởi 6 đơn vị hemiterpen và chia làm 2 nhóm:

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

ny

C

nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như: cloroform, eter, benzen.

on

fid

GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia

l

17

ü Saponin triterpenoid pentacyclic: phần aglycon của nhóm này có cấu trúc gồm 5 vòng và phân ra thành các nhóm nhỏ: olean, ursan, lupan, hopan. Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm olean. ü Saponin triterpenoid tetracyclic: phần aglycon có cấu trúc 4 vòng và phân

- Saponin steroid: Gồm các nhóm chính: spirostan, furostan, aminofurostan, spiroalan, solanidan. ü Trị long đờm, chữa ho ü Là chất phụ gia trong một số vắc xin ü Tác dụng thông tiểu ü Tác dụng kháng viêm, chống khối u 2.5.6 Germanium hữu cơ [18, 19]

Hợp chất Saponin có nhiều công dụng trong y học như:

Gemanium là nguyên tố hiếm, do nhà khoa học người Đức khám phá vào năm oxygen. Nó kích thích khả năng vận chuyển oxygen tuần hoàn máu trong cơ thể lên đến 1,5 lần. Vì thế, làm tăng mức độ trao đổi chất và ngăn chặn quá trình lão hóa. Cơ thể con người là thành phần của các electron. Khi mức năng lượng tăng hoặc giảm thấp, dẫn đến sự xáo trộn cân bằng và biểu lộ tình trạng bệnh lý. Gemanium hữu cơ

C

om pa

sẽ duy trì mức năng lượng một cách bình thường trong cơ thể và bảo vệ sức khoẻ. Khi tế bào ung thư xuất hiện, chúng làm xáo trộn quá trình trao đổi chất. Gemanium sẽ điều hoà và kiểm soát quá trình này, từ đó ngăn chặn tế bào ung thư phát triển. Chức năng của Germanium: ü Tăng cường khả năng mang oxygen và giảm nguy cơ xuất hiện ung thư ü Giảm nguy hiểm từ kết quả trị liệu phóng xạ

ü Ngăn chặn bệnh thiếu máu cục bộ

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

ny

C

1885. Germanium có thể cung cấp một lượng lớn oxygen và thay thế chức năng của

on

fid
GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia

thành 3 nhóm chính: dammanran, lanostan, cucurbitan.

l

18

Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM LÀM THÍ NGHIỆM Đề tài được thực hiện từ 27/09/2008 đến 1/1/2009 tại Phòng Thí nghiệm Vi sinh thực phẩm, Khoa Sinh học Ứng dụng - Trường Cao đẳng Kinh tế – Công nghệ TP. Hồ Chí Minh 3.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được nuôi trồng tại Phòng thí nghiệm khoa sinh học ứng dụng, Trường Cao Đẳng Kinh Tế - Công Nghệ Tp.HCM.

3.3.1 Thiết bị Cân phân tích Kính hiển vi

Máy chụp ảnh kỹ thuật số Tủ cấy vô trùng

Nồi hấp thanh trùng

om pa

Tủ sấy

3.3.2 Hóa chất

Các hóa chất bao gồm: MgSO4, KH2PO4, Glucose, Agar.

3.3.3 Môi trường sử dụng 3.3.3.1 Môi trường dinh dưỡng Môi trường PGA (Potato glucose agar) Khoai tây: Glucose: Agar: Nước cất vừa đủ: 200 (g) 20 (g) 20 (g) 1000 (ml)

C

Các môi trường đều được khử trùng ở 1210C trong 15 phút.
SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

ny

C

on

3.3 VẬT LIÊU THÍ NGHIỆM

fid

en tia

l

19

3.3.3.2 Môi trường nhân giống Chọn loại lúa gạo tốt, nấu cho lúa vừa nứt nanh, vớt ra để ráo, sau đó phối trộn với cám bắp. 3.4 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.4.1 Quan sát hình thái quả thể nấm Ganoderma lucidum 3.4.1.1 Hình thái quả thể 3.4.1.2 Phương pháp quan sát hệ sợi nấm [9]

ü Lấy một ít sợi nấm dàn đều vào 1 giọt nước có trên lam kính trên ngọn lửa đèn cồn ü Rửa thuốc nhuộm bằng cồn 95%

ü Cố định sợi nấm trên lam kính bằng cách hơ nhẹ mặt dưới lam kính qua lại ü Nhuộm bằng dung dịch fuchsin trong 5 – 10 phút

ü Rửa ngay với nước cất để chấm dứt công đoạn tẩy màu ü Quan sát mẫu vật dưới vật kính x100

3.4.1.3 Phương pháp quan sát bào tử nấm Linh chi [13, 17] ü Lấy quả thể nấm Linh chi trong giai đoạn phóng thích bào tử, đặt lên 1 tờ giấy trắng để thu bào tử ü Dùng khuyên cấy lấy ít bào tử rồi dàn đều vào 1 giọt nước trên lam kính ü Cố định bào tử trên lam kính bằng cách hơ nhẹ mặt dưới của lam kính qua ngọn lửa đèn cồn đến khô ü Quan sát bào tử nấm dưới vật kính x100

C

om pa

3.4.2 Khảo sát sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi trên các môi trường lỏng Cách tiến hành: Các môi trường đều được pha với nồng độ khác nhau. và được

hấp khử trùng ở 121oC/15 phút, để nguội và cấy giống. Sau 9 ngày ta thu sinh khối và sấy ở nhiệt độ 500C và tiến hành cân trọng lượng khô. Tổng số chai cấy: 52 chai

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

ny

C

on

fid
GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia

l

20

3.4.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4 đến tốc độ tăng sinh khối trong môi trường lỏng Thí nghiệm được bố trí 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa 20ml môi trường

1 2 3 4

PG + 1 g/l MgSO4 PG + 2 g/l MgSO4

PG + 3 g/l MgSO4 PG + 4 g/l MgSO4

3.4.2.2 Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến tốc độ tăng sinh khối trong môi trường lỏng Thí nghiệm được bố trí 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa 20ml môi trường Nghiệm thức 1 2 3 4

