MARKER PHÂN TỬ DÙNG TRONG XÁC ĐỊNH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở CÀ

PHÊ CHÈ VIỆT NAM VÀ ÚC

I.Giới thiệu

Marker phân tử đóng vai trò quan trọng trong việc xác định và cải tiến di truyền ở nhiều loại
cây trồng. Nhờ markers phân tử chúng ta có thể đánh giá được sự đa dạng sinh học, xây dựng
lại phả hệ và hiểu cấu trúc, sự tiến hóa và mối quan hệ giữa các cá thể trong quần thể cây
trồng. Hệ thống marker phân tử cho biết sự biến thiên về trật tự ADN trong hệ genome. Có hai
hệ thống marker là marker dựa trên màng lai (hybridisation-based) và marker dựa trên PCR
(PCR-based). Ngọai trừ RFLP (loại marker đầu tiên) dựa trên màng lai, số marker còn lại đều
dựa trên PCR.

Cà phê chè là loài cà phê được ưa chuộng và phổ biến nhất trên thế giới. Loài cà phê này được
biết đến như một loài cà phê có nguồn gốc di truyền hạn hẹp. Chính vì thế việc sử dụng
markers phân tử để xác định tính đa hình của cà phê chè là rất khó. Để có thể ứng dụng
markers trong các nghiên cứu sâu hơn về di truyền cần phải xác định hệ thống markers phù
hợp trong việc phát hiện đa hình. Trên thế giới, các nghiên cứu về di truyền đã sử dụng nhiều
loại marker khác nhau, trong đó phổ biến nhất là RFLP, RAPD, AFLP, SSR và ISSR (xem phụ
lục).

Trong nghiên cứu này 4 hệ thống markers dựa trên PCR phổ biến nhất (RAPD, ISSR, SSR và
AFLP) đã được sử dụng trong việc xác định tính đa hình giữa các cá thể cà phê Việt Nam và
các giống cà phê ở Úc nhằm xác định loại markers đáng tin cậy làm nền tảng cho các nghiên
cứu sử dụng marker cho cà phê chè về sau. Đồng thời thông tin di truyền từ các vật liệu nghiên
cứu sẽ phần nào giúp định hướng cho các phép lai trong công tác chọn giống.

II.Vật liệu - phương pháp

1.Vật liệu

Vật liệu sử dụng trong thí nghiệm gồm 5 giống (Bourbon, K7, Catuai, SL14 và Mundo Novo)
trong đó gồm 11 cá thể từ Việt nam (Viện KHKT NLN Tây nguyên, Đắk Lắk) và 9 cá thể từ
Úc (Bang New South Wales).

2.Phương pháp

a. Hệ thống markers

Sử dụng 4 hệ thống markers (RAPD, ISSR, SSR và AFLP) để xác định tính đa hình và xem xét
độ tin cậy (tính lặp lại, reproducible) của mỗi hệ thống.

Trong nghiên cứu này hệ thống markers RAPD đã được cải tiến bằng cách sử dụng enzym cắt
ADN trước khi đưa vào PCR. 20 RAPD primers (bao gồm 16 OP=Operon của công ty Operon,
Mỹ và 4 UBC= University of British Columbia của trường Đại học British Columbia, Canada)
kết hợp với 5 enzym cắt (HindIII, EcoRI, BamHI, RsaI và HaeIII) tạo nên 65 cách kết hợp giữa
RAPD primers và enzym cắt đã được sử dụng để xác định tính đa hình. 10 primers ISSR đơn
và 22 primers kết hợp được sử dụng trong nghiên cứu. Chiều dài của primers từ 16 -19 bazơ và
sử dụng các motifs lặp đôi, ba hay bốn nucleotide. 6 SSR primers có độ dài từ 19-2 bazơ được
gắn với chất huỳnh quang ở đuôi 5’nhằm phát hiện đa hình trên hệ thống điện di mao dẫn
huỳnh quang la-ze (lazer-induced fluorescence capillary electrophoresis system). 22 AFLP
primers được gắn với chất huỳnh quang nhằm phát hiện đa hình trên hệ thống điện di mao dẫn
huỳnh quang la-ze.

b. Hệ thống phát hiện đa hình

Với markers RAPD và ISSR sử dụng điện di trên agarose, nhuộm trong Ethibium Bromide và
xem dưới hệ thống đèn UV.

Với markers SSR và AFLP trước hết sử dụng điện di trên agarose, nhuộm trong Ethibium
Bromide và xem dưới hệ thống đèn UV để kiểm tra sản phẩm PCR. Sau đó sản phẩm PCR (các
đoạn ADN) sẽ được đặt vào hệ thống điện di mao dẫn huỳnh quang la-ze có độ chính xác đến
từng nucleotide.

