Professional Documents
Culture Documents
I. MỤC ĐÍCH
Thực tập sử dụng kính hiển vi quang học có 2 mắt kính để quan sát các dạng tế
bào thực vật và tế bào động vật. Phương pháp tính kích thước thực của tế bào và
nhiễm sắc thể bằng sử dụng trắc vi thị kính và trắc vi vật kính.
II. CHUẨN BỊ
1. Dụng cụ: Kính hiển vi một mắt kính và hai mắt kính với các vật kính 10X,
40X; trắc vi vật kính, trắc vi thị kính, lam kính, lamen, panh, kéo, lưỡi dao lam, khăn
lau, đèn cồn,..
2. Hoá chất: Dung dịch thuốc nhuộm carmin axêtic 2%, axit axêtic 45%, nước
cất, cồn tuyệt đối.
3. Mẫu vật: Tiêu bản cố định, quả dưa hấu.
169
2.1. Cách sử dụng
– Chuẩn bị kính: Kính hiển vi cần được đặt trên bàn phẳng, chắc chắn, ở nơi có
đủ ánh sáng. Đặt kính không quá thấp mà vừa tầm mắt để quan sát được dễ dàng.
– Lấy ánh sáng: Đối với kính hiển vi dùng điện, bật công tắc đèn và vặn chiết
áp từ từ cho đèn có độ sáng phù hợp. Đối với kính hiển vi dùng gương để lấy ánh sáng
thì phải điều chỉnh mặt phẳng của gương để lấy ánh sáng thiên nhiên (không dùng ánh
sáng mặt trời trực tiếp) hoặc điều chỉnh mặt lõm của gương để lấy ánh sáng từ đèn
điện, sau đó mở hết các chắn sáng rồi xoay bàn xoay để đưa vật kính có bội giác bé
(10X) vào giữa mâm kính, điều chỉnh gương và chắn sáng để được ánh sáng phù hợp.
– Quan sát: Đặt tiêu bản lên mâm kính, điều chỉnh cho vật cần quan sát vào
đúng giữa trường kính.
– Quan sát qua vật kính có độ phóng đại nhỏ, dùng ốc điều chỉnh sơ bộ để nâng
mâm kính nên sao cho đầu vật kính cách tiêu bản khoảng 0,4 – 0,5mm. Nhìn vào thị
kính và hạ từ từ mâm kính xuống cho đến khi nhìn rõ vật cần quan sát rồi tinh chỉnh
bằng ốc vi cấp để nhìn thấy vật rõ nét hơn.
– Khi quan sát bằng vật kính có độ phóng đại lớn làm như sau:
Điều chỉnh cho vị trí cần quan sát vào giữa thị trường của kính. Dùng tay xoay
nhẹ nhàng và từ từ để vật kính cần sử dụng vào vị trí làm việc.
Mở rộng thêm chắn sáng để tập trung nhiều ánh sáng hơn vào vật quan sát.
Dùng ốc vi cấp điều chỉnh từ từ trong khi mắt đang tập trung vào trường kính
cho đến khi nhìn rõ nét tiêu bản.
170
Nên dùng cả hai mắt để quan sát như thế sẽ quan sát trên kính thời gian lâu hơn,
vừa quan sát vừa có thể vẽ hình.
3. Thực tập sử dụng kính hiển vi quang học quan sát tế bào và nhân
3.1. Quan sát các dạng tế bào trên tiêu bản cố định (tiêu bản tế bào đỉnh rễ
hành, rễ cây ráy,...)
4. Sử dụng trắc vi vật kính và trắc vi thị kính xác định kích thước thực của
tế bào, nhiễm sắc thể
171
Vị trí trắc vi
thị kính
Cách tính:
1 vạch của trắc vi thị kính bằng
5
10µ× = 2,38= 2,24µ
21
Vạch thứ 21 của trắc vi thị kính B Mỗi vạch trắc vi vật kính tương ứng với
trùng với vạch thứ 5 của trắc vi vật 10µ
kính
Xác định kích thước vi Trắc vi thị kính Lấy trắc vi vật kính ra khỏi kính
khuẩn và thay vào vị trí đó là tiêu bản cần
Đường kính của vi khuẩn
A xác định kích thước hiển vi. Điều
= 2,4× 1,2 = 2,88 ≈ 2,9µ
chỉnh kính để xem rõ mẫu, đọc số
( ) (vạch)
Số vạch đo được vạch tương ứng với độ lớn mẫu cần
trên trắc vi thị kính đo
(× 100
là
172
A. QUAN SÁT CÁC DẠNG TẾ BÀO
I. MỤC ĐÍCH
Nhận dạng các hoá chất và pha chế được các loại dung dịch thường dùng để cố
định và nhuộm tế bào. Phương pháp làm tiêu bản hiển vi để quan sát các dạng tế bào,
nhận xét về tính nhiều dạng của các loại tế bào. Rèn luyện kĩ năng và thao tác làm tiêu
bản tế bào.
II. CHUẨN BỊ
1. Dụng cụ: Kính hiển vi, lam kính, lamen, kim mũi mác, lưỡi dao cạo, tiêu bản
cố định, đèn cồn, cốc thủy tinh, bút viết bảng, bột phấn màu.
2. Hoá chất: Nước cất, cồn tuyệt đối, cồn metylic (CH3OH), carmin axêtic
(2%) Giemsa, xanh metylen, Fuchsin, axit axêtic 45%, dung dịch muối sinh lí (0,6%
NaCl).
3. Mẫu vật: Củ hành tây, hoa các loài cây, lá cây thài lài tía, ếch sống.
173
Ngoài ra còn nhiều dung dịch cố định khác mà ở đó axit axêtic được thay thế
bằng axit propionic hay axit cromic...
174
– Quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 ~ 800 lần. So sánh hình dạng
các hạt phấn.
2.4. Quan sát hình dạng tế bào và lông tế bào niêm mạc hàm trên miệng ếch
– Mở miệng ếch bằng cách cầm ngả ếch trong lòng bàn tay, dùng ngón trỏ kéo
hàm dưới của ếch xuống. Dùng bụi phấn màu cho vào trong hàm trên của ếch.
– Quan sát dòng di chuyển của bột phấn đi vào thực quản ếch.
– Mở to miệng ếch, dùng lam quét cạo lấy lớp tế bào niêm mạc phía trong hàm
trên ếch. (Có thể cố định ếch trên giá, dùng panh và lam quét để mở miệng ếch sẽ dễ
dàng hơn).
– Đưa lớp niêm mạc lấy được dầm trong 1 – 2 giọt dung dịch muối sinh lí đã
nhỏ sẵn trên lam kính. Đậy bằng lamen và quan sát trên kính. Ghi nhận kết quả và vẽ
tế bào quan sát được.
175
hình tròn, hình đa giác nằm rời rạc.
I. MỤC ĐÍCH
– Nhận biết được một số thành phần hoá học của tế bào như prôtêin, lipit, các
loại đường có trong củ, lá thông qua các thí nghiệm. Rèn luyện kĩ năng và thao tác
thực hành.
II. CHUẨN BỊ
1. Mẫu vật: Đường glucozơ, saccarozơ, cùi dừa, sữa, trứng gà, củ khoai tây,
khoai lang, hạt lạc sống, gan lợn hoặc gà, lá cây (mướp, ngô,...).
2. Hoá chất: HCl đậm đặc, axit axêtic đặc, NaOH, CuSO 4, dung dịch Benedict,
nước cất, cồn, glyxêrin, etanol, Na(CH3COOH).
3. Dụng cụ: Kính hiển vi, lam kính, lamen, dao lam, kim mũi mác, giấy quỳ,
giá ống nghiệm, bếp, đèn cồn, dụng cụ thủy tinh (cốc đun, ống nghiệm,...), ống nhỏ
giọt, cối sứ.
176
và nhúng lá vào dung dịch kali iotat có nồng độ loãng. Mô lá sẽ có màu gì?
Thí nghiệm 4: Nhận biết các hạt dầu (lipit) trong cùi quả dừa
– Cắt nhỏ cùi dừa cho vào ống nghiệm và cho thêm vào vài ml cồn. Lượng cồn
trong ống nghiệm phải ngập hết cùi dừa, lắc đều trong ít phút.
– Để cùi lắng xuống và dùng pipet hút phần dịch nổi cho vào một ống nghiệm
khác có đựng 3ml nước. Quan sát kết qủa và giải thích hiện tượng.
I. MỤC ĐÍCH
Quan sát hiện tượng thẩm thấu qua màng dẫn đến co và phản co nguyên sinh ở
tế bào thực vật, hiện tượng tan bào và teo bào ở tế bào động vật, giải thích cơ chế
thông qua đó củng cố kiến thức về sự trao đổi chất qua màng tế bào. Rèn luyện kĩ
năng và thao tác thực hành.
II. CHUẨN BỊ
1. Dụng cụ: Kính hiển vi với các vật kính 10X, 40X, lam kính, lamen, kim mũi
mác, lưỡi dao cạo, đèn cồn, cốc thủy tinh, đĩa đồng hồ, giấy thấm.
2. Hoá chất: Nước cất, dung dịch NaCl 10% và 0,6%.
3. Mẫu vật: Lá rong mái chèo tươi, củ hành khô, thân hành ta, ếch sống (hoặc
máu tươi của ếch).
177
III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
Thí nghiệm 1: Quan sát tế bào và các bào quan trong tế bào lá cây rong mái
chèo
Ngâm lá rong còn tươi trong cốc nước 300C trong thời gian 15 phút. Cuộn lá đó
vào ngón tay trỏ của bàn tay trái để làm chỗ tì, tay phải cầm lưỡi dao lam, cạo hớt nhẹ
một lớp mỏng trên mặt lá. Đặt miếng lá đó lên lam kính, nhỏ một giọt nước, đậy
lamen, quan sát trên kính hiển vi.
Lúc đầu quan sát ở bội kính bé trước rồi chuyển sang quan sát ở bội giác lớn. Ta
thấy các tế bào xếp sát nhau, chung quanh có thành, sát mép thành có tế bào chất,
trong tế bào chất có các hạt lục lạp màu lục, ta cũng thấy nhân phình to hơn lục lạp.
Quan sát, vẽ tế bào và các bộ phận nhỏ trong tế bào.
Thí nghiệm 2. Co và phản co nguyên sinh ở tế bào thực vật (củ hành khô)
Dùng kim mũi mác bóc một lớp tế bào biểu bì hành. Đặt miếng biểu bì trên lam
kính đã nhỏ sẵn một giọt nước, đậy lamen và quan sát. Ta thấy vô số tế bào hành xếp
sát nhau. Mỗi tế bào được cấu tạo bởi màng, nguyên sinh chất, nhân. Các không bào
trong tế bào tương đối lớn chiếm phần lớn thể tích của tế bào.
Nhỏ vào mép lamen một giọt nước muối NaCl 10%. Dùng miếng giấy thấm
đặt ở phía bên kia lamen để hút hết phần nước cho đến khi dung dịch muối thay thế
hoàn toàn. Sau 1 – 2 phút ta thấy màng tế bào tách khỏi lớp vỏ xenlulozơ → thể tích
tế bào chất bị thu hẹp lại. Đó là hiện tượng co sinh chất.
Giữ nguyên tiêu bản ở vị trí này, dùng ống hút nhỏ một vài giọt nước ở một
mép lamen và ở mép lamen phía đối diện, dùng giấy thấm hút hết dung dịch muối ra,
quan sát sẽ thấy hiện tượng ngược lại với co nguyên sinh chất: Thể tích của tế bào chất
và các không bào dần dần mở rộng trở về vị trí ban đầu do nước được hút ngược trở
lại. Đó là hiện tượng phản co nguyên sinh.
Nếu giết chết tế bào (hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn) hoặc giữ trạng thái tế
bào co nguyên sinh sau một thời gian dài. Lặp lại thí nghiệm và nhận xét hiện tượng.
Cũng cách làm tương tự trên, ta cho tế bào trong dung dịch NaCl 0,6%. Quan
sát hiện tượng xảy ra và tự giải thích.
178
– Dùng 2 lamen đặt hai bên miếng biểu bì hành và nhỏ vào giữa một giọt dung
dịch đường 20%, dùng lamen thứ 3 đậy lên mẫu.
Quan sát dưới kính ở thời điểm sau khi nhỏ đung dịch đường, sau 10 phút và
sau 20 phút. Nhận xét kết quả và giải thích.
Thí nghiệm 4. Hiện tượng tan bào và teo bào ở động vật (tế bào máu người
hoặc máu ếch)
Nhỏ một giọt máu người hoặc máu ếch lên lam kính, đậy lamen, quan sát dưới
kính hiển vi sẽ thấy rất nhiều tế bào hình cầu trôi lơ lửng trong huyết tương của máu,
hồng cầu là những huyết cầu sáng và không màu, có hình đĩa với hai mặt lõm. Quan
sát sự thay đổi hình dạng của các hồng cầu này khi để chúng trong dung dịch có áp
suất thẩm thấu khác nhau.
Nhỏ vào mép lamen một giọt NaCl 0,6%, quan sát ở bội giác 40X thấy các hồng
cầu bị trương lên, tế bào bị căng phồng rồi vỡ tung đó là hiện tượng tan bào. Khi đặt
hồng cầu trong dung dịch nhược trương (NaCl 0,6%) gây ra trạng thái nước đi vào tế
bào nên tế bào bị trương lên và vỡ tung (Trường hợp là máu ếch thì không có hiện
tượng trên xảy ra vì dung dịch NaCl 0,6% là đẳng trương đối với máu ếch).
Lấy một giọt máu khác, đậy lamen, nhỏ một giọt NaCl 10% vào mép lamen.
Hiện tượng xảy ra tương tự như tế bào vỏ hành. Nhưng vì tế bào hồng cầu có hai lớp
màng mỏng ngoài cùng khi nước từ trong tế bào chảy ra ngoài làm cho thể tích tế bào
bị thu hẹp lại, màng tế bào nhăn nhúm. Đó là hiện tượng teo bào ở hồng cầu khi để
trong dung dịch ưu trương.
Cho biết hiện tượng gì đã xảy ra và giải thích nguyên nhân? Điền vào các ô
trống có dấu chấm hỏi câu trả lời thích hợp?
? ? ? ?
? ? ?
179
D. SỰ SINH SẢN CỦA TẾ BÀO
I. MỤC ĐÍCH
Quan sát sự phân bào nguyên nhiễm ở tế bào sinh dưỡng và phân bào giảm
nhiễm ở tế bào sinh dục. Hình thái và hoạt động của NST qua các kì của 2 quá trình
phân bào và sự sai khác có ý nghĩa của 2 quá trình này.
II. CHUẨN BỊ
1. Dụng cụ: Kính hiển vi, lam kính, lamen, kim mũi mác, lưỡi dao cạo, đèn
cồn, cốc thủy tinh, bình đung ổn nhiệt, đĩa đồng hồ, giấy thấm, panh, kéo.
2. Hoá chất: Dung dịch cố định (3 cồn : 1 axetic); thuốc nhuộm Shiff, axêto–
carmin 2%, H2O cất, cồn tuyệt đối, axit axêtic, xylen.
3. Mẫu vật: Củ hành tây, hành ta, hạt đại mạch (để lấy rễ non); châu chấu đực.
180
Chú ý: Phải ép đều và thẳng góc tránh vỡ lamen mà mẫu được trải đều. Đặt lên
kính hiển vi, điều chỉnh cho rõ. Quan sát, vẽ hình, phân biệt các pha phân chia, gọi tên
các pha đó.
(Trong thí nghiệm này, ta có thể tìm thấy hình thái của tế bào phân chia ở các kì
phân bào. Nếu là kì giữa thì toàn bộ thể nhiễm sắc tập trung trên mặt phẳng xích đạo;
nếu là kì sau thì các nhiễm sắc thể đã phân li và đang tách xa dần mặt phẳng xích đạo
để về hai cực mới. Ngoài ra, chúng ta có thể thấy hai tế bào con mới xuất hiện, kích
thước tế bào còn bé so với tế bào mẹ, thể nhiễm sắc đã cụm lại trong nhân ở hai tế bào
con. Cũng có thể thấy các tế bào mẹ chưa phân chia to hơn so với các tế bào con mới
sinh ra).
Đối với các tiêu bản tốt có thể tiến hành chụp ảnh trên kính hiển vi có hệ thống
chụp ảnh sau đó cố định tiêu bản.
Thí nghiệm 2: Quan sát phân bào giảm nhiễm ở tinh hoàn châu chấu đực
Dùng kim nhọn mổ lấy tuyến sinh dục (ở gần phần bụng) của châu chấu. Đem
ngâm tuyến này trong dung dịch nhược trương natri xitrat 1% để gây nhược trương tế
bào. Chuyển tinh hoàn sang dung dịch cố định carnoy, dùng kim mũi mác tách các tế
bào riêng ra, sau đó nhỏ dịch bào lên lam kính. Nhuộm tiêu bản bằng hematoxilin (Có
thể quan sát nhanh bằng cách: ngay sau khi tách tinh hoàn, lấy một ít đặt lên lam kính.
Dùng kim mũi mác xé rách bào cơ của ống sinh tinh để phân tán tế bào. Nhỏ lên mẫu
dung dịch axêto – orcêin hoặc axêto–carmin 2% để nhuộm trong 5 – 10 phút. Đậy
lamen lên và ép nhẹ bằng đầu ngón tay cái, thấm sạch thuốc nhuộm còn thừa và quan
sát trên kính hiển vi). Tinh hoàn bao gồm hàng ngàn ống dẫn tinh, mỗi ống này phát
triển hàng triệu tinh trùng. Những tế bào sinh dục đầu tiên gọi là tinh nguyên bào.
Trong quá trình phát triển, tinh nguyên bào phân chia theo kiểu nguyên phân làm cho
số tinh nguyên bào nhiều lên. Sự phát sinh tinh trùng bắt đầu từ lúc tinh nguyên bào
lớn trở thành những tế bào lớn hơn gọi là tinh bào cấp 1. Các tinh bào cấp 1 bước vào
thời kì phân chia.
Kì trước I của giảm phân kéo dài, bao gồm nhiều giai đoạn, nhiều quá trình
phức tạp xảy ra nhưng trên tiêu bản chỉ quan sát thấy giai đoạn cuối. Nhiễm sắc thể có
nhiều hình dạng.
Ở kì giữa I, ta không quan sát thấy màng nhân, thoi phân chia xuất hiện. Mỗi
tâm động của nhiễm sắc thể hướng về một cực của tế bào, các nhiễm sắc thể chuẩn bị
phân li.
181
Kì sau I: Các nhiễm thể của cặp tương đồng tách nhau và đi về hai cực.
Kì cuối I: Các nhiễm sắc thể tương đồng nằm gọn trong tế bào. Chúng vẫn giữ
nguyên hình thái.
Lần phân chia thứ II:
Về cơ bản lần phân chia thứ II giống với phân bào nguyên nhiễm thông thường
nhưng không có sự nhân đôi của NST. Ở lần phân chia thứ II của quá trình phân bào
giảm nhiễm, NST từ kì cuối I sẽ chuyển ngay sang kì giữa II trong khoảng thời gian
rất nhanh.
Kì sau II: Các NST đơn trong NST kép tách nhau ở tâm động và di chuyển về
hai cực của tế bào.
Kì cuối II: Màng nhân và nhân con được hình thành, màng tế bào co thắt lại
tách tế bào mẹ thành hai tế bào con giống hệt nhau.
1. B. Alberts et all. Molecular Biology of the Cell. 3rd ed, Garland Publishing, Inc.
New York & London, 1994.