C

ny

C

om pa

3.4.2.3 Ảnh hưởng của hàm lượng Glucose đến tốc độ tăng sinh khối trong Thí nghiệm được bố trí 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa

môi trường lỏng

20ml môi trường

Nghiệm thức 1 2 3

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

on

fid

Môi trường nuôi cấy

PG + 0,5 g/l KH2PO4 PG + 1g /l KH2PO4 PG + 1,5 g/l KH2PO4 PG + 2 g/l KH2PO4

Môi trường nuôi cấy P + 10 g/l Glucose P + 15 g/l Glucose P + 20 g/l Glucose
GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia

Nghiệm thức

Môi trường nuôi cấy

l

21

4 5

P + 25 g/l Glucose P + 30 g/l Glucose

3.4.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH lên môi trường nuôi cấy các giá trị pH khác nhau thì tốc độ sinh trưởng của sợi nấm khác nhau. Do đó, trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH đến tốc độ sinh trưởng và phát triển của sợi nấm Linh chi để tìm được giá trị pH thích hợp cho sự phát triển của sợi nấm. Cách tiến hành: pha môi trường lỏng PG (potato glucose) với nồng độ pH khác nhau và đổ vào chai thuỷ tinh 100ml một lượng môi trường 20 ml. Môi trường được hấp khử trùng ở 121oC/15 phút, để nguội và cấy một lượng giống nhất định vào (mỗi lần cấy gắp 1 hạt lúa), ủ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành thu nhận sinh khối sau 9 ngày. Sinh khối được sấy đến khô ở nhiệt độ 50oC và tiến hành cân trọng lượng khô. Thí nghiệm được thực hiện với 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 2 chai. Vậy tổng số chai cấy là 14 chai 3.4.4 Nghiên cứu đường cong sinh trưởng của Ganoderma lucidum Chúng tôi khảo sát sự tích lũy sinh khối sợi nấm Linh chi trên môi trường lỏng PG Cách tiến hành: pha môi trường và đổ vào chai thuỷ tinh 100ml một lượng môi

C

om pa

trường 20 ml. Hấp khử trùng ở 121oC/15 phút, để nguội và cấy một lượng giống nhất định vào (mỗi lần cấy gắp 1 hạt lúa), ủ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành thu nhận sinh khối ở các ngày 3, 6, 9, 12, 15, 21. Sinh khối được sấy đến khô ở nhiệt độ 50oC và tiến hành cân trọng lượng khô.

Trong quá trình thí nghiệm, gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 2 chai.

Tổng số chai cấy là 10 chai. 3.5. PHƯƠNG PHÁP QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM 3.5.1. Mục đích Tìm điều kiện tối ưu để thực hiện các quá trình hoặc chọn lựa thành phần tối ưu

của nhiều phần tử trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật. Phương pháp quy hoạch thực
SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

ny

C

on

fid

en tia

pH ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ tăng trưởng của sợi nấm trong môi trường lỏng. Ở

l

22

nghiệm nhiều yếu tố cho phép thay đổi đồng thời nhiều yếu tố và xác định được tương tác giữa các yếu tố, nhờ đó giảm bớt số thí nghiệm.

3.5.2. Phương pháp xử lý số liệu phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng của các yếu tố nghiên cứu đến mật độ tế bào. Ảnh hưởng của các yếu tố được đánh giá dựa trên xác xuất tin cậy hay mức ý nghĩa p của chúng. p ≤ 0,05 và không đáng kể khi p > 0,05. Ảnh hưởng được coi là rất lớn khi p ≤ 0,0001, ảnh hưởng là đáng kể khi 0,0001 < Chỉ có những hệ số biểu diễn ảnh hưởng rất lớn và đáng kể mới được giữ lại trong phương trình hồi qui cuối cùng. Khi ảnh hưởng của các yếu tố hay ảnh hưởng tương hổ giữa các yếu tố là đáng kể thì hệ số biểu diễn ảnh hưởng của các yếu tố đó luôn được giữ lại trong phương trình. Phương trình hồi quy

Yi = b0 +b1 x1 + b2 x2 + b3 x3 + b12 x1 x2 + b13 x1 x3 + b23 x2 x3 + b123 x1 x2 x3 ü Yi: Sinh khối nấm thu được (g/20ml) ü xi (i= 1 – k): là các yếu tố ảnh hưởng, mỗi yếu tố có hai mức là hai giới hạn

om pa

biên của nó.

ü bo, bi, bj, bij: là các hệ số trong phương trình hồi quy Để đơn giản trong tính toán, chuyển từ hệ trục tự nhiên sang hệ trục không thứ Zio = ( Zi max + Zimin)/2 + Zimax: mức cao + Zimin: mức thấp + Zio: mức cơ sở ü Điểm có tọa độ (Z1o, Z2o, Z3o,…Zko) gọi là tâm của phương án

nguyên (hệ mã hoá). Xét yếu tố được kí hiệu là Zi

C

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

ny

Trong đó

Với:

C

on

fid

GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia

Phương trình hồi quy được xây dựng từ các kết quả thực nghiệm. Các hệ số trong

l

23

ü Việc mã hoá được thực hiện dễ dàng nhờ chọn tâm của miền được nghiên cứu làm gốc tọa độ. ü Phương pháp xử lý số liệu từ các kết quả thực nghiệm. Các hệ số trong phương trình mô tả ảnh hưởng của các yếu tố nghiên cứu đến khả năng tăng sinh khối.

