TÌM HIỂU VỀ PHỔ KHỐI LƯỢNG MS VÀ PHỔ HỒNG NGOẠI NMR

PHỔ KHỐI LƯỢNG

KHỐI PHỔ LÀ GÌ?

• là phương pháp nghiên cứu các chất, bằng cách đo chính xác khối lượng phân tử chất đó,
dựa trên điện tích của ion; dùng thiết bị chuyên dụng là khối phổ kế.

• Kĩ thuật này có nhiều ứng dụng, thường được kết hợp với một số sinh học phân tử khác như:

– Khối phổ kết hợp với sắc ký khí.

– Khối phổ kết hợp với sắc ký lỏng.

– Khối phổ kết hợp điện di

SỰ HÌNH THÀNH VÀ

NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG

Sự ion hoá

• nghiên cứu các chất bằng phương pháp khối phổ, các phân tử chất nghiên cứu phải ở dạng
khí hoặc hơi, phải được ion hoá bằng các phương pháp thích hợp(va chạm điện tử ,bằng
trường điện từ ,ion hoá học,chiếu xạ bằng các photon.)

Phương pháp ion hoá bằng

va chạm điện tử

• Trong buồng ion hoá, các điện tử phát ra từ cathode làm bằng vonfram hoặc reni, bay về
anode với vận tốc lớn.

• Các phân tử chất nghiên cứu ở trạng thái hơi sẽ va chạm với điện tử trong buồng ion hoá, có
thể nhận năng lượng điện tử và bị ion hoá.

Ion hoá bằng trường điện từ

• Tại buồng ion hoá đặt các “mũi nhọn” là bộ phận phát từ trường dưới dạng dây dẫn mảnh
(2.5 µm) hay các lưỡi mảnh

• đặt điện áp vào các “mũi nhọn”. cho một trường điện từ có gradien 10 7-1010 V/cm

• các điện tử sẽ bị bứt khỏi phân tử chất nghiên cứu do hiệu ứng đường hầm nên không gây
sự kích thích,vẫn giữ nguyên ở trạng thái cơ bản, do đó các vạch phổ sẽ rất mảnh.

Máy khối phổ

• là một thiết bị dùng cho phương pháp phổ khối, cho ra phổ khối lượng của một mẫu, để tìm
ra thành phần của nó.
 • Có thể ion hóa mẫu và tách các ion của nó với các khối lượng khác nhau và lưu lại thông tin
dựa vào việc đo đạc cường độ dòng ion

. Một khối phổ kế thông thường gồm 3 phần:

• phần nguồn ion

• phần phân tích khối lượng

• phần đo đạc.

Cấu tạo:

• Máy gồm một đĩa đựng mẫu, máy bắn laser, một ống tròn đảo chiều điện cực liên tục và
detector.
 • Bất kỳ máy khối phổ nào cũng có bốn khối chức năng sau đây:

• Hệ thống nạp mẫu

• Buồng ion hoá

• Bộ phân tích

• Bộ ghi tín hiệu

Dựa vào bộ phận phân tích mà người ta chia các loại máy khối phổ như sau:

• Bộ phận tích từ.

• Bộ phận tích tứ cực.

• Bộ phận tích theo thời gian

• Bộ phận tích cộng hưởng ion cyclotron.

Theo tính năng bộ ghi, người ta chia các máy khối phổ thành hai loại:

• Máy khối phổ ký ghi bằng kính ảnh. Tín hiệu phổ được ghi bằng kính ảnh ở
dạng vạch có độ đen khác nhau.

• Máy khối phổ kế: các tín hiệu của chùm ion được ghi dưới dạng xung điện
bằng các dao động ký điện tử nhiều kênh, hoặc đưa vào máy tính điện tử,tín
hiệu sẽ được đưa ra dưới dạng bảng số hoặc đồ thị thích hợp.

Ngày nay trong phân tích khối phổ người ta dùng các máy khối phổ kế.

nguyên lý hoạt động của máy khối phổ

• Mẫu chất cần phân tích sẽ được chuyển thành trạng thái hơi, sau đó mới bắt đầu quá trình
đo khối phổ

• Để đo được đặc tính của các phân tử cụ thể, máy khối phổ sẽ chuyển chúng thành các
ion,kiểm soát chuyển động của chúng bởi các điện từ trường bên ngoài

• quá trình được thực hiện trong môi trường chân không

• Trong khi áp suất khí quyển vào khoảng 760 mmHg, áp suất môi trường xử lý ion thường từ
10-5 đến 10-8 mmHg (thấp hơn một phần tỉ của áp suất khí quyển).

• Ion sau khi được tạo thành sẽ được phân tách bằng cách gia tốc và tập trung chúng thành
một dòng tia mà sau đó sẽ bị uốn cong bởi một từ trường ngoài.

• Các ion sau đó sẽ được thu nhận bằng đầu dò điện tử và thông tin tạo ra sẽ được phân tích
và lưu trữ trong một máy vi tính.
Ứng dụng của máy khối phổ trong phân tích protein

• protein được tinh chế rồi cắt bằng enzyme pepsin . Enzyme pepsin cắt polypeptide tại
những điểm nhất định trên chuỗi (giống enzyme giới hạn ở acid nucleic).

• Ta có thể dự đoán được các mảnh (fragments) polypeptide sau khi bị cắt

• Đưa mẫu đã xử lý pepsin vào đĩa và cho máy chạy. Laser ion hoá các fragments làm cho
chúng tích điện dương và bật ra bay vào ống.

• Ống này có chiều dài nhất định, 4 phía gắn 2 loại điện cực (+) và (-)

• ống có thể xoay tròn, do đó các cực điện đổi chiều liên tục làm cho các mảnh polypeptide
không bám được vào thành mà bay theo chiều xoắn ốc

• Vận tốc bay của 1fragment phụ thuộc 2 yếu tố

• điện tích (z)

• khối lượng (m)

• Máy khối phổ đo được thời gian, biết trước quãng đường => tính được vận tốc => xác định
được chỉ số m/z của fragment.

• Các tín hiệu được phát hiện bởi detector và khuếch đại, cuối cùng biểu diễn trên đồ thị ở
dạng các đỉnh (peak). Mỗi đỉnh tương ứng 1 fragment.
 • Với máy MS/MS (tandem MS) thì đây mới là lần MS thứ nhất, cho phép hiển thị các
fragment của một polypeptide bị cắt bằng pepsin. Lần MS thứ 2 cho phép khẳng định chắc
chắn 1 fragment nhất định nhờ hệ thống lọc.

Schematic of a MALDI-TOF Mass Spectrometer

Phân tích kết quả:

• Vì protein bao gồm 20 amino acid có khối lượng khác nhau do đó khối lượng của một trình
tự đủ nhỏ cũng nói lên được trình tự của nó. (Giả sử Valin có khối lượng là 3, methionin là
5 thì một fragment có khối lượng là 8 sẽ có trình tự Valin – Methionin hoặc Methionin –
Valin).