2. J. Ohta. Sinh học tế bào (tiếng Nhật). 1989.
3. Phạm Thị Trân Châu và nhiều tác giả khác. Hoá sinh học. NXB Giáo dục Hà
Nội, 1992.
4. Nguyễn Thành Đạt (Tổng chủ biên), Trần Dụ Chi – Trịnh Nguyên Giao, Phạm
Văn Lập, Phạm Văn Ty. Sinh học 10 (Sách giáo khoa thí điểm, Ban khoa học Tự
nhiên). NXB Giáo dục, 2002.
5. Nguyễn Như Hiền & Trịnh Xuân Hữu. Tế bào học. NXB Đại học Quốc gia Hà
Nội, 2000.
182
6. Nguyễn Như Hiền. Di truyền và công nghệ tế bào. NXB KH&KT, Hà Nội,
2002.
7. Phạm Thành Hổ (1998). Di truyền học. NXB Giáo dục.
8. Phan Cự Nhân (chủ biên), Trần Bá Hoành, Lê Quang Long, Phạm Đình Thái,
Hoàng Thị Sản, Mai Đình Yên. Sinh học đại cương, Tập I, II NXB ĐHSP, (Tái
bản), 2005.
9. Thái Duy Ninh. Tế bào học. NXB Giáo dục, 1996.
10. Vũ Văn Vụ và nhiều tác giả khác. Sinh lí thực vật. NXB Nông thôn.
183
CHUYÊN ĐỀ 3
184
VI – Virut
VII – Hệ thống sinh giới và vị trí của các nhóm vi sinh vật
VIII – Câu hỏi và bài tập
Chương II – Dinh dưỡng và sự chuyển hoá các chất ở vi sinh vật
I – Các chất dinh dưỡng
II – Các nhân tố sinh trưởng
III – Các loại môi trường sống của vi sinh vật
IV – Các kiểu dinh dưỡng của vi sinh vật
V – Các kiểu hô hấp của vi sinh vật
VI – Các hình thức lên men chính
VII – Quá trình tổng hợp một số chất
VIII – Câu hỏi và bài tập
Chương III – Sinh trưởng và sinh sản ở vi sinh vật
I – Khái niệm sinh trưởng ở vi sinh vật
II – Sự sinh sản ở vi khuẩn và Archaea
III – Sự sinh sản ở vi sinh vật nhân chuẩn
IV – Sinh trưởng trong nuôi cấy không liên tục
V – Sinh trưởng trong nuôi cấy liên tục
VI – Các tác nhân ức chế sự sinh trưởng và ứng dụng
VII – Công nghệ sinh học và công nghệ vi sinh
VIII – Câu hỏi và bài tập
Chương IV – Khái niệm bệnh truyền nhiễm và miễn dịch học
I – Khái niệm bệnh truyền nhiễm và phương thức lan truyền
II – Độc tố và độc lực
III – Bệnh do vi sinh vật, virut và các phân tử hữu cơ khác
IV – Kháng nguyên
V – Kháng thể
VI – Các loại miễn dịch
VII – Câu hỏi và bài tập
Chương V – Ôn tập và kiểm tra
185
Sử dụng các câu hỏi tự luận, trắc nghiệm ở cuối các chương.
Phần thực hành (3 tiết)
Bài 1: Quan sát một số loại vi sinh vật
1 – Thí nghiệm 1: Cách làm tiêu bản sống và tiêu bản cố định nhuộm màu
2 – Thí nghiệm 2: Quan sát vi khuẩn trong khoang miệng, nấm men rượu, mốc
trên một số cơ chất
Bài 2: Sự chuyển hoá các chất ở vi sinh vật
1 – Thí nghiệm 1: Phân giải prôtêin, phân giải xenlulozơ
2 – Thí nghiệm 2: Lên men rượu etanol
3 – Thí nghiệm 3: Lên men lactic, làm sữa chua, muối dưa cà.
186
PHẦN LÍ THUYẾT CHUYÊN ĐỀ 3 (17 TIẾT)
CHƯƠNG 1
I. VI SINH HỌC LÀ GÌ ?
Vi sinh học (Microbiology) là khoa học nghiên cứu sự sống hiển vi bao gồm
các vi sinh vật và dạng sống vô bào, hoạt động sống và vai trò của chúng đối với đời
sống trên hành tinh, nó là khoa học liên ngành và hiện đại.
Vi sinh vật (Microorganism) là những sinh vật có kích thước rất nhỏ (từ vài
trăm nm đến vài mm), muốn thấy rõ chúng phải sử dụng kính hiển vi. Chúng có thể là
đơn bào hoặc tập hợp đơn bào, một số ít là cơ thể đa bào chưa phân hoá thành mô,
chúng bao gồm các nhóm chủ yếu: Archaea, vi khuẩn (kể cả vi khuẩn lam) (nhân sơ–
Prokaryota), tảo đơn bào, nấm đơn bào và nấm sợi, động vật nguyên sinh (nhân thực–
Eukaryota).
Virut chưa có cấu trúc tế bào và chưa phải là cơ thể sống, nhưng lại có một số
đặc điểm của cơ thể sống khi kí sinh trong tế bào sống. Virut được coi là một nhóm
đối tượng của Vi sinh học.
*
Theo Nelson, Biology. 2003.
187
(Myxomycetes), lớp nấm roi sau (Chytridiomycetes), lớp nấm noãn (Oomycetes) và
nấm tiếp hợp (Zygomycetes), chúng lập thành giới phụ nấm cổ (Archimycota).
Các lớp nấm bậc cao chủ yếu là: Nấm túi (Ascomycetes), nấm đảm
(Basidiomycetes) và nấm bất toàn (Adelomycetes hay Deuteromycetes).
4. Algology: Khoa học nghiên cứu về vi tảo, khoa học hiện biết 15.000 loài tảo
*
.
5. Protozoology: Khoa học nghiên cứu về động vật nguyên sinh, 30.000 loài
động vật nguyên sinh được thống kê *.
Số lượng cá thể của từng nhóm cũng như số nhóm vi sinh vật có thể thay đổi
theo điều kiện sinh thái cụ thể, hơn nữa tại một số vùng sinh thái số lượng đó cũng
thay đổi theo chiều sâu các lớp đất và các lớp nước. Trong 1g đất trồng có khoảng 109
– 1010 mầm vi sinh vật (CFU là đơn vị hình thành khuẩn lạc), trong 1ml dịch dạ dày
của động vật nhai lại có 109 mầm vi sinh vật, trong 1g phân người chứa tới 10 12 mầm
sống hiển vi.
Có thể sử dụng kính hiển vi quang học (kính hiển vi thường), kính hiển vi nền
đen, kính hiển vi đối pha, kính hiển vi huỳnh quang, kính hiển vi điện tử thường
(TEM), kính hiển vi điện tử quét (SEM).
Muốn nghiên cứu cấu tạo siêu hiển vi của các vi sinh vật và tế bào sống, người
ta dùng phổ biến các phương pháp siêu li tâm với tốc độ 5 vạn vòng phút hay nhanh
hơn nữa cho phép lắng đọng thành lớp các hạt vi mô và những phân tử lớn hơn; dùng
máy cắt lớp siêu mỏng có thể cắt tế bào nấm men (đường kính khoảng 10µ m) ra 100
lát. Những lát cắt như vậy cho phép nhìn cấu trúc dưới mức tế bào. Các phương pháp
đồng vị phóng xạ (thường dùng S35 đối với prôtêin chứa S và P32 đối với axit nucleic),
huỳnh quang kháng thể cho phép theo dõi các quá trình tổng hợp sinh học bên trong tế
bào ở mức độ phân tử, nhiễu xạ quang để nghiên cứu cấu trúc không gian của những
phân tử. Sử dụng các phương pháp sắc kí, điện di
(ví dụ điện di trên gel các poliacrylamit) để tách các hợp chất, dùng các vi điện cực để
đo thế hiệu các lớp màng trong và ngoài tế bào. Một nhóm phương pháp rất phổ biến
trong vi sinh học là phương pháp nuôi cấy trên môi trường lỏng và đặc để nghiên cứu
khả năng hiếu khí của tế bào và các hợp chất mà chúng tiết ra, các phương pháp cố
định và nhuộm màu (nhuộm đơn, nhuộm kép, nhuộm phân li...) để nghiên cứu hình
dạng, kích thước và một số cấu tạo trong tế bào vi sinh vật.
Vi sinh vật có nhiều chức năng quan trọng trong môi trường tự nhiên, trong đó
có thể tóm tắt:
a – Phân giải các hợp chất hữu cơ (vô cơ hoá).
*
Theo Nelson, Biology. 2003.
188
b – Làm nguồn thức ăn bổ dưỡng cho các vi sinh vật hoá dị dưỡng hữu cơ khác,
tức là chuyển hoá nhanh các chất hữu cơ trong chu trình thức ăn.
c – Làm nguồn thức ăn cho các loại giun, sâu bọ tạo ra mạng lưới thức ăn.
d – Biến đổi các chất để các cơ thể khác nhau có thể sử dụng được.
e – Biến đổi rất lớn các chất bằng cách hình thành các chất hoà tan và khí, từ đó
tạo ra các chất tham gia vào các con đường chuyển hoá trực tiếp hoặc biến đổi môi
trường một cách gián tiếp.
g – Hình thành các chất ức chế làm giảm hoạt động của các vi sinh vật khác,
của thực vật và động vật.
Do đó, số lượng và chủng loại vi sinh vật trong tự nhiên là rất lớn, rất đa dạng
và luôn biến đổi. Ở một nơi, số vi sinh vật phụ thuộc vào nguồn chất dinh dưỡng, các
chất độc hại và các tác nhân giới hạn khác.
Vi sinh vật có vai trò quan trọng trong vòng tuần hoàn các nguyên tố C, N, S,
P... và có khả năng chuyển hoá các hợp chất độc hại chứa kim loại nặng như bạc,
vàng, thuỷ ngân, đồng, kẽm... thành các dạng không độc hoặc ít độc hơn đối với cơ thể
người, động vật và cây trồng.
Người ta sử dụng các kĩ thuật khác nhau để đánh giá sự có mặt, các loại và hoạt
động của vi sinh vật trong môi trường. Đối với các mẫu nước ô nhiễm, nước cống rãnh
chứa nồng độ chất hữu cơ cao và chứa nhiều vi sinh vật, người ta có thể đo lượng
cacbon hữu cơ bằng chỉ số BOD (nhu cầu sinh hoá đối với ôxi) và COD (nhu cầu hoá
học đối với ôxi).
Sử dụng vi sinh vật trong lên men đồ uống, lên men lactic, ủ chua thức ăn gia
súc, sử dụng những tác nhân ức chế vi sinh vật trong bảo quản thực phẩm, giữ vệ sinh
môi trường làm việc và hoạt động sống.
III. VI KHUẨN
Vi sinh vật, đặc biệt vi khuẩn là mô hình lí tưởng trong công nghệ di truyền,
công nghệ sinh học. Một số vi sinh vật là tác nhân gây bệnh trên người, động vật và
cây trồng. Hiện có khoảng 1000 loại virut gây bệnh trên thực vật, gần 90% các bệnh
đường hô hấp ở người là do virut, trong đó có bệnh viêm đường hô hấp cấp (bệnh
SARS), HIV/AIDS vẫn là một đại dịch chưa có thuốc chữa khỏi. Các bệnh vi khuẩn
trên người cũng rất nhiều như viêm xoang mũi (Staphylococcus sp.), bạch hầu
(Corynebacterium diphtheria), ho gà (Bordetella pertusis), tả (Vibrio cholerae), lị trực
khuẩn (Shigella spp.), lậu (Neisseria gonorrboeae), giang mai (Treponema pallidum),
lao phổi (Mycobacterium tuberculosis), ...
189
Những hình dạng chính của vi khuẩn:
+ Cầu khuẩn (coccus): Khi phân chia theo một phương và dính nhau, ta có song
cầu khuẩn (Diplococcus), hoặc chuỗi cầu khuẩn, liên cầu khuẩn (Streptococcus), phân
chia hai phương và dính với nhau ta có Tetracoccus, phân chia ba phương và dính với
nhau ta có Sarcina hoặc phân chia theo nhiều phương ta có tụ cầu khuẩn
(Staphylococcus) (đường kính 0,8 – 1,0µ m).
+ Trực khuẩn:
– Trực khuẩn không sinh bào tử như Escherichia coli... (0,5× 2 – 3µ m).
– Trực khuẩn sinh bào tử: Bacillus, Clostridium với kích thước khoảng 2 – 3 ×
1µ m.
+ Xoắn khuẩn và xoắn thể: Xoắn khuẩn như Spirillum, Campylobacter, xoắn
thể với các vòng khác nhau: Spirochaeta, Leptospira (1 × 5 – 500µ m).
+ Xạ khuẩn: Gồm những vi khuẩn thuộc bộ Actinomycetales trong đó có các
giống quan trọng như Streptomyces, Micromonospora...(1 – 2 × 100 – 5000µ m).
+ Vi sinh vật hình sao như giống Stella và vi sinh vật hình vuông như giống
Haloarcula, một loại vi sinh vật cổ ưa mặn.
Một số hình dạng vi khuẩn được giới thiệu trong hình I–1.
190
a b
c d
e
f
g h
Hình I.1. Một số hình dạng vi khuẩn
a- Tụ cầu (Staphylococcus aureus) nhuộm Gram dương (màu tím, × 1.000)
b- Enterococcus faecalis, chuỗi cầu (× 200)
c- Thực khuẩn (Bacillus megaterium), tạo thành chuỗi, nhuộm Gram dương (màu tím, x 600)
d- Xoắn khuẩn đỏ (Rhodospirullum rubrum, × 500)
e- Phẩy khuẩn tả (Vibrio cholerae) có tiên mao ở cực (× 1.000)
f- Xạ khuẩn (Actinomyces) dưới kính hiển vi điện tử quét (× 21.000)
g- Mycoplasma pneu moniae dưới kính hiển vi điện tử quét (× 62.000)
191
h- Archaeoglobus fulgidus, loại vi sinh vật cổ có tiên mao (× 40.000)
Nhờ kính hiển vi điện tử khoa học đã biết rất rõ tổ chức dưới mức tế bào của vi
khuẩn:
– Lớp màng nhày (capsule)
– Thành tế bào (cell wall)
– Màng tế bào chất (membrane cytoplasmic)
– Chất nguyên sinh với các thành phần quan trọng cho sự sống của vi khuẩn:
vật chất nhân, ribosom, plasmid, mesosom, cacboxysom, chất mang màu (ở vi khuẩn
quang hợp), không bào khí, các chất dự trữ…
(Pili)
(ADN)
(Cilia)
(flagella)
Nhiều vi khuẩn được bao bọc bên ngoài bằng một lớp màng nhày có bản chất hoá
học là polisaccharit của một loại gốc đường (homopolisaccharit) hoặc của nhiều gốc
đường khác nhau (heteropolisaccharit), ở một số vi khuẩn trong vỏ nhày còn chứa một ít
lipoprôtêin, người ta xác định được
90 – 98% trọng lượng màng nhày là nước.
192
Màng nhày có tác dụng hạn chế khả năng thực bào, do đó tăng cường độc lực
đối với vi khuẩn gây bệnh, do cấu trúc hoá học của màng nhày là polisaccharit có ít
lipoprôtêin nên có liên quan đến tính kháng nguyên của vi khuẩn gây bệnh.
Hợp chất cơ bản của thành tế bào vi khuẩn là hai chất dị cao phân tử
(heteropolyme): glucopeptit và axit tecoic. Glucopeptit (hay còn gọi là peptidoglycan,
mucopetit, murein) là khung chắc giữ vững hình dạng vi khuẩn, khi thuỷ phân
glucopeptit ta sẽ được hai hợp chất với số phân tử Gram như nhau là N–axetyl
Glucozamin và axit N–axetyl muramic, chúng liên kết với nhau qua liên kết 1,4 β
glucozit.
Enzim lyzozim cắt liên kết glucozit giữa C1 còn lại của axit N–axetyl muramic
và C4 còn lại của N–axetylglucozamin (liên kết β –1,4). Các gốc
N–axetyl muramic liên kết với nhau qua dây nối peptit, tạo ra mạng lưới chằng chịt
như tổ ong, trong thành phần của axit N–axetyl muramic có mặt của các axit amin với
trọng lượng phân tử Gram: 2 D.L.alanin, 1 D. glutamic và 1. Axit điamin. Axit điamin
này ở St.aureus là lyzin; ở E.coli là axit L – điaminpimelic (ADP), các axit điamin này
có thể kết hợp với mạch peptit của chuỗi bên, do đó mà hình thành một mạng murein
chắc chắn.
A.ribiteicoic
a b
Hình I.3. Sơ đồ thành vi khuẩn
b. Lớp thành dày của vi khuẩn Gram dương, màng lưới murein đan xen với
hai loại axit teicoic.
Ta thấy đơn phân murein lặp đi lặp lại có tỉ lệ phân tử gram như sau:
N–axetylglucozamin : Axit N–axetylmuramic : L.ala : D.glu : Axit diamin :
193
L.ala = 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1.
Đây chính là nét đặc trưng của thành tế bào vi khuẩn. Trong khi đó thành của
Archaea không chứa axit axetylmunamic nhưng chứa axit talozaminuronic vì vậy ở vi
sinh vật cổ có thành là Pseudomurein.
Ngoài ra, trong chuỗi peptit còn có một số sai khác về thành phần và trật tự các
axit amin.
Đối với nhóm vi khuẩn tiêu giảm thành tế bào (Mycoplasmatales, Mollicutes,
Tenericutes), người ta không tìm thấy các hợp chất murein. Những vi khuẩn này
không có thành rắn chắc cho nên chúng có thể thay đổi hình dạng, phần lớn chúng là
những cơ thể đa hình như các dạng PPLO, Mycoplasma (vi khuẩn nhỏ nhất có thể
nuôi cấy trên môi trường).
Trong thành tế bào vi khuẩn còn có một loại hợp chất đặc biệt đó là axit teicoic,
hợp chất thấy nhiều ở vi khuẩn Gram dương (có thể chiếm tới 50% trọng lượng khô
của thành xạ khuẩn), ở vi khuẩn Gram âm hiện chưa tìm thấy hợp chất này. Axit
teicoic liên kết với axit muramic qua mạch photphođieste. Axit teicoic có hai loại là
ribiteicoic và glyxêrin teicoic.
Bên ngoài thành tế bào là lớp S (lớp không cố định về thành phần các hợp chất
và độ lớn), lớp bên ngoài này thấy ở một số loài Bacillus, Clostridium, đặc biệt thấy ở
nhiều loài vi khuẩn Gram âm, vì vậy tạo ra các lớp màng ở ngoài thành vi khuẩn Gram
âm rất phức tạp và không đồng nhất đối với các loài khác nhau.
194
Salmonella chuỗi đường phân nhánh O là kháng nguyên O của vi khuẩn và rất khác
nhau ở các loài khác nhau (Hiện biết tới 170 KN–O, 100 KN – K và 55 KN – H ở
Salmonella).
Ở vi khuẩn Gram âm, lớp LPS tích điện âm; còn ở vi khuẩn Gram dương, axit
teicoic vượt ra ngoài lớp murein, vì axit này tích điện âm nên làm cho thành tế bào vi
khuẩn Gram dương ở phía ngoài cũng tích điện âm.
Thành phần của thành tế bào là một chỉ tiêu sinh hoá quan trọng (các hợp chất
peptidoglucan, các polisaccharit, các loại axit teicoic) dùng trong phân loại số để phân
loại loài và giống.
