Professional Documents
Culture Documents
a. Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên cơ sở phức chất đồng protein khử hỗn hợp
photphomolipden – photphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất
mầu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước song 660nm.
Cường độ mầu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong một
phạm vi nhất định. Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta có thể
xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.
OD 0,6
660 0,5
nm 0,4
0,3
0,2
0,1
2
Nguyễn Xuân Hạnh K12 – Sinh học thực nghiệm
Chuyên đề thực hành Hoá sinh học các hợp chất thiên nhiên
Dựa vào đồ thị chuẩn, có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu
nghiên cứu.
3
Nguyễn Xuân Hạnh K12 – Sinh học thực nghiệm
Chuyên đề thực hành Hoá sinh học các hợp chất thiên nhiên
Trong đó:
+ X: số mg protein có trong mẫu
+ [C]: nồng độ protein theo đồ thị 1000 (mg/ml).
+ V: thể tích dung dịch mẫu.
+ a: độ pha loãng dung dịch.
Trong đó:
+ [OD]: mật độ quang học của 1ml dung dịch mầu.
+ V: thể tích dung dịch mầu.
+ a: độ pha loãng dung dịch.
4
Nguyễn Xuân Hạnh K12 – Sinh học thực nghiệm
Chuyên đề thực hành Hoá sinh học các hợp chất thiên nhiên
Chú ý:
1. Con số 0,67 là hệ số tắt của BSA. Để xác định nồng độ các loại protein khác
thì cần phải sử dụng hệ số tắt tương ứng đối với mỗi loại protein. Ví dụ: hệ số tắt của
protein con A là 1, 2.
2. Lựa chọn các protein tiêu chuẩn cần có cấu trúc tương tự như cấu trúc của
các protein cần đo xét nghiệm ở mẫu nghiên cứu vì các protein thường có hệ số tắt
khác nhau ở bước sóng 280nm (Hệ số tắt biểu thị bằng sự hấp thụ của dung dịch 1%
protein đối với một tia sáng có bề dày 1cm). Thêm vào đó, các protein có cấu trúc
khác nhau cũng cho khả năng tạo phản ứng mầu khác nhau với các thuốc thử tạo mầu
như thuốc thử folin – ciocalteu, coomassie brilliant blue G 250.
1%
Sau đây là bảng cho các giá trị hệ số tắt ( E 280 , nghĩa là sự hấp thụ của dung
dịch 10mg protein/ml ở bước sóng 280nm) đối với một số loại protein khác nhau:
Bảng 3.1. Hệ số tắt của một số protein ở bước sóng 280nm
(theo Fashman, 1976)
1%
Các protein E 280
IgG 13,6
IgM 11,8
IgA 13,2
IgA tiết 13,1
IgD 17,0
IgE 15,3
Chuỗi γ 13,7
Chuỗi µ 13,9
Chuỗi α 15,5
Chuỗi nhẹ 12,3
Fab 15,0
Fc 12,0
VH 27,0
Con A (lectin Canavalia
12,0
ensiformis)
Lectin Lens culinaris (LCA) 12,5
BSA 6,7
3. Nếu chưa biết hệ số tắt của protein, hoặc dung dịch gồm hỗn hợp của một số
dạng protein thì nồng độ protein tổng số có thể được tính theo phương trình sau:
Nồng độ protein, tính theo mg/ml = 1,55 x A280 – 0,77 x A260
Trong đó:
+ A280 là giá trị hấp thụ ở bước sóng 280 nm.
5
Nguyễn Xuân Hạnh K12 – Sinh học thực nghiệm
Chuyên đề thực hành Hoá sinh học các hợp chất thiên nhiên
6
Nguyễn Xuân Hạnh K12 – Sinh học thực nghiệm