Báo cáo thực hành SHPT Nhóm 1.

4 – Lớp 50 CNSH

BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH SINH HỌC PHÂN TỬ:

CHẨN ĐOÁN BỆNH VIRUS TRÊN ĐỘNG VẬT THỦY SẢN
( VIRUS WSSV GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM)

I. Giới thiệu về bệnh đốm trắng

Bệnh đốm trắng là loại dịch bệnh nguy hiểm, gây rủi ro nhất cho người
nuôi tôm sú từ trước đến nay (được phát hiện từ năm 1993). Bệnh do một loài
virus có tên là Virus gây hội chứng đốm trắng (tên tiếng Anh là white spot
syndrome virus). Khi xâm nhập vào tôm, virus sẽ cư trú ở nhiều bộ phận của
tôm như mô dạ dày, mang, trứng, mắt, chân bơi, … Các virus này sẽ sinh sản
rất nhanh làm tôm nhiễm bệnh nặng và sau đó tiếp tục phát tán ra môi trường
bên ngoài gây bệnh cho cả đàn tôm có trong ao. Từ những thông tin trên, cho
thấy mức độ nguy hiểm của bệnh đốm trắng là rất cao.

Virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) là một trong những nhóm virus
được xếp vào nhóm virus gây chết cấp tính trên tôm nuôi. WSSV gây chết trên
hầu hết các loài tôm thuộc nhóm Penaeus như P. monodon, P. japonicus,
P.chinensis, P. merguiensis… và trên tất cả các giai đoạn phát triển của tôm từ
ấu trùng đến tôm giống, tôm trưởng thành.
Hình thái
Vỏ WSSV là những tiểu phần đối xứng, có hình ellipse hoặc hình que,
không tạo thể ẩn, đường kính từ 120 – 150 nm, chiều dài từ 270 – 290 nm.
WSSV có một phần phụ giống như đuôi ở điểm cuối của vỏ. Một số loại
nucleocapsid cá biệt có đường kính từ 65 – 70 nm, chiều dài từ 300 – 350 nm.
Virus WSSV mang vật chất di truyền là DNA.

Hình 1: Hình thái của virus đốm trắng quan sát dưới kính hiển vi điện tử
(A): phần vỏ (B ): nuclocapsid
II. Phương pháp.
1. Giới thiệu sơ lược về PCR
Trong sinh học phân tử có nhiều phương pháp khếch đại invitro có chọn lọc
nhưng phương pháp nổi tiếng nhất, được phổ biến nhiều nhất đó là PCR

Trang 1
Báo cáo thực hành SHPT Nhóm 1.4 – Lớp 50 CNSH

(Polymerase Chain Reaction).PCR do Karl Mullis và cộng sự phát minh vào

năm 1985 và đã tạo bước nhảy vọt trong sinh học phân tử và kỹ thuật gene.

Hình 2: máy PCR

Nguyên tắc của PCR là dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá
trình tổng hợp DNA mới từ mạch khuôn và khả năng biến tính và hồi tính của
DNA
PCR là phản ứng nhân bản đoạn DNA nhờ enzyme polymerease in vitro và
primer, trong vài giờ có thể tạo ra 230-235 bản sao từ một trình tự DNA, là
một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại một đoạn
DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống.
PCR được sử dụng để làm tăng tốc độ khám phá bộ gene người và khám
phá sớm các bệnh virus. PCR làm thuận lợi cho việc tạo dòng các trình tự DNA
và tạo thành một cơ sở tự nhiên cho việc giải trình tự bằng phương pháp Sanger
và nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác…Cùng với PCR , RT-PCR cũng đã trở
thành một kỹ thuật được áp dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu sinh y, RT-
PCR đã tạo ra nhiều cơ hội trong chuẩn đoán, cho phép phát hiện các vius
RNA.
2. Chương trình PCR
PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kì gồm 3
giai đoạn:

GIAI ĐOẠN 1: BIẾN TÍNH

Nhiệt độ của ống mẫu sẽ được tăng lên đến 94-95oC trong vòng 30s đến 1
phút, ở nhiệt độ này sẽ làm cho phân tử DNA biến tính tách ra làm đôi hoàn
toàn, tất cả hoạt động của các enzyme đều dừng lại (Ví dụ hoạt động kéo dài ở
chu kỳ trước). Mục đích của giai đoạn này làm cho phân tử DNA tách ra làm
DNA mạch đôi và được duỗi thẳng ra hoàn toàn, từ đó dễ dàng cho việc bắt cặp

Trang 2
Báo cáo thực hành SHPT Nhóm 1.4 – Lớp 50 CNSH

và gắn các Nu vào mạch đơn đó theo nguyên tắc bổ sung.

GIAI ĐOẠN 2: BẮT CẶP

Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi bắt
cặp với khuôn, thường dao động từ 40- 70 oC .Các Primer (đoạn mồi) có sẵn
trong ống mẫu sẽ bắt cặp vào các chuỗi đơn DNA sau khi biến tính theo
nguyên tắc bổ sung.
Sự bắt cặp này sẽ có 2 ý nghĩa đặc hiệu:
• Đặc hiệu theo nguyên tắc bổ sung với đoạn gen mà ta cần khuếch đại
• Đặc hiệu theo chiều dài của đoạn gen khuếch đại.

GIAI ĐOẠN 3 : KÉO DÀI

Nhiệt độ được tăng đến 72 oC giúp cho DNA polymerase sử dụng vốn là
polymerase chịu nhiệt hoạt động tốt nhất. Enzyme này sẽ gắn các Nu có sẵn
trong ống nghiệm vào các primer theo nguyên tắc bổ sung, từ đó làm cho đoạn
mồi dài ra và hình thành nên một mạch đơn mới bổ sung với mạch đơn cũ. Và
một bản sao DNA mới đã được hình thành. Như vậy, sau giai đoạn này ta có
được hai phân tử DNA có cấu trúc giống hệt như phân tử DNA ban đầu.

Cả ba giai đoạn biến tính, bắt cặp và kéo dài thuộc một chu kỳ của khuếch
đại DNA. Như vậy, sau mỗi chu kỳ khuếch đại thì từ một phân tử DNA ban
đầu sẽ thành 2 phân tử DNA giống hệt nhau, và sau 30 chu kỳ khuếch đại sẽ có
khoảng 230 phân tử DNA giống hệt nhau (Khoảng 1 tỷ DNA). Như vậy khi số
lượng DNA trong mẫu là vài triệu thì chỉ sau 30 chu kỳ khuếch đại (Thời gian
khoảng 2-3 giờ) ta đã có hàng nghìn tỷ bản sao, lượng DNA này đủ để ta làm
phản ứng cắt cho giải trình tự chuỗi.