Thành tế bào vi khuẩn có chức năng quan trọng là giữ hình dạng ổn định của tế
bào, tham gia và việc duy trì áp suất thẩm thấu, sự phân bào, tham gia vào quá trình
nhuộm Gram…
Từ những đặc điểm trên và tính chất của protêin tế bào chất đã quyết định tính
nhuộm Gram khác nhau giữa 2 nhóm vi khuẩn Gram dương và Gram âm (Xem thêm
phần thực hành ở cuối sách).
Trong môi trường đẳng trương, khi vi khuẩn mất thành sẽ vón thành hình cầu, ở
vi khuẩn Gram dương sẽ tạo thành tế bào trần (Protoplast), còn ở vi khuẩn Gram âm
sẽ hình thành thể hình cầu (Spheroplast).
Người ta có thể làm mất thành tế bào vi khuẩn bằng lyzozim trong dung dịch
đẳng trương có đường, enzim này tác động vào mạch β – 1,4 Glucozit giữa axit N–
axetylmuramic và N–axetyl glucozamin. Penicillin khi mở vòng β –lactam sẽ tác
động vào mối liên kết của sự vận chuyển peptit, do đó Penicillin cản trở sự tổng hợp
mạch peptit bình thường của thành tế bào. Tác động vào mạch ngang nối các mạch
peptit trong murein còn có một enzim có tên là Endomuropeptiđaza.
Màng tế bào chất
Màng tế bào chất của vi khuẩn và vi sinh vật cổ có thể thấy được nhờ gây co
nguyên sinh; lớp màng này dưới kính hiển vi đối pha là lớp có độ dày khoảng 7,5nm,
nằm ngay dưới lớp thành hoặc các lớp màng ngoài, nó bao bọc toàn bộ khối chất
nguyên sinh, khoa học còn gọi nó là màng cơ sở vì có cấu tạo giống hầu hết các màng
trong tế bào như màng nhân, màng ti thể, lục lạp, màng lưới nội chất, màng bào
quan…
195
Hình I.5. Sơ đồ cấu tạo màng tế bào chất
Sơ đồ màng khảm động (để dễ hình dung, các phân tử photpholipit được làm to hơn so với các
prôtêin) (Theo Tracey Green Wood et al. Biology, 2003)
Màng tế bào chất ở vi khuẩn không hình thành màng lưới nội chất, nhưng ở một
số loại vi khuẩn (như vi khuẩn nitrat hoá, vi khuẩn quang hợp…), người ta thấy màng
tế bào chất gấp lại thành màng trong của tế bào. Màng tế bào chất của vi khuẩn khác
với màng tế bào chất của cơ thể nhân thực ở chỗ nó không chứa cholesterol (một loại
sterol), nhưng màng tế bào chất vi khuẩn lại chứa sterol pentacyclic như hopanoid.
Phân tích hoá sinh cho thấy màng tế bào chất gồm 3 loại phân tử: lipit (chủ yếu
ở dạng photpholipit – chiếm khoảng 30 – 40%), prôtêin (gồm rất nhiều hệ enzim,
trong đó có các hệ permeaza, thành phần prôtêin này có thể chiếm tới 60 – 70%) và
một ít hợp chất gluxit. Các photpholipit có thể là phophatidylglyxerol và hoặc
photphatidylethanolamin. Các photpholipit dưới kính hiển vi điện tử gồm hai lớp phân
tử trong suốt, trong khi các lớp prôtêin có màu đậm tối.
Chức năng chủ yếu của màng tế bào chất là tấm bình phong ngăn trở dòng các
chất ra, cũng như cho đi qua các hợp chất từ phía ngoài vào. Nó đảm bảo tế bào hấp
thụ được các chất dinh dưỡng, các nguyên tố có lợi cho quá trình trao đổi chất. Nó lựa
chọn cho đi qua cả những phân tử chất hữu cơ loại nhỏ đồng thời ngăn cản các hợp
chất phân tử lớn. Đối với các phân tử bé kị nước như O 2, N2, CH4, N2O, H2 hoặc các
phân tử có cực nhưng không tích điện như H2O, urê, CO2… màng tế bào chất thể hiện
như một màng vật lí cho đi qua theo quy luật lí học.
Màng tế bào chất chứa các enzim sinh tổng hợp kiểm soát các khâu kết thúc
tổng hợp lipit của màng và các hợp chất kiến tạo thành tế bào.
Cuối cùng, màng thế bào chất là nơi định vị của nhiều enzim tham gia tổng hợp
196
ATP. Ở các cơ thể nhân thực, các enzim này có mặt ở trong các ti thể. Các chuỗi hô
hấp của màng tế bào chất vi khuẩn và vi sinh vật cổ làm chức năng tương tự như màng
trong của ti thể.
Khi màng tế bào chất gấp nếp để biến thành mezosom thì nó là nơi định vị của
ADN của tế bào nhân sơ. Các hạt này có lẽ đóng vai trò quan trọng làm điểm khởi đầu
của quá trình nhân đôi vòng ADN và vách ngăn trong sự phân bào vô tơ thành hai tế
bào con. Sự gấp nếp của màng tế bào chất còn thấy ở vi khuẩn tía, ở đây chúng hình
thành các túi hoặc các ống chứa sắc tố quang hợp. Ở các vi khuẩn cố định đạm, hệ
nitrogenaza bị ức chế bởi O2, sẽ được bảo vệ trong các nếp gấp của màng tế bào chất.
Trong các vi khuẩn nitrat hoá, rất nhiều nếp gấp của màng tế bào chất làm tăng bề mặt
tiếp xúc của các hệ enzim thực hiện quá trình này.
Ở các vi sinh vật metan (vi sinh vật cổ) cũng có các cấu tạo gấp nếp màng tế
bào chất, đây là nơi định vị của nhiều sắc tố loại bacteriorhodopsine, là sắc tố rất đặc
trưng của Archaea. Sắc tố này tạo ra một gradient vận chuyển các proton qua màng
nhờ tác động của ánh sáng.
Tế bào chất và các hạt nội bào
Tế bào chất của cơ thể nhân sơ gồm có 80 – 90% là nước. Nước có thể ở trạng
thái tự do (chiếm phần lớn) làm nhiệm vụ hoà tan các chất và tạo nên dung dịch keo
với các chất cao phân tử. Nước ở trạng thái kết hợp (phần nhỏ) thường liên kết trong
các vi cấu trúc như prôtêin, lipit và hiđrat cacbon. Phần còn lại của tế bào chất là
lipoproteit (chiếm từ 10 – 20%).
Hệ keo của tế bào chất bao gồm 2 pha: pha thứ nhất là dung dịch muối khoáng và các
hợp chất hoà tan có bản chất là lipoproteit; pha thứ hai là pha huyền phù gồm các hạt
nuclêôprôtêin, lipit và nhiều loại hạt có kích thước rất khác nhau.
Khi còn non, đang sinh trưởng, chất nguyên sinh có cấu tạo đồng nhất và bắt
màu giống nhau. Khi trưởng thành, trong chất nguyên sinh xuất hiện các vật thể ẩn
nhập, không bào khí làm cho tế bào chất có dạng huyền phù lổn nhổn bắt màu không
đồng đều và có tính chiết quang khác nhau. Tế bào chất của vi khuẩn có pH bình
thường là 7 – 7,2. Để nghiên cứu tế bào chất, người ta dùng siêu li tâm cao tốc để tách
chất nguyên sinh và các cấu trúc siêu hiển vi riêng ra.
Trong tế bào chất, ngoài vật chất nhân, các hạt và các cấu trúc thường thấy là
ribosom, các axit ribonucleic, các chất dự trữ ẩn nhập và vài bào quan chuyên hoá đặc
biệt.
Các chất dự trữ có thể chia thành 2 loại:
– Các chất vô cơ như volutin (dự trữ photphat), hạt lưu huỳnh (ở các vi khuẩn
197
lưu huỳnh)…
– Các chất hữu cơ như PHB (polihiđroxybutyrat), glicogen, cyanophyxin (chất
dự trữ nitơ ở vi khuẩn lam), hạt cacboxysom (chứa enzim ribulozo–1,5 diphotphat–
cacboxylaza, nơi cố định CO2)... Như vậy ta thấy trong Cyanobacteria có các hạt dự
trữ phổ biến là cyanophyxin, cacboxysom và không bào khí.
Các hạt dự trữ cacbon dễ dàng nhìn thấy khi nhuộm bằng dung dịch có iot, hợp
chất này nhuộm các hợp chất đa trùng hợp (polime) không phân nhánh của glucozơ
(tinh bột) thành màu xanh thẫm và các hiđrat cacbon phân nhánh (glicogen) thành đỏ
nâu. Các hợp chất poli–β –hiđroxy butyrat được nhuộm màu bởi Sudan đen như màu
các giọt mỡ.
Chất nhân (thể nhân – Nucleoid) của vi khuẩn
ADN của tế bào vi khuẩn chiếm khoảng 1 – 2% trọng lượng khô của chúng, đó là
hợp chất chứa đựng lượng thông tin di truyền chủ yếu của tế bào. Để xác định chất nhân
của vi khuẩn, người ta dùng phản ứng Feulgen.
Chất nhân của vi khuẩn không có màng bọc, hình dạng chất nhân rất khác nhau,
chỉ có một chuỗi gồm hai mạch ADN. Chiều dài của nó trong
tế bào E.coli đo được là 1mm, tức là gấp từ 500 đến 1000 lần chính chiều dài của vi
khuẩn. Vòng thể nhiễm sắc được định vị tại một điểm trên màng tế bào chất lúc sắp
phân chia. Độ lớn ADN vào khoảng 5.106pb (cặp bazơ nitơ) với trọng lượng phân tử
vào khoảng 3.109 dalton (4,5.108 đối với Mycoplasma, 1.109 đối với Acholeplasma).
Không thấy có histon kiểu tế bào nhân thực, mà chỉ có các poliamin như specmidin và
specmin làm chức năng củng cố ổn định ADN.
Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây cho thấy ở Thermoplasma (một loại vi
sinh vật cổ – Archaea) đã tìm thấy histon.
Vật chất di truyền ngoài thể nhiễm sắc bao gồm ADN của các plasmid, các yếu
tố giới tính, các yếu tố “diệt”, một số prophage…
Khoa học đã xác định plasmid có ở rất nhiều loài vi khuẩn.
Tiên mao (flagella), tiêm mao (cillia) và nhung mao(pilia)
Tiên mao thường thấy ở Vibro, Spirillum và ở nhiều loài vi khuẩn Gram âm. Số
lượng tiên mao có thể từ 1 đến 30 sợi tùy thuộc vào loài vi khuẩn. Một tiên mao có
chiều dài từ 6 đến 30µ m và đường kính từ 10 đến 30nm (12nm ở Proteus, từ 20 đến
25nm ở Vibiro và Pseudomonas). Khi tiên mao ngắn thì người ta thường gọi là tiêm
mao. Tiên mao có cấu tạo từ một loại đơn phân prôtêin gần với keratin mà người ta
gọi là flagelline; prôtêin này có trọng lượng phân tử khoảng 40.000 (trong đó các axit
198
amin chủ yếu là acginin, lysin, axit aspactic, axit glutamic); những prôtêin này có tính
kháng nguyên (H).
Tiên mao giúp cho vi khuẩn chuyển động. Khi vi khuẩn di động, tiên mao xoáy
vào nước hoặc môi trường lỏng (có thể 100 vòng trong 1 giây), trong khi tiêm mao
chuyển động như que gạt. Mặc dù vậy, trong Vi sinh học người ta thường dùng tiên
mao và tiêm mao với một nghĩa khác với chúng là nhung mao, là những sợi mảnh và
ngắn hơn nhiều, thường có xung quanh tế bào Gram âm, ít thấy ở vi khuẩn Gram
dương.
Các loại bào tử của vi khuẩn
+ Nội bào tử vi khuẩn (endospore)
Một số loài vi khuẩn ở cuối giai đoạn sinh trưởng, khi chất dinh dưỡng ở môi
trường cạn kiệt và chất qua trao đổi độc hại quá nhiều, hoặc có sự thay đổi đột ngột các
điều kiện sinh trưởng, có khả năng hình thành bào tử ở bên trong tế bào, nên gọi là nội
bào tử. Mỗi tế bào vi khuẩn chỉ tạo một nội bào tử nên loại bào tử này không phải là
bào tử sinh sản. Nội bào tử có thể ở giữa hay lệch tâm của tế bào sinh dưỡng.
+ Khác với nội bào tử, ở một số loài vi khuẩn có thể hình thành bào tử bên
ngoài tế bào (ngoại bào tử – exospore), bào tử nhày (Myxospore), bào tử giáp (Cyste)
và các bào tử đốt (Arthrospore hay Conidium) là những bào tử sinh sản.
Ví dụ xạ khuẩn, có thể sinh sản bằng bào tử đốt, ngoài ra có loại có thể sinh sản
bằng cách nảy chồi (ví dụ vi khuẩn tía quang dưỡng Rhodomicrobium vanniellii).
Ở vi khuẩn, quá trình hình thành nội bào tử có thể chia làm 6 – 7 giai đoạn,
trong đó có giai đoạn IV – là giai đoạn hình thành lớp vỏ dày (Cortex) kèm theo sự
hình thành hợp chất đặc trưng axit dipicolinic giúp cho bào tử bền nhiệt.
Khi đưa bào tử vào môi trường thuận lợi để phát triển, bào tử sẽ có hàng loạt
thay đổi tích cực và mọc mầm. Quá trình mọc mầm gồm 3 giai đoạn chủ yếu: hoạt
hoá, nứt vỏ và mọc ra. Muốn quan sát được bào tử, người ta dùng phương pháp
nhuộm đơn hoặc kép.
Ở một số vi khuẩn sinh nội bào tử, ví dụ Bacillus thuringiensis (BT) thường
hình thành tinh thể diệt sâu bọ. Khi sâu ăn phải dưới tác động pH kiềm, proteaza của
ruột sâu, nên endotoxin tinh thể này được hoà tan ra và trở thành prototoxin có hoạt
tính làm tê liệt đường tiêu hoá của sâu
ăn phải.
Khi hình thành bào tử, tế bào có thể mất đi đến 70% nước. Một số vi khuẩn khi
hình thành bào tử có thể tồn tại rất lâu trong tự nhiên, ví dụ Bac. anthracis có thể tiềm
199
sinh trong nhiều năm. Trong một số chất độc,
tế bào vi khuẩn chết rất nhanh, nhưng bào tử có thể tồn tại được khá lâu, ví dụ trong
phenol có thể vẫn sống trong 15 ngày, trong HgCl2 1% – tồn tại trong 2 ngày. Thời
gian để hình thành bào tử khác nhau tuỳ theo loài (vài giờ – 20 giờ).
IV. ARCHAEA
Lipit của màng Glyxerol, axit béo, este Glyxerol, ete isopranyl
Có polimeraza–ARN loại
– +
nhân thực
Những nghiên cứu gần đây về nhiệt độ và pH tối ưu của vi khuẩn ưa nhiệt và
Archaea cho phép chia vi sinh vật cổ (Archaea) thành 2 nhóm: Crenarchaeota và
Euryarchaeota; dựa trên ARNr trong Bergey’s Manual mới xuất bản đã chia Archaea
thành 2 giới (Kingdom):
Giới Crenarchaeota là những vi sinh vật cổ kị khí bắt buộc, ưa nhiệt và ưa axit.
200
Giới Euryarchaeota là những vi sinh vật cổ ưa mặn, sinh metan và một vài loài
kị khí ưa nhiệt.
Có 3 nhóm sinh lí và sinh thái quan trọng là:
1) Các cơ thể sinh metan (methanogen), đây có lẽ là nhánh cổ xưa nhất, ở các
lớp nước sâu, ở đáy, kị khí, một số loài tìm thấy trong đường tiêu hoá của động vật
nhai lại.
Phân loại cơ thể sinh metan dựa chủ yếu vào khả năng và cơ chế sinh metan của
chúng.
Ví dụ những cơ thể sinh metan như: Hansenula polymorpha, Metlylo monas...
2) Các cơ thể ưa mặn (halophile), những cơ thể này sống trong môi trường có
nồng độ muối cao (ở biển, ở mỏ muối), hấp thụ chất dinh dưỡng chủ yếu là do chênh
lệch gradien nồng độ muối tạo ra; quá trình quang hợp ở đây khá đặc biệt nhờ
bacteriorhodopsine, hợp chất liên kết với màng tế bào chất chứ không phải là khuẩn
diệp lục.
Ví dụ: ta gặp nhiều loài của Haloarcula (vi sinh vật cổ hình vuông) và
Halobacterium.
3) Các cơ thể ưa nhiệt, ưa axit (thermoacidophile), là những cơ thể sống ở
nguồn đất – nước nóng, ở vùng núi lửa như các loài của Sulfolobus, Thermoplasma,
chúng là những cơ thể hiếu khí hoặc hiếu kị khí.
Ví dụ: Sulfolobus acidocaldaricus có nhiệt độ sinh trưởng tối đa là 900C và tối
ưu là 750C ở pH tối ưu là 2,5. Thermoplasma acidophilum có Tmax là 650C, pHopt là 1,5.
Một số Archaea ưa mặn có trên màng tế bào sắc tố bacteriorhodopsine, chúng là
những cơ thể quang dưỡng hữu cơ (photoorganotroph), còn sự chuyển hoá vật chất
của các Archaea hoá tự dưỡng vô cơ (chemolithoautotroph) thì nhờ năng lượng của
các phản ứng oxi hoá khử.
Chức năng chính của các bộ phận tế bào nhân chuẩn có thể tóm tắt:
1) Tế bào chất: Nơi có các bào quan khác nhau, nơi diễn ra
201
các quá trình chuyển hoá vật chất
2) Vi sợi (microfilament), sợi
gian bào (filament Cấu trúc tạo bộ khung tế bào, vận chuyển nội
intermediate) và các vi ống bào, chuyển động tế bào
(microtubule):
3) Màng lưới nội chất: Vận chuyển các chất, tham gia tổng hợp lipit
và prôtêin
4) Ribosom: Tổng hợp prôtêin
5) Thể Gôngi: Bọc gói và tiết các chất, hình thành các hạt
lyzôxôm
6) Lyzôsôm: Tiêu hoá nội bào
7) Ti thể: Giải phóng năng lượng từ chu trình axit
tricacboxilic, của sự vận chuyển electron, của
quá trình photphorin ôxi hoá và từ các con
đường khác
8) Lục lạp: Quang hợp thu tóm năng lượng ánh sáng và
hình thành các gluxit từ CO2 và nước
9) Nhân: Chứa thông tin di truyền, trung tâm điều hành
hoạt động tế bào
10) Vùng nhân bé (hạch nhân), Tổng hợp ARNr, hình thành các ribôsôm
(nucleolus):
11) Thành tế bào và các lớp Tạo nên hình dạng tế bào và sự cứng rắn
ngoài:
12) Roi, lông: Chuyển động tế bào
202
bào cùng với vi sợi và vi ống tạo nên bộ khung tế bào giữ hình dạng tế bào và giúp
chúng chuyển động. Ở các tế bào nhân sơ không có khung tế bào được tổ chức như
vậy và không có prôtêin actin.
Hình I.6. Sơ đồ màng lưới các vi ống, vi sợi và các sợi gian bào
của tế bào vi sinh vật nhân thực
ER – màng lưới nội chất; MT – vi ống; M – ti thể;
PM – màng tế bào chất; R – Ribôsôm tự do hoặc poliribôsôm.
203
của ER.
ER cũng là nơi chủ yếu tổng hợp lớp màng tế bào.
3. Thể Gôngi
Thể Gôngi là một bào quan cấu trúc màng được tạo bởi các túi dẹt sắp xếp cái
nọ trên cái kia.
