Professional Documents
Culture Documents
Phần 1: MỞ ĐẦU
l
tia
loại thượng dược. Cách đây hàng ngàn năm, nấm Linh chi đã được dùng để làm thuốc,
các sách dược thảo của nhiều triều đại ở Trung Quốc đều ghi nhận Linh chi được sử dụng
làm thuốc từ lâu đời. Giá trị dược liệu của Linh chi đã dược ghi chép trong các thư tịch cổ
en
của Trung Quốc, cách nay hơn 4000 năm (Zgao, J.D., 1994). Từ những kinh nghiệm lưu
truyền trong nhân gian, loài người đã biết sử dụng Linh chi theo nhiều cách khác nhau.
fid
Đến nay khoa học kỹ thuật phát triển, nấm Linh chi còn được các nhà khoa học trên
thế giới chứng minh được tác dụng hữu ích trong việc điều trị bệnh: ung thư, cao huyết
áp, tiểu đường, tim mạch, HIV, viêm gan siêu vi, suy nhược thần kinh… [3, 9]
on
Hiện nay Linh chi không còn khan hiếm như lúc trước do con người có thể áp
dụng kỹ thuật để nuôi trồng Linh chi trong môi trường nhân tạo và ngày càng phát triển
C
mạnh trên thế giới và đạt đến quy mô công nghiệp. Trong hai thập niên gần đây, các nhà
khoa học ở nước Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Singapore, Hongkong đã tăng cường
ny
nghiên cứu sản xuất nấm Linh Chi và mở rộng hiệu quả sử dụng dược liệu này.
Tại thị trường Việt Nam, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi làm thuốc chữa bệnh ở
trong nước cũng như xuất khẩu ngày càng tăng. Nhiều cơ sở đã tiến hành nghiên cứu nuôi
pa
trồng, chế biến và thăm dò các hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi. Các thành phần
hóa học có trong nấm Linh chi rất phong phú bao gồm các nhóm: acid béo, steroid,
om
alcaloid, protein, polysaccharide… [19]. Trong đó thành phần có tác dụng dược lý quý
báu, đặc trưng cho nấm Linh chi phần lớn thuộc nhóm triterpenoid [2].
Việt Nam với khí hậu nhiệt đới gió mùa và nguồn nguyên liệu cellulose dồi dào, đã
C
tạo điều kiện cho nghề trồng nấm không ngừng phát triển. Hiện nay cả nước có 32/61 tỉnh
thành đã có cơ sở nuôi trồng nấm dược liệu (tháng 12/2001) [6].
Dựa vào tình hình ngày càng phát triển của ngành nấm ở Việt Nam và sự cho phép
của bộ môn công nghệ sinh học của Trường Cao đẳng Kinh tế – Công nghệ TP. Hồ Chí
Minh chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối sợi
nấm Ganoderma lucidum”.
1.2 MỤC ĐÍCH
Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối tơ nấm Linh chi.
l
1.3 YÊU CẦU
tia
Ø Xác định ảnh hưởng các yếu tố dinh dưỡng đến tốc độ tăng trưởng của sợi nấm
Linh chi
Ø Xác định ảnh hưởng các yếu tố pH đến tốc độ tăng trưởng của sợi nấm Linh chi
en
Ø Xác định đường cong tăng trưởng của sợi nấm Linh chi
Ø Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy sợi nấm Linh chi theo quy trình thực nghiệm
fid
Ø Phân tích thành phần hoạt chất có trong sợi nấm Linh chi
1.4 HẠN CHẾ ĐỀ TÀI
on
Chưa khảo sát hết các yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng đến tốc độ tăng sinh khối nấm
Linh chi.
C
ny
pa
om
C
l
tia
Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum, người miền Bắc xưa còn
gọi là nấm lim. Trong thư tịch cổ nấm Linh chi còn được gọi với tên khác như Tiên thảo,
Nấm trường thọ, Vạn niên nhung…
en
Nấm Linh chi thường phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, chúng thường
phát triển trên giá thể là gỗ mục hoặc các nguyên liệu có chất sơ.
fid
Hình thái quả thể nấm Linh chi được mô tả như sau: Tai nấm hóa gỗ, hình quạt
hoặc thận. Mặt trên mũ có vân đồng tâm và bóng loáng, màu vàng cam cho đến màu đỏ
đậm hoặc nâu đen. Mặt dưới phẳng, có nhiều lổ nhỏ li ti, là cơ quan sinh bào tử. Cuống
on
nấm đặc và cứng, sậm màu và bóng loáng.
Giá trị dược liệu của Linh chi đã được ghi chép trong các thư tịch cổ của Trung
C
Quốc, cách nay hơn 4000 năm (Zgao, J.D., 1994). Trong sách “Thần nông bản thảo“ cách
đây khoảng 2000 năm thời nhà Châu và sau đó được nhà dược học nổi tiếng Trung Quốc
ny
Lý Thời Trân phân ra thành “Lục Bảo Linh Chi“ thời nhà Minh với các khái quát công
dụng dược lý khác nhau, ứng theo từng màu (Lý Thời Trân, 1590).
Theo Lý Thời Trân thì nấm Linh chi có 6 màu khác nhau:
pa
Cấu trúc độc đáo của Linh chi chính là thành phần khoáng vi lượng đủ loại, trong
đó một số khoáng tố như germanium, vanadium, crôm... Chúng đã được sử dụng là nhân
tố quan trọng cho nhiều loại phản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa, đông máu
nội mạch, giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc của nhân tế bào với hàm
l
lượng rất thấp
tia
Ở các nước Châu Á, đặc biệt là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan…,
việc nghiên cứu phát triển và sử dụng Linh chi đang được công nghiệp hóa với quy mô
lớn về phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào chế dược phẩm. Đồng thời nghiên
en
cứu được các hoạt chất có tác dụng dược lý và phương pháp điều trị lâm sàng.
Ở Việt Nam, trong các tài liệu lưu lại của Hải Thượng Lãn Ông, Lê Hữu Trác
fid
(1720-1791) cũng thấy đề cập đến Linh chi. Sau đó, Lê Quý Đôn còn khẳng định, đây là
nguồn sản vật quý hiếm của đất rừng Đại Nam. Trong quyển “Cây thuốc và vị thuốc Việt
on
Nam” (1991), giáo sư Đổ Tất Lợi còn mô tả chi tiết và trình bày về đặc tính trị liệu của
loài nấm này, đồng thời cho rằng đây là loại Siêu thượng dược.
2.1.2 Vị trí phân loại [5, 7]
C
Nấm Linh chi có vị trí phân loại được thừa nhận rộng rãi hiện nay:
Ngành: Eumycota
ny
Bộ: Aphyllophorales
Họ: Ganodermataceae
om
Họ phụ: Ganodermoidae
Giống: Ganoderma
2.1.3 Đặc điểm hình thái và chu trình sống của nấm Linh chi
C
2.1.3.1 Đặc điểm hình thái nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)
Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại. Từ khi xác lập thành
một chi riêng là Ganoderma Karst (1881), đến nay tính ra có hơn 200 loài được ghi nhận,
riêng Ganoderma lucidum đã có 45 loài. [3]
Nấm Linh chi là một trong những loại nấm phá gỗ, đặc biệt trên các cây thuộc bộ
Đậu (Fabales). Nấm xuất hiện nhiều vào mùa mưa, trên thân cây hoặc gốc cây. Ở Việt
Nam Nấm Linh chi được gọi là nấm Lim và được phát hiện ở miền Bắc bởi Patouillard
N.T (1890 đến 1928).
l
tia
en
fid
Hình 2.1: Nấm Linh chi
on
Nấm Linh chi (quả thể) cây nấm gồm 2 phần cuống nấm và mũ nấm (phần phiến
đối diện với mũ nấm). Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,5-
3cm. Cuống nấm ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo. Lớp vỏ cuống màu đỏ,
C
nâu đỏ, nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên mặt tán nấm.
ny
Mũ nấm khi non có hình trứng, lớn dần có hình quạt. Trên mặt mũ có vân gạch
đồng tâm màu sắc từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tím
nhẵn bóng như láng vecni. Mũ nấm có đường kính 2 - 15cm, dày 0,8 - 1,2cm, phần đính
pa
cuống thường gồ lên hoặc hơi lõm. Khi nấm đến tuổi trưởng thành thì phát tán bào tử từ
phiến có màu nâu sẫm.
