Tiểu luận

1. Amylase (phân loại, đặc điểm, nguồn gốc, ứng dụng)

2. Protease (phân loại, đặc điểm, nguồn gốc, ứng dụng)
3. Lipase (phân loại, đặc điểm, nguồn gốc, ứng dụng)
4. Ứng dụng enzym trong xử lý rác thải, ô nhiễm môi trường
5. Ứng dụng enzym trong chẩn đoán bệnh
6. Các phương pháp xác định hoạt tính và hoạt độ enzym (amylase,
protein, lipase)
7. Ứng dụng enzym trong dược phẩm
8. Các enzym sử dụng trong công nghệ thực phẩm
9. Nguồn enzym từ vi sinh vật (loại enzym, loại vi sinh vật)
10. Các enzym, protein sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử
11. Phương pháp cải biến enzym (tạo enzym chịu nhiệt, chịu chất hoạt
động bề mặt, kiềm, axit...)
12. Các phương pháp tinh sạch protein, enzym
13. Protein đơn bào
14. Các chất ức chế protease (vô cơ, hữu cơ)
Phương pháp nghiên cứu enzym protein

1. Thu nhận enzym protein

2. Tách chiết, tinh sạch enzym protein

3. Định lượng protein enzym

4. Xác định hoạt tính enzym

5. Xác định hoạt độ enzym

6. Nghiên cứu động học enzym

 1. Thu nhận enzym protein

Nguồn enzym:

Enzym nội bào: Mô, tế bào động vật, thực vật, vi sinh vật

Enzym ngoại bào: Dịch enzym được tiết ra trong môi trường

nuôi cấy vi sinh vật

Quy trình tách chiết protein enzym
 Sơ đồ thu nhận, tinh sạch và nghiên
cứu enzym ở phòng thí nghiệm

Nghiên cứu động học

Xác định hoạt độ
Nuôi cấy tế bào, Xác định đặc điểm, tính
vi sinh vật chất enzym
Ngoại bào

Nội bào
Thu sinh khối

Phá vỡ mô, Tủa enzym,

tế bào Dịch enzym thô Tinh sạch
cô đặc

Mô động, thực vật Chế phẩm enzym

tinh khiết
Thử hoạt tính
Xác định hoạt độ
Sơ đồ quy trình sản xuất enzym
Nội bào
Ngoại bào
Cô đặc

Tinh sạch enzym Làm khô

Nuôi cấy
VSV

Tách pha

Phá vỡ tế bào
Phối trộn

Dịch chiết tế bào Tách pha

Tế bào, mô
(động thực vật)
Chế phẩm
enzym
 Quy trình chung

Enzym ngoại bào:

• Dịch enzym được tiết ra trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật, tế bào
• Ly tâm thu dịch nuôi cấy, loại bỏ tế bào và cặn tạp
• Sử dụng các biện pháp kết tủa, ly tâm kết hợp với màng lọc để thu
nhận enzym.

• Cô đặc enzym
• Tinh sạch (nếu cần thiết)
• Thu nhận chế phẩm enzym sạch
• Nghiên cứu tính chất, thử hoạt tính, xác định hoạt độ, động học
enzym
 Dịch chứa enzym

Ly tâm dùng Kết tủa

Sản xuất ở quy mô công nghiệp màng lọc

Cô đặc
Sản xuất thử ở quy mô vừa

• Xác định hoạt tính, hoạt độ Enzym thô

• Nghiên cứu động học
• Thử phản ứng xúc tác Tinh sạch enzym
Tối ưu
quy trình chuyển hóa cơ chất
 Quy trình chung

Enzym nội bào:

• Enzym được tổng hợp bên trong tế bào vi sinh vật, tế bào động, thực
vật.
• Ly tâm thu dịch sinh khối tế bào (nếu tế bào được nuôi cấy trong môi
trường lỏng)
• Sử dụng các biện pháp phá tế bào, mô để giải phóng enzym.