Thể Gôngi có mặt trong phần lớn các tế bào nhân thực, nhưng cũng có một số
nấm và động vật nguyên sinh có roi không có thể Gôngi thực thụ, đôi khi ở chúng chỉ
có một túi dẹt làm chức năng như thể Gôngi; trái lại rất nhiều tế bào nhân thực có thể
chứa đến 20 túi dẹt, trong trường hợp này chúng có tên là hạt đĩa (dictyosome) và có
thể tập trung trong một vùng hoặc phân tán trong tế bào.
Thể Gôngi làm chức năng bao gói và tiết các chất. Ngoài ra còn thấy chúng
thực hiện một số chức năng khác, như tham gia hình thành thành cứng của tảo silic
(Diatomea), một số nấm. Trong quá trình tiết dịch các dịch tiết được vận chuyển từ
ER đến thể Gôngi và thường được tách ra từ ER, được chuyển đến thể Gôngi và hợp
nhất với túi cis. Như vậy là thể Gôngi có mối liên hệ chặt chẽ với ER cả về cấu trúc và
chức năng.
204
Hình I.8. Sơ đồ cấu tạo, hình thành và chức năng lyzôxôm
Một chức năng quan trọng nhất của thể Gôngi và mạng lưới nội chất (ER) là
tổng hợp một loại bào quan khác đó là lyzôxôm. Lyzôxôm thấy có ở nhiều loại vi sinh
vật nhân thực như động vật nguyên sinh, một số loại tảo đơn bào và nấm, cũng như
trong động vật và thực vật. Các lyzôxôm có dạng hình cầu, được bao bọc bởi một lớp
màng, với kích thước từ 50nm đến vài µ m tuỳ loài. Chúng là nơi tiêu hoá nội bào vì
trong lyzôxôm chứa các enzim cần thiết để tiêu hoá tất cả các phân tử lớn. Các enzim
này gọi là enzim thuỷ phân xúc tác cho quá trình thuỷ phân các phân tử và chỉ hiệu
quả nhất trong điều kiện axit yếu (thường vào khoảng pH 3,5 và 5). Các lyzôxôm giữ
được môi trường axit bên trong nhờ bơm proton từ phía ngoài. Các enzim tiêu hoá
được tổng hợp nhờ RER và được bao gói nhờ thể Gôngi để hình thành nên lyzôxôm.
Một bộ phận của REL ở gần thể Gôngi cũng có thể tách ra và hình thành các hạt
lyzôxôm.
Một điểm đáng chú ý của lyzôxôm là khi thực hiện tất cả chức năng tiêu hoá
của mình thì lyzôxôm không giải phóng các enzim tiêu hoá vào tế bào chất
205
Các ribôsôm của tế bào nhân chuẩn có thể đính vào màng lưới nội chất hoặc tự
do trong tế bào chất; chúng là những hạt 80S, lớn hơn ribôsôm 70S của vi khuẩn.
Một số loại prôtêin được tổng hợp ở các ribôsôm tự do có thể tham gia vào hình
thành các bào quan như nhân, ti thể và lục lạp. Rất nhiều ribôsôm thường liên kết với
một ARNm và dịch mã đồng thời thông tin ARNm thành các phân tử prôtêin giống
nhau. Tập hợp ARNm và ribôsôm này được gọi là poliribosom hay polisom.
6. Ti thể
Ti thể có mặt trong phần lớn tế bào nhân chuẩn, là “trung tâm điện năng” của tế
bào. Ti thể là nơi hoạt động của chu trình axit tricacboxylic, sinh ra ATP nhờ sự vận
chuyển electron và quá trình photphorin oxi hoá.
Ti thể được bao bọc bởi 2 lớp màng, màng ngoài cách màng trong bằng một
khoang giữa các màng từ 6 – 8nm. Bề mặt màng trong ti thể được tăng lên rất nhiều là
nhờ sự hình thành các tấm răng lược; hình dạng sự gấp nếp màng trong ti thể thành
các tấm này rất khác nhau tuỳ theo loài, ví dụ ở nấm thì các tấm có dạng bản mỏng,
còn ở trùng roi Euglena các tấm có dạng đĩa, ở một số nấm và phần lớn động vật
nguyên sinh các tấm có dạng ống, còn ti thể của amip lại có tấm dạng túi. Màng trong
của ti thể được giới hạn tạo thành khoang trong ti thể chứa dịch với các ribosom ti thể,
ADN và thường chứa những hạt photphatcanxi. Các ribosom ti thể bé hơn ribosom tế
bào chất và giống với ribosom của vi khuẩn về kích thước, độ lắng và các đơn phân.
ADN của ti thể là phân tử 2 mạch vòng giống ADN vi khuẩn.
7. Lục lạp
Mặc dù lục lạp khác nhau về kích thước, hình dạng ở các loài, nhưng chúng có
nhiều đặc điểm cấu tạo giống nhau. Thông thường, chúng có hình trái xoan với kích
thước (2 – 4µ m) × (5 – 10µ m). Một vài loại tảo có một lục lạp khổng lồ choán đầy
tế bào. Cũng giống như ti thể, lục lạp được bao bọc bởi hai lớp màng. Một khoang
giữa các phiến tạo nên bởi các màng trong gọi là stroma; trong stroma chứa ADN,
ribosom và các giọt lipit, hạt tinh bột. Hệ thống phiến tạo nên bởi các màng trong hình
thành các túi dẹt gọi là tilacoit. Một nhóm hai hay nhiều tilacoit rải ra trong stroma
thấy ở các lục lạp của tảo. Ở một số tảo có nhiều tilacoit tạo nên chồng đĩa tựa như
chồng các đồng xu hình thành grana.
206
Nhân có hình cầu với đường kính 5 – 7µ m, được bao bọc bởi màng nhân.
Có thể thấy các chromatin trong nhân tế bào đã nhuộm màu, trong tế bào chưa
phân chia các chromatin phân tán, nhưng chúng được tập trung lại thành các nhiễm
sắc thể trong nguyên phân và giảm phân. Màng nhân gồm 2 lớp cách nhau 15 – 75nm.
Màng nhân liên hệ trực tiếp với ER và màng ngoài của nó được phủ các ribosom, các
chromatin thường đính vào màng trong. Màng nhân có rất nhiều lỗ, mỗi lỗ màng nhân
có đường kính 70nm và thường chiếm khoảng 10 – 25% bề mặt của màng nhân. Các
lỗ màng nhân giúp cho sự trao đổi dễ dàng giữa tế bào chất và nhân. Cấu trúc thấy rõ
ở trong nhân khi được nhuộm màu là vùng nhân bé (hạch nhân), có thể có một hoặc
vài vùng nhân bé trong nhân tế bào nhân thực, vùng nhân bé không có màng bọc,
nhưng là vùng chứa các hạt và vi sợi, nó có mặt trong tế bào không phân chia và
thường biến mất trong nguyên phân và tái xuất hiện sau phân bào.
Vùng nhân bé có vai trò chủ yếu trong quá trình tổng hợp ribôsôm. ADN của
nhân điều khiển sự phiên mã của ARN ribôsôm, từ đó hình thành ARNr, các phân tử
ARNr chín liên kết với các protêin của ribôsôm (các phân tử này được tổng hợp trong
tế bào chất) để hình thành các tiểu phần của ribosom. Các tiểu phần ribosom chưa
thành thục rời khỏi nhân qua lỗ màng nhân ra tế bào chất nơi chúng gắn các tiểu phần
để tạo ra ribôsôm hoàn chỉnh. Tham gia vào quá trình hình thành các ARN có các
enzim ARN–polimeraza, ở các cơ thể nhân thực hiện biết 3 loại: I, II và III.
207
Hình I.10. Chu trình sống của tế bào nhân thực
Chu trình này gồm 2 giai đoạn kế tiếp nhau: kì trung gian (interphase) và kì
nguyên phân. Giai đoạn M (kì nguyên phân) được vẽ to và kéo dài ra để chỉ rõ các kì
của nguyên phân, nó gồm các kì: kì đầu (prophase), kì giữa (metaphase), kì sau
(anaphase), kì cuối (telophase) và phân chia tế bào chất (cytocinesis).
Kì trung gian gồm các pha G1, S và G2.
Pha G1: Tổng hợp ARNm, ARNt, ribôsôm và các thành phần tế bào chất, vùng
nhân bé phát triển nhanh.
Pha S: Tổng hợp nhanh và nhân đôi ADN của nhân và tổng hợp histon.
Pha G2: Chuẩn bị cho nguyên phân và phân bào.
Như vậy sự lớn lên của tế bào diễn ra chủ yếu ở kì trung gian, pha G1, S, G2 có
thể dài ngắn tuỳ theo loại vi sinh vật. Ở vi sinh vật, giai đoạn nguyên phân (M) có thể
không hoàn toàn giống như các mô tả điển hình của tế bào nhân thực, ví dụ màng nhân
không biến mất ở nhiều loại nấm, ở một số động vật nguyên sinh và ở một số loại tảo
đơn bào. Thông thường, sự phân chia tế bào chất của tế bào bố mẹ để hình thành hai tế
bào con bắt đầu từ kì sau và được kết thúc ở cuối kì cuối, giai đoạn nguyên phân (M)
có thể diễn ra mà không có sự phân chia tế bào chất do đó hình thành các cơ thể đa
nhân hoặc cộng bào (sợi nấm cộng bào).
208
Trong nguyên phân số lượng nhiễm sắc thể không thay đổi sau khi tế bào phân
đôi, một tế bào lưỡng bội (diploid) vẫn là lưỡng bội hay 2N.
Vi sinh vật nhân thực có thể giảm một nửa số lượng nhiễm sắc thể để chuyển sang
trạng thái đơn bội (haploid) tức 1N (chỉ chứa một bản sao của mỗi nhiễm sắc thể). Các
tế bào đơn bội trở thành các giao tử và hợp nhất để sinh ra cơ thể lưỡng bội mới. Quá
trình dẫn đến số lượng nhiễm sắc thể giảm đi một nửa trong các tế bào con gọi là quá
trình phân chia giảm nhiễm (meiosis) hay giảm phân. Nếu như nguyên phân từ một tế
bào tạo ra 2 tế bào con có số nhiễm sắc thể giống nhau và giống tế bào bố mẹ, thì ở
giảm phân từ một tế bào ban đầu cho ra 4 tế bào con với số lượng nhiễm sắc thể giảm
đi một nửa. Sở dĩ như vậy là vì giảm phân diễn ra theo 2 bước: giảm phân I và giảm
phân II. Có hai lần phân chia liên tiếp nhưng chỉ có một lần nhân đôi nhiễm sắc thể
diễn ra ở giảm phân I.
Ở vi sinh vật độ dài các kì của giảm phân I và giảm phân II có thể khác nhau
tuỳ theo loài và điều kiện nuôi cấy. Cũng xin nhắc lại là trong genôm của vi sinh vật
nhân chuẩn có intron nên khi phiên mã để tạo ra ARN m sơ cấp rồi sau đó mới tạo ra
ARNm thứ cấp.
209
a. b.
Hình I.11. So sánh cơ chế tách các thể nhiễm sắc trong phân chia vô tính
ở vi khuẩn (a) và ở nấm men (b)
a. Ảnh chụp hiển vi điện tử quét tế bào nấm men nảy chồi
Thấy rõ tế bào bố mẹ (Parent cell), chồi (Bud) và sẹo chồi (Bud sear);
(SEM × 20.000) Sac.cerevisiae (a)
210
Bào tử Nơi sống
Lớp Nấm Loại sợi Bào tử vô tính Ví dụ
hữu tính chính
Oomycetes Không có Bào tử chuyển Oospora Thuỷ sinh, Allomyces
vách ngăn động (bào tử nhiều loài
(Coenocytic noãn) gây bệnh
) cá, mốc
sương
khoai tây
Zygomycetes Coenocyte Bào tử túi, đôi Zygospora Đất, phân Mucor,
khi bào tử đính (bào tử tiếp giải chất Rhizopus
(conidium) hợp) hữu cơ
thực vật
Ascomycetes Có vách Bào tử đính Bào tử túi Đất, phân Neurospor
ngăn (một (conidium) (Ascospore) giải chất a
số đơn bào) (nảy chồi) của thực Saccharo
vật myces
Morchella
Basidiomycete Có vách Uredospores, Bào tử đảm Đất, phân Agaricus,
s ngăn (một conidium (nảy (Basidios– giải chất Amanita
số đơn bào) chồi) pore) của
thựcvật
Deuteromycet Có vách Bào tử đính, Chưa thấy Đất, thực Candida,
es ngăn (một bào tử đốt vật và trên Trychophyto
số đơn bào) (Arthrosp ora) cơ thể n,
động vật Epidermop
hyton
Vi tảo
Vi tảo là tảo hiển vi có sắc tố quang hợp. Vi tảo đơn giản nhất là cơ thể đơn
bào, hoặc tập hợp đơn bào: Có thể có roi như Chlamydomonas, Peridium và Euglena
(tảo mắt), hoặc không có roi như Chlorella (Tảo lục), Diatomia (tảo cát). Các vi tảo
thường gặp hơn là những cơ thể đa bào hoặc tập hợp đơn bào, như các tập đoàn
Volvox, Pediastrum, Scenendesmus (thuộc nhóm Archethalle) hoặc phức tạp hơn có
bộ phận dính bám và bộ phận dựng đứng như các sợi mảnh phân nhánh hoặc không
(có thể có vách ngăn tạo thành các tế bào tương đối độc lập hoặc không có vách ngăn
như một ống cộng bào, Những tảo này sinh sản bằng cách chia của tế bào lạ ở giữa
hoặc bằng cách rụng tế bào ở đầu cùng (Sphacelaria, Ectocarpus...), chúng sinh sản
211
hữu tính bằng tiếp hợp đẳng giao (hai giao tử bằng nhau) hoặc dị giao (hai giao tử
khác nhau).
a. Chu trình phát triển của tảo lục đơn bào Chlamydomonas;
b. Sinh sản vô tính ở tảo cát (diatoms) Achnanthes minutissima.
Phần trên là ảnh chụp trên kính hiển vi điện tử quét cho thấy 2 mảnh úp vào
nhau. Phần dưới cho thấy trong gián phân (mitosis) mỗi tế bào con có một nửa từ tế
bào bố mẹ, phần nửa kia được tổng hợp bổ sung.
Với hơn 30.000 loài được mô tả, động vật đơn bào là những “cư dân” ở đất và
nước. Nhiều động vật đơn bào có vai trò quan trọng ở các lớp bùn hoạt tính tại các
trạm lọc nước thải.
Một số nhóm động vật đơn bào và tính chất của chúng
212
Giardia,
Leishmania
Sarcodina Dạng Amip, giả túc, không roi, Nước ngọt và mặn, kí Amoeba,
chia đôi sinh trên động vật Entamoeba
Sporozoa Thường bất động, một số có Kí sinh sơ cấp trên Plasmodium (gây
thể trườn, bò, chia đôi, kí sinh động vật chân đốt, tác bệnh sốt rét cơn
động vật, sâu bọ nhân truyền bệnh kí Malaria)
sinh Toxoplasma
Ciliophora Nhiều roi ngắn (tiêm mao, Nước ngọt và mặn, kí Paramecium
cilia), chia đôi ngang, mỗi tế sinh trên động vật, Balantidium
bào thường có nhân lớn và trong dạ của động vật
nhân bé làm chức năng khác nhai lại
nhau
Cnidospora Hình thành chuỗi bào tử nhờ Kí sinh trên động vật Nosema gây
sợi phình ra và cắt khúc có xương và không bệnh tầm gai
xương
213
Hình I.14. Sơ đồ cấu tạo một số đại diện động vật nguyên sinh
Như vậy là chúng ta đã nghiên cứu các nhóm vi sinh vật có nhân sơ như vi
khuẩn, nhân thực như nấm, tảo đơn bào và động vật đơn bào khác với các loại virut
mà chúng ta sẽ nghiên cứu sau.
214
So sánh một số tính chất của các nhóm vi sinh vật
215
bào) động vật
đơn bào)
VI. VIRUT
Người ta nhận định virut như sau :
– Virut là dạng sống siêu hiển vi (từ 18nm đến 300 – 400nm)
– Virut có cấu tạo rất đơn giản: lõi mang yếu tố di truyền chỉ có axit nuclêic một loại
và vỏ bao bên ngoài là prôtêin gồm các đơn vị hình thái (capsome); những virut phức
tạp có thêm màng bọc và enzim riêng.
– Virut là dạng sống kí sinh bắt buộc, chỉ sinh trưởng và phát triển trong tế bào vật
chủ sống, khi ở ngoài cơ thể vật chủ có thể tồn tại ở trạng thái đại phân tử hoá học và
có tính truyền nhiễm; một số virut thực vật có khả năng hình thành tinh thể.
– Virut nhân lên một cách đặc biệt trong tế bào sống: tổng hợp các thành phần của
mình và lắp ráp thành virut hoàn chỉnh và được giải phóng ra ngoài.
– Virut rất dễ biến dị đặc biệt đối với các virut có ARN
•
•
•
•
•
•
•
•
Hình I.15. Kích thước (đơn vị là nm), vài loại virut so sánh với một số vi khuẩn bé
(Chlamydia), vi khuẩn E.coli và tế bào hồng cầu của người.
216
Cấu tạo của virut
Virut có 3 dạng cấu trúc: xoắn, khối (icosahedron) và phức hợp (các phage).
Cấu trúc xoắn:
Cấu trúc xoắn đặc trưng cho các virut hình ống như virut đốm thuốc lá (TMV),
cúm, sởi, quai bị, dại... Đây là cấu trúc đối xứng trụ, có một trục đối xứng trùng với
trục dọc – khi quay hạt virut 180o xung quanh trục dọc thì sẽ dẫn đến một vị trí hoàn
toàn giống như vị trí lúc đầu.
Mỗi đơn vị hình thái TMV (capsomer) chứa khoảng 158 axit amin, một ống
rỗng có đường kính ≈ 15nm và dài ≈ 300nm.
A B
Axit nucleic của TMV là sợi ARN một mạch có khối lượng phân tử khoảng
6
25.10 dalton, chiếm 5,5% trọng lượng của cả hạt. Sợi ARN này được uốn theo chiều
xoắn của capsit và gắn vào 2/3 chiều dày của capsit tính từ bên trong. Người ta còn biết
được rằng chỉ có 474 nucleotit trong số 6400 nucleotit trong ARN của TMV mã hoá cho
quá trình tạo vỏ capsit của nó.
Không phải tất cả các virut hình ống đều có cấu trúc vỏ capsit giống như TMV.
Virut cúm có capsit mềm, dễ uốn, lõi axit nucleic được gói gọn trong vỏ mỏng lipit
217
chứ không uốn theo chiều xoáy của vỏ capsit.
Cấu trúc khối:
Nhiều loại virut nhìn thoạt qua có dạng hình cầu (Adenovirus, Retrovirus,
Poliovirus...) nhưng khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử lại thấy vỏ prôtêin của
chúng có cấu trúc hình khối đa diện, thường là các hình khối 20 mặt tam giác đều
(icosahedron).
Cấu trúc icosahedron là một hình khối đa diện 20 mặt tam giác đều: 5 mặt
ở đỉnh, 5 mặt ở đáy, và 10 mặt ở giữa. Các tam giác đều này đều bằng nhau và
đối xứng, có thể xếp theo bất cứ hướng nào. Icosahedron có 12 đỉnh (góc hợp
của 5 tam giác đều) và 30 cạnh (đường gấp của từng cặp cạnh tam giác gần
nhau). Icosahedron có ba loại trục đối xứng xuyên qua tâm của nó (hình I.17) là:
Trục đối xứng cấp 3 Trục đối xứng cấp 5 Trục đối xứng cấp 2
Hình I.17. Sơ đồ cấu trúc khối
Trong cấu trúc icosahedron, mỗi tam giác đều được cấu tạo từ các đơn vị hình
thái (ĐVHT). Mỗi ĐVHT có thể được cấu tạo từ cấu trúc dưới đơn vị hình thái.
