Báo cáo chuyên đề thực vật chuyển gene

CHUYÊN ĐỀ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO


Chuyên đề báo cáo:
Thực vật chuyển gene
Nội dung báo cáo:
I. Giới thiệu về thực vật chuyển gene.
II. Phương pháp tạo cây chuyển gene.
III. Thành tựu cây chuyển gene.
I. Giới thiệu về thực vật chuyển gene.
Kyõ thuaät chuyeån gen laø kyõ thuaät ñöa moät hoaëc nhieàu gen laï ñaõ ñöôïc thieát
keá ôû daïng DNA taùi toå hôïp vaøo teá baøo chuû cuûa caây troàng noùi rieâng vaø cuûa caùc sinh
vaät noùi chung (VSV, ñoäng vaät,…) laøm cho gen laï coù theå toàn taïi ôû daïng plasmid taùi toå
hôïp hoaëc gaén vaøo boä gen teá baøo chuû. Trong teá baøo chuû gen laï naøy hoaït ñoäng toång
hôïp neân caùc protein ñaëc tröng daãn ñeán vieäc xuaát hieän caùc ñaëc tính môùi cuûa cô theå
chuyeån gen.
(Lang,2004).
II. Phương pháp tạo cây chuyển gene.
1. Phương pháp chuyển gene gián tiếp.
a. Phương pháp chuyển gene gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
• Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Agrobacterium laø nhoùm caùc vi khuaån ñaát Gram aâm gaây ra caùc trieäu chöùng
beänh ôû caây. Agrobacterium goàm coù caùc loaïi: A. tumefaciens; A. rhizogenes; A. rubi; A.
radiobacter. Trong ñoù A. tumebacterium ñöôïc söû duïng phoå bieán cho chuyeån gen vaøo thöïc
vaät.
• Quy trình chuyển gene nhờ vi khuẩn A. tumefaciens.

Site where restriction enzyme cuts: Enzyme cắt hạn chế.

DNA conteining gene for desired trait: DNA chứa gene mong muốn cần chuyển.
Insertion of gene into plasmid using restriction enzyme and DNA ligase:Chuyển DNA chứa gene mong muốn
vào Plasmid nhờ enzyme cắt hạn chế và DNA ligase.
Recombinant Ti-plasmid: Ti-plasmid tái tổ hợp.
Introduction into plant cells in culture: Chuyển Ti-plasmid ( chứa gene mong muốn) vào tế bào thực vật.
T DNA carrying new gene within plant chromosome: Ti-plasmid đưa gene mới vào NST của thực vật.
Regeneration of plant: Tái sinh thành cây.
Plant with new trait: Cây có những đặt tính mới.
b. Phương pháp chuyển gene gián tiếp nhờ virus:
Bên cạnh vi khuẩn Agrobacterium, còn có các hệ thống dùng Virus làm vectơ chuyển gene vào thực vật. Việc sử
dụng Virus có một số ưu điểm như: Chúng dễ xâm nhập và lây lan nhanh trong cơ thể thực vật. Đồng thời có thể mang đoạn
DNA lớn hơn so với khả năng của các plasmid.
Ngoài những ưu điểm trên, chuyển gene trên cơ sở virus có một số hạn chế:
- Các acid nucleic của virus không ghép nối với bộ gene của thực vật, vì vậy DNA tái tổ hợp không di truyền được cho
các thế hệ sau thong qua hạt. Do đó nhân giống các cây chuyển gene phải qua con đường vô tính.

Trang 1 Nhóm 10
 Báo cáo chuyên đề thực vật chuyển gene

- Sự lây nhiễm virus thường làm yếu tế bào thực vật ở các mức độ khác nhau… Vì thế nhìn chung chuyển gen nhờ virus
nhìn chung ít được sử dụng.