om
C
Quả thể
Đảm
Sợi nấm song nhân
l
tia
en
Sợi nấm đơn nhân Phối nhân trong
Đảm và bào tử đảm
đảm
fid
Hình 2.2: Chu trình phát triển của nấm Linh chi [5]
on
2.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐẶC TÍNH DƯỢC LÝ CỦA NẤM LINH CHI
C
(GANODERMA LUCIDUM)
Các phân tích của G-Bing Lin đã chứng minh các thành phần hóa được tổng
ny
Lignine: 13 – 14%
Lipid: 1.9 – 2.0%
om
Từ những năm 1980 đến nay, bằng các phương pháp hiện đại: phổ kế UV (tử
ngoại), IR (hồng ngoại), phổ kế khối lượng - sắc ký khí (GC – MS), phổ cộng hưởng từ
hạt nhân và đặc biệt là kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC) cùng phổ kế plasma (ICP), đã
xác định chính xác gần 100 hoạt chất và dẫn xuất trong nấm Linh chi. [2]
l
Bảng 2.1: Các hoạt chất sinh học và dẫn xuất trong nấm Linh chi (Ganoderma
tia
lucidum) [19]
Thành phần hoạt Loại mô
Nhóm chất Hoạt tính dược lý
en
chất nấm
Kích thích hệ miễn dịch
ARN Nucleic acid Bào tử
Chống virút
fid
**(Không xác
Alkaloid Bổ tim Quả thể
định) on
Glycoprotein Ức chế khối u Quả thể
**
C
Tăng sự lưu thông máu
Adenosine Nucleotide Quả thể
Thư giản cơ, giảm đau
Chống khối u
ny
Bổ tim
Chống dị ứng
Bảo vệ gan
om
Giảm huyết áp
C
Chống khối u
Beta – D -glucans Polysaccharide Kích thích hệ miễn dịch Hệ sợi nấm
Tăng sản suất kháng thể
l
tia
Cyclooctasulpher Chống dị ứng Hệ sợi nấm
en
Ling Zhi – 8 Protein Hệ sợi nấm
Điều hoà huyết áp
fid
Ganoderic Acids Triterpenoid Bảo vệ gan Hệ sợi nấm
và bào tử nấm Linh chi. Thành phần và hàm lượng triterpene phụ thuộc vào nguồn giống,
yếu tố môi trường. Vai trò của triterpene có ý nghĩa quan trọng trong phòng chống căn
bệnh HIV. [22]
om
Hàng loạt các nghiên cứu của Shufeng Zhou chứng minh rằng polysaccharide và
triterpene của nấm Linh chi có khả năng chữa trị bệnh viêm gan mãn tính. Ganopoly ức
chế quá trình dịch mã của ADN polymerase của virút gây bệnh HBV, ngăn chặn sự hoạt
C
động của virút. Ngoài ra polysaccharide và triterpene tác động hữu hiệu trong việc điều trị
bệnh đái đường loại 2 (type II diabetes mellitus) cho các bệnh nhân. [14]
Năm 1994, Lin Zhibin và Lei Lin Sheng đã xác định được trọng lượng phân tử của
Polysaccharide từ G.lucidum là khoảng 7.100 – 9.300. Những tổng kết về vai trò sinh
dược học của nhóm polysaccharide ở các loài nấm Linh chi đã được giới thiệu tại Hội
thảo Bắc Kinh với các báo cáo của các tác giả Đài Loan, Trung Quốc, Hoa kỳ.
He, Y. et al (1992) đã khảo cứu các BN3B - gồm 4 polycaccharide đồng nhất có
hoạt tính tăng miễn dịch. Trong đó BN3B1 được xác định là glucan (chỉ chứa glucose) và
l
BN3B3 là một arabinogalactan mang các liên kết glycoside.
tia
Hikino, H.et al từ 1985 đến 1989 chứng minh hoạt lực hạ đường huyết của nhiều
polysaccharide. Đó là các heteroglycan có cả hoạt tính chống ung thư. Các ganoderan B
en
có tác dụng làm tăng mức insuline trong huyết tương, giảm sinh tổng hợp glycogen và
giảm hàm lượng glycogen trong gan. Đây chính là cơ sở trị liệu trên các bệnh nhân đái
tháo đường.
fid
Các phức hợp polysaccharide – protein có hoạt tính chống khối u và tăng tính miễn
dịch. Năm 1994, Byong Kak Kim tiến hành lai hệ sợi nấm bằng phương pháp dung hợp
on
Protoplast giữa chủng G.lucidum với G.applanatum, thậm chí với cả nấm hương
(Lentinus edodes), qua đó tăng cường hoạt tính chống khối u sarcom 180 của các phức
polysaccharide – protein lên đáng kể.
C
Lei L.S và Lin L.B (1993) đã chứng minh tác dụng tăng sinh tổng hợp IL – 2
(Interleukine-2) và hoạt tính ADN polymerase ở chuột già tuổi bởi polysaccharide, càng
ny
soi sáng thêm khả năng trẻ hóa, tăng tuổi thọ của các nấm Linh chi.
Những nghiên cứu về polysaccharide không tan trong nước cũng chứng tỏ hiệu lực
chống khối u rất rõ, thậm chí làm tan khối u với tỷ lệ ¾ ở các loài G.lucidum và
pa
triterpenoide và các acid ganoderic. Vai trò của các chất này chủ yếu là ức chế giải phóng
histamine, ức chế Angiotensine Conversino emzyme (ACE), ức chế sinh tổng hợp
Cholesterol và hạ huyết áp. [2, 3, 19]
C
đông máu nội mạch, giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc của nhân tế
bào.
Tài liệu cổ nhất nói tương đối cụ thể về khả năng trị liệu của nấm Linh chi cũng
của Lý Thời Trân (1595). Theo tác giả trong 6 loại Linh chi thì mỗi loại có đặc tính riêng.
l
tia
Bảng 2.2: Lục bảo Linh chi và tác dụng trị liệu (Lý Thời Trân, 1590)
Tên gọi Màu sắc Đặc tính dược lý
en
Vị chua, tính bình, không độc chủ trị sáng mắt,
Thanh chi Xanh
bồ gan khí an thần, tăng trí nhớ.
Vị đắng, tính bình, không độc, tăng trí nhớ,
fid
Hồng chi Đỏ
dưỡng tim, bổ trung, chữa trị tức ngực.
Hoàng chi Vàng Vị ngọt, tính bình, không độc, an thần ích tì khí.
Theo cách diễn đạt truyền thống của người phương Đông, các tác dụng lớn của
ny
Qua phân tích các hoạt chất về mặt dược lý và sử dụng nấm Linh chi, người ta thấy
Linh chi có tác dụng với một số bệnh:
Đối với các bệnh tim mạch: Nấm Linh chi có tác dụng điều hoà, ổn định huyết áp.
Khi dùng cho người huyết áp cao, nấm Linh chi không làm tăng mà làm giảm bớt, dùng
nhiều thì huyết áp ổn định. Đối với những người suy nhược cơ thể, huyết áp thấp thì nấm
Linh chi có tác dụng nâng huyết áp lên gần mức dễ chịu nhờ cải thiện, chuyển hoá dinh
dưỡng. Đối với bệnh nhiễm mỡ, xơ mạch, dùng nấm Linh Chi có tác dụng giảm
cholesterol toàn phần, làm tăng nhóm lipoprotein tỷ trọng cao trong máu, làm giảm hệ số
sinh bệnh. Nấm Linh chi làm giảm xu thế kết bờ của tiểu cầu, giảm nồng độ mỡ trong
l
tia
máu, giảm co tắc mạch, giải tỏa cơn đau thắt tim. Nhiều nghiên cứu đã phát hiện ra vai trò
của các nguyên tố khoáng vết hiếm. Vanadium (V) có tác dụng chống tích đọng
en
cholesterol trên thành mạch. Germanium giúp lưu thông khí huyết, tăng cường vận
chuyển oxy vào mô. Hiện nay, chỉ số Ge trong các dược phẩm Linh chi được xem như là
một chỉ tiêu quan trọng, có giá trị trong điều trị tim mạch và giảm đau trong trị liệu ung
fid
thư. [2, 3]
Đối với các bệnh về hô hấp: nấm Linh chi đem lại kết quả tốt, nhất là với những
on
ca điều trị viêm phế quản dị ứng, hen phế quản tới 80% có tác dụng giảm và làm nhẹ bệnh
theo hướng khỏi hẳn.[7, 8]
Hiệu quả chống ung thư: Bằng việc kết hợp các phương pháp xạ trị, hoá trị, giải
C
phẫu với trị liệu nấm trên các bệnh nhân ung thư phổi, ung thư vú và ung thư dạ dày có
thể kéo dài thời gian sống trên 5 năm cao hơn nhóm không dùng nấm. Nhiều thông tin ở
ny
Đài Loan cho biết nếu dùng nấm Linh chi trồng trên gỗ long não điều trị cho các bệnh
nhân ung thư cổ tử cung đạt kết quả tốt - khối u tiêu biến hoàn toàn. Các nhà khoa học ở
Đại học Haifa, Israel khẳng định nấm Linh chi - một loài nấm dại thường dùng trong
pa
Đông Y ở Trung Quốc (và Việt Nam) - có thể chữa ung thư tuyến tiền liệt. Ung thư tiền
liệt tuyến là một trong những dạng ung thư phổ biến nhất ở đàn ông, với hơn 543.000
om
người được chẩn đoán mỗi năm trên toàn thế giới.