218
A
C
B D
Hình I.18. Sơ đồ cấu trúc một số loại virut cấu trúc khối
A. Virut cà chua B. Poliovirus C. Virut SV–40 D. Virut nhũn thân thuốc lá
Nhẫn ở cổ
b 0,1µ
m
Lizôzim
a
Hình I.19. Phage T2 – một loại virut kí sinh trên E.coli
a. Sơ đồ cấu tạo phage T2
b. Ảnh chụp TEM phage T2.
Các giai đoạn phát triển phage gây độc
219
Nói chung sự sinh sản của Bacteriophage độc có thể chia làm
5 giai đoạn :
Hấp phụ → xâm nhập → tổng hợp các thành phần → lắp ráp → giải phóng
phage
HIV – tế bào: Ở các virut động vật, ngoài cơ chế trên virut còn xâm nhập vào tế
bào theo cơ chế ẩm bào (Pinocytosis) hay thực bào (Phagocytosis), sau đó tế bào chủ
sinh ra các enzim làm tan vỏ prôtêin của virut và giải phóng các axit nucleic trong tế
bào chất.
Phage ôn hoà và hiện tượng tiềm tan
Khi phage xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, quá trình kí sinh có thể xảy ra theo
hai hướng:
1. Phage nhân lên một cách độc lập trong tế bào vi khuẩn sau đó làm tan tế bào
vi khuẩn, đây là chu trình làm tan hay li giải tế bào (Lytic cycle). Những phage li giải
tế bào vi khuẩn gọi là phage gây độc.
Hình I.20. Mối liên quan giữa tế bào, phage độc và phage ôn hoà
2. Có một số phage, sau khi vào tế bào chúng gắn bộ genom của mình vào
genom của tế bào vật chủ. Hệ gen của phage tồn tại song song với tế bào chủ, không
làm tan tế bào và ở dạng nghỉ (dormant). Lúc này người ta gọi chúng là prophage. Khi
220
có tác nhân cảm ứng tác động (như tia UV, X, etylen imin, peroxit hữu cơ v.v...), các
prophage sẽ hoạt động trở lại thành phage gây độc. Đây là mối quan hệ tiềm tan giữa
phage và tế bào (Lysogeny). Các phage này gọi là các phage ôn hoà. Các tế bào vi
khuẩn chứa các phage ôn hoà gọi là tế bào tiềm tan (hay tế bào tiềm tan).
Bệnh virut có thể lan truyền theo hai cơ chế chính:
+ Sự lan truyền dọc (lan truyền di truyền): các tế bào bố mẹ nhiễm virut ở dạng
tiềm sinh truyền cho các tế bào con cháu từ thế hệ này qua thế hệ khác. Ví dụ các virut
thuộc Retrovirus gây AIDS, virut Rubella (Togaviridae).
+ Lan truyền ngang (lan truyền tiếp xúc): bao gồm một số con đường chính sau:
– Qua đường hô hấp (qua không khí bẩn chứa các virut gây bệnh). Ví dụ:
Virut cúm, quai bị, sởi, đậu mùa....
– Qua đường tiêu hoá (qua thức ăn và nước uống bị nhiễm). Ví dụ: Virut bại liệt
(poliomyelite), virut viêm gan A (Piconaviridae).....
– Viêm qua đường sinh dục và tiết niệu: HIV, HBV ...
– Lan truyền do vật trung gian như muỗi, bọ chét, chấy rận... (Ví dụ: các virut
gây bệnh sốt vàng da, viêm não, sốt vẹt, sốt xuất huyết..)
– Lan truyền qua vết cắn: Virut dại (Rhabdoviridae)...
– Lan truyền đường truyền máu. Ví dụ HBV hoặc HIV....
VII. HỆ THỐNG SINH GIỚI VÀ VỊ TRÍ CỦA CÁC NHÓM VI SINH VẬT
Hệ thống 5 giới
Ngay từ năm 1969, dựa vào những nghiên cứu của Masgulis về cấu tạo và hệ
enzim ôxy hoá các cơ thể nấm, mà Whittaker đã đề nghị tách nấm thành một giới
riêng và nêu ra hệ thống sinh giới gồm 5 giới:
1. Giới (Kingdom) khởi sinh (Monera): Gồm tất cả cơ thể nhân sơ, mà chủ yếu
là vi khuẩn, trong đó có vi khuẩn lam.
2. Giới nguyên sinh (Protista): Gồm tất cả cơ thể đơn bào hoặc tập hợp đơn bào
nhân thực.
3. Giới nấm (Fungi): Các cơ thể nấm dinh dưỡng theo kiểu "thấm".
4. Giới thực vật (Plantae): Gồm tất cả các cơ thể đa bào nhân thực quang hợp.
5. Giới động vật (Animalia): Gồm tất cả các cơ thể đa bào nhân chuẩn dinh
dưỡng kiểu nuốt.
Ba tiêu chí cơ bản của hệ thống 5 giới là:
221
– Loại tế bào nhân sơ hay nhân thực.
– Mức độ tổ chức cơ thể: Đơn bào riêng lẻ, tập hợp thành tập đoàn hay là cơ thể
đa bào đã có phân hoá.
– Kiểu dinh dưỡng.
Năm 1970, Takhtakjan đã phê phán giới nguyên sinh của Whittaker, cho rằng
trong giới đó đã xếp tất cả các cơ thể nhân thực đơn bào là nấm bậc thấp, động vật
nguyên sinh và thực vật đơn bào vào cùng một giới là không hợp lí và đề nghị hệ thống
gồm bốn giới 1, 3, 4, 5.
Hệ thống 3 lãnh giới (domain, lãnh địa) sinh vật
Dựa vào trật tự các Nucleotit của 16S ARNr hoặc 18S ARNr mà khoa học đã
phân chia các vi khuẩn thành hai nhóm khác biệt nhau bởi nhiều đặc điểm: vi sinh vật
cổ (Archaea) và vi khuẩn (Bacteria). Những cơ thể nhân sơ này khác hoàn toàn với
các cơ thể nhân thực.
Virut là đối tượng quan trọng của vi sinh học. Có thể xem virut là loại vật chất
sống khi ở ngoài tế bào chủ và là dạng sống vô bào khi kí sinh trong cơ thể chủ đang
phát triển. Vì chúng chưa có cấu tạo tế bào nên không được xếp vào hệ thống sinh
giới. Virut có vai trò to lớn đối với đời sống của con người và muôn loài sinh vật. Ví
dụ virut là vật tải gen có ích từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận, hay virut viêm
đường hô hấp cấp (SARS) đã gây thiệt hại lớn cho sản xuất và du lịch của nhiều nước
hay virut cúm A H5N1 đã làm thiệt hại cho ngành chăn nuôi gia cầm hàng trăm tỉ
đồng.... Như vậy, đối tượng của vi sinh học nằm cả ở 3 cấp tổ chức.
222
Thực vật Nấm Động vật
Cấp các cơ thể nhân
chuẩn
Nấm đơn bào, Động vật nguyên
Thực vật đơn bào nấm sợi sinh
Vi khuẩn Archaea
Cấp các cơ thể nhân
sơ
Hình I.21. Các nhóm đối tượng của vi sinh học (trong khung chữ nhật)
223
a. Thay các số trong sơ đồ bằng tên các cấu trúc.
1 .................... 5 ...................................
2 ................... 6 ...................................
3 .................. 7 ...................................
4 .................. 8 ..................................
b. Cấu trúc số 1, 5, 8 khác nhau về chức năng như thế nào?
c. Cấu trúc số 2 chứa hợp chất không gặp ở các cơ thể nhân thực và nó khác
với Archaea. Cho biết cấu tạo hoá học của cấu trúc số 2 và vai trò của nó.
d. Cấu trúc số 7 có vai trò gì? Nêu 3 ví dụ vi khuẩn có cấu trúc này.
e. Cấu trúc số 6 khác gì giữa vi khuẩn và cơ thể nhân thực?
2. Điền vào chỗ dấu chấm thuật ngữ (tập hợp từ) phù hợp nhất.
a. Trong phân tử .............. của thành vi khuẩn, thay ....................... bằng .................
cấu tạo nên thành của Archaea có thành.
b. Thành tế bào vi khuẩn có hợp chất đặc trưng là .........................., còn gọi
là ................. hay phức chất ...........................
c. Các hợp chất .................. là loại prôtêin chủ yếu của ............................. của thành
tế bào vi khuẩn Gram âm.
d. Bên ngoài lớp ............................ có các ...................... có vai trò quan trọng về
tính kháng nguyên của vi khuẩn Gram âm.
e. Thành vi khuẩn Gram dương dưới tác động của ................. làm đứt liên
kết................... tế bào biến thành tế bào trần, còn ở vi khuẩn Gram âm sẽ
thành ..................................
3. Các câu sau đúng hay sai, giải thích.
a. Các loài vi khuẩn đều có khả năng hình thành nội bào tử (endospore).
b. Cơ chế nhân đôi ADN bán bảo tồn là vì nó giữ lại 50% số lượng ADN có mặt
trong tế bào bố mẹ.
c. Axit teicoic là thành phần đặc trưng của thành vi khuẩn Gram dương.
d. Thành phần và kiểu cấu tạo thành tế bào vi khuẩn Gram âm đã làm cho rượu khó
đi qua trong quá trình nhuộm Gram.
4. Chức năng của thành tế bào vi khuẩn:
1. Tham gia vào quá trình phân bào
224
2. Thực hiện quá trình hô hấp
3. Giữ hình dạng tế bào ổn định
4. Là nơi xuất phát của tiên mao (flagella)
5. Có vai trò quan trọng trong quá trình nhuộm Gram
6. Tham gia vào việc duy trì áp suất thẩm thấu
Tổ hợp đúng là: A = 1–2–5–6 ; B = 2–3–4–5 ; C = 1–3–5–6 ; D = 3–4–5–6.
5. Nghiên cứu sự kháng thuốc penixilin của tụ cầu vàng Staphylococcus aureus, người
ta thấy ở Việt Nam có đến 70% số tụ cầu vàng mới phân lập từ người bệnh chữa
bằng Penixilin có khả năng kháng penixilin gốc.
a. Sự kháng thuốc này thường có nguồn gốc từ plasmid. Vậy plasmid là gì? Vai trò
của các loại plasmid?
b. Sự có mặt của plasmid trong vi khuẩn cho phép nó sinh tổng hợp một loại phân
tử mới, đó là phân tử gì? Hoạt động của phân tử này như thế nào?
c. Người ta làm một kháng sinh đồ đối với chủng tụ cầu vàng được phân lập từ một
người bệnh chỉ chữa bệnh bằng penixilin. Chủng vi khuẩn này xuất hiện sự đề
kháng đồng thời với penixilin và tetraxyclin, biết rằng lúc đầu khi chữa bệnh, các tụ
cầu vàng là những chủng mẫn cảm với cả hai loại kháng sinh trên.
– Có thể giải thích hiện tượng trên như thế nào?
– Có thể sử dụng phương pháp điều trị nào để tránh hiện tượng trên?
225
CHƯƠNG 2
226
định cần cho sự sinh trưởng của chúng.
Các vi khuẩn nguyên dưỡng có thể nuôi cấy được trên môi trường tối thiểu,
loại môi trường này chỉ chứa các nguyên tố dinh dưỡng vô cơ chủ yếu.
227
Hình II.1. Phương pháp cấy (zic zăc) để thu được các khuẩn lạc riêng rẽ.
Hai kiểu chuyển hoá vật chất quang dưỡng (phototrophic metabolism)
Kiểu trao đổi chất Chất cho Nguồn cacbon Ví dụ vi sinh vật, cơ
electron thể
Vi khuẩn lam
H2O CO2 (Cyanobacteria) thực
Quang dưỡng vô cơ
vật
Chromatiaceae
H2S, S0, H2 CO2
Chlorobiaceae
Quang dưỡng hữu cơ Cơ chất hữu cơ Hợp chất hữu cơ Rhodospirillaceae
Hai kiểu chuyển hoá vật chất hoá dưỡng (chemotrophic metabolism)
228
Cơ chất hữu cơ Cơ chất Cơ chất hữu cơ Clostridium vi
hữu cơ khuẩn lactic
Vi khuẩn oxi hoá
H2 O2 CO2
hydrogen
H2S O2 CO2 Thiobacillus
Vi khuẩn sinh
H2 CO2 CO2
metan
Vi khuẩn sinh
H2 CO2 CO2
axetic
229
Hình II.2. Sơ đồ vận chuyển electron và proton
Do đó, hô hấp của một cơ thể là một quá trình vận chuyển electron và proton
qua màng với ôxi phân tử làm chất nhận electron cuối cùng, còn “hô hấp kị khí” dùng
để chỉ một quá trình vận chuyển qua màng của các electron và proton cho đến tận chất
nhận electron cuối cùng là một chất khác ôxi phân tử, như nitrat trong trường hợp hô
hấp nitrat, hợp chất hữu cơ như fumarat như hô hấp fumarate, ion S O24− trong hô hấp
sunphat...
Rất nhiều vi sinh vật có nhiều chuỗi vận chuyển electron có thể cùng họat động,
hoặc được họat động trong những điều kiện nuôi cấy nhất định.
A. Hô hấp: Vận chuyển electron và proton qua màng. Các proton vận chuyển
để tạo ra ATP hoặc để đảm bảo một chức năng khác (vận chuyển chẳng hạn…).
B. Lên men, với khả năng vận chuyển proton nhờ ATP aza thực hiện chức năng
khác theo hướng ngược lại.
DH2 – cơ chất cho electron
Substrat – cơ chất
Mem cyt – màng tế bào chất
230
Ví dụ như ở E.coli, vi khuẩn đường ruột này có một chuỗi vận chuyển electron
với ôxi phân tử là chất nhận electron cuối cùng (chuỗi hoạt động như cơ thể hiếu khí)
và chuỗi “hô hấp nitrat” hoạt động kị khí trong môi trường nitrat, một chuỗi “hô hấp
fumarat”, hoạt động kị khí trong môi trường chứa cơ chất hữu cơ, mà vi khuẩn này có
thể lên men.
Bên cạnh quá trình photphorin ôxi hoá cơ chất, còn tồn tại những con đường
khác, đặc biệt là con đường ôxi hoá trực tiếp nhờ các enzim vận chuyển các electron
từ cơ chất đến oxi với sự tạo thành nước ôxi hoá hoặc hiđro peroxit.
FADH2 + O2
FAD–oxidaza FAD + H2O2
Hợp chất này rất độc và cần phải ngay tức khắc được phân giải nhờ catalaza,
peroxiđaza hoặc superoxit dimutaza, tránh cho tế bào khỏi bị chết.
Có thể có hai cơ chế:
catalaza
H2O2 → H2O + 1/2O2
peroxidaza
H2O2 + 2H+ + 2e– → 2H2O
Tùy thuộc vào số và lượng các enzim có thể phân giải H 2O2 mà quyết định tính
hiếu khí hay kị khí ở các vi khuẩn.
Sự tham gia của các con đường khác nhau trong trao đổi chất hexozơ
(tính theo %)
231
frutozơ–1,6– pentozơ– 2–xeto–3–deoxi–6–
điphotphat photphat photphogluconat
Candida utilis 70–80 30–20
Streptomyces griseus 97 3
Penicillium chrysogenum 77 23
Escherichia coli 72 28
Bacillus subtilis 74 26
Pseudomonas aeruginosa 29 71
Gluconobacter oxidans 100
Pseudomonas saccharophila 100
Alcaligenes eutrophus 100
Ghi chú: – Con đường fructozơ–1,6–diphotphat (hay là glycolyse, Embden–
Meyerhof–Parnas)
– Pentozơ–photphat (hay là hexozơ–monophotphat, Warburg–Dickens–Horecker)
– 2–xeto–3 deoxi–6–photpho gluconat (hay Entner–Doudoroff).
Số phận của pyruvat sẽ tiếp tục như thế nào là tùy thuộc vào hệ enzim của vi
sinh vật. Nếu ở các vi sinh vật hiếu khí hoàn toàn thì các hợp chất 3 cacbon này sẽ
được oxi hoá đến cùng để tạo ra CO2 và H2O, còn nếu pyruvat được các vi sinh vật
hoạt động kị khí sử dụng, thì tùy thuộc vào hệ enzim của từng loài mà có các sản
phẩm lên men khác nhau.
Lên men lactic
Lên men lactic là quá trình chuyển hoá sinh học kị khí các hợp chất đường
thành axit lactic (chủ yếu) và một số sản phẩm khác nữa.
Lên men lactic đồng hình là loại lên men lactic hầu như chỉ cho sản phẩm là
axit lactic.
Lên men lactic dị hình là quá trình lên men, ngoài axit lactic còn có các sản
phẩm khác như axit axêtic, etanol, CO2... Leuconostoc
Streptococcus lactis mesenteroides (x1000)
(x500)
232
Lactobacillus lactis
Lactobacillus
(x500)
Hình II.3. Ảnh chụp hiển vi một số loài vi khuẩn lactic
Cơ chế của quá trình lên men lactic
Phương trình tóm tắt của quá trình lên men lactic đồng hình từ glucozơ có thể
viết là:
Glucozơ
2ATP
*
2ADP
2Pyruvat
2 1,3– Biphotphoglyxerat
*
4ATP 233
4ADP
Mức năng lượng:
A. Trong lên men đồng hình: 2 ATP cho một glucozơ 5ATP cho 1 phân tử
lactozơ
B. Trong lên men dị hình: 1 ATP cho 1 glucozơ và 3 ATP cho phân tử lactozơ.
Ngoài vi khuẩn còn có một số cơ thể bậc cao có thể tạo được axit lactic, ví dụ
một số loài nấm Rhizopus như Rh.oryzae có thể tạo ra được khoảng 60% axit lactic so
với lượng đường sử dụng, nhưng ở đây là lên men oxi hoá.
234
Ngoài những tác dụng có lợi của vi khuẩn lactic, một số vi khuẩn lactic còn làm
chua rượu vang, bia, nước ngọt.
Lên men etylic
Lên men rượu là một quá trình sinh hoá phức tạp cần có sự tham gia của nấm
men hoặc một số vi sinh vật khác. Trong quá trình lên men rượu, đường được biến đổi
thành rượu etylic và CO2.
Tác nhân chính của quá trình lên men rượu là các loại nấm Saccharomyces. Đây
là tên nấm men theo nghĩa hẹp. Còn nấm men theo nghĩa rộng là nhóm nấm đơn bào
hoặc tập hợp đơn bào, nhân chuẩn, hiển vi, chúng có thể thuộc về 3 lớp Nấm: Nấm túi
(Asscomycetes), Nấm đảm (Basidiomycetes) và Nấm bất toàn (Deuteromycetes hay
Fungi imperfecti). Các loài nấm men Saccharomyces có tế bào hình ôvan. Kích thước
khoảng 3–10 × 5–12µ m. Trong công nghệ sinh học, người ta có thể tuyển chọn các
chủng nấm men có kích thước lớn, đa bội và hoạt tính sinh học rất cao. Nấm men
Saccharomyces sinh sản vô tính theo cách nảy chồi, có khả năng hình thành bào tử
trong điều kiện nhất định, thường 1 – 4 bào tử.