2. Phương pháp chuyển gene trực tiếp.

a. Chuyển gene trực tiếp bằng súng bắn gene ( gene gun).
Nguyên tắc chung của phương pháp này là ngâm các viên đạn nhỏ ( vi đạn) bằng vàng hoặc tungsten có kích
thước cực nhỏ, đường kính khoảng 0,5-1,5 µm với dung dịch có chứa đoạn DNA ngoại lai cần chuyển vào tế bào thực vật. Các
vi đạn này được làm khô trên một đĩa kim loại mỏng cá kích thước 0,5-0,9 cm. Đĩa kim loại này được gắn vào đầu một viên
đạn lớn (macroprojectile) bằng nhựa, hoặc vật liệu nhẹ. Viên đạn lớn có kích thước vừa khít đầu nòng súng bắn gen. Khi bắn áp
suất hơi sẽ đẩy viên đạn lớn đi với tốc độ cao. Tới đầu nòng sung, viên đạn lớn sẽ bị cản lại bởi một lưới thép mịn, còn các viên
đạn nhỏ ( vi đạn) vẫn tiếp tục di chuyển với vận tốc lớn tới 1300m/s đến đối tượng bắn rồi xuyên vào tế bào. Sauk hi bắn, tách
các mô, tế bào và nuôi cấy in vitro để tái sinh cây. Chỉ có một tỷ lệ nào đó của tế bào mang gen chuyển do vậy cần phải chọn
lọc. Người ta thường dùng khí nén là helium áp lực cao để bắn gen.

b. Chuyển gene trực tiếp bằng xung điện ( electroporation).

Trong công nghệ di truyền thực vật, người ta sử dụng phương pháp xung điện để chuyển gene vào protoplast thực
vật. Ở điện thế cao, trong thời gian ngắn có thể tạo ra các lỗ trên màng tế bào trần ( protolast) làm cho DNA bên ngoài môi
trường có thể xâm nhập vào bên trong tế bào. Người ta chuẩn bị một huyền phù protoplast với các plasmid tái tổ hợp đã mang
gene mong muốn cần chuyển vào thực vật.
Dùng thiết bị điện xung tạo điện thế cao ( 200-400V/cm) trong khoảng thời gian 4-5 phần nghìn giây. Kết quả là
màng tế bào trần xuất hiện các lỗ thủng tạm thời giúp cho plasmid tái tổ hợp có thể xâm nhập vào hệ gene của thực vật. Quá
trình được thực hiện trong cuvett chuyên dụng. Sau quá trình xung điện, đem protolast nuôi trong môi trường nuôi cấy thích
hợp, môi trường chọn lọc để tách các protolast đã được biến nạp. Tiếp theo là nuôi cây in vitro, tái sinh cây và chọn lọc cây
chuyển gene.

c. Chuyển gene trực tiếp nhờ kỹ thuật siêu âm.

Kỹ thuật siêu âm dùng để chuyển gene vào tế bào trần protoplast. Sau khi tạo protoplast, tiến hành trộn protoplast
với plasmid tái tổ hợp mang gene mong muốn để tạo hỗn hợp dạng huyền phù.
Cắm đầu siêu âm của máy phát siêu âm ngập trong hỗn hợp huyền phù sâu khoảng 3 mm. Cho máy phát siêu âm
với tần số 20 KHz theo từng nhịp ngắn, mỗi nhịp khoảng 100 miligiây. Số nhịp khoảng từ 6-9 nhịp với tổng thời gian tác động
từ 600 – 900 miligiây.
Sauk hi siêu âm, đem protoplast nuôi trong môi trường, chọn lọc để tách các protoplast đã được chuyển gene.
Nuôi cấy in vitro để tái sinh cây. Chọn lọc cây và đưa ra trồng ở môi trường bên ngoài.
d. Chuyển gene trực tiếp bằng phương pháp hóa học.
Là phương pháp chuyển gene vào tế bào protoplast nhờ các chất hóa học như polyethylene glycol (PEG). Khi có
mặt PEG, màng của protoplast bị thay đổi và protoplast có thể thu nhận DNA ngoại lai vào bên trong tế bào. Phương pháp
chuyển gene bằng hóa chất có thể áp dụng đối với nhiều loài thực vật nhưng khả năng chuyển gene với tần số chuyển gene rất
thấp. Tuy nhiên với khả năng tạo ra số lượng lớn protoplast, do vậy khắc phục được hạn chế của phương pháp này.
e. Chuyển gene trực tiếp qua ống phấn.
Là phương pháp pháp chuyển không qua nuôi cấy mô in vitro.
Nguyên tắc của phương pháp này là DNA ngoại lai chuyển vào cây theo đường ống phấn, chui vào bầu nhụy cái.
Thời gian chuyển gene là vào lúc hạt phấn mọc qua vòi nhụy và lúc bắt đầu đưa tinh tử vào thụ tinh. Theo các tác giả, tốt
nhất là sự chuyển gene xảy ra đúng khi quá trình thụ tinh ở noãn và cho tế bào hợp tử chưa phân chia. Như vậy sự chuyển
gene chỉ xảy ra ở một tế bào sinh dục cái duy nhất.
f. Chuyển gene trực tiếp bằng vi tiêm ( microinjection).

