Professional Documents
Culture Documents
vn/present/show/entry_id/341029
http://www.scribd.com/doc/24805339/Tong-Quat-Ve-Phan-Tich-Sac-Ky
http://tcyh.yds.edu.vn/2010/Duoc_RHM_YTCC/@@@/DUOC/%E1%BB%A8NG%20D%E1%BB
%A4NG%20S%E1%BA%AEC%20K%C3%9D%20L%E1%BB%8ENG%20HI%E1%BB%86U
%20N%C4%82NG%20CAO%20TRONG%20%C4%90I%E1%BB%80U%20CH%E1%BA%BE
%20CH%E1%BA%A4T%20CHU%E1%BA%A8N%20ASIATICOSID.htm
http://www.scribd.com/doc/25962719/Biodiesel-Doc
http://www.ngoinhachung.net/diendan/threads/42758-Giao-trinh-cua-mon-cac-san-pham-dau-khi-
Phần I : Cơ sở lý thuyết
HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
( High Performance Liquid Chromatography) ,trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High
Pressure Liquid Chromatography)
Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột
cổ điển . Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển
nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích .Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều nghành kiểm
nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho nghành kiểm nghiệm Thuốc . Và nó hiện là công cụ đắc lực trong
phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng .
Phần I : Cơ sở lý thuyết
1 - Khái niệm : Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là châ�t
lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng
phủ lên một chất mang rắn ,hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm
chức hữu cơ .Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ,phân bố ,trao đổi Ion hay phân loại theo
kích cỡ ( Rây phân tử ) .
2- Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột :
Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và lọai sắc ký .
Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có Sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo .
Nếu pha tĩnh là chất trao đổi Ion thì ta có Sắc ký trao đổi ion .
Nếu pha tĩnh là chất Lỏng thì ta có Sắc ký phân bố hay sắc ký chiết .
Phần I : Cơ sở lý thuyết
Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có Sắc ký Gel hay Rây phân tử .
Cùng với pha tĩnh để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột ,chúng ta cần có một pha độ�ng .
Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A,B,C .. Vào cột phân tích ,kết
quả các chất A,B,C.. Sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột .Quyết định hiệu quả của sự tách sắc
ký ở đây là tổng hợp các tương tác .
F2
F3
F1
Phần I : Cơ sở lý thuyết
Tổng của 03 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa rải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ
trên cột là nhỏ nhất ( F1) .và ngược lại .
Đối với mỗi chất ,sự lưu giữ được qui định bởi 03 lực F1,F2,F3 .Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết
định .còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn .
Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột .F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi
cột .
Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau ,Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển
trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột . ( như hình dưới đây )
Phần I : Cơ sở lý thuyết :
Phần minh hoạ quá trình tách các chất A và B trong cột tách sắc ký
Thời gian
A
B
Pha động
Phần I : Cơ sở lý thuyết
3 - Phân loại sắc ký :
Theo cơ chế tách sắc ký người ta phân loa�i như sau :
3.1 Sắc ký hấp phụ :
Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh ,yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa
giải ( phản hấp phụ ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột .Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính
chất động học của chất hấp phụ . Trong trường loại này có 02 loại hấp phụ :
+ Sắc ký hấp phụ pha thuận ( NP - HPLC) : Pha tĩnh phân cực ,pha động không phân cực .
+ Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC) : Pha tĩnh không phân cực ,pha động phân cực .
Loại sắc ký này được áp dụng rất thành công để tách các hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự
nhau và thuộc loại không phân cực,phân cực yếu hay trung bình như các Vitamin,thuốc hạ nhiệt giảm
đau ....
Hiện nay chúng ta đang sử dụng chỉ có loại sắc ký này mà thôi.
Phần I : Cơ sở lý thuyết
Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP )
Trong dược điển USP khi chúng ta tra cứu cột có giá trị tương ứng như sau :
Phần I : Cơ sở lý thuyết
4 - Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ
Kết quả của quá trinh tách các chất được Detector phát hiện ghi thành sắc ký đồ như hình trên
Phần I : Cơ sở lý thuyết
to
t’r2
t’r1
tr1
tr2
To : Thời gian lưu chết
t`r1 : Thời gian lưu thực chất A
t`r2 : Thời gian lưu thực chất B
tr1 : Thời gian lưu chất A
tr2 : Thời gian lưu chất B
Phần I : Cơ sở lý thuyết
Từ các thông số của các peak trên đây ,nhiều đại lượng đặc trưng về lý thuyết được đưa ra để dánh giá
một quá trình sắc ký .Dưới đây là một số đại lượng thường dùng trong thực tế và cách thay đổi các đại
lượng này có lơi� cho quá trình phân tích sắc ký.