Y = b0 +b1 x1 + b2 x2 + b3 x3 + b1b2 x1 x2 + b1b3 x1 x3 + b2b3 x2 x3 + b1b2b3 x1 x2 x3 Với + Y: sinh khối (g/20ml) + x 1 : nồng độ MgSO4 (g/l) + x 2 : nồng độ KH2PO4 (g/l) + x 3 : nồng độ Glucose (g/l) Bảng 3.1: Các yếu tố thí nghiệm Các mức Mức cơ sở

+ b0, b1, b2, b3, b12, b13, b23, b123 : các hệ số trong phương trình hồi quy

C

on
x2
y1 y2

Các yếu tố (g/l)

x1

Khoảng biến thiên Mức trên Mức dưới

om pa

Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm Số TN 1 2 3 4 5 6
x1 x2 x3

ny

fid
x3
y3 Ytb
GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

+ -

+ + + +

+ + + + -

C

+ + -

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

en tia

Phương trình hồi quy

l

24

7 8

+ -

-

-

3.6 XÁC ĐỊNH DƯỢC CHẤT CÓ TRONG NÂM LINH CHI 3.6.1 Phương pháp định tính alcaloid [11] Để phát hiện sự hiện diện của alcaloid trong dược liệu người ta thường áp dụng nguyên tắc thử của Webb với cách thử gồm 2 phần như sau:

- Phần 1: Bột nấm Linh chi xay nhuyễn (10 – 20 gam) và dung dịch nước 1% H2SO4 được cho vào erlen, đun nhẹ trong 1 giờ. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với cả Quan sát kết tủa, nếu có kết tủa theo qui định là dương tính. Tuy nhiên, nếu không có kết tủa, chưa thể kết luận là không có alcaloid mà phải tiếp tục thử nghiệm phần 2. - Phần 2: Bột xay nhuyễn (10 – 20 gam) ngâm trong dung dịch prollius là hổn hợp gồm: chloroform:ethanol 95o:NH4OH đậm đặc, theo tỷ lệ là 8:8:1 (môi trường phải có dung môi đến cạn, thu được cặn. Hòa tan cặn trong dung dịch HCl 1% đun ấm cho dễ tan. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với 2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff. 3.6.1.2 Thuốc thử định tính alcaloid - Thuốc thử Mayer: Hòa tan 1,36 gam HgCl2 trong 60 ml nước cất và 5 gam KI tính baz). Ngâm nguội trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc trộn. Lọc và đuổi

C

om pa

trong 10 ml nước cất. Thu hỗn hợp 2 dung dịch này lại và thêm nước cất cho đủ 100 ml. Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid loãng có chứa alcaloid, nếu có

alcaloid sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt. Cần lưu ý vì tủa tạo thành có thể hòa

tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc hòa tan bởi ethanol có sẵn trong dung dịch thử. - Thuốc thử Dragendorff: Hòa tan 8 gam Nitrat bismuth Bi(NO3)3 trong 25 ml

HNO3 30% (D=1,18). Hòa tan 28 gam KI và 1 ml HCl 6N trong 5 ml nước cất. Hỗn hợp

2 dung dịch này lại để yên trong tủ lạnh 5oC sẽ thấy tủa màu sậm xuất hiện và tan trở lại, lọc và thêm nước cho đủ 100 ml. Dung dịch màu cam – đỏ được chứa trong chai màu nâu để che sáng, cất trong tủ lạnh, có thể giữ lâu vài tuần.

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

ny

C

on

fid

2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff.

GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia

3.6.1.1 Chuẩn bị dịch thử

l

25

Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff vào dung dịch acid loãng có chứa alcaloid, nếu có alcaloid sẽ xuất hiện tủa màu cam – nâu. 3.6.2 Phương pháp xác định hợp chất saponin [11] lọc bốc hơi đến cắn khô. Dùng cắn để làm các phản ứng định tính. 3.6.2.1 Thử nghiệm tính tạo bọt

Một đặc tính quan trọng của saponin là tính tạo bọt, nên đây là một trong những phương pháp chính xác để định tính sự hiện diện của saponin. Cách tiến hành: Hòa tan một lượng cắn tương ứng với 1 gam dược liệu vào 5 ml nước nóng. Lọc vào một ống nghiệm 1,6 – 16 cm và để nguội, thêm nước cho đủ 10 ml, dùng ngón tay cái bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 1 phút (khoảng 30 lần lắc). Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt và đánh giá kết quả: Bọt bền trong 15 phút: Bọt bền trong 30 phút: Bọt bền trong 60 phút: +

C

3.6.1.2 Thử nghiệm Fontan – Kaudel Lấy một lượng cắn tương ứng với 1 gam bột dược liệu, đun nóng nhẹ trên cách thủy để hòa tan với 10 ml nước. Chia đều vào 2 ống nghiệm. Ống 1: thêm 2 ml HCl 0.1N (pH =1) Ống 2: thêm 2 ml NaOH 0.1N (pH =13)

C

om pa

Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc cả 2 ống trong 1 phút và để yên, ü Nếu cột bọt trong cả 2 ống cao ngang nhau và bền như nhau, thì sơ bộ xác định là có saponin triterpenoid. định là có saponin steroid.

quan sát các cột bong bóng trong cả 2 ống nghiệm.

ü Nếu ống pH = 13 có cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, sơ bộ xác

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

ny

on
++ +++

fid

GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia

Chiết 10 gam dược liệu với cồn 70% bằng cách ngâm trong 24 giờ rồi lọc. Cô dịch

l

26

3.6.3 Định tính triterpenoid (bằng phản ứng Liebermann – Burchard) Chiết 10 – 20 gam bột dược liệu bằng diethylether lắc trong bình nón, trong 10 – 20 phút, chiết cho tới khi dịch ether sau khi bốc hơi không còn để lại lớp cắn mờ trên mặt kính đồng hồ, gộp các dịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50 ml dịch chiết ether.

Lấy 5 ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hới tới cắn. Hòa tan cắn với 0,5 ml anhydrid acetic, rồi thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform. Chuyển dung dịch vào 1 ống nghiệm nhỏ khô, dùng pipet pasteur thêm cẩn thận 1 – 2 ml H2SO4 đậm đặc lên thành ống nghiệm để nghiên cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp phía dung dịch trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím. Kết luận có triterpenoid 3.6.4 Định tính acid hữu cơ

Lấy 2 ml dịch chiết nước cho vào một ống nghiệm. Thêm vào dung dịch một ít tinh thể natri Na2CO3. Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2CO3 thì kết luận

3.7 ĐỊNH LƯỢNG POLYSACCHARIDE (GLPs) [15, 16] Polysaccharide có nhiều dạng và nhiều qui trình chiết khác nhau. Chiết GLPs ở 100oC trong 16 giờ, cho năng suất ly trích cao, nhưng làm biến đổi cấu trúc sinh học các polysaccharides có trong nấm Linh chi. Một qui trình thứ hai được ứng dụng rộng rãi để chiết các GLPs ở nhiệt độ thấp, nhằm ổn định cấu trúc sinh học của các GLPs.