Trang 2 Nhóm 10
 Báo cáo chuyên đề thực vật chuyển gene

Nguyên lý cơ bản của chuyển gen băng vi tiêm giống như chuyển gene bằng vi tiêm ở động vật. Ở thực vật,
chuyển gene bằng vi tiêm là chuyển gene trực tiếp vào tế bào protoplast nhờ thiết bị vi thao tác và kim vi tiêm. Phương pháp
này cần có thiết bị có độ chính xác cao, kỹ thuật và kỹ năng của người thực hiện phải chính xác.
III. Thành tựu cây chuyển gene.
1. Bông vải chuyển gene.
Khaùng coân truøng (gen Bt) khaùng saâu ñuïc traùi hay saâu ñuïc thaân (cotton boll).
Bằng phương pháp du nhập vào cây bông các gen “Non-expressor of Pathogenesis-Related genes-1 (viết tắt là NPR1) từ
cây Arabidopsis thaliana, các nhà khoa học của Đại Học Texas A&M và Bộ Nông Nghiệp Hoa Kỳ đã phát triển thành công
dòng bông vải kháng được bệnh do vi nấm và kháng được tuyến trùng. NPR1 có vai trò rất quan trọng trong hệ thống miễn dịch
của cây: SAR (viết tắt từ chữ systemic acquired resistance), phản ứng tự vệ lâu dài được cảm ứng trong cây khi bị vật lạ xâm
nhiễm; chúng tạo ra phản ứng kháng bảo vệ sau đó với phổ kháng rộng các vi nấm gây bệnh hại cây.
2. Đu đủ chuyển gene.
Nghiên cứu do một số Trường đại học vùng Midwest thực hiện cho thấy, với việc ngăn chặn được loại sâu bệnh này,
những người trồng bắp ở Illinois, Minnesota, và Wisconsin đã tiết kiệm được 3,2 tỷ đô trong vòng 14 năm qua, trong đó những
người trồng bắp không chuyển gen hưởng lợi được 2,4 tỷ. Tương tự, những người trồng bắp ở Iowa và Nebraska đã tiết kiệm
được 3,6 tỷ đô, trong đó những người trồng bắp không biến đổi gen hưởng lợi được 1,9 tỷ.
Bắp chuyển đổi gen được tạo ra để có protein trừ sâu, giúp bắp chống lại vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt). Bắp
kháng Bt được áp dụng rộng rãi trong ngành nông nghiệp Mỹ kể từ khi được thương mại hóa vào năm 1996. Vào năm 2009,
bắp kháng khuẩn Bt chiếm 63% vụ mùa ở Mỹ.
3. Gạo hạt vàng.
Hạt gạo vàng là một thành quả lớn trong chương trình nghiên cứu của đội ngũ khoa học gia Thụy Sĩ và Đức quốc,
được cơ quan Rockerfeller Foundation của Mỹ tài trợ 100 triệu Mỹ kim trong 10 năm. Đội ngũ này được hướng dẫn bởi Giáo
sư Ingo Potrykus, Viện Kỹ Thuật Liên Bang ở Thụy Sĩ, và Tiến Sĩ Peter Beyer, Đại học Freiburg ở Đức. Các nhà khoa học
đã đưa tất cả 7 gien lạ vào giống lúa TP 309 qua hai qui trình khác nhau, với phương pháp chuyển gien bằng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens (Potrykus, 2003):
- 3 loại enzym có mã số từ gien carotene synthetase (vi khuẩn Erwinia uredovora), gien phytoene synthase
(Narcissus), và gien lycopene cyclase (cDNAs từ Narcissus pseudonarcissus) cùng một phân tử geranyl-pyrrhophosphate làm
cho hạt gạo có khả năng tạo ra chất β-carotene màu vàng; và
- 3 emzym khác: một gien chuyển chất sắt ferritin (từ đậu Tây Phaseolus vulgaris) làm tăng hàm lượng sắt gấp đôi,
một gien để tạo ra chất giống protein - metallothionin (từ gạo Basmati Oryza sativa) có nhiều chất cystein để làm tăng hấp thụ
chất sắt 7 lần, và enzym phytase chịu nhiệt độ cao (từ Aspergillus fumigatus) ngăn phá hủy chất sắt để giúp hạt gạo tích tụ
nhiều chất này mà cơ thể con người có thể hấp thụ được.
4. Đậu nành chuyển gene.
Khaùng thuoác dieät coû Roundup ready (laøm giaûm söï phun thuoác dieät coû cho caây
troàng).
Caûi taïo chaát beùo trong daàu).

Trang 3 Nhóm 10