• Ly tâm thu dịch chiết thô chứa enzym

• Sử dụng các biện pháp kết tủa chọn lọc để thu enzym quan tâm
• Cô đặc enzym
• Tinh sạch enzym
• Nghiên cứu tính chất, thử hoạt tính, xác định hoạt độ, động học
enzym
 Ly tâm thu sinh khối
tế bào

Phá vỡ tế bào, mô

Chế phẩm enzym Ly tâm

Dịch chiết thô

Sản xuất quy mô lớn chứa enzym

Sản xuất quy mô vừa Kết tủa chọn lọc

Tối ưu quy trình Enzym thô

• Xác định hoạt tính, hoạt độ Cô đặc

• Nghiên cứu động học

• Thử phản ứng xúc tác Tinh sạch enzym
chuyển hóa cơ chất
 Ly tâm thu sinh khối

Đối với vi sinh vật: Kiểm tra sinh khối bằng phương pháp đo
mật độ quang (độ đục)
Ly tâm: thường ở tốc độ 3.000 đến 5.000 vòng/ phút (thời
gian tùy thuộc vào trọng lượng, kích thước của tế bào).

Một số khái niệm cơ bản

Máy đo quang phổ (Spectrophotometer): ???

OD (optical density): ???
Bước sóng ánh sáng: ???
Pha loãng huyền phù nuôi cấy: ???
Lực ly tâm & tốc độ ly tâm ???
 Tách chiết enzym protein

Dung dịch đệm chiết:

Yếu tố pH, lực ion: pH, nồng độ muối

Các chất hoạt động bề mặt: Triton, Tween

Phá vỡ tế bào:

Cơ học: Nghiền, siêu âm

Hóa học: Enzym phân giải thành, vách, màng tế bào: lysozyme

Bảo vệ protein enzym trong quá trình tách chiết

Các chất chống oxy hóa, chất làm bền cấu trúc enzym:
Các chất ức chế protease: EDTA, PMSF
Nhiệt độ thấp (40C)
 Phương pháp kết tủa enzym

Dựa trên cơ sở của nguyên lý làm kết tủa protein

Sử dụng các yếu tố gây kết tủa (không làm biến tính)
Muối trung hòa
Dung môi hữu cơ không (ít) phân cực

Lưu ý: Khi làm việc với protein phải tiền hành ở nhiệt độ
thấp, tốt nhất là 40C.
 Phương pháp cô đặc

Bay hơi ở áp suất và nhiệt độ thấp (chân không, lạnh)

Ly tâm loại bỏ nước, dung dịch đệm chiết enzym

(sử dụng màng ly tâm)

Tủa protein, sau đó hòa tan lại bằng một lượng nhỏ
dung dịch đệm
 Phương pháp tinh sạch

Sắc ký (chromatography)

• Sắc ký lọc gel (sắc ký loại trừ dựa vào kích thước phân tử)

• Sắc ký trao đổi ion

• Sắc ký ái lực
Sắc ký lọc gel
Gel: silicagel, sephadex
 Các loại gel sắc ký và kích thước
phân tử được sàng lọc tương ứng
Sephadex Mạng lưới phân tử của gel đã được
nhồi trong cột sắc ký
 Sắc ký ái lực

Phương pháp này được Cuatrecasas P, Wilchek M, và Meir

Wilchek phát minh và được trao giải thưởng Nobel Y học năm
1987.

Sắc ký ái lực là một phương pháp dùng để tách hỗn hợp các
chất dựa vào tương tác đặc hiệu cao (ái lực)
Ví dụ:

• Các tương tác giữa kháng nguyên, kháng thể

• Enzym và cơ chất
• Thụ thể và chất gắn thụ thể (receptor & ligand)
Sắc ký ái lực
 Sắc ký ái lực trong việc tinh
sạch các protein tái tổ hợp

• Glutathione-S-transferase (GST)
• Hexahistidine (HIS)
• Lectin
 Sắc ký trao đổi ion

• Sắc ký trao đổi ion: là một quá trình để phân tách các
ions và các phân tử phân cực dựa vào điện tích của
chúng.
• Sắc ký trao đổi ion được sử dụng để tinh sạch protein,
các nucleotide, amino acid.
 Đánh giá độ sạch của protein enzym

• Sắc ký
• Điện di