C

om pa

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

ny

C

là có acid hữu cơ.

on

fid

GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia

l

27

Sinh khối nấm Linh Chi

Nghiền

Hổn hợp chiết rút lần 1

Dịch chiết lần 2

C

ny

C

om pa

Hình 3.1: Qui trình chiết suất polysaccharides từ nấm Linh chi (Yihuai Gao và ctv, 2001) Thu nhận cả 3 dịch chiết và đem đi lọc. Lấy phần cặn (dịch lơ lửng sau khi lọc) đem đi sấy khô và cân trọng lượng. Từ đó đánh giá hàm lượng polysaccharide thô có trong quả thể nấm Linh chi.

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

on

Hỗn hợp chiết rút lần 2

Bã chiết lần 2 -Ngâm trong cồn 80% ở 70oC trong 2 giờ Dịch chiết lần 3

fid

Dịch chiết lần 1

Bã chiết lần 1

-Ngâm trong nước 70oC trong 3 giờ

GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia

-Ngâm nước 70oC trong 3 giờ

l

28

Phần 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1 QUAN SÁT HÌNH THÁI GIẢI PHẨU CỦA NẤM LINH CHI (GANODRMA

4.1.1 Hình thái quả thể nấm Linh chi sinh học ứng dụng trước đó, có hình dạng như sau :

Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được nuôi trồng tại Phòng thí nghiệm, Khoa

Hình 4.1: Hình thái nấm Linh chi nấm to (đường kính 2- 3 cm), lớp vỏ cuống láng, đỏ nâu. Mũ nấm hình quạt, đôi khi có màu vàng chanh – vàng cam cho đến đỏ tươi, càng về già thì màu càng sẫm lại. Kích thước từ 3 – 12 cm, dày từ 1 – 3,5 cm. Phần đính cuống gồ lên hoặc lõm xuống. Mặt dưới

C

om pa

thể quả thường màu trắng kem – hơi vàng, có nhiều lỗ nhỏ. Đây là lớp bào tầng sinh sản của nấm, chính những lỗ này là nơi phóng thích bào tử khi quả thể trưởng thành. Mật độ lỗ khoảng 3 – 5 ống/mm2, miệng lỗ gần tròn. Khi chúng tôi bổ đôi quả thể ra thì thấy đây là những ống thẳng, chiều dày từ 0,3 – 1,5 cm. Khi bào tử đảm chín thì nó được phóng thích dọc theo ống này và thoát ra ngoài qua miệng lỗ ống. Còn phần thịt nấm ở trên thì có màu vàng nâu đến nâu đỏ. Phân cách giữa phần trên và phần dưới (tầng sinh sản) là khá rõ ràng vì phần trên thì các lớp tia sợi hướng lên, còn phần dưới thì là ống thẳng hướng xuống.

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

ny

hình dị dạng, mặt mũ nấm láng, đỏ nâu, có vân gợn đồng tâm. Khi còn non, tai nấm có

C

Nhận xét: Quả thể của nấm Linh chi thu hái được có cuống ngắn, đính bên, cuống

on

fid
GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia

l

LUCIDUM)

29

4.1.2 Hệ sợi nấm Ganoderma lucidum

Hình 4.2: Hình thái sợi nấm Linh chi (vật kính dầu x100) 4.1.3 Cấu trúc bào tử nấm Ganoderma lucidum

Bào tử đảm có dạng hình trứng, chúng ta có thể thấy rõ trên cả 2 hình đều có đầu

thủng (porus, lacunae) và có kích thước bào tử khoảng 8 – 11 x 6 – 8 µm

Hình 4.3: Cấu trúc bào tử nấm Ganoderma lucidum

C

om pa

4.2 SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM) 4.2.1 Tốc độ sinh trưởng hệ sợi nấm Ganodrma lucidum trên các môi trường lỏng 4.2.1.1 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4 đến tốc độ tăng sinh khối sợi nấm Mg2+ là khoáng chất cần thiết cho sự hoạt động một số loại enzym, giúp quá trình

Linh chi trong môi trường lỏng sinh tổng hợp các chất tham gia xây dựng tế bào được xảy ra nhanh hơn. Trong thí

nghiệm này chúng tôi sử dụng MgSO4 ở các hàm lượng khác nhau. Từ đó, chúng tôi có thể xác định được hàm lượng MgSO4 cần thiết để quá trình tạo sinh khối xảy ra nhanh nhất.

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

ny

C

on
GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

fid

chóp tròn - nhọn, phồng căng. Bào tử nấm Linh chi có cấu trúc vỏ kép, có kiến tạo lỗ

en tia

l

30

Thí nghiệm được bố trí 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa 20ml môi trường Bảng 4.1: ảnh hưởng của MgSO4 lên môi trường Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 NT4
0.5 khối lượng sinh khối (g/20ml) 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 NT1

Môi trường nuôi cấy PG + 1 g/l MgSO4 PG + 2 g/l MgSO4 PG + 3 g/l MgSO4 PG + 4 g/l MgSO4

Khối lượng (g/20ml)

ny

C

NT2

on
NT3 NT4 Nghiệm thức

C

om pa

Biểu đồ 4.1: Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4 đến tốc độ tăng sinh khối Nhận xét: Dựa vào biểu đồ 4.1, chúng tôi nhận thấy khi sử dụng MgSO4 ở mức 1g/l thì sinh

khối phát triển chậm nhất và khi tăng dần hàm lượng MgSO4 lên 3g/l thì lượng sinh khối

thu được cao nhất 0,466 g/20ml và khi tăng hàm lượng MgSO4 lên 4g/l thì lượng sinh khối giảm đáng kể chỉ còn 0,379 g/20ml Điều này có thể khi tăng Mg2+ vượt quá mức chịu đựng của tế bào, sẽ ức chế sự

hoạt một số enzyme cần thiết trong quá trình tổng hợp tế bào cũng như sẽ giảm các phản ứng tổng hợp trong tế bào sợi nấm.