Cơ chế hoá học của quá trình lên men
Phương trình tổng quát của quá trình lên men rượu có thể viết là:
235
ë Saccharcomyces cervisiae
NAD+
TPP NADH.H+
COOH TPP TPP CH2OH
H HC=O
C=O H H−C−OH CH3
CH3 etanol
CH3 CH3
Pyruvat CO2 Axetan®ehit
Ancol ®ehi®rogenaza
Các loài S.cerevisiae lên men rượu theo con đường EMP, trong khi vi khuẩn
Zymomonas mobilis lại phân giải glucozơ theo con đường
xetodioxiphotphogluconat (XDPG), còn các nấm mốc như Mucor lên men glucozơ
chủ yếu (70% cơ chất) theo EMP và phần khác (30% cơ chất) theo HMP.
Hiệu suất năng lượng khi nấm men rượu sống trong điều kiện hiếu khí:
236
vải…
b. Sản xuất bia
Bia là một loại nước giải khát lên men rượu nhẹ không chưng cất gồm; 92%
nước, 2–9% rượu etylic và các loại đường sót, rất nhiều vitamin nhóm B, nên là loại
nước uống rất được ưa chuộng ở nhiều nước. Bốn nguyên liệu cơ bản quyết định chất
lượng bia: lúa mạch (orge) mọc mầm, hoa houblon, nấm men và nước.
Quá trình làm bia gồm 2 công đoạn chủ yếu:
– Nấu malt (biến tinh bột thành đường, maltage);
– Lên men, nhào trộn, ủ chín.
c. Nấm men rượu làm nở bột mì
Chính các ổ CO2 sẽ nở ra khi nướng bánh làm cho bánh xốp.
Giống nấm men làm nở bột mì là S.cerevisiae phải đạt những tiêu chuẩn sau: dễ
khuếch tán vào nước, có đặc tính sinh hoá ổn định và độ bền vững tốt (không dễ tự
thủy phân), khả năng sinh sản nhanh, năng suất lên men cao, hàm lượng chất dinh
dưỡng dễ hấp thụ cao.
d. Sản xuất sinh khối nấm men, sản xuất prôtêin đơn bào
Nấm men có nhiều ưu điểm so với các vi sinh vật khác để tạo sinh khối: Sinh
trưởng và phát triển nhanh (30–60 phút một thế hệ), lên men nhanh, tận dụng được
phế liệu rẻ tiền, có thành phần dinh dưỡng hết sức quý giá đối với người và vật nuôi.
237
– Các prôtêin được hình thành do tập hợp của hơn 20 loại axit amin và sắp xếp bất
quy luật, đó là các dị trùng hợp bất quy luật: A–B–L–G–D–D–...
Sự trùng hợp các đơn phân để tạo ra các hợp chất trùng hợp đòi hỏi một số năng
lượng nhất định, trừ một số ít các chất trùng hợp đơn giản và các đơn phân trước đó có
hoạt tính.
Ngày nay, bên cạnh các chất chuyển hoá sơ cấp, người ta đã biết rất nhiều chất
chuyển hoá thứ cấp (khoảng 1100 sản phẩm khác nhau từ vi khuẩn, gần 2000 hợp chất
từ nấm, khoảng 6500 hợp chất từ xạ khuẩn, 110 chất từ địa y, 270 chất từ tảo, 3000
chất rút chiết từ thực vật bậc cao và 750 chất do các cơ thể động vật tạo ra).
1. Bài tập
Để nghiên cứu kiểu hô hấp của 3 loại vi sinh vật: Pseudomonas aeruginosa,
Escherichia coli và Clostridium sporogenes, người ta cấy sâu chúng vào môi trường
thạch loãng có nước thịt và gan (VF) với thành phần sau (g/l):
Lô A Lô B
Nước chiết thịt : 30g Môi trường như A
Glucozơ : 2g có thêm KNO3 – 1g
Thạch : 6g
Nước cất : 1 lít
Sau khi nuôi ở nhiệt độ phù hợp kết quả thu được như sau:
238
b. Con đường phân giải glucozơ và chất nhận electron cuối cùng trong trường hợp
lô A, lô B của mỗi loại vi khuẩn.
c. Vì sao Ps.aeruginosa ở hai lô lại có sinh trưởng khác nhau? Enzim đặc trưng
trong sự chuyển hoá nitrat là gì?
2. Viết sơ đồ các bước chính:
a. Len men rượu etylic do Sac. Cerevisiae.
b. Len men lactic do Streptococcus lactis.
3. Để định lượng một dung dịch piridoxin chiết từ hạt ngô đang nảy mầm, người ta
chuẩn bị một môi trường dinh dưỡng lỏng chứa tất cả các chất dinh dưỡng cần thiết
cho sự sinh trưởng của chủng Streptococcus faecalis, trừ piridoxin. Phân phối môi
trường này vào 8 ống nghiệm khác nhau, đánh số từ 1 đến 8, sau đó tiến hành:
– Bổ sung vào các ống nghiệm từ 2 đến 6 những thể tích nhất định của một dung
dịch mẹ chứa 2mg/ ml piridoxin chuẩn.
– Bổ sung vào các ống 7 và 8 những thể tích nhất định một dung dịch được chuẩn bị
từ hạt ngô nảy mầm.
– Bổ sung nước cất vào tất cả các ống nghiệm để chúng đạt cùng một thể tích.
– Sau khi cấy vi khuẩn để đạt nồng độ tế bào ban đầu là 105 tế bào /ml, tất cả các
ống ngiệm được giữ trong tủ ấm 370C trong 24 giờ trên máy lắc. Đo sự sinh trưởng
bằng cách đếm khuẩn lạc trên mặt thạch của khay petri, kết quả trong bảng sau:
Ống nghiệm số 1 2 3 4 5 6 7 8
Môi trường dinh dưỡng (ml) 5 5 5 5 5 5 5 5
Dung dịch piridoxin chuẩn (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 0
Dung dịch ngô nảy mầm (ml) 0 0 0 0 0 0 2,5 5
Nước cất (ml) 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2,5 0
Sinh trưởng của vi sinh vật logN 5 5,12 5,24 5,36 5,39 5,40 5,12 5,24
a. Có thể thay thế chủng vi khuẩn Streptococcus faecalis trong thí nghiệm trên bằng
bất kì chủng vi khuẩn nào khác được không? Vì sao?
b. Ống nghiệm 1 có cần thiết không?
c. Các ống nghiệm từ 2 đến 6 có tác dụng gì?
d. Tính nồng độ của piridoxin trong dung dịch chuẩn bị từ hạt ngô nảy mầm.
239
240
CHƯƠNG 3
241
IV. SINH TRƯỞNG TRONG NUÔI CẤY KHÔNG LIÊN TỤC
Nếu bắt đầu từ một tế bào vi sinh vật, sau thời gian của một lứa (g), chúng ta có
2 tế bào, tiếp theo có 4 tế bào... Nên số lượng của chúng tăng theo cấp số mũ : 1(20) →
21 → 22(4) → 23(8) → 24(16) ... 2n.
Trong điều kiện thích hợp nhất, thời gian của một lứa đối với:
– V.parahaemolyticus là 10 phút.
– E.coli là 20 phút (sau 24 giờ sẽ sinh ra số lượng tế bào từ một tế bào ban đầu
có thể đắp thành khối tháp có đáy là 1km2 và chiều cao 1km).
– Vibrio cholerae (vi khuẩn gây bệnh tả) sau 48 giờ tạo được 22.10 24 (cứ 20
phút phân chia 1 lần) tế bào, có khối lượng 22.1024 tấn, tức là nặng gấp 4000 lần chính
trọng lượng Trái Đất.
Chúng ta có thể xác định số lần phân chia trong một đơn vị thời gian (trong
một giờ), tức là số đảo ngược (1/g), ứng với các vi sinh vật kể trên ta có:
– 6 đối với V.parahaemolyticus.
– 3 đối với E.coli.
Nếu trong một đơn vị thể tích lúc đầu có N0 tế bào thì sau n lần phân chia số tế
bào sẽ là : N = N0.2n (1)
Lôgarit hoá ta có : lgN =lgN0 + nlg2 (2)
Từ đó tính được số lần phân chia theo công thức :
lgN − lgN 0
n= (3)
lg2
Số lần phân chia trong một giờ, hay tốc độ sinh trưởng trung bình (µ ) là:
n lgN − lgN 0
µ= = (4)
t lg2(t 2 − t1 )
Nếu các giá trị logN1 (t1), logN2(t2) lấy trong pha log thì ta có µ là cực đại và là
hằng số.
1
Rõ ràng, nếu thời gian của một lứa ( = g ) càng ngắn thì vi khuẩn sinh trưởng
µ
và phát triển càng nhanh. Hằng số tốc độ phân chia phụ thuộc vào loài vi sinh vật và
điều kiện nuôi cấy.
Đồ thị sinh trưởng của quần thể vi sinh vật trong hệ “kín” (nuôi cấy không
liên tục)
242
Hệ "kín" ở đây có nghĩa là trong môi trường không được đổi mới, ta biết trên
môi trường đặc (thạch đĩa) một tế bào vi khuẩn sau 24–48 giờ sẽ tạo thành một khuẩn
lạc.
Sự sinh trưởng trong hệ "kín” theo những quy luật chi phối không chỉ đối với cơ
thể đơn bào mà còn đối với cả cơ thể đa bào nữa.
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của log số tế bào với thời gian gọi là đồ thị sinh
trưởng. Đồ thị này có thể chia làm 6 pha liên tiếp :
a. Pha tiềm phát (lag) : Ở pha này số lượng tế bào (X) không tăng, tức là bằng
dx
X0, đặc trưng khi µ x = 0, khi đó = x.µ x = 0.
dt
b. Pha tăng tốc: Số lượng tế bào tăng dần, do đó µ x tăng dần.
c. Pha cấp số mũ (pha log): Ở pha này x tăng theo thời gian theo cấp số mũ và
lnX tỉ lệ thuận theo t, ở suốt pha này µ cực đại và là cực đại đối với điều kiện nuôi
cấy cụ thể và đối với một chủng vi sinh vật nhất định, ta có µ x là cực đại.
d. Pha giảm tốc: Ở pha này, sự tăng số lượng vi sinh vật trong quần thể x bị
chậm dần, µ x giảm dần, tốc độ sinh trưởng riêng chậm dần.
e. Pha cân bằng động: Số lượng vi sinh vật x đạt đến cực đại và không đổi theo
thời gian, chính ở pha này µ x = 0, tốc độ sinh trưởng riêng bằng 0, vì có một số tế
bào tự phân huỷ cung cấp một số chất dinh dưỡng để một số tế bào tiếp tục phân
chia, nên số lượng tế bào trong quần thể (N) không đổi.
f. Pha suy vong: Ở đây x giảm dần, tế bào tự phân giải do các enzim nội bào và
các chất ngoại bào.
Hình III.1. Đồ thị sinh trưởng của vi sinh vật trong hệ “kín”.
243
Khi nuôi cấy vi sinh vật trong hệ “kín”, tức là môi trường không được đổi mới,
điều kiện môi trường sống bị thay đổi, hàm lượng chất dinh dưỡng cạn kiệt dần, sự
tích luỹ các sản phẩm đã qua trao đổi tăng lên không ngừng, đó là nguyên nhân chính
làm cho pha sinh trưởng cấp số chỉ kéo dài trong một thời gian ngắn, nguyên nhân làm
thay đổi tốc độ sinh trưởng riêng, hình thái và các đặc điểm sinh lí – sinh hoá, điều
này rất bất lợi cho quá trình công nghệ vi sinh, sản xuất công nghiệp. Để tránh sự
“già” của giống, để giữ giống nuôi cấy ổn định trong cùng một trạng thái, ví dụ ở pha
log chẳng hạn, bằng cách đưa liên tục các dung dịch dinh dưỡng vào và đồng thời loại
bỏ một lượng tương đương dịch huyền phù nuôi cấy ra, đó là nguyên tắc cơ bản cho
quá trình nuôi cấy liên tục trong các hệ nồi lên men kiểu chemostat (máy điều chỉnh
bằng phân tích sinh hoá) và turbidostat (máy điều chỉnh bằng con mắt điện).
244
* Các lượng tử bức xạ gây nên những biến đổi hoá học của các nguyên tử và
phân tử có chiều dài bước sóng khoảng 10.000Å, trong đó có ánh sáng mặt trời, tia tử
ngoại, tia X, tia gamma, tia vũ trụ...
Các tác nhân gây đột biến:
Trong môi trường sống quanh ta có rất nhiều nhân tố hoá lí, những sản phẩm
thải ra của hoạt động công nghiệp và đời sống, những nhân tố tiềm tàng gây ung thư,
đang là mối lo ngại khôn lường. Người ta dự tính rằng có khoảng 80% ung thư của
người là do tiếp xúc (hấp thụ, hít thở, ăn uống...) với các tác nhân trên. Hằng năm, có
khoảng một ngàn hợp chất mới tổng hợp được tung ra thị trường thế giới và hàng ngàn
chất được vứt bỏ ra môi trường mà không có khả năng kiểm soát.
Sự thăm dò các tác nhân gây ung thư thường được làm trên động vật, là những
thí nghiệm rất dài (từ hai đến ba năm) và rất tốn kém (tốn khoảng vài triệu đô la).
Trong điều kiện như vậy, người ta tính rằng các thí nghiệm tác nhân gây ung thư lên vi
khuẩn dễ dàng hơn và đỡ tốn kém hơn nhiều lần, mà vẫn đưa ra được những kết luận
cần thiết. Khoảng 90% số chất hoá học đem thử tác nhân gây ung thư, thực tế đã tạo ra
các đột biến.
245
– Xác định và làm tinh khiết prôtêin được tổng hợp.
Có thể nói rất nhiều về ứng dụng và triển vọng của công nghệ di truyền trong
hiện tại và tương lai. Trong lĩnh vực y học phải kể tới interferon, insulin...
Việc tổng hợp insulin là một bước phát triển mới của công nghệ, nó đã giảm rất
nhiều những chi phí trong việc chữa bệnh tiểu đường (đái tháo đường); sự tinh khiết
của insulin đảm bảo tính dung nạp tuyệt vời của nó so với các insulin có nguồn gốc từ
động vật.
1. Nguyên nhân gì làm cho một chủng vi sinh vật cần phải có pha tiềm phát (pha lag)
khi bắt đầu nuôi cấy chúng trong môi trường mới?
2. Hãy tính tốc độ sinh trưởng trung bình và thời gian một thế hệ của một chủng vi
sinh vật, khi nuôi cấy nó tăng từ 5.102 lên 1.108 tế bào trong 12 giờ.
3. Nếu thời gian một thế hệ là 90 phút và quần thể ban đầu khi nuôi cấy gồm 10 3 tế
bào, thì quần thể sẽ là bao nhiêu tế bào sau 8 giờ nuôi cấy trong pha sinh trưởng cấp
số mũ (pha log)?
4. Nuôi cấy liên tục có lợi thế gì và nhược điểm gì so với nuôi cấy không liên tục?
5. Bài tập
Người ta nuôi vi khuẩn Acetobacter suboxydans trên môi trường lỏng chứa các chất
dinh dưỡng phù hợp, trong bình A không có axit para–aminobenzoic (PAB) và
trong bình B có hợp chất này. Ở từng thời điểm người ta tính sự sinh trưởng của vi
khuẩn giấm theo lnN = f(t), kết quả ghi trong bảng sau; biết rằng chỉ có vi khuẩn
phát triển trong môi trường B.
246
8 14,90 17 17,75
a. Hợp chất PAB là loại hợp chất gì và có vai trò như thế nào đối với vi khuẩn giấm
này?
b. Hãy kẻ đồ thị sinh trưởng của vi khuẩn theo hàm số lnN = f(t).
c. Xác định các pha sinh trưởng và ý nghĩa sinh lí của từng pha.
d. Nêu mối liên hệ giữa 2 đại lượng lnNt (logarit N ở thời điểm t) và lnNt + g (logarit
N ở thời điểm t+g). Biết rằng g là thời gian một thế hệ tế bào; t và t+g đều nằm
trong pha log (pha cấp số mũ).
e. Hãy tính hằng số tốc độ sinh trưởng riêng và thời gian một thế hệ của vi khuẩn
này (lấy ln2 = 0,7).
6. Một vi khuẩn hình cầu có khối lượng khoảng 5.10–13 gam, cứ 20 phút lại nhân đôi
một lần. Giả sử nó được nuôi trong các điều kiện sinh trưởng hoàn toàn tối ưu, hãy
tính xem sau một khoảng thời gian là bao lâu khối lượng do tế bào vi khuẩn này
sinh ra sẽ đạt tới khối lượng của Trái Đất là 6.1027 gam? (lấy lg2 = 0,3)
247
CHƯƠNG 4
248
Độc lực của vi sinh vật phụ thuộc vào độc tố và chất trợ độc tố. Ngoại độc tố
(exotoxin) thường do vi sinh vật tiết ra ngoài môi trường sống, như vi khuẩn uốn ván,
bạch hầu, độc thịt.... Ngoại độc tố cũng có tác dụng đặc hiệu như vi sinh vật sinh ra
nó, còn độc tố nằm bên trong tế bào vi sinh vật và chỉ thoát ra ngoài khi tế bào bị tan,
gọi là nội độc tố (endotoxin). Những sai khác chính giữa hai loại độc tố này được trình
bày trong bảng sau:
Những chất trợ lực cho độc tố là những chất chống lại sự bảo vệ của cơ thể,
giúp cho vi sinh vật dễ dàng xâm nhập và phát triển mạnh mẽ trong cơ thể vật chủ.
Muốn gây bệnh, vi sinh vật phải có số lượng nhất định trong cơ thể chủ và phải có
đường xâm nhập thích hợp. Có những vi sinh vật gây bệnh là do chúng kí sinh sinh
sản làm tan tế bào như Plasmodium malariae gây bệnh sốt rét. Lại có những loài
không sống kí sinh trong cơ thể, chúng sống trên các chất thức ăn của người và động
vật, tiết ra các chất độc, gây hại cho người và động vật sử dụng các loại thức ăn này,
như Clostridium botulinum tiết độc tố thịt (botulin) ra canh thịt để lâu ngày. Fusarium
graminerum khi phát triển trên hạt lúa mì, bột mì để lâu, tạo thành đám mốc mầu
hồng, tiết ra chất độc tác động lên hệ thần kinh của người và động vật ăn, gây ra say
249
nôn mửa. Khi cây mọc, nấm cũng mọc theo, tiết vào hạt lúa mì độc tố, nướng cũng
không thể phá huỷ hết được, độc tố này gây viêm hoại tử. Clavicepa purpures nhiễm
trên lúa mạch đen (đôi khi trên lúa mì và đại mạch) tiết độc tố cogotin và cogutaxin
gây bệnh ocgotin (nấm cựa gà)… Một số nấm mốc (đặc biệt Aspergillus flavus) khi
phát triển trên lạc, sắn... sinh ra độc tố aflatoxin; độc tố này gây tổn thương chủ yếu ở
gan, thận và hệ thần kinh, dẫn đến ung thư gan. Nhiều loại nội độc tố (LPS) gây hiện
tượng giảm bạch cầu rất nhanh, chỉ một liều nhỏ tiêm ven đã gây ra chứng giảm 60%
bạch cầu.
Một loại vi khuẩn gây bệnh có độc lực còn là do chúng có một hệ thống enzim
giúp chúng nhanh chóng xâm nhập vào cơ thể chủ, ví dụ rõ nhất ở Staphylococcus
sinh ra các enzim :
– Coagulaza dẫn đến hình thành cục máu đông ở các đường ven, ngăn trở các tế
bào thực bào chui qua và là ổ để vi khuẩn nhân lên.