4.1 Thời gian lưu thực t`r : Retention time
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt
giá trị cực đại.
Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng
một điều kiện sắc ký đã chọn .Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất.
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố :
+ Bản chất sắc ký của pha tĩnh.
+ Bản chất ,thành phần,tốc độ của pha động
+ Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan
+ Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thu?c vào pH của pha động .
Trong một phép phân tích nếu tr nhỏ quá thì sự tách kém ,còn nếu tr quá lớn thì peak bị doãng và độ
lặp lại của Peak rất kém ,thời gian phân tích rất dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn
dung môi,hoá chất, độ chính xác của phép phân tích kém.
Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố trên đã trình bày .
4.2 Hệ số dung lượng K` : Capacity Factor
Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha cộng với sức chứa
cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm
cân bằng .
K` = ( tR - t0)/ t0
Nếu K` nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém . Nếu K` lớn thì Peak bị doãng . Trong thực tế K` từ 1- 5 là
tối ưu .
Phần I : Cơ sở lý thuyết
4.3 - Độ chọn lọc ? :
Độ chọn lọc ? cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký ,khi 02 chất A ,B có K`A và K`B khác nhau
thì mới có khả năng tách .,mức độ tách biểu thị ở Độ chọn lọc ? .
Phần I : Cơ sở lý thuyết
4.2 Số đĩa lý thuyết N:
Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định .Mỗi đĩa lý
thuyết trong cột săc ký giống như là một lớp pha tĩnh có chiều cao là H ,Tất nhiên lớp này có tính chất
động tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa
nồ�ng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động .
Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố :
+ Đường kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh
+ Tốc độ và độ nhớt ( độ phân cực )của pha động
+ Hệ số khuyếch tán của các chất trong cột .
Vì vậy với một điều kiên sắc ký xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối với một chất phân tích và
số đĩa lý thuyết của cột cũng được xác định.
Phần I : Cơ sở lý thuyết
N = 5,54 ( tR / W0,5)2
Phần I : Cơ sở lý thuyết
Trong thực tế nếu các Peak cân đối ( Gass) thì độ phân giải tối thiểu để 02 Peak tách là R =1.0 .Trong
phép định lượng R=1,5 là phù hợp
+ Nếu R nhỏ thì các Peak chưa tách hẳn ,việc tính toán diện tích Peak sẽ không chính xác ,lúc này phải
tìm cách tăng R theo 03 cách sau:
* Làm thay đổi K` bằng cách thay đổi lực rửa giải của pha động ( Thay đổi độ phân cực nếu là RP -
HPLC ,thay đô�i cường độ ion nếu là IE - HPLC ....)
* Làm tăng số đĩa lý thuyết của cột bằng cách dùng cột dài hơn hoặc cột có kích thước nhỏ hơn .
Phần I : Cơ sở lý thuyết
Peak dạng đô�i xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được vì vậy phải quan tâm đến hệ số không đối
xứng T,
Phần I : Cơ sở lý thuyết
Phần I : Cơ sở lý thuyết
+ Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP-HPLC): Pha tĩnh phân cực ,pha động không phân cực .
+ Sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP - HPLC): Pha tĩnh không phân cực pha động phân cực .
Loại sắc ký này được áp dụng rất rộng rãi ,thành công để tách các hỗn hợp các chất có tính chất gần
tương tự nhau và thuộc loại không phân cực ,phân cực yếu hay trung bình như các Vitamin, các thuốc
hạ hiệt giảm đau .......
Phần I : Cơ sở lý thuyết
I- Máy HP:C gồm các bộ phận cơ bản được tóm tắt trên sơ đ? sau :
Degasse
Pump
Tiêm mẫu
Column
Detector
Phần II : H? th?ng HPLC
Trong đó :
1- Bình chứa dung môi pha độ�ng
2- Bộ phận khử khí
3- Bơm cao áp
4-Bộ phận tiêm mẫu ( bằng tay hay Autosample)
5-Cột sắc ký ( Pha tĩnh ) ( để ngòai môi trường hay trong bộ điều nhiệt )
6- Detector ( nhận tín hiệu )
7-Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận,tín hiệu và sử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống HPLC.
8- In dữ liệu .
Pha Động : Pha động dùng trong loại này là các dung môi có phân cực như :Methanol
,Acetonitril,,nước hay các loại dung dịch đệm ,hỗn hợp của các dung môi-đệm .
Sự tách của chất nhồi loại cột này có độ lặp lại cao và nó được ứng dụng chủ yếu trong phân tích Dược
phẩm . Hiện nay chúng ta chỉ sử dụng loại này là chủ yếu .