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

fid
GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia
0,346 0,466 0,379

0,178

l

31

Kết luận: Chúng tôi chọn hàm lượng MgSO4 là 3 g/l làm giá trị thực nghiệm cho bước thí nghiệm qui hoạch tiếp theo. 4.2.1.2 Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến tốc độ tăng sinh khối trong môi trường lỏng đồng yếu tố (cofactor), cung cấp cho các loại enzym hoạt động. Đồng thời, Kali đóng vai trò cân bằng khuynh độ (gradient) bên trong và ngoài tế bào. Nguồn phosphate tham gia tổng hợp ATP, acid nucleic, phospholipid màng. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát hàm lượng KH2PO4 thích hợp cho môi trường nuôi cấy tơ nấm Linh chi 20ml môi trường Thí nghiệm được bố trí 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa Bảng 4.2: ảnh hưởng của KH2PO4 đến tốc độ tăng trưởng Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 NT4
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 NT1 NT2 NT3 NT4 Nghiệm thức

Môi trường nuôi cấy PG + 0,5g/l KH2PO4 PG + 1,5g/l KH2PO4

on

C

PG + 1g/l KH2PO4 PG + 2g/l KH2PO4

khối lượng sinh khối (g/20ml)

C

om pa

Biểu đồ 4.2: Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến tốc độ tăng sinh khối
SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

ny

0.45 0.35 0.25 0.15 0.05

fid

Khối lượng (g/20ml) 0,322 0,475 0,449 0,364

en tia

KH2PO4 là nguồn cung cấp kali và photphat cho nấm. Nguồn kali đóng vai trò làm

l

32

Nhận xét: Dựa và biểu đồ 4.2, chúng tôi nhận thấy khi tăng hàm lượng KH2PO4 lên dần thì lượng sinh khối tăng. Mặt khác, khi hàm lượng KH2PO4 sử dụng vượt quá mức chịu đựng của tế bào nấm Linh chi thì lượng sinh khối thu được giảm. Lượng sinh khối thu được cao lượng sinh khối thu được thấp nhất 0,322 g/20ml nhất là 0,475 g/20ml khi hàm lượng KH2PO4 là 2 g/l. Khi lượng KH2PO4 là 1 g/l thì Kết luận: Trong thí nghiệm này, chúng tôi chọn hàm lượng KH2PO4 là 1 g/l làm giá trị thực nghiệm cho bước thí nghiệm qui hoạch tiếp theo. 4.2.1.3 Ảnh hưởng của hàm lượng Glucose đến tốc độ tăng sinh khối trong môi Nguồn cacbon dùng để tổng hợp nên các chất: hydratcacbon, amino acid, acid nucleic, lipid… cần thiết cho sự phát triển của nấm. Trong sinh khối nấm, cacbon chiếm nửa trọng lượng khô, đồng thời nguồn cacbon cung cấp năng lượng cho quá trình trao đổi chất. Đối với các loài nấm khác nhau thì nhu cầu cacbon cũng khác nhau. Trong thí nấm Linh chi trên môi trường lỏng ở các mức thay đổi khác nhau. Thí nghiệm được bố trí 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa 20ml môi trường Bảng 4.3: Ảnh hưởng của Glucose đến tốc độ tăng trưởng nghiệm này, chúng tôi khảo sát hàm lượng Glucose ảnh hưởng tới tốc độ tạo sinh khối sợi

om pa

Nghiệm thức NT1 NT2

ny

Môi trường nuôi cấy P + 10 g/l Glucose P + 15 g/l Glucose P + 20 g/l Glucose P + 25 g/l Glucose P + 30 g/l Glucose

C

on

NT3 NT4 NT5

C

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

fid

trường lỏng

Khối lượng (g/20ml) 0,389 0,414 0,435 0,247 0,215

GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia

l

33

Khối lượng sinh khối (g/20ml)

0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.2 0.15 0.1 0.05 0 NT1 NT2 NT3 Nghiệm thức 0.25

NT4

Biểu đồ 4.3: Ảnh hưởng của hàm lượng Glucose đến tốc độ tăng sinh khối Nhận xét: Dựa vào biểu đồ 4.3, chúng tôi nhận thấy khi tăng hàm lượng Glucose tăng lên dần càng giảm. Hàm lượng Glucose đạt mức 20g/l thì lượng sinh khối thu được là cao nhất

Kết luận: Trong thí nghiệm này, chúng tôi chọn hàm lượng glucose là 20 g/l làm giá trị thực nghiệm cho bước thí nghiệm qui hoạch tiếp theo.

C

om pa

4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA pH LÊN MÔI TRƯỜNG CẤY Hầu hết môi trường nuôi cấy đều có pH tối thích cho quá trình phát triển của từng

giống. Sự tăng hoặc giảm pH (chính là sự tăng hoặc giảm H+) trong môi trường nuôi cấy

sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển của hệ sợi tơ nấm Linh chi. Chúng tôi tiến hành cấy giống trong chai thuỷ tinh 100ml, chứa một lượng môi

trường là 20ml. Trước khi hấp thanh trùng, ta chỉnh pH môi trường trong các mẫu về các

giá trị : pH =3,5 ; pH =4; pH =4,5; pH =5; pH =5,5; pH =6,8; pH =7. Sau đó tiến hành cấy

giống bằng cách gắp một hạt lúa cho vào chai.

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

ny

0,435 g/20ml.

C

thì sinh khối sở nấm tăng. Khi hàm lượng Glucose càng tăng thì lượng sinh khối thu được

on

fid

GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia
NT5

l

34

Bảng 4.4: Ảnh hưởng pH lên tốc độ tạo sinh khối của Linh Chi
pH Khối lượng (g/20ml) TN 1 TN 2 Trung bình 0,193 0,111 0,152 0,225 0,241 0,233 0,348 0,290 0,319 0,333 0,366 0,349

3,5

4

4,5

5

5,5

6,8

7

Khối lượng sinh khối (g/20ml)

0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0

ny

3,5

4

C

on
4,5 5 pH 5,5 6,8 7

om pa

Biểu đồ 4.4: Ảnh hưởng của pH lên sự tăng sinh khối của Ganoderma lucidum

Nhận xét

Dựa vào biểu đồ trên chúng tôi nhận thấy sinh khối tơ nấm Linh chi có khả năng

tăng trưởng tốt trong khoảng pH = 4,5 đến pH = 7,0. Khi nuôi cấy trong mô trường có pH = 3,5 thì khối lượng sinh khối thấp nhất 0,152 g/20ml. Sinh khối nấm tăng dần theo giá trị của pH, nhưng khi tăng giá trị pH 6,8 thì sinh khối giảm 0,341 g/20ml và giảm dần cho

C

đến pH = 7,0 trong cùng một điều kiện nuôi cấy.