– Fibrinolyzin làm rời các cục máu và giải phóng các mầm bệnh đi.
Chỉ số LD50 là liều vi sinh vật và độc tố của chúng gây chết 50% động vật được
tiêm (Lethal Dose 50%)
250
Streptomyces) đã tạo ra 60% số chất. Hơn 80% số xạ khuẩn phân lập từ các mẫu đất
vùng Hà Nội nuôi cấy trên ba môi trường cơ bản đã biểu hiện hoạt tính kháng sinh
(Nguyễn Thành Đạt, 1977).
Hình IV.1. Sơ đồ cơ chế tác động chủ yếu của các chất kháng sinh.
251
Tham gia vào quá trình thực bào gồm các loại bạch cầu. Sốt là sự tăng nhiệt độ
trên mức 370C, là cơ chế bảo vệ tự nhiên của cơ thể, do nhiệt độ cao làm tăng tốc độ
hoạt động của các enzim phân giải vi sinh vật, làm tăng hoạt động của interferon và
giảm lượng sắt trong máu, hạn chế sự sinh trưởng của vi sinh vật gây bệnh. Viêm tấy
là hiện tượng do các tế bào (chủ yếu là bạch cầu ưa kiềm) tiết các histamin làm dãn
mạch, giúp máu dồn về nhiều hơn, do đó làm đỏ nơi khu trú nhiều vi sinh vật gây
bệnh; nơi viêm đỏ nóng lên, các bạch cầu trung tính và đại thực bào tăng cường hoạt
động thâu bắt các vi sinh vật gây bệnh, tạo nên sưng tấy và có mủ.
Cơ chế đề kháng đặc hiệu của cơ thể gồm hoạt động của tế bào lympho (T và B)
và các kháng thể, cơ chế đặc hiệu có thể là miễn dịch tế bào (cơ chế tế bào) hay miễn
dịch thể dịch (cơ chế thể dịch).
Các phản ứng miễn dịch có thể được tăng cường nhờ các hợp chất khác nhau
khi thêm vào mà người ta gọi là các tá dược. Các chất này có thể là chất vô cơ nhôm
hiđroxit, nhôm photphat, các chất từ vi khuẩn (BCG) v.v... Chúng làm chậm quá trình
tái hấp phụ của kháng nguyên và do đó làm tăng cường phản ứng viêm nhiễm. Ngược
lại, có một số dược chất (corticoit, các globulin kháng thực bào lympho ...) được sử
dụng trong ung thư học hay trong ghép cấy lại làm giảm tính miễn dịch do chúng tác
động lên tế bào lympho T.
Như vậy là trong phản ứng miễn dịch, các tế bào lympho B và T đều cần thiết
bắt buộc. Sự nhận biết một kháng nguyên là điểm mấu chốt và phải thực hiện nhanh
để cơ thể có chiến lược và sách lược phòng thủ thích hợp nhờ các kháng thể và miễn
dịch tế bào.
Kháng nguyên là chất hoá học có khả năng gây ra trong cơ thể đáp ứng miễn
dịch. Kháng nguyên là các chất lạ như các loại prôtêin, các chất độc thực vật (abin,
rôbin, crotin, rixin, curxin...), các chất độc động vật (nọc rắn, nọc ong, nọc rết), các
loại enzim, các chất có khối lượng phân tử lớn hơn 10.000 Da, các bào quan của tế
bào, ribôsom, thể nhiễm sắc, một số loại polisaccarit. Tuy nhiên, không phải bất kì
chất lạ nào cũng là kháng nguyên. Có loại tự mình nó cũng gây cho cơ thể hình thành
kháng thể đặc hiệu, gọi là kháng nguyên thực (kháng nguyên hoàn toàn), loại khác tự
nó không thể kích thích tổng hợp kháng thể gọi là bán kháng nguyên (haften), mà chỉ
có khả năng phản ứng đặc hiệu với loại kháng thể nhất định sẵn có, ví dụ các bán
kháng nguyên như các haften polisaccarit, axit penicillinic... Khi kháng nguyên không
hoàn toàn liên kết với prôtêin mang thì trở thành kháng nguyên hoàn toàn.
252
Các kháng nguyên có thể được xếp vào hai lớp:
– Các prôtêin và các polipeptit lớn hơn octopeptit.
– Các polisaccarit.
V. KHÁNG THỂ
Như trên đã nêu, miễn dịch có thể là miễn dịch thể dịch hoặc miễn dịch tế bào.
Các kháng thể là những prôtêin được tổng hợp nhờ các tế bào lympho. Các kháng thể
có thể tồn tại dưới dạng các phân tử tự do lưu chuyển trong dịch thể của cơ thể miễn
dịch hoặc dưới dạng phân tử nằm trong màng tế bào chất của các tế bào lympho B. Tất
cả các kháng thể (KT) là loại prôtêin miễn dịch thuộc họ globulin và viết tắt là Ig
(immunoglobulin G). Các Ig là những glucoprôtêin có ít gluxit. Các immunoglobulin
thường có dạng chữ Y.
253
Hình IV.2. Sơ đồ cấu trúc phân tử globulin miễn dịch
Bên trái : Sơ đồ một phân tử kháng thể. H– chuỗi polipeptit nặng (2 chuỗi giống nhau), L –
các chuỗi nhẹ (giống nhau), V (phần gạch) vùng thay đổi của các chuỗi (NH2 điểm
mút). C– vùng không đổi của các chuỗi (COOH điểm mút). SC – điểm kết hợp với
kháng nguyên. Bốn polipeptit được nối với nhau bởi các cầu đisunfit (S–S).
Bên phải : Mô hình phân tử của G. Edelman.
Bốn phân tử polipeptit bằng nhau từng đôi một: có 2 chuỗi nặng khoảng 450
axit amin, hay chuỗi H (heavy chains) và hai chuỗi nhẹ khoảng 200 axit amin, hay
chuỗi L (light chains). Bốn chuỗi được liên kết với nhau nhờ các cầu đisunfit, tạo
thành một đại phân tử có đối xứng hai bên kiểu hình chữ Y. Các kháng thể có khối
lượng phân tử rất lớn từ 160.000 trở lên, khá bền với lạnh và khô, nhưng rất dễ bị phá
huỷ bởi nhiệt, chúng bị hỏng ở 70oC và bởi các enzim như pepxin, tripxin... Như vậy
kháng thể IgG có 3 phần lớn I, II, III. Phần I và II rất giống nhau về khối lượng phân
tử và có trung tâm hoạt động của kháng thể (điểm kết hợp với kháng nguyên) mỗi
phần có một chuỗi nhẹ L và một nửa chuỗi nặng H, còn phần III gồm hai nửa chuỗi
nặng.
Cấu trúc sơ cấp của các vùng cố định của các chuỗi H và L cho phép phân biệt
các Ig thành các lớp và lớp phụ. Người ta biết có 5 loại chuỗi nặng: gamma, mu,
alpha, delta và epsilon. Đặc điểm của 5 lớp chủ yếu của Ig: IgG, IgM, IgA, IgD và
IgE.
254
kháng nguyên (KN) khác nhau. Mặt khác, mỗi phân tử KN với các điểm xác định
KN khác nhau của nó lại có thể kết hợp với rất nhiều phân tử KT. Khi các phân tử
KT tự do cùng có mặt với KN tương ứng thì chúng tạo ra phản ứng kết tủa
(precipitation). Khi các KN được đính trên bề mặt của tế bào (vi khuẩn, hồng cầu...),
các phân tử KT tương ứng đính vào các thụ thể bề mặt này, thì thấy sự ngưng kết
(agglutination) của các tế bào KN.
Như thế là các hình thức tác động của KT rất đa dạng, các hình thức này có thể
là:
– Trung hoà độc tố do kết tủa.
– Ngưng kết các vi khuẩn hay các loại tế bào khác.
– Làm tan các vi khuẩn khi có mặt của bổ thể trong huyết thanh bình
thường.
– Dẫn dụ và giao nộp các vi khuẩn cho quá trình thực bào của các đại thực bào
và tế bào bạch cầu nhờ quá trình biến dụ (opsonization) của các kháng thể.
Hình IV.3. Hiệu quả kết tủa và ngưng kết của các kháng thể
1– Sự kết tủa của các phân tử kháng nguyên, ví dụ một độc tố vi khuẩn,
nhờ các phân tử kháng thể.
2– Sự ngưng kết của hồng cầu mang kháng nguyên màng nhờ các phân tử
kháng thể IgM (các pentame).
Miễn dịch và bệnh lí miễn dịch
a. Miễn dịch tự nhiên (miễn dịch của loài)
Loại miễn dịch này do bản thân loài xác định, phụ thuộc vào các nhân tố tế bào
có mặt ở trong máu và trong các mô khác nhau, chẳng hạn như các nhân tố protêin có
mặt trong máu và trong dịch thể.
+ Các nhân tố tế bào bao gồm :
255
– Các tế bào lympho NK (Natural killer – Tế bào tiêu diệt tự nhiên): chúng nhận
biết và tiêu diệt các tế bào gây bệnh.
– Các tế bào thực bào: chúng thực hiện nội thực bào đối với các tế bào đã chết.
+ Các nhân tố prôtêin có thể xếp vào bốn loại tham gia vào các tình huống khác
nhau của quá trình nhiễm khuẩn :
– Các lyzozye, prôtêinaza làm tan thành vi khuẩn và thường có mặt trong các
chất tiết ra ngoài cơ thể.
– Các interferon, loại prôtêin được sinh ra do tế bào bị nhiễm virut.
– Các prôtêin huyết tương khi bệnh cấp, hợp chất rất khó xác định nguồn gốc,
hợp chất tăng lên hàng trăm lần khi nhiễm khuẩn, những hợp chất này cố định lên
màng các vi khuẩn gây nhiễm.
– Hệ thống bổ thể gồm đến 17 loại prôtêin khác nhau có khả năng tương tác và
kết hợp với các prôtêin của màng một số loài vi khuẩn. Các prôtêin bổ thể bao bọc và
làm tan các vi khuẩn.
b. Miễn dịch thu được (riêng đối với từng cá thể)
Miễn dịch thu được chống lại tác nhân gây bệnh nhất định không chỉ là đặc hiệu
đối với tác nhân gây bệnh này mà còn được kéo dài. Sự kích thích của KN đối với cơ
thể cảm ứng tổng hợp các KT tương ứng diễn ra trong một thời kì có thể trong thời
gian rất dài có bệnh truyền nhiễm, hệ thống miễn dịch bao gồm cả những tế bào ghi
nhớ miễn dịch; chính những tế bào này là cơ sở của phòng bệnh miễn dịch.
Sự kết hợp của KN và KT có tính đặc hiệu cao, nó phụ thuộc vào sự tương tác
của cấu trúc phân tử của KN và KT tương ứng, mối liên kết giữa KN và KT giống như
kiểu liên kết giữa enzim và cơ chất, là những mối liên kết yếu, không đồng hoá trị,
như mối liên kết hiđro, liên kết ion, liên kết Van der wal, liên kết kị nước.
Tất cả các động vật có xương sống là những cơ thể có khả năng tổng hợp một
số lớn các kháng thể khác nhau, thường là hàng triệu kháng thể và là sự đáp ứng đối
với các kích thích của kháng nguyên, kết quả của quá trình tiến hoá. Khả năng của cá
thể có thể tổng hợp nhiều loại prôtêin kháng thể khác nhau đặc hiệu cho sự kích thích
của kháng nguyên làm chúng ta rất ngạc nhiên, nhưng là hiện tượng có thể lí giải được
nhờ kĩ thuật tái tổ hợp invitro của ADN. Các kháng thể được mã hoá bởi các gen thuộc
về 4 loại V, J, D và C nằm trong hệ gen của động vật, các đoạn gen thuộc về một trong
bốn loại có thể tổ hợp ngẫu nhiên và do đó có thể sinh ra hàng triệu gen khác nhau (S
Tonegawa nhận giải thưởng Nobel về y học năm 1987). Người ta tính rằng, nhờ có
quá trình tái tổ hợp di truyền khác nhau mà hệ thống miễn dịch có thể sản sinh được
1012 tế bào lympho, khoảng 1 tỉ các KT khác nhau.
256
Như vậy các hiện tượng miễn dịch thu được có thể tóm tắt vào sơ đồ sau:
Miễn dịch
Miễn dịch thu được tự nhiên Miễn dịch thu được nhân tạo
1. Vi sinh vật gây bệnh đặc trưng (BPS) và vi sinh vật gây bệnh cơ hội (BPO) là gì?
Vi khuẩn, vi sinh vật và vi trùng là thuật ngữ giống nhau?
2. Ngoại độc tố và nội độc tố, cho ví dụ bệnh và vi sinh vật gây bệnh.
3. Miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào, cho ví dụ.
4. Miễn dịch tự nhiên và miễn dịch nhân tạo, cho ví dụ.
5. Kháng nguyên: đặc điểm, cho ví dụ. 6–Haften là gì?
7. Kháng thể: cấu trúc phân tử?
8. Phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể.
257
9. Sự khác biệt giữa tế bào lympho B và T.
10. Bệnh tự miễn là gì, cho ví dụ?
11. Điền vào chỗ dấu chấm :
a– Bệnh viêm gan B là do một loại virut truyền chủ yếu qua đường......
b– Một hợp chất gọi là ....... khi nó làm chết toàn bộ tế bào, còn hợp chất gọi là....
khi nó chỉ tiêu diệt một số loại vi sinh vật nhất định.
c– Các kháng sinh penixillin và........ được đặc trưng bởi cấu trúc vòng
β –lactam và chúng ức chế sự tổng hợp........ vi khuẩn.
d– KN của thành tế bào vi khuẩn Gram âm là............ còn ở đầu tiên mao là..........
12. Các câu sau đúng hay sai, giải thích?
a– Nước lã đun sôi 100o C là đủ để diệt tất cả các mầm vi sinh vật gây bệnh.
b– Nước javel (hipochlorit natri) sẽ mất tác dụng nếu lạm dụng thường xuyên.
c– Xà phòng là chất diệt khuẩn.
d– Vi sinh vật gây bệnh là vi sinh vật kí sinh.
13. Người ta tính rằng ở Việt Nam có đến 70% số tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus)
mới phân lập từ bệnh phẩm có khả năng kháng lại penixilin gốc.
a– Sự nhờn thuốc này thường có nguồn gốc từ plasmid. Vậy plasmid là gì?
b– Sự có mặt của plasmid cho phép tụ cầu tổng hợp một loại phân tử mới, đó là chất
gì?
c– Để tránh sự nhờn thuốc người ta phải làm gì trong điều trị?
258
CHƯƠNG 5
259
PHẦN THỰC HÀNH CHUYÊN ĐỀ 3 (3 TIẾT)
1. Thí nghiệm 1: Cách làm tiêu bản sống và tiêu bản cố định nhuộm màu
Cách chuẩn bị một số loại vi sinh vật (VSV): vi khuẩn hiếu khí và kị khí, nấm
mốc, nấm men, xạ khuẩn
1.1. Chuẩn bị dịch huyền phù VSV
– Nếu VSV nuôi trên môi trường đặc: Dùng que cấy vòng lấy một ít tế bào
VSV, đưa vào thành trong của ống nghiệm chứa 5ml nước cất vô trùng, vừa mài nhẹ
vào thành ống nghiệm vừa chấm vào mặt nước để phân tán đều các tế bào vào nước
tạo ra dịch huyền phù VSV.
– Nếu VSV nuôi trong môi trường dịch thể chỉ cần lắc đều dịch trong môi
trường lỏng (có thể pha loãng bằng nước cất vô trùng).
a. Phương pháp làm tiêu bản giọt ép
+ Lấy một phiến kính khô và sạch đặt lên cầu rửa trong chậu rửa.
+ Dùng pipet hoặc que cấy lấy lên phiến kính một giọt dịch huyền phù VSV.
+ Đậy lá kính nhẹ nhàng lên giọt dịch huyền phù VSV, tránh tạo bọt khí.
+ Thấm nhẹ lớp dịch trào ra xung quanh lá kính bằng giấy thấm.
+ Quan sát tiêu bản ở hệ kính khô (× 10; × 20; × 40; × 60). Nếu cần soi ở hệ
kính dầu thì nhỏ lên lá kính một giọt dầu seđre (hoặc dầu khoáng).
b. Phương pháp làm tiêu bản ép lam
Loại tiêu bản này thường được dùng để nghiên cứu sự sắp xếp của tế bào một
cách tự nhiên trong khuẩn lạc như hình dạng cuống sinh bào tử, chuỗi bào tử của xạ
khuẩn hay nấm mốc. Có thể ép lam theo một số cách thông dụng sau.
260
1. Đổ môi trường và hộp 2. Dùng khoan nút chai 3. Dùng pinset hoặc que
petri vô trùng thành một (φ = 5–10mm) khoan cấy lấy một khối thạch
lớp mỏng (2mm), để môi trường thành các khối lên phiến kính. Cấy ria
nguội. thạch nhỏ. VSV xung quanh khối
thạch.
4. Dùng pinset vô trùng úp 5. Đặt tiêu bản lên que 6. Gói hộp lồng vào túi
một lá kính vô trùng lên thuỷ tinh bẻ cong trong nilon vô trùng, để vào tủ
khối thạch. hộp lồng vô trùng ẩm ấm ở nhiệt độ, thời gian
(Cách chuẩn bị hộp lồng thích hợp... Bào tử của
vô trùng ẩm: Miếng giấy nấm hoặc xạ khuẩn khi
lọc được thấm nước và phát triển sẽ lan sang
đặt ở đáy hộp, trên miếng mép lá kính. Khi quan
giấy đặt một thanh thuỷ sát lấy tiêu bản ra khỏi
tinh bẻ cong, thanh trùng hộp lồng đặt lên bàn
ở nồi áp suất ở 1210C kính và quan sát dưới hệ
trong 30 phút). kính khô.
Hình dạng tự nhiên của nấm mốc hoặc xạ khuẩn cũng có thể quan sát trực tiếp
khi nuôi cấy trên lớp môi trường đặc mỏng và không màu ở hộp petri hay ống nghiệm,
hay dùng phương pháp xẻ rãnh khối thạch trong hộp petri.
c. Làm tiêu bản vi sinh vật nhuộm màu
261
Để quan sát hình thái của các tế bào vi sinh vật được rõ hơn, người ta thường
dùng các phương pháp nhuộm đơn hoặc nhuộm kép tế bào bằng thuốc nhuộm. Hầu hết
các thuốc nhuộm là các loại muối, trong đó có một ion mang màu.
+ Nếu ion mang màu là ion dương của muối thì gọi là thuốc nhuộm kiềm,
ngược lại ion màu là ion âm thì gọi là thuốc nhuộm axit. Các thuốc nhuộm kiềm
thường dùng là xanh metylen, tím gentian, tím kết tinh, safranin, fuchsin kiềm...
Chúng thường liên kết với các thành phần mang điện tích âm của tế bào. Xanh
metylen nhuộm tế bào tế bào chậm (mất khoảng 30 – 60 giây), tím kết tinh nhuộm
màu nhanh hơn (10 giây), còn fuchsin kiềm chỉ cần 5 giây. Trong môi trường trung
tính, điện tích của tế bào vi khuẩn thường âm cho nên nó bắt màu mạnh với các
thuốc nhuộm bazơ. Bởi vậy trong thực hành vi sinh thường sử dụng các thuốc
nhuộm bazơ.
+ Các thuốc nhuộm axit thường dùng là êozin, eritrozin, nigrozin, fuchsin axit...
thường liên kết với các thành phần mang điện tích dương của tế bào.