Khả năng kháng HIV: Để khảo sát khả năng kháng HIV của các hợp chất trong
nấm Ganoderma lucidum, người ta đã sử dụng dịch chiết từ quả thể trong thử nghiệm
C
kháng virút HIV – 1 trên các tế bào lympho T ở người. Sự nhân lên của virút được xác
định qua hoạt động phiên mã ngược trên bề mặt các tế bào lympho T đã được gây nhiễm
HIV – 1. Kết quả cho thấy có sự ức chế mạnh mẽ hoạt động sinh sản của loại virút này
(Gau J.P, 1990; Kim, 1996). Do đó, nhiều quốc gia đã đưa Linh chi vào phác đồ điều trị
tạm thời, nhằm tăng cường khả năng miễn dịch và nâng đỡ thể trạng cho các bệnh nhân
trong khi AZT, DDI, DDC, còn hiếm và rất đắt. Các nghiên cứu tại Nhật Bản đã chứng
minh các hoạt chất từ nấm Linh chi có tác dụng như sau: (Masao Hattori, 2001)
ü Ganoderiol F và ganodermanontirol có hoạt tính chống HIV – 1
ü Ganoderderic acid B và lucidumol B có tác động ức chế hữu hiệu protease
l
tia
HIV – 1
ü Ganodermanondiol và lucidumol A ức chế phát triển tế bào Meth – A
en
(mouse sarcoma) và LLC (mouse lung carcinoma).
Ngoài ra các ganoderma alcohol là lanostane triterpene với nhóm hydroxol (-OH)
ở vị trí C25 có khả năng chống HIV – 1, Meth – A và LLC ở chuột. [2, 22]
fid
Khả năng antioxydant: Nhiều thực nghiệm chỉ ra vai trò của các saponine và
triterpenoid, mà trong đó Ganoderic acid được coi là hiệu quả nhất (Wang C.H, 1985).
on
Những nghiên cứu gần đây đang đẩy mạnh theo hướng làm giàu Selenium - một yếu tố
khoáng có hoạt tính antioxydant rất mạnh – vào nấm Linh chi. Chính vì vậy con người có
thể chờ đợi vào một dược phẩm tăng tuổi thọ, trẻ hoá từ nấm Linh chi nói chung và Linh
C
chi Việt Nam nói riêng. [2]
Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi có khả năng khử một số gốc tự do trong
ny
cơ chế chống não hóa, chống ung thư. Bảo vệ và chống ảnh hưởng của các tia chiếu xạ.
Linh chi cũng có tác dụng giúp cơ thể thải loại nhanh các chất độc, kể cả các kim loại
năng như: Chì, Germanium.
pa
Trị suy nhược thần kinh: Bệnh viện Hoa Sơn thuộc Viện Y học số 1 Thượng Hải
báo cáo: Dùng cả 2 loại Linh chi nhân tạo và Linh chi hoang dại chế thành viên ( mỗi viên
tương đương 1g thuốc sống), mỗi lần uống 3 viên, ngày 3 lần, một liệu trình từ 10 ngày
C
đến 2 tháng. Trị 225 ca, tỷ lệ kết quả 83,5 - 86,3%, nhận xét thuốc có tác dụng an thần,
điều tiết thần kinh thực vật và tăng cường thể lực ( theo báo Tân y học, số phụ chuyên đề
về bệnh hệ thống thần kinh 1976,3:140).
Trị chứng cholesterol máu cao: Báo cáo của Sở nghiên cứu kháng khuẩn tố công
nghiệp Tứ Xuyên, dùng liên tục từ 1 đến 3 tháng cho 120 ca thuốc có tác dụng hạ
cholesterol huyết thanh rõ rệt, tỷ lệ kết quả 86% ( theo báo cáo đăng trên báo thông tin
Trung thảo dược 1973,1:31).
Trị viêm phế quản mạn tính: Tổ nghiên cứu Linh chi tỉnh Quảng Đông báo cáo
l
tia
dùng siro Linh chi và đường Linh chi, trị 1.110 ca có kết quả và có nhận xét là thuốc có
tác dụng đối với thể hen và thể hư hàn ( theo tờ báo cáo tư liệu Y dược Quảng Đông
en
1979,1:1).
Trị viêm gan mạn tính: Tác giả dùng polysaccarit Linh chi chiết xuất từ Linh chi
hoang dại chế thành thuốc bột hòa nước uống, trị các loại bệnh viêm gan mạn hoạt động,
fid
viêm gan mạn kéo dài và xơ gan gồm 367 ca, có nhận xét phần lớn triệu chứng chủ quan
được cải thiện, men SGOT, SGPT giảm tỷ lệ 67,7% ( Tạp chí Bệnh gan mật 1985,4:242).
on
Trị chứng giảm bạch cầu: dùng polysaccarit chế thành viên (mỗi viên có 250mg
thuốc sống) cho uống, theo dõi 165 ca, ghi nhận tỷ lệ có kết quả 72,57% ( Báo cáo của
Lưu Chí Phương đăng trên tạp chí Trung hoa huyết dịch bệnh 1985,7:428).
C
Trị bệnh xơ cứng bì, viêm da cơ, bệnh liput ban đỏ, ban trọc: dùng Linh chi chế
thành dịch, tiêm bắp và viên uống. Trị xơ cứng bì 173 ca, tỷ lệ kết quả 79,1%, viêm da cơ
ny
43 ca, có kết quả 95%, Liput ban đỏ 84 ca có kết quả 90%, ban trọc 232 ca, có kết quả
78,88% ( Thông tin nghiên cứu Y học 1984,12:22).
Theo sách Trung dược ứng dụng lâm sàng: thuốc có tác dụng đối với bệnh loét
pa
bao tử, rối lọan tiêu hóa kéo dài, thường dùng phối hợp với Ngũ bội tử, Đảng sâm, Bạch
truật, Trần bì, Kê nội kim, Sa nhân, Sinh khương.
om
Trị xơ cứng mạch, cao huyết áp, tai biến mạch não: thường phối hợp với Kê
huyết đằng, Thạch xương bồ, Đơn bì, Cẩu tích, Đỗ trọng, Thỏ ty tử, Hoàng tinh. Thuốc
còn dùng chữa bệnh động mạch vành, đau thắt ngực.
C
Dùng giải độc các loại khuẩn: phối hợp với cam thảo, gừng, táo.
Ngoài ra sách Những cây thuốc và vị thuốc Việt nam của Đỗ Tất Lợi có ghi:
Thuốc chữa bệnh phụ nữ thời kỳ mãn kinh, giúp thông minh và trí nhớ, dùng lâu ngày
giúp cho nhẹ người, tăng tuổi thọ. Nhiều người mua nấm Linh chi về nấu canh, nấu súp
làm món ăn cao cấp.
2.5 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ HOẠT CHẤT CÓ TRONG NẤM LINH CHI
l
2.5.1 Ganoderma polysaccharide (GLPs) [15, 16]
tia
Có trên 200 loại polysaccharide được ly trích và thu nhận từ nấm Linh chi nhưng
polysaccharid gồm 2 loại chính:
en
GL-A: Gal: Glu: Rham: Xyl (3,2: 2,7: 1,8; 1,0) M= 23.000 Da
GL-B: Glu: Rham: Xyl (6,8: 2,0: 1,0) M= 25.000 Da
GL-A có thành phần chính là Gal, nên gọi là Galactan, còn GL-B có thành phần
fid
chính là Glu, nên gọi là Glucan.
b (1-3) -D-glucan, khi phức hợp với một protein, có tác dụng chống ung thư rõ rệt
(Kishida & al., 1988).
on
. Hầu hết các GLPs hình thành từ 3 chuỗi monosaccharide, có cấu trúc xoắn ốc 3
chiều, giống cấu trúc của ADN và ARN. Cấu trúc xoắn này tựa trên khung sườn cacbon,
C
lượng khung sườn từ 100,000 – 1000,000, đa số chúng tồn tại phía trong vách tế bào
(CWM). Một phần polysaccharide phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan
ny
trị.
Polysaccharid có nguồn gốc từ Linh chi dùng điều trị ung thư đã được công nhận
om
sáng chế (patent) ở Nhật. Năm 1976, Cty Kureha Chemical Industry sản xuất chế phẩm
trích từ Linh Chi có tác dụng kháng carcinogen. Năm 1982, Cty Teikoko Chemical
Industry sản xuất sản phẩm từ Linh chi có gốc glucoprotein làm chất ức chế neoplasm.
C
Bằng sáng chế Mỹ 4051314, do Ohtsuka & al. (1977), sản xuất từ Linh chi chất
mucopolysaccharid dùng chống ung thư.