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

fid
GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia
0,344 0,386 0,365 0,346 0,336 0,341 0,278 0,270 0,274

l

35

Kết luận Như vậy chúng tôi chọn được giá trị pH = 5,5 là giá trị pH tối thích cho sự phát triển của tơ nấm với lượng sinh khối cao nhất đạt 0,365 g/20ml. 4.4 ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA NẤM LINH CHI

Quá trình sinh trưởng của tơ nấm phải trải qua 4 giai đoạn: giai đoạn thích nghi, giai đoạn phát triển, giai đoạn cân bằng và giai đoạn già cỗi. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành nuôi cấy sinh khối trong trong những chai nhỏ 100ml, chứa 20ml môi trường PG + MgSO4 + KH2PO4. Điều chỉnh về pH 5,5 rồi sau đó đem đi hấp thanh trùng. Mỗi được sấy khô ở 500C - 600C sau đó đi cân và ghi nhận số liệu.

Bảng 4.5: Khối lượng sinh khối nấm Linh chi thay đổi theo thời gian khi nuôi cấy trong môi trường lỏng

(ngày) TN LẦN 1 LẦN 2 TB

3 NGÀY 0,114 0,144

6

C

Thời gian

9

on
12 NGÀY 0,699 0,685 15 NGÀY 0,773 0,787 18 NGÀY 0,781 0,819 21 NGÀY 0,790 0,820 NGÀY 0,251 0,265 NGÀY 0,451 0,461 0.258 0.456 0.692 0.78 0.8 0.805
GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

C

om pa

0.129

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

ny

fid

lần cấy gắp 1 hạt lúa cho vào chai. Khoảng thời gian lấy mẫu là cách nhau 3 ngày. Mẫu

en tia

l

36

0.9 Khối lượng sinh khối (g/20ml) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 3 6 9 12 Ngày 15

Đồ thị 4.1: Đường cong sinh trưởng của Ganoderma lucidum

Đường cong sinh trưởng là một yếu tố quan trọng trong quá trình nuôi cấy sinh khối sợi nấm Linh chi. Dựa vào đồ thị ta biết chính xác được khoảng thời gian nào sinh khối phát triển mạnh nhất, lúc nào sinh khối ổn định và lúc sinh khối bắt đầu già đi. Từ đường cong sinh trưởng chúng tôi nhận thấy: • Đến ngày thứ 12, sinh khối phát triển nhưng không nhanh, tơ nấm dần dần chuyển • Trong 6 ngày đầu, tơ nấm thích nghi với môi trường, sinh khối tăng lên rất ít

C

om pa

sang màu vàng

• Từ ngày 12 đến ngày 15, sinh khối phát triển vượt bậc • Từ ngày 15 trở đi sinh khối tăng rất chậm, tơ nấm từ vàng nhạt chuyển sang màu vàng đậm

ny

Hình 4.4: Sinh khối sợi nấm
SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

C

on
15 ngày

Nhận xét

fid

en tia
18 21

l

37

4.5 TỐI ƯA HÓA THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG LỎNG NUÔI CẤY HỆ SỢI GANODERMA LUCIDUM BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM Chúng tôi xác định điền kiện tối ưu để thu được sinh khối cực đại, chúng tôi tiến hành tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp qui hoạch Xét k=3 nhân tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm (Glucose, KH2PO4, MgSO4) và mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần Hàm mục tiêu Y là sinh khối Ganoderma lucidum Bảng 4.6 : Mức biến thiên của các nhân tố sinh trưởng Các yếu tố (g/l) Các mức Mức cơ sở Khoảng biến thiên Mức trên Mức dưới Trong đó x1 3,0 0,5 3,5 2,5

x2

on
0,2 1,2 0,8 y1 0,495 0,51 Y2 0,501 0,513

1,0

C

x1 : Hàm lượng MgSO4 bổ sung vào môi trường khoai tây ( g/l)

C

om pa

x2 : Hàm lượng KH2PO4 bổ sung vào môi trường khoai tây ( g/l) x3 : Hàm lượng glucose bổ sung vào môi trường khoai tây ( g/l) y1 : Khối lượng sinh khối Ganoderma lucidum ở lần lặp thứ 1 (g/20ml)

y2 : khối lượng sinh khối Ganoderma lucidum ở lần lặp thứ 2 (g/20ml)

y3 : khối lượng sinh khối Ganoderma lucidum ở lần lặp thứ 3 (g/20ml)

Ytb : là khối lượng trung bình của sinh khối Ganoderma lucidum trong 3 lần lặp lại Bảng 4.7 : kết quả thí nghiệm theo phương pháp thực nghiệm Số TN 1 2
x1 x2 x3

ny

fid
x3
2 22 18 20 Y3 0,516 0,519 Ytb 0,504 0,514
GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

3,5 2,5

1,2 1,2

22 22

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

en tia

thực nghiệm và tiến hành như sau:

l

38

3 4 5 6 7 8

3,5 2,5 3,5 2,5 3,5 2,5

0,8 0,8 1,2 1,2 0,8 0,8

22 22 18 18 18 18

0,534 0,537 0,534 0,573 0,528 0,474

0,522 0,534 0,537 0,51 0,576 0,54

0,528 0,534 0,543 0,537 0,57

0,528 0,535 0,538 0,54 0,558 0,519

Si2 =

( y1 − y)2 + ( y2 − y)2 + ( y3 − y)2 với k là số lần lặp lại thí nghiệm, k=3 k −1
2 i

∑S
Gtt =

=0,000378

f=k–1=2 N=8

C

om pa

Thu được Gtb = 0,5157

Vậy Gtt = 0,4471 < Gtb = 0,5157 . Nên các phương sai đồng nhất, thí nghiệm lặp lại

có nghĩa.