Trang 3
Báo cáo thực hành SHPT Nhóm 1.4 – Lớp 50 CNSH

3. Những vấn đề cần chú ý trong kỹ thuật PCR.

3.1. Hot start ( khởi đầu ở nhiệt độ cao)
Khởi động nóng PCR (hot start) là phương pháp sản xuất các sản phẩm
PCR sạch hơn. DNA khuôn mẫu và primer được trộn với nhau và được giữ ở
nhiệt độ trên ngưỡng của liên kết không đặc hiệu giữa primer và khuôn mẫu.
Tất cả các thành phần của PCR được bổ sung trước ngoại trừ một chất then
chốt thường là (Taq pol). Chỉ trước khi đi vào chu kì khếch đại, thành phần
chưa có mới được bổ sung để cho phép phản ứng xảy ra ở nhiệt độ cao hơn. Do
không có hiện tượng lai không đặc hiệu giữa primer với khuôn mẫu, nên các
băng DNA được khếch đại trở nên sáng hơn, các đoạn primer không có cơ hội
để gắn lại với nhau.
3.2. Enzyme
Việc chọn DNA polymerease đã được xác định bởi mục đích của thí
nghiệm. Có hàng loạt enzyme thương mại sẵn có để lựa chọn, Taq DNA
polymerase là được sử dụng phổ biến nhất và được nghiên cứu rộng rãi nhất.
Lượng enzyme cần thiết là phụ thuộc vào lượng DNA template và kích thước
phản ứng PCR.
3.3. Buffter
Hiệu suất, tính chính xác của enzyme DNA polymerase phụ thuộc nhiều
vào hệ buffer sử dụng. Thông thường nên sử dụng đúng loại buffer tương ứng
với enzyme do nhà sản xuất khuyến cáo.
Nhiều loại buffer đã có sẵn một lượng nhất định ion Mg 2+ nên cần lưu ý khi
tối ưu hóa nồng độ Mg2+
3.4. Nồng độ Mg2+ và dNTP
- Việc tăng nồng độ ion Mg2+ có thể làm xuất hiện thêm các sản phẩm
không đặc hiệu. Tuy nhiên nếu thiếu ion Mg2+ thì dẫn đến lượng sản
phẩm PCR thấp.
- Nồng độ ion Mg2+ tối ưu phụ thuộc vào loại DNA polymerase, loại
DNA template và thành phần buffer (một số buffer thương mại đã có
sẵn 1 lượng nhất định ion Mg2+).
- Dò tìm nồng độ Mg2+ tối ưu thông thường bằng gradien nồng độ từ 0.5
đến 2 mM với các khoảng cách mỗi bước là 0.2 mM.
- dNTPs là loại hóa chất kém bền cần lưu ý khi sử dụng và bảo quản. Nên
chia nhỏ lượng dNTPs để giảm số lần làm tan, sử dụng lại.
- Lượng dNTP tối ưu là 200 µM of mỗi loại dNTP. Việc tăng dNTP
không làm tăng đáng kể lượng sản phẩm PCR so với việc hiệu chỉnh các
yếu tố khác.
3.5. Primers
Mồi được thiết kế bố sung với trình tự đầu cuối của đoạn DNA đích PCR,
mồi thường dài khoảng 15-25 nucleotide và có khoảng 50-60% G +C. Mồi cần

Trang 4
Báo cáo thực hành SHPT Nhóm 1.4 – Lớp 50 CNSH

đặc hiệu với DNA khuôn và tránh các trình tự kẹp tóc, trình tự kết thúc để PCR
đạt được hiệu quả.
III. Vật liệu, thiết bị và hóa chất.
1. Mẫu vật thí nghiệm
- 3 đôi chân bơi tôm (mua ngoài thị trường)
2. Dụng cụ, thiết bị
- Máy PCR luân nhiệt
- Máy li tâm lạnh
- Bộ điện di
- Bộ chụp hình gel
- Lò vi sóng
- Cân điện tử
- Ống li tâm 1,5ml
- Đầu tip các loại
- Bút đánh dấu
- Kéo, kẹp, panh
- Bình tam giác chịu nhiệt
- Cốc thủy tinh
3. Hóa chất :
- Cồn 95%,75%
- Agarose
- Nước cất
- Ethidium bromide.
- TBE buffer.
- Choloroform.
- Isopropanol.
IV.Phương pháp thực hiện chuẩn đoán hội chứng đốm trắng ở tôm bằng
Kit IQ2000WSSV