III.Kết quả

1.So sánh các markers

Bảng 1: Kết quả PCR của 4 hệ thống markers

Loại Số Số Chiều dài Tổng số Số Tỷ lệ Nhận xét

markers primers primer đoạn band/ band/alleles đa hình
sử có kết ADN (bp) đa hình (%)
alleles
dụng quả
RAPD 65 50 300-2500 333 10 3.0 không rõ
ISSR 32 27 100-1642 113 1 0.9 không rõ
SSR 6 5 96-278 16 11 68.8 rất rõ, chính
xác
AFLP 22 19 57-400* 576 12 2.1 rõ, chính xác
* Việc ghi số liệu hạn chế đến 400 bp bởi tính chất của marker AFLP

bp = base pair = cặp bazơ

RAPDs: Chỉ có 15 trong số 65 kết hợp đủ rõ ràng để ghi chép số liệu và số band thể hiện sự đa
hình là rất thấp (3%). RAPD thể hiện sự ít nhất quán giữa các lần PCR và khả năng phát hiện
đa hình thấp.
ISSRs: Trong số primers sử dụng có 2 primers không thể ghi lại được số band, 3 primers
không thể nhân bản ADN trong PCR. 27 primers đã tạo ra 113 bands và chỉ duy nhất 1 band đa
hình (0.9%). Kết quả của hệ thống markers ISSR thể hiện khá giống với hệ thống markers
RAPD về đoạn ADN được nhân bản với số lượng band từ 1 band đến 11 bands và chiều dài
mỗi đoạn từ 100 cặp basơ (bp) đến 2642 cặp basơ. Cũng như RAPDs, ISSR markers cũng
không đủ thông tin để phát hiện ra sự khác nhau giữa các giống và cũng không có tính lặp lại
(reproducible) giữa các PCR và số band đa hình thấp nhất trong tất cả các hệ thống markers sử
dụng trong nghiên cứu.

SSR: Trong số 6 primers sử dụng có 1 primer không thể nhân bản ADN mặc dù đã sử dụng
nhiều phản ứng PCR khác nhau. Từ 5 primers này 16 alleles đã được phát hiện trong đó có 11
alleles đa hình. Chiều dài đoạn ADN từ 96-278 cặp bazơ. 1 primer thể hiện đa hình rất cao 6/6
alleles đa hình/locus. Marker này có tính lặp lại rất cao giữa các lần làm thí nghiệm và số liệu
rất rõ ràng, chính xác, số band đa hình là rất cao, đạt 68.8%.

AFLP: Trong 22 primers sử dụng có 3 primers không nhân bản ADN. Chiều dài đoạn ADN
biến thiên từ 57-400 cặp bazơ. Tuy số band đa hình ở marker này là thấp (2.1%) nhưng cũng
như SSR, marker này có tính lặp lại rất cao giữa các lần làm thí nghiệm và số liệu rất rõ ràng,
chính xác.

2.Thông tin di truyền

Bảng 2: Kiểu gen của các giống nghiên cứu tại 4 locus của marker SSR

Kiểu gen
Nhóm
STT Giống Locus Locus Locus Locus 4
giống
1 2 3
1 K7-VN B F A A
2 K7 K7-Úc 1 A C A A
3 K7-Úc 2 A C A A
4 Bourbon-VN 1 B A A A
5 Bourbon-VN 2 A A A B
6 Bourbon-VN 3 A B A B
Bourbon
7 Bourbon-VN 4 B A B A
8 Bourbon-Úc 1 B A A B
9 Bourbon-Úc 2 B A A B
10 Catuai-VN 1 B A A B
11 Catuai-VN 2 B A A B
12 Catuai-VN 3 B A A B
Catuai
13 Catuai-VN 4 B A A B
14 Catuai-Úc 1 B A A A
15 Catuai-Úc 2 A A A A
16 SL14-VN A A A B
SL14
17 SL14-Úc A C A A
18 Mundo MNovo-VN A H A A
 19 Mundo Novo-Úc 1 B A A A
Novo
20 Mundo Novo-Úc 2 B A A A
(Nguồn gốc giống xem phụ lục)
Ghi chú
Locus 1: Kiểu gen A: allele 96 bp, 106 bp Locus 3: Kiểu gen A: allele 236 bp, 240 bp
Kiểu gen B: allele 96 bp, 106 bp, 110 bp Kiểu gen B: allele 234 bp, 240 bp
Locus 2: Kiểu gen A: allele 195 bp, 217 bp Locus 4: Kiểu gen A: allele 181 bp
Kiểu gen C: allele 197 bp, 219 bp Kiểu gen B: allele 182 bp
Kiểu gen F: allele 197 bp, 217 bp
Kiểu gen H: allele 195 bp, 217 bp, 219 bp
Bảng 2 cho thấy thông tin di truyền của các cá thể cà phê trong cùng nhóm giống vẫn có sự
khác nhau mặc dù nguồn gen cà phê chè là khá hẹp. Các cá thể trong cùng nhóm giống giữa
Việt nam và Úc luôn luôn có sự khác nhau về di truyền (K7, Bourbon, Catuai, SL14 và Mundo
Novov). Tuy các cá thể trong cùng một giống của Úc được lấy ở các đồn điền khác nhau
nhưng có sự đồng nhất về di truyền cao (2 cá thể K7, 2 cá thể Bourbon và 2 cá thể Mundo
Novo) ngoại trừ 2 cá thể của giống Catuai. Các cá thể trong cùng nhóm giống của Việt nam
được lấy từ vườn tập đoàn có thể khác nhau như 4 cá thể Bourbon, cũng có thể giống nhau như
4 cá thể Catuai mặc dù là những giống có nguồn gốc khác nhau