Hiện nay pha tĩnh trên nền Silicagel đã có hàng trăm chất khác nhau tùy thuộc vào nhóm thế của
nguyên tử H ,ngoài ra còn có các lọai pha tĩnh trên nền Oxid Nhôm,trên nền chất hữu cơ cao phân
tử,trên nền mạch các bon......
Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký
+ Phải phù hợp với loại Detector : vd UV - VIS thì dung môi không được hấp thụ quang (vd acid acetic
ở bước sáng thấp < 220 nm) . Detector huỳnh quang thì dung môi không được phát quang.
+ Phải kinh tế ,không quá hiếm và đắt
Trong hệ sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP - HPLC) pha động là dung môi phân cực là :
Nước,ACN,MeOH ,acid hay Base hữu cơ và một vài Amin hay Aminoacid ..
+ Do sự thêm nước vào dung môi hữu cơ tạo thành một pha động phân cực hơn chất hữu cơ nguyên
một mình nó .Vd thêm nước vào ACN hay MeOH .. Sẽ tạo được pha động phân cực hơn nó . Tất nhiên
độ phân cực phụ thuộc vào tỷ lệ nước được thêm vào.
Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký
+ Ngòai các dung môi chính thì trong thành phần pha động trong rất nhiều trường hợp tách RP- HPLC
còn có thêm hỗn hợp đệm pH để ổn định pH.Chất tạo phức,tạo cặp ion để tạo ra sự rửa giải tốt nhất .
+ Khi chọn dung môi ta thường dựa vào lực rửa rải E của dung môi theo bảng sau:
BẢNG ĐỘ PHÂN CỰC CỦA MỘT SỐ DUNG MÔI
01- n Hexan 0.1 04 - Methanol 5.11
02-Tetra Chloro Carbon 1.6 05- Actenitril 5.8
03- Toluen 2.4 06- Nước cất 10.20
Phần III : Chọn Điều kiện sắc ký
- Việc lựa chọn điều kiện sắc ký là công việc hết sức cần thiết trong quá trình xây dựng chương trình
sắc ký . Chỉ khi lựa chọn điều kiên sắc ký tốt,phù hợp thì chúng ta mới có thể định tính,định lượng
được các lọai thuốc đa thành phần một cách nhanh chóng và hiệu quả cao .
- Tất nhiên phần lý thuyết nói rất nhiều về các phương pháp chọn điều kiện sắc ký tuy nhiên để chọn
được chương trình sắc ký tốt đồi hỏi phải có thời gian ,tài liệu và một phần kinh nghiệm của những
người làm sắc ký
-Tỷ lệ ACN hay MeOH : Nước ( 50 : 50 ) cho sạch hết các chất còn đọng lại trong cột đồng thời để bảo
vệ cột không bị Mốc khi để lâu . Tuyệt đối tình trạng chỉ rửa bằng nước 100% sau đo� để cột một thời
gian không sử dụng chắc chắn cột sẽ bị mốc ,hỏng không thể dùng được . Xin lưu ý nếu rưẳ cột không
tốt thì kết quả chạy sắc ký sẽ không thể đáp ứng được các yêu cầu phân tích .
4.2 - Chuẩn bị dung môi pha động :
Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết HPLC
Các hóa chất dùng phải là loạ�i PA
Pha dung môi đúng ,chính xác theo đúng tỷ lệ đã nêu ,để ổn định dung môi đúng thời gian theo chuyên
luận đã yêu cầu .Lọc dung môi qua màng lọc 0.2 - 0.45 ?m ,Siêu âm đuổi bọt khí
Phần IV : Tiến hành sắc ký
-Mẫu chuẩn :
Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng dung môi ,riêng về nồng độ các
thành phần giô�ng như mẫu thử là tốt nhất ,ngoài ra có thể dùng nồng độ khác nhưng phải nằm trong
khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần.
4.4 Cách đo HPLC :
Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuôc� vào hãng sản xuất ,phần mền sắc ký . Tuy nhiên
cách vận hành luôn phải theo nguyên tă�c sau :
+ chạy máy với dung môi pha động để đuỏi hết bọt khí có trong hệ thống ống dẫn trước khi cho vào
cột.
Phần VI : Kỹ Thuật tiến hành sắc ký
Phần V
Hệ thống sắc ký Merck - Hitachi và phần mềm điều khiển
D7000 – Multi HSM manager
(Sẽ bổ sung sau)
Người viết
KS Phan Hiền Lương
Mail : luonghoak8@ymail.com