CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC

ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA.

 I.Phương pháp Maxam-Gilber
1.Nguyên tắc : thủy giải đặc trưng phân tử ADN
cần xác định trình tự bằng phương pháp hóa học.
2.Phương pháp:
Phân tử DNA được đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 ở
đầu 5’ của mạch đơn.
Sau đó, chúng được chia thành 4 hoặc 5 phân
đoạn, mỗi phân đoạn chịu một xử lý hóa học
chuyên biệt.
Ống Xử lí đặc hiệu Vị trí cắt
1 Dimethyl sulphat Cắt tại G
2 Acid (pH=2) Cắt tại A và G
3 Hydrazin Cắt tại A và C
4 Hydrazin + NaCl Cắt tại C
5 NaOH Cắt tại A hoặc C (A>C)
 I.Phương pháp Maxam-Gilber
Cuối cùng các phân đoạn trên được đen đi phân
tách trên gel polyacrylamide.
Vị trí của các oligonucleotide trên gel tương ứng
với kích thước của chúng và được phát hiện
nhờ đầu đánh phóng xạ.
 I.Phương pháp Maxam-Gilber
 Ưu điểm:
• Phương pháp này dễ tiến hành.
• Chi phí thấp.
 Nhược điểm:
• Độ chuẩn xác không cao.
• Không được sử dụng rộng rải do độc tính của hoá
chất.
 II.Phương pháp Sanger (phương pháp enzyme):

1.Nguyên tắc: dựa vào sự tổng hợp nhờ enzyme

ADNpolymerase mạch bổ xung cho trình tự ADN
mạch đơn cầ n xác định.
Sử dụng thêm bố n loại dideoxynucleotide (ddNTP)
là những loại deoxynucleotide (dNTP) bị mấ t cả
hai nhóm OH ở carbon số2 và số3, hoặc có thể
dùng dideoxynucleotides triphosphate (didNTP)
bị mất nhóm OH ở carbon số3.
II.Phương pháp Sanger (phương pháp
enzyme):
Phương pháp Sanger (phương pháp
enzyme):
2.Phương pháp: Sanger thiết lập 4 lọ phản ứng riêng
biệt
Lọ 1 Lọ 2 Lọ 3 Lọ 4
DNA template DNA template DNA template DNA template

1 primer ngắn 1 primer ngắn 1 primer ngắn 1 primer ngắn

(khoãng 20 (khoãng 20 (khoãng 20 (khoãng 20
nucleotide) nucleotide) nucleotide) nucleotide)

DNA DNA DNA DNA

polymerase III polymerase III polymerase III polymerase III

4 loại dNTP 4 loại dNTP 4 loại dNTP 4 loại dNTP

(dATP, dGTP, (dATP, dGTP, (dATP, dGTP, (dATP, dGTP,
dTTP, dCTP ) dTTP, dCTP ) dTTP, dCTP ) dTTP, dCTP )

didNTP – A didNTP – T didNTP – C didNTP – G

Sau đó, bốn phản ứng tổng hợp sẽ được đem phân
tách trên gel polyacrylmide.
 II.Phương pháp Sanger (phương pháp
enzyme):
 Ưu điểm:
• Đơn giản, có độ chính xác cao.
• Có thể dùng chung mồi cho nhiều đối tượng khác
nhau.
 Nhược điểm:
• Chỉ đọc được một đoạn trình tự ngắn.
• Các đoạn ADN cần được tách dòng trước khi tiến
hành giải trình tự ADN.
III.Giải trình tự DNA bằng máy tự động
III.Giải trình tự DNA bằng máy tự động

1.Nguyên tắc: dựa trên phương pháp Sanger.

2.Phương pháp:
Mỗi loại dideoxynucleotide được đánh dấu bằng
một fluochrome có màu khác nhau.
Dùng tia laser để xác định bước sóng để từ đó
định ra nucleotide tương ứng.
IV.Phương pháp PCR dùng trong xác định trình t ự nucleic acid

1.Nguyên tắc: phối hợp giữa phương pháp PCR và

phương pháp sử dụng các dideoxynucleotide.
2.Phương pháp:
Đọan DNA cần xác định sẽ đượ khuếch đại bằng
phương pháp PCR.
Các bước tiếp theo tiến hành giống như phương
pháp Sanger.
THANK YOU!