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

ny

Tra bảng với các thông số

C

2 Smax = 0, 4471 ∑ Si2

on
GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

fid

Kiểm tra sự đồng nhất của các phương sai S i2 theo tiêu chuẩn Cochran: y1 + y 2 + y 3 y = (trung bình cộng của ba lần thí nghiệm) 3

en tia
0,543

l

39

0.57 Khối lượng sinh khối (g/20ml) 0.56 0.55 0.54 0.53

0.5 0.49 0.48 0.47 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Nghiệm thức

Biểu đồ 4.5: Biểu đồ thí nghiệm theo phương pháp thực nghiệm Sau khi tiến hành thí nghiệm tối ưu theo qui hoạch thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy nghiệm thức số 7 có các thành phần như sau: MgSO4 (3,5 g/l); KH2PO4 (0,8 g/l) và Glucose (18 g/l) thì sinh khối nấm Linh chi khô là cao nhất đạt 0,558 g/20ml. Để tiến hành thu sinh khối sợi nấm Linh chi phục vụ cho thử nghiệm sản xuất trà túi lọc và phân tích các hoạt chất có trong hệ sợi. Chúng tôi, tiến hành pha môi trường trường PG có bổ sung các thành phần các hoạt chất như trên và nuôi cấy tĩnh hệ sợi nấm Linh chi. Kết quả cho thấy, lượng sinh khối nấm Linh chi sau 15 ngày đạt năng suất 17 g/l. 4.6 XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT CÓ TRONG NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM) 4.6.1 Định tính alkaloid • Thử nghiệm 1 Cho dịch chiết bột tơ nấm Linh chi đỏ tác dụng với thuốc thử Mayer và thuốc thử ống 1 : dịch chiết tơ nấm Linh chi đỏ + thuốc thử Dragendoff ống 2: dịch chiết tơ nấm Linh chi đỏ + thuốc thử Mayer 1 2

C

om pa

Dragendoff

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

ny

C

on

fid

GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia
NT6 NT7 NT8

0.51

l

0.52

40

Hình 4.5: Định tính alcaloid với thuốc thử Mayer và Dragendoff Kết quả Dựa và kết quả thử nghiệm trên ta thấy

Ống 1: Khi dịch chiết tác dụng với thuốc thử Dragendoff thì dung dịch chuyển sang màu nâu nhưng không có kết tủa • Thử nghiệm 2 Ống 2: Dịch chiết có màu vàng nhạt, xuất hiện kết tủa trắng

C

C

om pa

Hình 4.6: Định tính alcaloid với thuốc thử Mayer và Dragendoff

Kết quả

Ống 1: xuất hiện màu vàng nhưng không có kết tủa

Ống 2: màu hơi đục xuất hiện kết tủa nhưng với hàm lượng rất ít

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

ny

on
1 2

fid

GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia

l

41

Nhận xét: Dịch chiết nấm Linh chi ở phần 1 đem thử nghiệm với 2 loại thuốc thử Mayer và Dragendorff thì nhận thấy kết quả là dương tính. Đối với dịch chiết ở phần 2 đem thử nghiệm thì kết quả là âm tính: tự do (N sẽ biến thành NH+ tan trong nước), alcaloid dạng thứ cấp N+, dạng N – oxid (N+ -> O), dạng glycosid, alcaloid loại có tính phân cực mạnh, nhưng sẽ trích luôn những hợp chất có chứa nitơ (protein, glycoprotein, nucleotide)… là những hợp chất tuy không phải là alcaloid nhưng có thể cho kết quả dương tính với thuốc thử. Bột dược liệu trích với dung môi hữu cơ – kiềm sẽ không trích được những alcaloid dạng N – oxid, dạng N tứ cấp, dạng tan tốt trong nước. Phương pháp này trích tốt các alcaloid dạng baz tự do có tính phân cực kém và tính baz yếu, cũng như các alcaloid có cấu trúc đặc thù –C=C –N – . Kết luận: hoạt chất alcaloid có trong tơ nấm Linh chi đỏ với hàm lượng rất thấp 4.6.2 Định tính saponin Bột dược liệu trích với nước – acid: có thể trích hết tấc cả các alcaloid ở dạng baz

4.6.2.1 Thử nghiệm tính tạo bọt

C

om pa

Hình 4.7: thử nghiệm tính tạo bọt từ sinh khối nấm Linh chi Độ bền của bọt Sau 15 phút Sau 30 phút Sau 60 phút

Kết quả:

ny

C

nên những phương pháp định tính không thấy đươc sư hiện diện của chúng

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

on
Kết quả + ++ +++

fid

GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia

l

42

Độ bền của bọt đều bền vững sau 60 phút. Như vậy dược liệu từ sinh khối có chứa hoạt chất saponin 4.6.2.2 Thử nghiệm Fontan – Kaudel Ống 1: dịch chiết sau khi cho acid vào Ống 2: dịch chiết sau khi cho bazo vào 1 2

Hình 4.8: Thử nghiệm saponin toàn phần theo Fontan – Kaudel Kết quả 3 lần cột bọt trong ống nghiệm 1

luận là có saponin steroid.

4.6.3 Định tính triterpenoid

om pa

ny

Như vậy, trong môi trường kiềm bọt bền hơn trong môi trường acid. Sơ bộ kết

C

Bọt trong 2 ống nghiêm đều bền hơn 15 phút, bọt trong ống nghiệm 2 cao hơn gấp

1

C

Hình 4.9: Định tính triterpenoid bằng phản ứng Liebermann – Burchard

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

on
2

fid
GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia

l

43

Kết quả thí nghiệm nhận thấy sinh khối và quả thể nấm Linh chi có chứa hoạt chất triterpenoid (môi trường chuyển sang màu xanh lục sau khi cho acid H2SO4 đậm đặc vào từ từ). Ống 1(đối chứng): nước cất + acid 4.6.4 Định tính acid hữu cơ Ống 2: Dịch chiết + acid đậm đặc

Hình 4.10 : Định tính acid hữu cơ có trong quả thể Linh chi. Sau khi cho dịch chiết nước bột tơ và quả thể nấm Linh chi đỏ tác dụng với tinh thể Na2CO3 và hơ nóng thì nhận thấy có bọt khí xuất hiện rất ít và bay ra. Như vậy, dịch chiết nước từ tơ nấm Linh chi đỏ có chứa hàm lượng rất ít thành phần acid hữu cơ. Tiến hành ly trích polysaccharides từ 10 gam nấm Linh chi đã sấy khô theo qui trình thí nghiệm. Sau quá trình lọc và sấy khô thu nhận được 0.3144 gam polysaccharide 4.6.5 Định lượng polysaccharide từ sinh khối nấm Linh chi

C

om pa

thô. Như vậy hàm lượng polysaccharide thô có trong quả thể nấm Linh chi đỏ chỉ đạt

khoảng 0.31%.