2.5.2 Ganoderic Acid
Ganoderic acid được định hướng là một cyclopropene hoặc cyclopentene. Hàm
lượng G.acid thay đổi theo giống Linh chi, môi trường nuôi trồng, giai đoạn bào tử
ganodermal. Chính sự thay đổi này làm cho mức độ đắng bị ảnh hưởng. Hàm lượng
G.acid cao thì có nhiều vị đắng. [18, 19]
Triterpenoid là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren. Các triterpen có
l
tia
bộ khung chính từ 27 – 30 nguyên tử carbon (C38H48) rất thường gặp trong thực vật. Các
triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một
số nhóm chức như: -OH; -Oac; eter -O-; Carbanil C=O; nối đôi C=C. Đặc tính chung là
en
có tính thân dầu (tan tốt trong eter dầu hỏa, hexan, eter ethyl, cloroform), ít tan trong nước
ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành glycosid. [10, 11]
fid
Bảng 2.3: Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh chi
(Ganoderma lucidum) (Lê Xuân Thám, 1996)
on
Hoạt chất Hoạt tính
Ganodermaldiol Hạ huyết áp
Triterpenoid đặc biệt là acid ganoderic có tác dụng chống dị ứng, ức chế sự giải
phóng histamin, tăng cường sử dụng oxy và cải thiện chức năng gan. Hiện nay, đã tìm
C
thấy trên 80 dẫn xuất từ acid ganoderic. Trong đó ganodosteron được xem là chất kích
thích hoạt động của gan và bảo vệ gan.
2.5.3 Ganoderma Adenosine [18, 19]
Adenosine thuộc nhóm purine và là thành phần chính trong cấu trúc nucleic acid.
Nấm Linh chi có nhiều dẫn xuất adenosine, tất cả chúng đều có hoạt tính dược liệu mạnh.
Chức năng của adenosine:
ü Giảm độ nhớt máu
ü Ức chế kết dính tiểu cầu
l
tia
ü Ngăn chặn hình thành cục nghẽn
ü Tăng lượng lipoprotein 2 – 3 phosphricglycerin
ü Gia tăng khả năng vận chuyển oxygen, tăng lượng máu cung cấp cho não
en
ü Lọc máu và tăng tuần hoàn máu trong cơ thể
2.5.4 Alcaloid [10, 11]
fid
Alcaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản
ứng kiềm, chúng có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng.
on
Các alcaloid ở dạng tự do hầu như không tan trong nước, thường tan trong dung
môi hữu cơ: cloroform, eter diethyl, alcol bậc thấp. Các muối của alcaloid thì tan trong
nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như: cloroform, eter, benzen.
C
Chính vì thế, tính hòa tan của các alcaloid đóng vai trò quan trọng trong việc ly trích
alcaloid ra khỏi nguyên liệu và trong kỹ nghệ dược phẩm điều chế dạng thuốc để uống.
ny
Alcaloid là những chất có hoạt tính sinh học, nhiều ứng dụng trong ngành y dược
và nhiều chất rất độc. Các alcaloid có tác dụng rất khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc của
alcaloid.
pa
ü Saponin triterpenoid pentacyclic: phần aglycon của nhóm này có cấu trúc
gồm 5 vòng và phân ra thành các nhóm nhỏ: olean, ursan, lupan, hopan.
Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm olean.
ü Saponin triterpenoid tetracyclic: phần aglycon có cấu trúc 4 vòng và phân
l
thành 3 nhóm chính: dammanran, lanostan, cucurbitan.
tia
- Saponin steroid: Gồm các nhóm chính: spirostan, furostan, aminofurostan,
spiroalan, solanidan.
en
Hợp chất Saponin có nhiều công dụng trong y học như:
ü Trị long đờm, chữa ho
ü Là chất phụ gia trong một số vắc xin
fid
ü Tác dụng thông tiểu
ü Tác dụng kháng viêm, chống khối u
2.5.6 Germanium hữu cơ [18, 19]
on
Gemanium là nguyên tố hiếm, do nhà khoa học người Đức khám phá vào năm
1885. Germanium có thể cung cấp một lượng lớn oxygen và thay thế chức năng của
C
oxygen. Nó kích thích khả năng vận chuyển oxygen tuần hoàn máu trong cơ thể lên đến
1,5 lần. Vì thế, làm tăng mức độ trao đổi chất và ngăn chặn quá trình lão hóa.
ny
Cơ thể con người là thành phần của các electron. Khi mức năng lượng tăng hoặc
giảm thấp, dẫn đến sự xáo trộn cân bằng và biểu lộ tình trạng bệnh lý. Gemanium hữu cơ
sẽ duy trì mức năng lượng một cách bình thường trong cơ thể và bảo vệ sức khoẻ. Khi tế
pa
bào ung thư xuất hiện, chúng làm xáo trộn quá trình trao đổi chất. Gemanium sẽ điều hoà
và kiểm soát quá trình này, từ đó ngăn chặn tế bào ung thư phát triển.
om
l
tia
3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM LÀM THÍ NGHIỆM
Đề tài được thực hiện từ 27/09/2008 đến 1/1/2009 tại Phòng Thí nghiệm Vi sinh
thực phẩm, Khoa Sinh học Ứng dụng - Trường Cao đẳng Kinh tế – Công nghệ TP. Hồ
en
Chí Minh
3.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
fid
Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được nuôi trồng tại Phòng thí nghiệm khoa
sinh học ứng dụng, Trường Cao Đẳng Kinh Tế - Công Nghệ Tp.HCM.
3.3 VẬT LIÊU THÍ NGHIỆM on
3.3.1 Thiết bị
Cân phân tích
C
Kính hiển vi
Máy chụp ảnh kỹ thuật số
ny
Tủ cấy vô trùng
Nồi hấp thanh trùng
Tủ sấy
pa
Glucose: 20 (g)
Agar: 20 (g)
Nước cất vừa đủ: 1000 (ml)
Các môi trường đều được khử trùng ở 1210C trong 15 phút.
l
tia
3.4.1 Quan sát hình thái quả thể nấm Ganoderma lucidum
3.4.1.1 Hình thái quả thể
3.4.1.2 Phương pháp quan sát hệ sợi nấm [9]
en
ü Lấy một ít sợi nấm dàn đều vào 1 giọt nước có trên lam kính
ü Cố định sợi nấm trên lam kính bằng cách hơ nhẹ mặt dưới lam kính qua lại
fid
trên ngọn lửa đèn cồn
ü Nhuộm bằng dung dịch fuchsin trong 5 – 10 phút
ü Rửa thuốc nhuộm bằng cồn 95%on
ü Rửa ngay với nước cất để chấm dứt công đoạn tẩy màu
ü Quan sát mẫu vật dưới vật kính x100
C
3.4.1.3 Phương pháp quan sát bào tử nấm Linh chi [13, 17]
ü Lấy quả thể nấm Linh chi trong giai đoạn phóng thích bào tử, đặt lên 1 tờ
ny
3.4.2 Khảo sát sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi trên các môi trường lỏng
Cách tiến hành: Các môi trường đều được pha với nồng độ khác nhau. và được
hấp khử trùng ở 121oC/15 phút, để nguội và cấy giống. Sau 9 ngày ta thu sinh khối và sấy
ở nhiệt độ 500C và tiến hành cân trọng lượng khô.
C
3.4.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4 đến tốc độ tăng sinh khối trong môi
trường lỏng
Thí nghiệm được bố trí 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa
20ml môi trường
l
Nghiệm thức Môi trường nuôi cấy
tia
1 PG + 1 g/l MgSO4
2 PG + 2 g/l MgSO4
en
3 PG + 3 g/l MgSO4
4 PG + 4 g/l MgSO4
fid
3.4.2.2 Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến tốc độ tăng sinh khối trong
môi trường lỏng
on
Thí nghiệm được bố trí 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa
20ml môi trường
Nghiệm thức Môi trường nuôi cấy
C
1 PG + 0,5 g/l KH2PO4
2 PG + 1g /l KH2PO4
ny
3.4.2.3 Ảnh hưởng của hàm lượng Glucose đến tốc độ tăng sinh khối trong
om
4 P + 25 g/l Glucose
5 P + 30 g/l Glucose
3.4.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH lên môi trường nuôi cấy
l
pH ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ tăng trưởng của sợi nấm trong môi trường lỏng. Ở
tia
các giá trị pH khác nhau thì tốc độ sinh trưởng của sợi nấm khác nhau. Do đó, trong thí
nghiệm này chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH đến tốc độ sinh trưởng và
en
phát triển của sợi nấm Linh chi để tìm được giá trị pH thích hợp cho sự phát triển của sợi
nấm.
Cách tiến hành: pha môi trường lỏng PG (potato glucose) với nồng độ pH khác
fid
nhau và đổ vào chai thuỷ tinh 100ml một lượng môi trường 20 ml. Môi trường được hấp
khử trùng ở 121oC/15 phút, để nguội và cấy một lượng giống nhất định vào (mỗi lần cấy
on
gắp 1 hạt lúa), ủ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành thu nhận sinh khối sau 9 ngày. Sinh khối
được sấy đến khô ở nhiệt độ 50oC và tiến hành cân trọng lượng khô.