Trang 5
Báo cáo thực hành SHPT Nhóm 1.4 – Lớp 50 CNSH

Hình 3: Qui trình chẩn đoán bệnh virus đốm trắng ở tôm sú bằng kỹ thuật PCR

1. Thành phần của Kit

- Buffer ly giải (200 phản ứng).
- Kit khuếch đại trình tự đặc hiệu WSSV (200 phản ứng):
+ First PCR Premix.
+ Nested PCR Premix.
+ P(+) standard.
+ tRNA nấm men
+ IQzyme DNA polymerase
+ 6X loading dye
- Thang chuẩn DNA (848bp, 630bp và 333bp)
2. Quy trình tách chiết DNA từ tôm.
- Dùng kéo cắt 3 đôi chân bơi của tôm.
- Thêm 500μl dd đệm ly giải lysis buffer vào ống 1,5ml
- Đặt mẫu tôm vào ống và nghiền

Trang 6
Báo cáo thực hành SHPT Nhóm 1.4 – Lớp 50 CNSH

- Ủ mẫu đã chuẩn bị ở 95 o C trong 10 phút, sau đó đem ly tâm 12000g

(12000 vòng/phút, r=5-7cm) trong 10 phút.
- Chuyển 200μl dd trong ở lớp trên vào ống 1,5ml sạch có 400μl cồn 95 % ,
để trong 10-15 phút.
- Vortex nhanh, ly tâm ở 12 000 vòng trong 5 phút, sau đó gạn bỏ cồn và
làm khô cặn
- Hòa tan cặn bằng 50μl nước cất hoặc buffer TE.
Giải thích:
- Đệm ly giải lysis buffer: phá vỡ màng tế bào, màng nhân…giải phóng
DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.
Ngoài ra trong đệm lysis buffer còn chứa dd đệm EDTA giúp duy trì độ
pH như trong môi trường tế bào giữ cho DNA không bị phân hủy.
- Nghiền cơ học: cùng với đệm lysis buffer giúp phá vỡ các cấu trúc tế bào
(màng tế bào, màng nhân,…) giải phóng DNA.
- Ly tâm lần 1:dựa trên sự khác biệt về kích thước, trọng lượng phân tách
các phân tử nucleotic và các chất hữu cơ như protein, lipid,… thành các
pha khác nhau.
- Bổ sung cồn 900 : nhằm kết tủa DNA
- Ly tâm lần 2: thu kết tủa DNA.
- Bổ sung thêm đệm TE:giúp giữ và bảo quản DNA trong một thời gian dài.
Đệm TE có tác dụng ổn định độ pH tránh sự phân hủy các DNA. Ngoài ra
đệm TE còn liên kết với một số ion kim loại (Mg2+,..) làm bất hoạt các
enzyme thủy phân nhằm giữ và bảo quản DNA .

3. Quy trình PCR

Chu trình bước 1 PCR:
5 chu kì: 94o C --- 30s
62 oC --- 30s
72 oC --- 30s

15 chu kì: 94 oC --- 15s

62 oC --- 15s
72 oC --- 20s

Chu kì cuối: 72 oC --- 30s

20 oC --- 30s

Trang 7
Báo cáo thực hành SHPT Nhóm 1.4 – Lớp 50 CNSH

Chương trình Nested PCR:

25 chu kì: 92 oC --- 20s
62 oC --- 20s
72 oC --- 30s

Chu kỳ cuối: 72 oC --- 30s

20 oC --- 30s
Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng cho bước 1 PCR:
8µl/phản ứng: - Frist PCR Premix 7.5µl
- IQzyme DNA Polymerase 2U/µl 0.5µl
Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng cho nested PCR:
15µl/phản ứng: - Nested PCR Premix: 14µl
- IQzyme DNA polymerase 2U/µl 1µl
Quy trình thực hiện:
- Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng bước 1 và nested PCR cho các mẫu và chứng
dương (103,102 và 101) chứng âm (nước hoặc tRNA nấm men).
- Hút 8µl hỗn hợp phản ứng PCR bước 1 vào ống 0,2ml
- Thêm 2µl DNA khuôn mẫu tách chiết hoặc chứng dương vào mỗi phản
ứng.
- Hút 7,5µl frist PCR, trộn 0,5µl enzyme
- Thực hiện chương trình PCR bước 1
- Thêm 14µl hỗn hợp phản ứng nested PCR vào mỗi ống sau khi PCR bước
1 kết thúc
- Tiến hành Nested PCR
- Sau khi phản ứng Nested kết thúc, thêm 5µl dd 6X loading dye vào mỗi
ống phản ứng và mix đều.
- Sau khi trộn đều mẫu được dùng cho điện di.
Giải thích:
• Tiến hành PCR thành 2 bước để đạt được hiệu quả cao hơn vì trong 1
bước số chu kỳ không được vượt quá 40 do: nguyên liệu cạn kiệt ,các
đoạn DNA đơn không bắt cặp với các đoạn mồi mà bắt cặp với nhau ,xuất
hiện các yếu tố phụ ảnh hưởng đến hiệu quả PCR
• Một bước gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ đều gồm 3giai đoạn:biến tính
92oC, bắt cặp 62oC, kéo dài 72oC.

Trang 8
Báo cáo thực hành SHPT Nhóm 1.4 – Lớp 50 CNSH

• 5 chu kỳ đầu: nguyên liệu còn nhiều, số lượng DNA còn ít, ít chịu sự ảnh
hưởng của các yếu tố phụ nên có thể tiến hành trong thời gian lâu ở mỗi
bước là 30s
• 15 chu kỳ tiếp theo: hiệu quả kém hơn 5 chu kỳ đầu nên thời gian ở mỗi
bước giảm xuống chỉ còn 20s
• Chu kỳ cuối: để kéo dài những đoạn DNA còn chưa được tổng hợp xong
và giữ ở 20oC để ổn định các DNA vừa được tổng hợp.
• Nested PCR : là một chiến thuật giúp cho PCR đạt được kết quả tốt hơn.
Hỗn hợp phản ứng nested PCR giúp hạn chế sự ảnh hưởng của các yếu tố
phụ sau khi tiến hành PCR bước 1, nồng độ enzyme cao hơn giúp cho
phản ứng xảy ra tốt hơn.
4.Điện di.
4.1. Chuẩn bị gel agarose.
- Chuẩn bị dd đệm TAE hoặc TBE. Sau đó pha loãng dd điện di về 1X để
sử dụng cho điện di và pha gel agrarose. Chú ý dd điện di và dd tạo gel
agarose phải giống nhau.
- Chuẩn bị gel agarose 2%: thêm 2g agarose vào bình có chứa 100ml dd
điện di.
- Đun hỗn hợp cho tới khi agarose tan hết.
- Để nguội gel agarose trong nhiệt độ phòng cho tới khi nhiệt độ khoảng 50
o
C và đổ từ từ gel vào khuôn. Độ dày của gel không ít hơn 0.8cm.
4.2. Điện di.
- Đặt gel agarose vào bể điện di. DNA sẽ di chuyển về phía cực dương vì
DNA mang điện âm.
- Thêm dd điện di 1X vào bể điện di cho đến khi phủ toàn bộ gel.
- Load 5-10µl hỗn hợp loading dye và sản phẩm PCR vào mỗi giếng. hỗn
hợp sẽ nằm ở đáy giếng.
- Load 5µl thang chuẩn của DNA
- Khi tất cả các mẫu đã load xong, lắp bể điện di với các điện cực và nguồn
điện, bật máy ở 100V- 150V
- Kết thúc điện di, chụp hình gel để phân tích kết quả.
5. Kết quả.
Không có kết quả.
6. Phân tích nguyên nhân.
6.1. Thao tác kỹ thuật
Thao tác còn chưa được thành thục:

Trang 9
Báo cáo thực hành SHPT Nhóm 1.4 – Lớp 50 CNSH

- Quá trình nghiền mẫu chưa tốt, làm DNA chưa được giải phóng hoàn
toàn, DNA bị đứt gãy dẫn đến chất lượng không tốt.
- Vortex mạnh làm DNA bị đứt gãy.
- Thao tác trong điện di còn chưa đúng kỹ thuật
6.2. Thành phần phản ứng.
Thành phần phản ứng chưa phù hợp hoặc có thể do các nguyên nhân sau:
- [dNTP] quá cao hoặc quá thấp
- Thành phần GC trong sản phẩm
- Mẫu bị hư hại hay có lẫn ức chế
- Primer không tinh sạch
- Nồng độ mẫu quá thấp
- dNTP không tinh sạch
- [primer] quá cao
- [enzyme] quá thấp
- Nước dùng cho phản ứng không tinh sạch
6.3. Thời gian và nhiệt độ bắt cặp.
Có thể chưa phù hợp:
- Thời gian biến tính quá dài hoặc quá ngắn
- Thời gian bắt cặp và kéo dài quá ngắn
- Quá ít chu kỳ phản ứng
- Nhiệt độ bắt cặp quá cao
- Nhiệt độ biến tính quá thấp

7. Một số trường hợp không thành công trong PCR.

7.1. Trường hợp 1: không có tín hiệu hoặc tín hiệu vạch rất thấp.
Nguyên nhân:
-Thời gian và nhiệt độ bắt cặp:
 Quá ít chu kỳ phản ứng
 Thời gian bắt cặp và kéo dài quá ngắn
 Nhiệt độ bắt cặp quá cao
 Nhiệt độ biến tính quá thấp
 Thời gian biến tính quá dài hoặc quá ngắn

Trang 10
Báo cáo thực hành SHPT Nhóm 1.4 – Lớp 50 CNSH

- Thành phần phản ứng:

 [dNTP] quá cao hoặc quá thấp
 Thành phần GC trong sản phẩm cao (>65%)
 Mẫu bị hư hại hay có lẫn chất ức chế
 Primer không tinh sạch
 Nồng độ mẫu quá thấp
 dNTP không tinh sạch
 [primer] quá cao
 [enzyme] quá thấp
 Trình tự mồi bị sai
 Trình tự đích quá dài
 Nước dùng cho phản ứng không tinh sạch
 [Mg 2+ ] không tinh sạch
- Thiếu thành phần phản ứng:
 Thiếu dNTP
 Thiếu primer
 Thiếu mẫu
 Thiếu enzyme
 Thiếu Mg 2+
7.2. Trường hợp 2: Sản phẩm không đặc hiệu hoặc primer- dimer
Nguyên nhân
- Thời gian bắt cặp và nhiệt độ chưa tối ưu:
 Quá nhiều chu kì phản ứng
 Thời gian kéo dài quá dài
 Thời gian bắt cặp quá dài hoặc quá ngắn
 Tốc độ gia giảm nhiệt của máy PCR quá chậm
 Nhiệt dộ nóng chảy của primer sai
- Thành phần phản ứng PCR chưa tối ưu
 Primer không tinh sạch
 Nồng độ mồi quá cao
 Mồi được thiết kế sai
 dNTP không tinh sạch

Trang 11
Báo cáo thực hành SHPT Nhóm 1.4 – Lớp 50 CNSH

 [Mg2+ ] quá cao

 Nước không tinh sạch
7.3. Trường hợp 3: tạo ra các vệt tín hiệu
Nguyên nhân:
- Thời gian bắt cặp chưa tối ưu
 Quá nhiều chu kì phản ứng
 Thời gian kéo dài quá dài
 Thời gian bắt cặp quá dài hoặc quá ngắn
 Tốc độ gia giảm nhiệt của máy PCR quá chậm
 Nhiệt dộ nóng chảy của primer sai
- Thành phần phản ứng PCR chưa tối ưu
 Primer không tinh sạch
 Quá nhiều DNA bản mẫu
 Mẫu bị hư hại
 Mồi được thiết kế sai
 dNTP không tinh sạch
 Nước không tinh sạch

Trang 12