Hình 4.11: hình ảnh polysaccharide kết tủa sau khi lọc
SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

ny

C

on

fid

en tia

l

44

Phần 5: KẾT LUẬN
5.1. KẾT LUẬN - Xác định đường cong sinh trưởng của sợi nấm Linh chi trên môi trường PG. - Xác định điều kiện nuôi cấy tốt nhất cho sự phát triển của sợi nấm Linh chi + pH môi trường nuôi cấy: pH = 5,5 Qua thí quá trình nghiên cứu, chúng tôi đạt được một số kết quả sau:

- Tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy theo phương pháp qui hoạch thực nghiệm. Kết quả về thành phần môi trường tốt nhất như sau » Ø Glucose : 18g/l Ø KH2PO4 : 0,8g/l Ø MgSO4 : 3,5g/l Ø Khoai tây : 200g/l

- Sinh khối hệ sợi (Ganoderma lucidum) có chứa các thành phần hóa học: Saponine, saponin triterpenoid, acid béo và hàm lượng polysaccharide thô ly trích được trong sinh khối nấm Linh chi là khoảng 0,31% 5.2 ĐỀ NGHỊ

C

om pa

Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn nên tôi chưa thể nghiên cứu đầy đủ về nấm

Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum), đề nghị nghiên cứu thêm về: ü Khảo sát sâu hơn tác dụng của một số khoáng chất khác và thành phần hóa học, tác dụng dược lý, lâm sàng. Nhằm hoàn thiện quy trình nuôi cấy trong môi trường lỏng và có thể ứng dụng trong ngành dược và ngành sản xuất trà thảo dược.

ü Nghiên cứu ứng dụng sản phẩm tơ nấm Linh chi, nhằm đa dạng hóa sản phẩm các sản phầm từ hệ sợi nấm.

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

ny

C

Lượng sinh khối thu được sau 15 ngày là 17g/l.

on
GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

fid

en tia

l

45

Phần 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt 1. Đoàn Sáng, 2003 Linh chi nguyên chất và bệnh thời nay. Nhà xuất bản Y học, Hà nội, Việt nam. 2. Lê Xuân Thám, 1996. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và đặc điển hấp thu khoáng nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss.ex Fr).Karst. Luận án phó tiến sỹ khoa học sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà nội, Việt nam. 3. Lê Xuân Thám, 1996. Nấm Linh chi - dược liệu quí ở việt nam. Nhà xuất bản mủi cà mau. 4. Lê Duy Thắng, 2001. Kỹ thuật nuôi trồng nấm ăn, tập 1. Nhà xuất bản Nông nghiệp.

5. Nguyễn Lân Dũng, 2001. Công nghệ nuôi trồng nấm, tập 1 và 2. Nhà xuất bản 6. Nguyễn Hữu Đống, 2003. Nuôi trồng chế biến nấm ăn và nấm làm thuốc chữa bệnh. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà nội. 7. Nguyễn Hữu Đống và Đinh Xuân Linh, 2000. Nấm ăn nấm dược liệu - công dụng và công nghệ nuôi trồng. Nhà xuất bản Hà nội. 8. Nguyễn Hữu Đống, Nguyễn Thị Sơn và Zani Federico, 2002. Cơ sở khoa học và công nghệ nuôi trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà nội. công nghệ sinh học, tập 2, thí nghiệm vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TPHCM. 9. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền và Nuyễn Ánh Tuyết, 2003. Thí nghiệm

C

om pa

10. Nguyễn Phước Nhuận, 2001. Giáo trình sinh hoá học, phần 1. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TPHCM.

11. Trần Hùng, 2004. Phương pháp nghiên cứu dược liệu. Đại học Y Dược TP.HCM. 12. Trần Văn Mão, 2004. Nuôi trồng chế biến nấm ăn và nấm làm thuốc chữa bệnh. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà nội.

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

ny

C

Nông nghiệp, Hà nội.

on

fid

GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia

l

46

Tài liệu tiếng anh 13. Steyaert R.L, 1972. Species of Ganoderma and related genera mainly of the

14. Shufeng Zhou, A clinical Study of a Ganoderma lucidum extract in patients with type II diabetes mellitus. Division of Pharmacology and Clinical Pharmacology, Faculty of Medicine and Health Science, Auckland University, Auckland, New Zealand.

15. Yihuai Gao, Guoliang Chen, Jin Lan, He Gao and Shufeng Zhou, 2001. Extractoin of Ganoderma polysaccharides at relatively low temperature. Froc Int Symposium Ganoderma Sci, Auckland.

Ganoderma polysaccharides. Int Med Complement Med Vol 1, Supplement 1,0000.

17. Zhaoji – Ding, 1980. The Ganodermataceae in chine. Berlin Shiffigart.

18. http://www.About Lingzhi.htm

C

om pa

19. http://www .activeCompoundsReishi.html

20. http://www. Biomed~1.htm 21. http://www.bfa-ernaehrung.de/Deutsch/Information/pflanzenstoffe/artikel3.pdf 22. http://www. Mushroom Information Gano HIV.mht

23. http://203.162.44.79/khcn/magazine/Tap7/So6/06.htmđnh5

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh

ny

Tài liệu internet

C

on

16. Yihuai Gao, Jin Lan and Zhifang Liu, Extraction and determination of

fid

GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

en tia

l

boyor and leiden herbaria. National de Beigique, Burxelle.

You're Reading a Free Preview

Tải về
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->