Thí nghiệm được thực hiện với 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 2 chai. Vậy tổng
C
số chai cấy là 14 chai
3.4.4 Nghiên cứu đường cong sinh trưởng của Ganoderma lucidum
ny
Chúng tôi khảo sát sự tích lũy sinh khối sợi nấm Linh chi trên môi trường lỏng PG
Cách tiến hành: pha môi trường và đổ vào chai thuỷ tinh 100ml một lượng môi
trường 20 ml. Hấp khử trùng ở 121oC/15 phút, để nguội và cấy một lượng giống nhất định
pa
vào (mỗi lần cấy gắp 1 hạt lúa), ủ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành thu nhận sinh khối ở các
ngày 3, 6, 9, 12, 15, 21. Sinh khối được sấy đến khô ở nhiệt độ 50oC và tiến hành cân
om
nghiệm nhiều yếu tố cho phép thay đổi đồng thời nhiều yếu tố và xác định được tương tác
giữa các yếu tố, nhờ đó giảm bớt số thí nghiệm.
l
tia
phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng của các yếu tố nghiên cứu đến mật độ tế bào. Ảnh
hưởng của các yếu tố được đánh giá dựa trên xác xuất tin cậy hay mức ý nghĩa p của
en
chúng.
Ảnh hưởng được coi là rất lớn khi p ≤ 0,0001, ảnh hưởng là đáng kể khi 0,0001 <
p ≤ 0,05 và không đáng kể khi p > 0,05.
fid
Chỉ có những hệ số biểu diễn ảnh hưởng rất lớn và đáng kể mới được giữ lại trong
phương trình hồi qui cuối cùng. Khi ảnh hưởng của các yếu tố hay ảnh hưởng tương hổ
on
giữa các yếu tố là đáng kể thì hệ số biểu diễn ảnh hưởng của các yếu tố đó luôn được giữ
lại trong phương trình.
Phương trình hồi quy
C
Yi = b0 +b1 x1 + b2 x2 + b3 x3 + b12 x1 x2 + b13 x1 x3 + b23 x2 x3 + b123 x1 x2 x3
Trong đó
ny
ü Việc mã hoá được thực hiện dễ dàng nhờ chọn tâm của miền được nghiên cứu
làm gốc tọa độ.
ü Phương pháp xử lý số liệu từ các kết quả thực nghiệm. Các hệ số trong phương
trình mô tả ảnh hưởng của các yếu tố nghiên cứu đến khả năng tăng sinh khối.
l
Phương trình hồi quy
tia
Y = b0 +b1 x1 + b2 x2 + b3 x3 + b1b2 x1 x2 + b1b3 x1 x3 + b2b3 x2 x3 + b1b2b3 x1 x2 x3
Với
en
+ Y: sinh khối (g/20ml)
+ b0, b1, b2, b3, b12, b13, b23, b123 : các hệ số trong phương trình hồi quy
+ x 1 : nồng độ MgSO4 (g/l)
fid
+ x 2 : nồng độ KH2PO4 (g/l)
Mức dưới
Số TN x1 x2 x3 y1 y2 y3 Ytb
1 + + +
2 - + +
C
3 + - +
4 - - +
5 + + -
6 - + -
7 + - -
8 - - -
3.6 XÁC ĐỊNH DƯỢC CHẤT CÓ TRONG NÂM LINH CHI
3.6.1 Phương pháp định tính alcaloid [11]
l
3.6.1.1 Chuẩn bị dịch thử
tia
Để phát hiện sự hiện diện của alcaloid trong dược liệu người ta thường áp dụng
nguyên tắc thử của Webb với cách thử gồm 2 phần như sau:
en
- Phần 1: Bột nấm Linh chi xay nhuyễn (10 – 20 gam) và dung dịch nước 1%
H2SO4 được cho vào erlen, đun nhẹ trong 1 giờ. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với cả
2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff.
fid
Quan sát kết tủa, nếu có kết tủa theo qui định là dương tính. Tuy nhiên, nếu không
có kết tủa, chưa thể kết luận là không có alcaloid mà phải tiếp tục thử nghiệm phần 2.
on
- Phần 2: Bột xay nhuyễn (10 – 20 gam) ngâm trong dung dịch prollius là hổn hợp
gồm: chloroform:ethanol 95o:NH4OH đậm đặc, theo tỷ lệ là 8:8:1 (môi trường phải có
tính baz). Ngâm nguội trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc trộn. Lọc và đuổi
C
dung môi đến cạn, thu được cặn. Hòa tan cặn trong dung dịch HCl 1% đun ấm cho dễ tan.
Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với 2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff.
ny
Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid loãng có chứa alcaloid, nếu có
alcaloid sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt. Cần lưu ý vì tủa tạo thành có thể hòa
om
tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc hòa tan bởi ethanol có sẵn trong dung dịch thử.
- Thuốc thử Dragendorff: Hòa tan 8 gam Nitrat bismuth Bi(NO3)3 trong 25 ml
HNO3 30% (D=1,18). Hòa tan 28 gam KI và 1 ml HCl 6N trong 5 ml nước cất. Hỗn hợp
C
2 dung dịch này lại để yên trong tủ lạnh 5oC sẽ thấy tủa màu sậm xuất hiện và tan trở lại,
lọc và thêm nước cho đủ 100 ml. Dung dịch màu cam – đỏ được chứa trong chai màu nâu
để che sáng, cất trong tủ lạnh, có thể giữ lâu vài tuần.
Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff vào dung dịch acid loãng có chứa alcaloid, nếu
có alcaloid sẽ xuất hiện tủa màu cam – nâu.
l
Chiết 10 gam dược liệu với cồn 70% bằng cách ngâm trong 24 giờ rồi lọc. Cô dịch
tia
lọc bốc hơi đến cắn khô. Dùng cắn để làm các phản ứng định tính.
3.6.2.1 Thử nghiệm tính tạo bọt
Một đặc tính quan trọng của saponin là tính tạo bọt, nên đây là một trong những
en
phương pháp chính xác để định tính sự hiện diện của saponin.
Cách tiến hành: Hòa tan một lượng cắn tương ứng với 1 gam dược liệu vào 5 ml
fid
nước nóng. Lọc vào một ống nghiệm 1,6 – 16 cm và để nguội, thêm nước cho đủ 10 ml,
dùng ngón tay cái bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 1
on
phút (khoảng 30 lần lắc). Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt và đánh giá kết quả:
Bọt bền trong 15 phút: +
Bọt bền trong 30 phút: ++
C
Bọt bền trong 60 phút: +++
3.6.1.2 Thử nghiệm Fontan – Kaudel
ny
Lấy một lượng cắn tương ứng với 1 gam bột dược liệu, đun nóng nhẹ trên cách
thủy để hòa tan với 10 ml nước. Chia đều vào 2 ống nghiệm.
Ống 1: thêm 2 ml HCl 0.1N (pH =1)
pa
ü Nếu ống pH = 13 có cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, sơ bộ xác
định là có saponin steroid.
l
tia
Lấy 5 ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hới tới cắn. Hòa tan cắn với 0,5 ml
anhydrid acetic, rồi thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform. Chuyển dung dịch vào 1 ống
nghiệm nhỏ khô, dùng pipet pasteur thêm cẩn thận 1 – 2 ml H2SO4 đậm đặc lên thành ống
en
nghiệm để nghiên cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung
dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp phía dung dịch trên dần dần chuyển thành màu
fid
xanh lục hay tím. Kết luận có triterpenoid
3.6.4 Định tính acid hữu cơ
on
Lấy 2 ml dịch chiết nước cho vào một ống nghiệm. Thêm vào dung dịch một ít
tinh thể natri Na2CO3. Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2CO3 thì kết luận
là có acid hữu cơ.