Nhuộm đơn là nhuộm tế bào bằng một loại thuốc nhuộm. Toàn bộ tế bào bị bắt
màu đậm của thuốc nhuộm đó, bởi vậy cách nhuộm này thường dùng để quan sát hình
dạng tế bào vi sinh vật.
Nhuộm kép là nhuộm tế bào bằng hai hay nhiều loại thuốc nhuộm. Phương
pháp nhuộm kép thường dùng trong nghiên cứu cấu tạo tế bào vi sinh vật.
Nhuộm màu tế bào sống: Thường nhuộm tế bào bằng các dung dịch thuốc
thuốc nhuộm loãng như xanh metylen hay fuchsin (1 : 1000), hoặc đỏ côngô 3%, hay
đỏ trung tính 0,001%.
Cách nhuộm: Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm lên phiến kính đ dùng que cấy đưa vào
đó một ít vi sinh vật đ trộn đều đ đậy lá kính đ giữ khoảng 1–2 phút đ quan sát.
+ Muốn nhuộm màu nấm sợi trước hết phải nhỏ 1–2 giọt lactophenol lên tiêu
bản để thấm ướt sợi nấm đ nhỏ tiếp 1–2 giọt thuốc nhuộm đ đậy lá kính, đ giữ 1–2
phút đ quan sát.
d. Làm tiêu bản cố định nhuộm màu
Thực chất đây là phương pháp nhuộm tế bào sau khi đã giết chết chúng. Ưu
điểm của phương pháp này là: VSV độc cố định tại vùng nhất định trên phiến kính ít
bị rửa trôi khi rửa hoặc tẩy màu, hơn nữa tế bào đã chết bắt màu nhanh và rõ, thuận
tiện khi soi ở hệ kính dầu và có thể giữ được thời gian lâu hơn tiêu bản nhuộm sống.
262
Quy trình nhuộm gồm các bước sau:
1. Lấy 1 giọt nước sạch (50 –100µ l) đặt 2. Chuẩn bị giọt huyền phù VSV trên
lên phiến kính. phiến kính như đã hướng dẫn ở trên.
3. Dùng que cấy hoặc lá kính dàn mỏng 4. Hong khô vết bôi trong không khí.
giọt dịch huyền phù thành một vùng nhất
định trên phiến kính.
5. Cố định vết bôi: Thường cố định bằng 6. Dùng pipet nhỏ lên vết bôi một vài
cách hơ nhẹ trên ngọn đèn cồn: đưa vết giọt thuốc nhuộm, giữ trong khoảng 1–
bôi nhanh qua ngọn đèn cồn 2–3 lần 2 phút.
(Hoặc bằng một số các dung dịch hoá
chất như trong phần phụ lục).
Tránh hơ quá nóng dễ làm biến dạng hình
thái và cấu trúc của tế bào VSV.
263
8. Thấm khô tiêu bản.
2. Thí nghiệm 2: Quan sát vi khuẩn trong khoang miệng, quan sát nấm men
rượu hoặc nấm váng dưa cà để quá chua, nấm mốc đen ở vỏ cam quýt, cơm, bánh mì
để mốc.
a. Quan sát hình dạng các loại vi sinh vật trong cao răn.
Khu hệ vi khuẩn trong cao răng rất đa dạng và phong phú, dễ dàng quan sát
bằng nhuộm tiêu bản cố định.
Cách làm: Lấy một giọt nước cho lên phiến kính, dùng tăm vô trùng lấy một ít
cao răng hoà vào giọt nước, sau đó tiến hành làm tiêu bản theo phương pháp nhuộm
tiêu bản cố định. Quan sát ở hệ kính dầu (có thể tham khảo hình ở phần đầu).
b. Quan sát hình thái nấm men Saccharomyces:
Hình thái tế bào và kiểu sinh sản nảy chồi của nấm men rất dễ quan sát bằng tất
cả các phương pháp trên, nhất là phương pháp nhuộm tiêu bản cố định.
264
và cơ quan sinh bào tử vô tính của cácVSV này.
Yêu cầu thấy rõ hệ sợi của chúng (sự phân nhánh, sợi có vách ngăn hay không
có vách, nguyên sinh chất có chuyển động hay không), cuống sinh bào tử (tế bào gốc
nơi xuất phát cuống, hình dạng, kích thước cuống sinh bào tử, có vách ngăn hay không
có, có màu sắc hay trong suốt...), hình dạng của tế bào sinh bào tử (hình dạng, xuất
phát trực tiếp từ cuống sinh bào tử hay từ bọng đỉnh giá, hình dạng của bọng đỉnh giá,
tế bào sinh bào tử mọc trực tiếp trên bọng đỉnh giá, hay qua một lớp cuống (melatue),
hình dạng bào tử, bề mặt bào tử…).
Để quan sát rõ hơn hình thái cuống sinh bào tử của Aspergillus và Penicillium
có thể làm như sau:
+ Lấy lá kính đã chuẩn bị bằng phương pháp ép lam (hoặc dùng que cấy vòng
lấy một khóm nấm mốc có đủ hệ sợi cơ chất, hệ sợi khí sinh và cơ quan sinh bào tử
đính lên phiến kính).
+ Nhỏ một vài giọt lactophenol lên nấm mốc đ dùng que cấy đập nhẹ, kĩ cho
bào tử của nấm mốc tách ra khỏi cuống sinh bào tử của chúng đ Đậy lá kính đ soi ở hệ
kính khô (× 40).
Cấu tạo quan sinh bào tử trần Cấu tạo quan sinh bào tử trần
ở Penicillium (× 400) ở Aspegillus (× 400)
Hình dạng cơ quan sinh bào tử trần ở nấm mốc
– Cũng có thể quan sát các VSV gây bệnh trên thực vật hoặc quan sát hình dạng
các tế bào nguyên sinh động vật trong nước cỏ khô bằng một trong các phương pháp
trên.
265
BÀI 2: SỰ CHUYỂN HOÁ CÁC CHẤT Ở VI SINH VẬT
Các vi sinh vật: phân giải mạnh prôtêin là các loại vi khuẩn: Bacillus (B.
mycoides, B, mésentericus, B. subtilis..), Pseudomonas fluorescens, Proteus vulgaris,
E. coli, Clotridium putrificum, C. sporogenes. Các loại nấm mốc (Asperigillus,
Trichoderma, Cladosporium, Alternaria...), xạ khuẩn...
Quá trình phân giải prôtêin của VSV được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất các
sản phẩm lên men truyền thống và lên men công nghiệp sản xuất mắm tôm, mắm cá,
nước chấm, nước mắm... Trong thiên nhiên, đây là quá trình phân giải các chất nitơ
hữu cơ thành các hợp chất nitơ vô cơ dinh dưỡng cho thực vật.
Đặt thí nghiệm:
Vật liệu, hoá chất: Thịt hoặc tôm, cá; bình tam giác 100ml; giấy quỳ hồng;
dung dịch 10% chì axetat; dung dịch Nesler; dung dịch 5% KNO2.
Tiến hành thí nghiệm:
+ Lấy 3 – 5g thịt hoặc cá (cắt nhỏ) vào bình tam giác, thêm khoảng 1g đất
trồng, khoảng 50ml nước.
+ Để trên miệng bình các giấy chỉ thị sau để xác định một số sản phẩm phân
huỷ:
– Một dải giấy quỳ hồng để xác định sự có mặt của NH3.
– Một dải giấy lọc tẩm dung dịch 10% chì axetat để xác định sự có mặt của H2S
(các axit amin có chứa S (xistein, xistin…) khi bị VSV phân giải sẽ tạo ra H2S).
266
+ Đậy nút bông để ở nhiệt độ từ 28 – 35oC.
Sau 1 ngày quá trình phân huỷ prôtêin đã xảy ra tạo ra mùi hôi thối đặc trưng.
Sau 5 – 7 ngày, các miếng thịt đã có thể nát vụn, môi trường lên men đổi màu.
Kiểm tra kết quả:
Xác định các sản phẩm lên men
+ Xác định sự có mặt của NH 3: Nếu giấy quỳ hồng biến thành màu xanh chứng
tỏ có NH3 bay ra.
+ Xác định sự có mặt của N H 4+ trong dịch lên men: nhỏ một giọt dịch phân huỷ
lên bản sứ, thêm một giọt dung dịch Nesler. Nếu có mặt N H 4+ dung dịch Nesler
chuyển từ màu vàng trong sang vàng sẫm.
+ Xác định sự có mặt của H2S: Quan sát màu của miếng giấy lọc tẩm axetat chì,
nếu có H2S được giải phóng từ dịch lên men giấy sẽ hoá đen do tạo thành sunfua chì:
H2S + Pb(CH3COO)2 đ PbS ↓ + 2CH3COOH.
Quan sát VSV: Lấy một giọt dịch phân huỷ làm tiêu bản nhuộm màu cố định để
quan sát các vi sinh vật.
267
Một số vi khuẩn phân giải prôtêin
268
– Đổ một ít môi trường Getchinson vào bình nón dung tích 150ml (dày khoảng
2cm), thêm 0,5g đất trồng và một mẩu phấn nhỏ (bằng hạt đậu xanh). Gấp một miếng
giấy lọc thành hình nón hoặc hình gấp nếp đặt vào môi trường trong bình tam giác, sao
cho một phần giấy lọc chìm trong môi trường, phần còn lại nằm trong không khí. Đậy
nút bông lên miệng bình và để ở 20 – 250C trong 10 – 15 ngày. Sự phân huỷ giấy lọc
sẽ xảy ra mạnh ở vùng tiếp xúc giữa không khí và môi trường. Có thể nhìn thấy các
khuẩn lạc vi sinh vật mọc tại vùng này.
Kiểm tra kết quả
– Quan sát sự phân huỷ của giấy lọc tại vùng có các khuẩn lạc vi sinh vật
– Làm tiêu bản vi sinh vật từ các khuẩn lạc mọc trên vùng giấy lọc và quan sát.
2. Thí nghiệm 2: Lên men rượu etanol
Bản chất: Khi phân huỷ đường trong điều kiện kị khí VSV chuyển hiđro từ
NADH sang axetanđehit tạo thành rượu etylic để tái tạo NAD. Sản phẩm tạo thành
rượu etylic và CO2.
C6H12O6 → CH3COCOOH → CH3CHO → C2H5OH + CO2 + 113,4kJ
VSV lên men: Quá trình lên men rượu chủ yếu là do các nấm men chi
Saccharomyces (S.cerevisiae, S.elipsoideus.) hay Schizosaccharomyces (Schiz.
pombe…) thực hiện. Ngoài ra, một số loài nấm mốc Mucor (M. rouxi) hay vi khuẩn
Sarcina ventriculi cũng có khả năng lên men etylic.
Tiến hành thí nghiệm xác định khả năng lên lên men rượu:
* Vật liệu
+ Chuẩn bị dịch lên men: Để quá trình lên men xảy ra tốt nhất, dùng dịch lên
men có thành phần: 15% nước đường, 0,5% pepton, 0,3% KH2PO4 và 0,1% MgSO4.
Cũng có thể dùng dung dịch 10% đường hoặc dung dịch 10% đường bổ sung 1%
(NH4)2SO4. Đun sôi để nguội.
+ Nấm men: dùng 10% dịch nuôi cấy nấm men S. cerevisiae thuần, hoặc bánh
men thuốc bắc tán nhỏ.
+ Dụng cụ: Bình lên men Smith cải tiến; nếu không có có thể dùng chai bia có
nút kín.
* Hoá chất: dung dịch 10% Ba(OH)2; dung dịch 20% NaOH; iot tinh thể ở dạng
bột; H2SO4 đậm đặc; dung dịch kali đicromat (K2Cr2O7).
* Tiến hành lên men như sau:
Cách 1: Lên men trong bình Smith cải tiến
269
+ Cho dịch lên men vào bình lên men được đậy bằng nút cao su nối với ống thuỷ
tinh uốn cong, một đầu được nhúng chìm vào ống nghiệm chứa đầy nước úp ngược
trong một lọ đầy nước ống nghiệm có thể chia độ sẵn.
+ Đặt các bình thí nghiệm vào 30 – 35oC, sau vài giờ lên men CO2 thải ra sẽ đẩy
cột nuớc trong ống nghiệm tụt xuống.
Cách 2. Cho dịch lên men vào chai bia, dập nút kín lại, để 24 – 36 giờ, khi mở
nút chai thấy bọt khí CO2 nổi mạnh lên.
Phân tích kết quả thí nghiệm:
Xác định cường độ lên men rượu: Cường độ lên men rượu có thể xác định dựa
vào luợng CO2 thoát ra hoặc hàm lượng etanol được tạo thành từ một thể tích môi
trường xác định trong một thời gian nhất định. Thông thường người ta dùng phương
pháp xác định theo hàm lượng CO2 vì nó dễ dàng xác định hơn hàm luợng rượu etylic.
270
– Nếu đặt thí nghiệm trong bình Smith (cách 2): đánh giá mức độ thải CO2 bằng
mức tụt của cột nước trong ống nghiệm.
+ Định tính rượu etylic bằng phản ứng tạo màu với dung dịch kali đicromat
(K2Cr2O7):
Lấy vào ống nghiệm 1 – 2ml dung dịch đã lên men,1 – 2ml H2SO4 đậm đặc rồi
thêm từng giọt dung dịch 1% K2Cr2O7, lắc đều. Nếu trong dung dịch phản ứng có mặt
rươu etylic sẽ xuất hiện màu xanh lam, do phản ứng của rượu etylic với K 2Cr2O7 theo
phương trình:
2K2Cr2O7 + 8H2SO4 + CH3CH2OH → KCr(SO4)2 + CH3COOH + 11H2O
Ống đối chứng: Làm tương tự như trên song thay 1 – 2ml dịch lên men bằng 1 –
2ml dịch chưa lên men. So sánh sự thay đổi màu ở hai ống thí nghiệm và đối chứng.
+ Phát hiện etylic bằng phương pháp chưng cất: Thay ống thuỷ tinh bẻ cong
của bình lên men Smith bằng ống thuỷ tinh thẳng đứng rồi đun trên ngọn đèn cồn cho
sôi lăn tăn. Rượu etylic sẽ bốc hơi thoát ra ngoài. Dùng diêm châm lửa lên đầu ống
thuỷ tinh, nếu có rượu etylic bay ra sẽ cháy thành ngọn lửa xanh.
Xác định sự có mặt của nấm men:
Dùng que cấy lấy một vòng dịch lên men làm tiêu bản bằng phương pháp
nhuộm đơn tế bào. Tế bào Saccharomyces có hình cầu hay ovan, nảy chồi.
3. Thí nghiệm 3: Lên men lactic, làm sữa chua, muối dưa cà
Bản chất: Khi phân huỷ đường trong điều kiện kị khí, VSV lactic chuyển hiđro
từ NADH sang axit pyruvic để tái tạo NAD+, sản phẩm tạo thành axit lactic.
NADH NAD+
C6H12O6 → CH3COCOOH CH3–CHOH–COOH + Q
Căn cứ vào sản phẩm sinh ra, quá trình lên men lactic được chia thành hai kiểu:
– Lên men lactic đồng hình:
+ Bản chất: Các vi khuẩn lactic đồng hình chuyển hoá đường tạo thành sản
phẩm chủ yếu là axit lactic (95%).
+ VSV lên men: là giống Streptococcus (S. cremoris, S. lactis, S.thermophillus)
và Lactobacillus (L. bulgaricus, L. acidophillus, L. cucumerris, L. plantarum...).
– Lên men lactic dị hình:
+ Bản chất: Khi lên men các vi khuẩn chỉ tạo ra 60% axit lactic, phần còn lại là
axit axetic, rượu etylic, glyxerin và một vài sản phẩm khác.
+ VSV lên men: L. brasicar fermentatae, Leuconostoc mesenteroides, E. coli...
271
Đặt thí nghiệm lên men lactic:
a. Lên men rau quả:
+ Rau cải (hay bắp cải, su hào, cà,...) rửa sạch, phơi trong chỗ râm để loại bớt
nước.
+ Đổ dung dịch nước 6% muối vào vại (sành sứ hoặc thuỷ tinh), có thể bổ
sung 5% đường làm nguồn cacbon dễ hấp thụ lúc đầu cho các vi khuẩn lactic.
+ Cho rau vào vại, nén rau chìm hẳn trong dung dịch trên. Để ở chỗ ấm hoặc tủ
ấm 30 – 350C trong 2 – 3 ngày. Vi sinh vật có mặt trên rau, củ sẽ lên men đường chiết
rút từ tế bào, làm chua rau quả. Vì vậy nếu quá trình lên men lactic xảy ra tốt, dưa
không bị nát, có màu vàng, thơm đặc trưng của dưa muối.
b. Lên men sữa thành sữa chua:
Sữa tươi là cơ chất thích hợp nhất cho lên men lactic, vì trong sữa tươi đã có từ
10 – 200T axit lactic (10T = 0,009g axit lactic), tạo điều kiện thuận lợi cho các vi
khuẩn lactic phát triển và lên men. Khi lên men sữa tươi có thể thêm 1% đường.
+ Rót sữa tươi vào cốc đong → đun sôi nhẹ để thanh trùng (85 – 870C trong 5 –
10 phút hoặc 90 – 920C 2 –3 phút).
+ Bổ sung tỉ lệ 10% giống vi sinh vật thuần chủng (S. cremoris,
S. lactis, S. diacetylacetíc, L. acidophyllus... đã nhân giống ở môi trường sữa.), hoặc
sữa chua thành phẩm loại tốt → khuấy đều → đậy bằng nilon sạch → buộc kĩ → để ở
nhiệt độ từ 30 – 350C khoảng 5 – 7 giờ, sữa bắt đầu đông tụ.
+ Giữ ở 5 – 100C trong 10 – 12 giờ cho prôtêin trong sữa dãn nở, giảm độ ẩm tự
do làm sản phẩm trở nên mịn.
+ Nếu làm bằng sữa hộp thì không cần phải cho đường, chỉ pha sữa vừa uống để
nguội 400C, cho một thìa sữa chua thành phẩm Vinamilk khuấy đều rồi đổ ra cốc.
Phân tích kết quả thí nghiệm:
Định tính sự có mặt của axit lactic:
+ Phản ứng tạo axetanđehit: Cho 10ml dịch lên men dưa chua vào cốc đong
dung tích 50ml, thêm vào đó 1ml dung dịch 10% axit H2SO4, 2ml dung dịch 5%
KMnO4. Tẩm dung dịch AgNO3 trong NH4NO3 vào một miếng giấy lọc, đậy lên
miệng cốc và đun sôi trên ngọn đèn cồn. Quan sát sự chuyển màu của giấy lọc. Nếu có
mặt của axit lactic, phản ứng sẽ xảy ra và tạo thành axetanđehit. Axetanđehit tác dụng
với hỗn hợp AgNO3 trong NH4NO3 tạo ra chất làm đen giấy lọc. Phương trình phản
ứng:
2KMnO4 + 3H2SO4 → K2SO4 + 2MnSO4 + 3H2O + 5O (1)
5CH3CHOHCOOH + 5O2 → 5CH3CHO + 5CO2 + 5H2O (2)
272
Quan sát VSV: Làm vết bôi từ dịch nước dưa chua hay sữa chua → cố định trên
ngọn đèn cồn → nhuộm đơn → quan sát ở vật kính dầu.
273
Chịu trách nhiệm xuất bản:
Giám đốc ĐINH NGỌC BẢO
Tổng biên tập LÊ A
Kĩ thuật vi tính:
ĐÀO PHƯƠNG DUYẾN
Thiết kế bìa:
274