IV. Nhận xét

Trong 4 hệ thống marker sử dụng trong nghiên cứu, hai markers RAPD và ISSR thể hiện sự ít
nhất quán giữa các lần PCR và khả năng phát hiện đa hình thấp, là marker trội, có nghĩa việc
phân biệt các cá thể đồng hợp và dị hợp bị hạn chế bởi những gen điều khiển tính trạng lặn sẽ
khó tìm thấy sự đa hình trong điện di. Hai marker SSR và AFLP là hai markers có thể sử dụng
để phát hiện đa hình ở cà phê chè tốt bởi tính lặp lại cao. Riêng với marker SSR có khả năng
phát hiện đa hình cao và có khả năng phát hiện đa hình ở thể đồng trội, cho phép phân biệt
được cá thể đồng hợp và dị hợp.

Tuy các cá thể trong cùng một giống của Úc được lấy ở các đồn điền khác nhau nhưng có sự
đồng nhất về di truyền cao (2 cá thể K7, 2 cá thể Bourbon và 2 cá thể Mundo Novo) ngoại trừ
2 cá thể của giống Catuai. Điều này cho thấy sự đồng đều của vật liệu đem trồng ở Úc. 4 cá thể
Bourbon thu thập từ Việt nam là 4 giống khác nhau đã thể hiện rõ sự khác nhau khi dùng
marker SSR. Tuy nhiên 4 cá thể Catuai có nguồn gốc hoàn toàn khác nhau (Nam Phi, Costa
Rica, Brazil, Cuba) nhưng không thấy sự khác biệt sau khi chạy ADN. Điều này cho thấy tầm
quan trọng trong công tác quản lý nguồn gen và tầm quan trọng của việc sử dụng marker để
biết thông tin di truyền của các cá thể làm bố mẹ trước khi tiến hành phép lai trong công tác
chọn tạo giống nhằm tránh phép lai trùng hợp gây lãng phí công sức, thời gian và tiền bạc.

Phụ lục

(1)

RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism = Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn.
RAPD = Random Amplified Polymorphic DNA = Sự đa hình đoạn DNA khuếch đại ngẫu
nhiên.

ISSR = Inter-Simple Sequence Repeat = Các đoạn giữa của các trình tự lặp lại đơn.

SSR = Simple Sequence Repeat = Lặp lại chuỗi đơn giản.

AFLP = Amplified Fragment Length Polymophism = Đa hình chiều dài đọan cắt được
khuếch đại.

(2)

Ký hiệu Mô tả Nguồn gốc Nơi thu thập

K7-VN Giống chọn lọc Nam Phi Vườn tập đoàn WASI, Daklak
K7-Úc 1 Kenya Đông Phi Đồn điền Chesterfield, NSW
K7-Úc 2 Đông Phi Đồn điền King, NSW
K7- Úc 3 Đông Phi Đồn điền Myers, NSW
Bourbon-VN 1 Bourbon số 2 Cameroon Vườn tập đoàn WASI, Daklak
Bourbon Cameroon
Bourbon-VN 2 Salavadoreno
Bourbon Cameroon
Bourbon-VN 3 Mayaquez số 1
Bourbon-VN 4 Bourbon ĐL Đà lạt, VN
Bourbon-Úc 1 Chọn lọc địa Úc Đồn điền Chesterfield, NSW
Bourbon-Úc 2 phương Úc Đồn điền King, NSW
Catuai-VN 1 Con lai Mundo Nam Phi Vườn tập đoàn WASI, Daklak
Catuai-VN 2 Novo và Caturra Costa Rica
Catuai-VN 3 Brazil
Catuai-VN 4 Cuba
Catuai-Úc 1 Costa Rica Đồn điền Zentveld, NSW
Catuai-Úc 2 Costa Rica Đồn điền Zentveld, NSW
SL14-VN Chọn lọc Kenya Thái lan Vườn tđoàn WASI, Daklak
SL14-Úc Đông Phi Đồn điền Zentveld, NSW
MNovo-VN Con lai Bourbon Brazil Vườn tđoàn WASI, Daklak
Mundo Novo-Úc 1 và Typica Costa Rica Đồn điền Zentveld, NSW
Mundo Novo-Úc 2 Costa Rica Đồn điền Zentveld, NSW

NSW = Bang New South Wales

Th.S. Trần Thị Minh Huệ, ngày 24/06/2008