C
3.7 ĐỊNH LƯỢNG POLYSACCHARIDE (GLPs) [15, 16]
ny
Polysaccharide có nhiều dạng và nhiều qui trình chiết khác nhau. Chiết GLPs ở
100oC trong 16 giờ, cho năng suất ly trích cao, nhưng làm biến đổi cấu trúc sinh học các
polysaccharides có trong nấm Linh chi. Một qui trình thứ hai được ứng dụng rộng rãi để
pa
chiết các GLPs ở nhiệt độ thấp, nhằm ổn định cấu trúc sinh học của các GLPs.
om
C
Nghiền
l
-Ngâm nước 70oC
tia
trong 3 giờ
Hổn hợp chiết rút lần 1
en
Dịch chiết lần 1 Bã chiết lần 1
fid
-Ngâm trong nước
70oC trong 3 giờ
on Hỗn hợp chiết rút lần 2
C
Dịch chiết lần 2 Bã chiết lần 2
Hình 3.1: Qui trình chiết suất polysaccharides từ nấm Linh chi (Yihuai Gao và ctv, 2001)
Thu nhận cả 3 dịch chiết và đem đi lọc. Lấy phần cặn (dịch lơ lửng sau khi lọc)
đem đi sấy khô và cân trọng lượng. Từ đó đánh giá hàm lượng polysaccharide thô có
om
4.1 QUAN SÁT HÌNH THÁI GIẢI PHẨU CỦA NẤM LINH CHI (GANODRMA
LUCIDUM)
l
tia
4.1.1 Hình thái quả thể nấm Linh chi
Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được nuôi trồng tại Phòng thí nghiệm, Khoa
sinh học ứng dụng trước đó, có hình dạng như sau :
en
fid
on
Hình 4.1: Hình thái nấm Linh chi
Nhận xét: Quả thể của nấm Linh chi thu hái được có cuống ngắn, đính bên, cuống
C
nấm to (đường kính 2- 3 cm), lớp vỏ cuống láng, đỏ nâu. Mũ nấm hình quạt, đôi khi có
hình dị dạng, mặt mũ nấm láng, đỏ nâu, có vân gợn đồng tâm. Khi còn non, tai nấm có
ny
màu vàng chanh – vàng cam cho đến đỏ tươi, càng về già thì màu càng sẫm lại. Kích
thước từ 3 – 12 cm, dày từ 1 – 3,5 cm. Phần đính cuống gồ lên hoặc lõm xuống. Mặt dưới
pa
thể quả thường màu trắng kem – hơi vàng, có nhiều lỗ nhỏ. Đây là lớp bào tầng sinh sản
của nấm, chính những lỗ này là nơi phóng thích bào tử khi quả thể trưởng thành. Mật độ
lỗ khoảng 3 – 5 ống/mm2, miệng lỗ gần tròn. Khi chúng tôi bổ đôi quả thể ra thì thấy đây
om
là những ống thẳng, chiều dày từ 0,3 – 1,5 cm. Khi bào tử đảm chín thì nó được phóng
thích dọc theo ống này và thoát ra ngoài qua miệng lỗ ống. Còn phần thịt nấm ở trên thì
có màu vàng nâu đến nâu đỏ. Phân cách giữa phần trên và phần dưới (tầng sinh sản) là
C
khá rõ ràng vì phần trên thì các lớp tia sợi hướng lên, còn phần dưới thì là ống thẳng
hướng xuống.
l
tia
Hình 4.2: Hình thái sợi nấm Linh chi (vật kính dầu x100)
en
4.1.3 Cấu trúc bào tử nấm Ganoderma lucidum
Bào tử đảm có dạng hình trứng, chúng ta có thể thấy rõ trên cả 2 hình đều có đầu
chóp tròn - nhọn, phồng căng. Bào tử nấm Linh chi có cấu trúc vỏ kép, có kiến tạo lỗ
fid
thủng (porus, lacunae) và có kích thước bào tử khoảng 8 – 11 x 6 – 8 µm
on
C
ny
LUCIDUM)
4.2.1 Tốc độ sinh trưởng hệ sợi nấm Ganodrma lucidum trên các môi trường lỏng
4.2.1.1 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4 đến tốc độ tăng sinh khối sợi nấm
om
nghiệm này chúng tôi sử dụng MgSO4 ở các hàm lượng khác nhau. Từ đó, chúng tôi có
thể xác định được hàm lượng MgSO4 cần thiết để quá trình tạo sinh khối xảy ra nhanh
nhất.
Thí nghiệm được bố trí 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa
20ml môi trường
Bảng 4.1: ảnh hưởng của MgSO4 lên môi trường
Nghiệm thức Môi trường nuôi cấy Khối lượng (g/20ml)
l
NT1 PG + 1 g/l MgSO4 0,178
tia
NT2 PG + 2 g/l MgSO4 0,346
NT3 PG + 3 g/l MgSO4 0,466
en
NT4 PG + 4 g/l MgSO4 0,379
0.5
khối lượng sinh khối (g/20ml)
fid
0.45
0.4
0.35
0.3 on
0.25
0.2
0.15
C
0.1
0.05
0
ny
Biểu đồ 4.1: Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4 đến tốc độ tăng sinh khối
Nhận xét:
Dựa vào biểu đồ 4.1, chúng tôi nhận thấy khi sử dụng MgSO4 ở mức 1g/l thì sinh
om
khối phát triển chậm nhất và khi tăng dần hàm lượng MgSO4 lên 3g/l thì lượng sinh khối
thu được cao nhất 0,466 g/20ml và khi tăng hàm lượng MgSO4 lên 4g/l thì lượng sinh
khối giảm đáng kể chỉ còn 0,379 g/20ml
C
Điều này có thể khi tăng Mg2+ vượt quá mức chịu đựng của tế bào, sẽ ức chế sự
hoạt một số enzyme cần thiết trong quá trình tổng hợp tế bào cũng như sẽ giảm các phản
ứng tổng hợp trong tế bào sợi nấm.
Kết luận: Chúng tôi chọn hàm lượng MgSO4 là 3 g/l làm giá trị thực nghiệm cho
bước thí nghiệm qui hoạch tiếp theo.
4.2.1.2 Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến tốc độ tăng sinh khối trong môi
trường lỏng
KH2PO4 là nguồn cung cấp kali và photphat cho nấm. Nguồn kali đóng vai trò làm
l
tia
đồng yếu tố (cofactor), cung cấp cho các loại enzym hoạt động. Đồng thời, Kali đóng vai
trò cân bằng khuynh độ (gradient) bên trong và ngoài tế bào. Nguồn phosphate tham gia
en
tổng hợp ATP, acid nucleic, phospholipid màng. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát hàm
lượng KH2PO4 thích hợp cho môi trường nuôi cấy tơ nấm Linh chi
Thí nghiệm được bố trí 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa
fid
20ml môi trường
Bảng 4.2: ảnh hưởng của KH2PO4 đến tốc độ tăng trưởng
Nghiệm thức
NT1
on
Môi trường nuôi cấy
PG + 0,5g/l KH2PO4
Khối lượng (g/20ml)
0,322
NT2 PG + 1g/l KH2PO4 0,475
C
NT3 PG + 1,5g/l KH2PO4 0,449
NT4 PG + 2g/l KH2PO4 0,364
ny
0.5
khối lượng sinh khối (g/20ml)
0.45
pa
0.4
0.35
0.3
0.25
om
0.2
0.15
0.1
0.05
C
0
NT1 NT2 NT3 NT4
Nghiệm thức
Biểu đồ 4.2: Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến tốc độ tăng sinh khối
Nhận xét:
Dựa và biểu đồ 4.2, chúng tôi nhận thấy khi tăng hàm lượng KH2PO4 lên dần thì
lượng sinh khối tăng. Mặt khác, khi hàm lượng KH2PO4 sử dụng vượt quá mức chịu đựng
của tế bào nấm Linh chi thì lượng sinh khối thu được giảm. Lượng sinh khối thu được cao
l
nhất là 0,475 g/20ml khi hàm lượng KH2PO4 là 2 g/l. Khi lượng KH2PO4 là 1 g/l thì
tia
lượng sinh khối thu được thấp nhất 0,322 g/20ml
Kết luận: Trong thí nghiệm này, chúng tôi chọn hàm lượng KH2PO4 là 1 g/l làm giá
en
trị thực nghiệm cho bước thí nghiệm qui hoạch tiếp theo.
4.2.1.3 Ảnh hưởng của hàm lượng Glucose đến tốc độ tăng sinh khối trong môi
trường lỏng
fid
Nguồn cacbon dùng để tổng hợp nên các chất: hydratcacbon, amino acid, acid
nucleic, lipid… cần thiết cho sự phát triển của nấm. Trong sinh khối nấm, cacbon chiếm
on
nửa trọng lượng khô, đồng thời nguồn cacbon cung cấp năng lượng cho quá trình trao đổi
chất. Đối với các loài nấm khác nhau thì nhu cầu cacbon cũng khác nhau. Trong thí
nghiệm này, chúng tôi khảo sát hàm lượng Glucose ảnh hưởng tới tốc độ tạo sinh khối sợi
C
nấm Linh chi trên môi trường lỏng ở các mức thay đổi khác nhau.
Thí nghiệm được bố trí 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa
ny
0.5
l
0.25
tia
0.2
0.15
0.1
en
0.05
0
NT1 NT2 NT3 NT4 NT5
fid
Nghiệm thức
Biểu đồ 4.3: Ảnh hưởng của hàm lượng Glucose đến tốc độ tăng sinh khối
Nhận xét:
on
Dựa vào biểu đồ 4.3, chúng tôi nhận thấy khi tăng hàm lượng Glucose tăng lên dần
thì sinh khối sở nấm tăng. Khi hàm lượng Glucose càng tăng thì lượng sinh khối thu được
C
càng giảm. Hàm lượng Glucose đạt mức 20g/l thì lượng sinh khối thu được là cao nhất
0,435 g/20ml.
ny
Kết luận: Trong thí nghiệm này, chúng tôi chọn hàm lượng glucose là 20 g/l làm giá
trị thực nghiệm cho bước thí nghiệm qui hoạch tiếp theo.
pa
giống. Sự tăng hoặc giảm pH (chính là sự tăng hoặc giảm H+) trong môi trường nuôi cấy
sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển của hệ sợi tơ nấm Linh chi.
Chúng tôi tiến hành cấy giống trong chai thuỷ tinh 100ml, chứa một lượng môi
C
trường là 20ml. Trước khi hấp thanh trùng, ta chỉnh pH môi trường trong các mẫu về các
giá trị : pH =3,5 ; pH =4; pH =4,5; pH =5; pH =5,5; pH =6,8; pH =7. Sau đó tiến hành cấy
giống bằng cách gắp một hạt lúa cho vào chai.
Bảng 4.4: Ảnh hưởng pH lên tốc độ tạo sinh khối của Linh Chi
pH
3,5 4 4,5 5 5,5 6,8 7
Khối lượng
l
tia
(g/20ml)
TN 1 0,193 0,225 0,348 0,333 0,344 0,346 0,278
TN 2 0,111 0,241 0,290 0,366 0,386 0,336 0,270
en
Trung bình 0,152 0,233 0,319 0,349 0,365 0,341 0,274
fid
0.4
Khối lượng sinh khối (g/20ml)
0.35
0.3 on
0.25
0.2
0.15
C
0.1
0.05
ny
0
3,5 4 4,5 5 5,5 6,8 7
pH
pa
Biểu đồ 4.4: Ảnh hưởng của pH lên sự tăng sinh khối của
Ganoderma lucidum
om
Nhận xét
Dựa vào biểu đồ trên chúng tôi nhận thấy sinh khối tơ nấm Linh chi có khả năng
tăng trưởng tốt trong khoảng pH = 4,5 đến pH = 7,0. Khi nuôi cấy trong mô trường có pH
C
= 3,5 thì khối lượng sinh khối thấp nhất 0,152 g/20ml. Sinh khối nấm tăng dần theo giá trị
của pH, nhưng khi tăng giá trị pH 6,8 thì sinh khối giảm 0,341 g/20ml và giảm dần cho
đến pH = 7,0 trong cùng một điều kiện nuôi cấy.
Kết luận
Như vậy chúng tôi chọn được giá trị pH = 5,5 là giá trị pH tối thích cho sự phát
triển của tơ nấm với lượng sinh khối cao nhất đạt 0,365 g/20ml.
l
tia
Quá trình sinh trưởng của tơ nấm phải trải qua 4 giai đoạn: giai đoạn thích nghi,
giai đoạn phát triển, giai đoạn cân bằng và giai đoạn già cỗi. Trong thí nghiệm này, chúng
en
tôi tiến hành nuôi cấy sinh khối trong trong những chai nhỏ 100ml, chứa 20ml môi trường
PG + MgSO4 + KH2PO4. Điều chỉnh về pH 5,5 rồi sau đó đem đi hấp thanh trùng. Mỗi
lần cấy gắp 1 hạt lúa cho vào chai. Khoảng thời gian lấy mẫu là cách nhau 3 ngày. Mẫu
fid
được sấy khô ở 500C - 600C sau đó đi cân và ghi nhận số liệu.
Bảng 4.5: Khối lượng sinh khối nấm Linh chi thay đổi theo thời gian khi nuôi cấy
trong môi trường lỏng
on
Thời gian
C
(ngày) 3 6 9 12 15 18 21
TN NGÀY NGÀY NGÀY NGÀY NGÀY NGÀY NGÀY
ny
TB
0.129 0.258 0.456 0.692 0.78 0.8 0.805
om
C
0.9
l
0.4
tia
0.3
0.2
0.1
0
en
3 6 9 12 15 18 21
Ngày
fid
Đồ thị 4.1: Đường cong sinh trưởng của Ganoderma lucidum
Nhận xét on
Đường cong sinh trưởng là một yếu tố quan trọng trong quá trình nuôi cấy sinh
khối sợi nấm Linh chi. Dựa vào đồ thị ta biết chính xác được khoảng thời gian nào sinh
C
khối phát triển mạnh nhất, lúc nào sinh khối ổn định và lúc sinh khối bắt đầu già đi.
Từ đường cong sinh trưởng chúng tôi nhận thấy:
• Trong 6 ngày đầu, tơ nấm thích nghi với môi trường, sinh khối tăng lên rất ít
ny
• Đến ngày thứ 12, sinh khối phát triển nhưng không nhanh, tơ nấm dần dần chuyển
sang màu vàng
pa
• Từ ngày 12 đến ngày 15, sinh khối phát triển vượt bậc
• Từ ngày 15 trở đi sinh khối tăng rất chậm, tơ nấm từ vàng nhạt chuyển sang màu
om
vàng đậm
C
15 ngày
Hình 4.4: Sinh khối sợi nấm
4.5 TỐI ƯA HÓA THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG LỎNG NUÔI CẤY HỆ SỢI
GANODERMA LUCIDUM BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
Chúng tôi xác định điền kiện tối ưu để thu được sinh khối cực đại, chúng tôi tiến
hành tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp qui hoạch
l
thực nghiệm và tiến hành như sau:
tia
Xét k=3 nhân tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm (Glucose, KH2PO4, MgSO4)
và mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần
en
Hàm mục tiêu Y là sinh khối Ganoderma lucidum
Bảng 4.6 : Mức biến thiên của các nhân tố sinh trưởng
Các yếu tố (g/l)
fid
Các mức
x1 x2 x3
Mức cơ sở 3,0 on 1,0 20
Khoảng biến thiên 0,5 0,2 2
Mức trên 3,5 1,2 22
C
Mức dưới 2,5 0,8 18
Trong đó
ny
x1 : Hàm lượng MgSO4 bổ sung vào môi trường khoai tây ( g/l)
x2 : Hàm lượng KH2PO4 bổ sung vào môi trường khoai tây ( g/l)
pa
x3 : Hàm lượng glucose bổ sung vào môi trường khoai tây ( g/l)
y1 : Khối lượng sinh khối Ganoderma lucidum ở lần lặp thứ 1 (g/20ml)
y2 : khối lượng sinh khối Ganoderma lucidum ở lần lặp thứ 2 (g/20ml)
om
y3 : khối lượng sinh khối Ganoderma lucidum ở lần lặp thứ 3 (g/20ml)
Ytb : là khối lượng trung bình của sinh khối Ganoderma lucidum trong 3 lần lặp lại
Bảng 4.7 : kết quả thí nghiệm theo phương pháp thực nghiệm
C
Số TN x1 x2 x3 y1 Y2 Y3 Ytb
1 3,5 1,2 22 0,495 0,501 0,516 0,504
2 2,5 1,2 22 0,51 0,513 0,519 0,514
l
7 3,5 0,8 18 0,528 0,576 0,57 0,558
tia
8 2,5 0,8 18 0,474 0,54 0,543 0,519
en
Kiểm tra sự đồng nhất của các phương sai S i2 theo tiêu chuẩn Cochran:
y1 + y 2 + y 3
y =
3 (trung bình cộng của ba lần thí nghiệm)
fid
( y1 − y)2 + ( y2 − y)2 + ( y3 − y)2 với k là số lần lặp lại thí nghiệm, k=3
Si2 =
k −1
∑S i
2
=0,000378
on
2
Smax
Gtt = = 0, 4471
∑ Si2
C
f=k–1=2
N=8
pa
Vậy Gtt = 0,4471 < Gtb = 0,5157 . Nên các phương sai đồng nhất, thí nghiệm lặp lại
có nghĩa.
C
0.57
0.56
l
0.51
tia
0.5
0.49
0.48
en
0.47
NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8
Nghiệm thức
fid
Biểu đồ 4.5: Biểu đồ thí nghiệm theo phương pháp thực nghiệm
Sau khi tiến hành thí nghiệm tối ưu theo qui hoạch thực nghiệm, chúng tôi nhận
on
thấy nghiệm thức số 7 có các thành phần như sau: MgSO4 (3,5 g/l); KH2PO4 (0,8 g/l) và
Glucose (18 g/l) thì sinh khối nấm Linh chi khô là cao nhất đạt 0,558 g/20ml.
Để tiến hành thu sinh khối sợi nấm Linh chi phục vụ cho thử nghiệm sản xuất trà
C
túi lọc và phân tích các hoạt chất có trong hệ sợi. Chúng tôi, tiến hành pha môi trường
trường PG có bổ sung các thành phần các hoạt chất như trên và nuôi cấy tĩnh hệ sợi nấm
ny
Linh chi. Kết quả cho thấy, lượng sinh khối nấm Linh chi sau 15 ngày đạt năng suất 17
g/l.
4.6 XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT CÓ TRONG NẤM LINH CHI (GANODERMA
pa
LUCIDUM)
4.6.1 Định tính alkaloid
om
• Thử nghiệm 1
Cho dịch chiết bột tơ nấm Linh chi đỏ tác dụng với thuốc thử Mayer và thuốc thử
Dragendoff
C
l
tia
en
Hình 4.5: Định tính alcaloid với thuốc thử Mayer và Dragendoff
Kết quả
fid
Dựa và kết quả thử nghiệm trên ta thấy
Ống 1: Khi dịch chiết tác dụng với thuốc thử Dragendoff thì dung dịch chuyển
sang màu nâu nhưng không có kết tủa on
Ống 2: Dịch chiết có màu vàng nhạt, xuất hiện kết tủa trắng
• Thử nghiệm 2
C
1 2
ny
pa
om
Hình 4.6: Định tính alcaloid với thuốc thử Mayer và Dragendoff
Kết quả
Ống 1: xuất hiện màu vàng nhưng không có kết tủa
C
Ống 2: màu hơi đục xuất hiện kết tủa nhưng với hàm lượng rất ít
Nhận xét:
Dịch chiết nấm Linh chi ở phần 1 đem thử nghiệm với 2 loại thuốc thử Mayer và
Dragendorff thì nhận thấy kết quả là dương tính. Đối với dịch chiết ở phần 2 đem thử
nghiệm thì kết quả là âm tính:
Bột dược liệu trích với nước – acid: có thể trích hết tấc cả các alcaloid ở dạng baz
l
tia
tự do (N sẽ biến thành NH+ tan trong nước), alcaloid dạng thứ cấp N+, dạng N – oxid (N+
-> O), dạng glycosid, alcaloid loại có tính phân cực mạnh, nhưng sẽ trích luôn những hợp
en
chất có chứa nitơ (protein, glycoprotein, nucleotide)… là những hợp chất tuy không phải
là alcaloid nhưng có thể cho kết quả dương tính với thuốc thử.
Bột dược liệu trích với dung môi hữu cơ – kiềm sẽ không trích được những
fid
alcaloid dạng N – oxid, dạng N tứ cấp, dạng tan tốt trong nước. Phương pháp này trích tốt
các alcaloid dạng baz tự do có tính phân cực kém và tính baz yếu, cũng như các alcaloid
có cấu trúc đặc thù –C=C –N – .
on
Kết luận: hoạt chất alcaloid có trong tơ nấm Linh chi đỏ với hàm lượng rất thấp
nên những phương pháp định tính không thấy đươc sư hiện diện của chúng
C
4.6.2 Định tính saponin
4.6.2.1 Thử nghiệm tính tạo bọt
ny
pa
om
Hình 4.7: thử nghiệm tính tạo bọt từ sinh khối nấm Linh chi
Kết quả:
C
Độ bền của bọt đều bền vững sau 60 phút. Như vậy dược liệu từ sinh khối có chứa
hoạt chất saponin
4.6.2.2 Thử nghiệm Fontan – Kaudel
Ống 1: dịch chiết sau khi cho acid vào
Ống 2: dịch chiết sau khi cho bazo vào
l
tia
1 2
en
fid
on
Hình 4.8: Thử nghiệm saponin toàn phần theo Fontan – Kaudel
Kết quả
Bọt trong 2 ống nghiêm đều bền hơn 15 phút, bọt trong ống nghiệm 2 cao hơn gấp
C
3 lần cột bọt trong ống nghiệm 1
Như vậy, trong môi trường kiềm bọt bền hơn trong môi trường acid. Sơ bộ kết
ny
1 2
om
C
Hình 4.9: Định tính triterpenoid bằng phản ứng Liebermann – Burchard
Kết quả thí nghiệm nhận thấy sinh khối và quả thể nấm Linh chi có chứa hoạt chất
triterpenoid (môi trường chuyển sang màu xanh lục sau khi cho acid H2SO4 đậm đặc vào
từ từ).
Ống 1(đối chứng): nước cất + acid
Ống 2: Dịch chiết + acid đậm đặc
l
tia
4.6.4 Định tính acid hữu cơ
en
fid
on
Hình 4.10 : Định tính acid hữu cơ có trong quả thể Linh chi.
Sau khi cho dịch chiết nước bột tơ và quả thể nấm Linh chi đỏ tác dụng với tinh
C
thể Na2CO3 và hơ nóng thì nhận thấy có bọt khí xuất hiện rất ít và bay ra. Như vậy, dịch
chiết nước từ tơ nấm Linh chi đỏ có chứa hàm lượng rất ít thành phần acid hữu cơ.
4.6.5 Định lượng polysaccharide từ sinh khối nấm Linh chi
ny
Tiến hành ly trích polysaccharides từ 10 gam nấm Linh chi đã sấy khô theo qui
trình thí nghiệm. Sau quá trình lọc và sấy khô thu nhận được 0.3144 gam polysaccharide
pa
thô. Như vậy hàm lượng polysaccharide thô có trong quả thể nấm Linh chi đỏ chỉ đạt
khoảng 0.31%.
om
C
Hình 4.11: hình ảnh polysaccharide kết tủa sau khi lọc
SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang
44
l
tia
- Xác định đường cong sinh trưởng của sợi nấm Linh chi trên môi trường PG.
- Xác định điều kiện nuôi cấy tốt nhất cho sự phát triển của sợi nấm Linh chi
+ pH môi trường nuôi cấy: pH = 5,5
en
- Tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy theo phương pháp qui hoạch thực
nghiệm. Kết quả về thành phần môi trường tốt nhất như sau »
fid
Ø Glucose : 18g/l
Ø KH2PO4 : 0,8g/l
Ø MgSO4 : 3,5g/l on
Ø Khoai tây : 200g/l
Lượng sinh khối thu được sau 15 ngày là 17g/l.
C
- Sinh khối hệ sợi (Ganoderma lucidum) có chứa các thành phần hóa học:
Saponine, saponin triterpenoid, acid béo và hàm lượng polysaccharide thô ly trích được
ny
5.2 ĐỀ NGHỊ
pa
Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn nên tôi chưa thể nghiên cứu đầy đủ về nấm
Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum), đề nghị nghiên cứu thêm về:
om
ü Khảo sát sâu hơn tác dụng của một số khoáng chất khác và thành phần hóa học, tác
dụng dược lý, lâm sàng. Nhằm hoàn thiện quy trình nuôi cấy trong môi trường
lỏng và có thể ứng dụng trong ngành dược và ngành sản xuất trà thảo dược.
C
ü Nghiên cứu ứng dụng sản phẩm tơ nấm Linh chi, nhằm đa dạng hóa sản phẩm các
sản phầm từ hệ sợi nấm.
l
tia
nội, Việt nam.
2. Lê Xuân Thám, 1996. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và đặc điển hấp thu khoáng
nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss.ex Fr).Karst. Luận án phó tiến sỹ khoa
en
học sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà nội, Việt nam.
3. Lê Xuân Thám, 1996. Nấm Linh chi - dược liệu quí ở việt nam. Nhà xuất bản mủi
fid
cà mau.
4. Lê Duy Thắng, 2001. Kỹ thuật nuôi trồng nấm ăn, tập 1. Nhà xuất bản Nông
nghiệp. on
5. Nguyễn Lân Dũng, 2001. Công nghệ nuôi trồng nấm, tập 1 và 2. Nhà xuất bản
Nông nghiệp, Hà nội.
C
6. Nguyễn Hữu Đống, 2003. Nuôi trồng chế biến nấm ăn và nấm làm thuốc chữa
bệnh. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà nội.
ny
7. Nguyễn Hữu Đống và Đinh Xuân Linh, 2000. Nấm ăn nấm dược liệu - công
dụng và công nghệ nuôi trồng. Nhà xuất bản Hà nội.
8. Nguyễn Hữu Đống, Nguyễn Thị Sơn và Zani Federico, 2002. Cơ sở khoa học và
pa
công nghệ nuôi trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà nội.
9. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền và Nuyễn Ánh Tuyết, 2003. Thí nghiệm
om
công nghệ sinh học, tập 2, thí nghiệm vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại học Quốc
Gia TPHCM.
10. Nguyễn Phước Nhuận, 2001. Giáo trình sinh hoá học, phần 1. Nhà xuất bản Đại
C
13. Steyaert R.L, 1972. Species of Ganoderma and related genera mainly of the
boyor and leiden herbaria. National de Beigique, Burxelle.
l
tia
14. Shufeng Zhou, A clinical Study of a Ganoderma lucidum extract in patients with
type II diabetes mellitus. Division of Pharmacology and Clinical Pharmacology,
Faculty of Medicine and Health Science, Auckland University, Auckland, New
en
Zealand.
15. Yihuai Gao, Guoliang Chen, Jin Lan, He Gao and Shufeng Zhou, 2001.
fid
Extractoin of Ganoderma polysaccharides at relatively low temperature. Froc Int
Symposium Ganoderma Sci, Auckland.
16. Yihuai Gao, Jin Lan and Zhifang Liu, Extraction and determination of
on
Ganoderma polysaccharides. Int Med Complement Med Vol 1, Supplement 1,00-
00.
C
17. Zhaoji – Ding, 1980. The Ganodermataceae in chine. Berlin Shiffigart.
23. http://203.162.44.79/khcn/magazine/Tap7/So6/06.htmđnh5
C