TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.

HCM

KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC

----------

----------

BÀI GIẢNG

THỰC HÀNH HOÁ SINH

Biên soạn: TS. Nguyễn Hoài Hương CN. Bùi Văn Thế Vinh

Tp. Hồ Chí Minh, 04/2009

Lời mở đầu
Bài giảng “Thực hành sinh hoá” dành cho sinh viên năm thứ hai khoa Môi trường & Công nghệ Sinh học, trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM. Với thời lượng 30 tiết và tuỳ thuộc điều kiện, cơ sở vật chất của phòng thí nghiệm cho phép, sinh viên tiến hành làm 5 bài thực hành gồm các nội dung chính của học phần lý thuyết sinh hóa cơ sở. 1. Giới thiệu phòng thí nghiệm sinh hóa, cách pha chế các dung dịch chuẩn độ và các dung dịch đệm; 2. Định lượng đường khử bằng phương pháp acid dinitro-salicylic (DNS); 3. Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl; 4. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford; 5. Xác định hoạt tính enzyme amylase.

2

sắp xếp lại dụng cụ. phương trình phản ứng. rất thận trọng khi sử dụng dung môi dễ cháy nổ và hóa chất độc hại. micropipet. Máy đo pH 7. viết tay gồm nguyên tắc. . Nếu nghỉ học có lí do chính đáng thì sinh viên phải xin phép giáo viên sắp xếp cho làm thí nghiệm bù. thiết bị thì phải bồi thường. sinh viên mới được làm thí nghiệm. lớp cử một tổ trực nhật có nhiệm vụ nhắc nhở các bạn giữ vệ sinh chung và làm sạch PTN sau giờ thí nghiệm. Máy khuấy từ 5. bảng kết quả thô. tuân thủ nội quy và điểm các bài báo cáo.. giữ sạch nơi làm thí nghiệm.Sinh viên phải có mặt đủ và đúng giờ trong các buổi thí nghiệm. . burette. công thức tính và kết quả tính cùng các ý kiến giải thích hay nhận xét. Yêu cầu đối với sinh viên làm thí nghiệm: .Sau khi thí nghiệm. Làm vỡ hoặc gây hư hỏng dụng cụ. Máy đo so màu quang phổ 3. lau sạch bàn thí nghiệm và bàn giao cho cán bộ phòng thí nghiệm. Cân điện tử 2.Trong PTN phải mặc áo blouse. Hướng dẫn sử dụng một số thiết bị trong phòng thí nghiệm 1. 2. tiết kiệm hoá chất.Cuối mỗi buổi thí nghiệm sinh viên phải nộp bản báo cáo kết quả thí nghiệm cho giáo viên hướng dẫn.Sinh viên phải đọc kỹ.BÀI 1: CÁCH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH CHUẨN ĐỘ VÀ CÁC DUNG DỊCH ĐỆM 1.Mỗi bài thí nghiệm sẽ có điểm. nắm vững nội dung bài thí nghiệm và chuẩn bị sẵn bản báo cáo kết quả trước khi đến phòng thí nghiệm (PTN). phương pháp. sự hiểu bài. cẩn thận. Viết báo cáo ngắn gọn. .. Bộ chưng cất Kjendahl (hoặc máy cất nitơ tự động) 4. Trước buổi thí nghiệm giáo viên hướng dẫn sẽ kiểm tra việc chuẩn bị của sinh viên. bình Kjendahl.Khi làm thí nghiệm phải trật tự. . pipet. Thiếu một bài thí nghiệm coi như chưa hoàn tất chương trình. Điểm môn học sẽ gồm điểm thực hành thao tác. Máy ly tâm 6. sơ đồ tiến hành thí nghiệm. Đạt yêu cầu. . 3 . . sinh viên phải rửa dụng cụ. Mỗi buổi thí nghiệm. Các dụng cụ thủy tinh khác: bình định mức.. . hóa chất đúng chỗ.

Zn . Nếu làm văng lên da. 4 .. khẩu trang khi làm việc với dung dịch kiềm đậm đặc Thao tác trong tủ hút. găng tay và kính bảo vệ mắt. thiết bị bảo vệ hệ thống hô hấp. halogen.. sử dụng khẩu trang và găng tay để tránh phòng khi văng acid Các acid dạng hơi (HCl) thao tác trong tủ hút và mang găng tay. axit mạnh. Kim loại Na. axit mạnh. Oxit canxi rất ăn da. luôn phải cho axit vào nước trừ phi được dùng trực tiếp Giữ để axit không bắn vào da hoặc mắt bằng cách đeo khẩu trang. halogen. Chỉ sử dụng cồn khô khi tạo dung dịch natri alcoholate. An toàn khi làm việc với kiềm Kiềm có thể làm cháy da. Tạo hơi ăn mòn khi cháy. khẩu trang. An toàn khi làm việc với axit: Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nóng axit hoặc thực hiện phản ứng với các hơi axit tự do Khi pha loãng. . cần bảo vệ da mắt. Natri và kali hydroxyt: rất ăn da. phản ứng cực mạnh với nước. phản ứng mạnh với chất oxy hoá. ẩm. An toàn khi làm việc với axit và kiềm 1. Hơi amoniac dễ cháy. đường hô hấp do dễ nhiểm bụi oxit. Ca: phản ứng cực mạnh với nước. 2. phản ứng cực mạnh với nước. Li. dẫn xuất clo của hydrocacbon. kính bảo hộ. cho vào từ từ. tiến hành phản ứng.. 4. Chuẩn bị thí nghiệm 1.3. cho từng viên hoặc ít bột vào nước chứ không được làm ngược lại. Tương tự khi hoà tan với nước. lập tức rửa ngay bằng một lượng nước lớn Luôn phải đọc kỹ nhãn của chai đựng và tính chất của chúng H2SO4: Luôn cho acid vào nước khi pha loãng. Cần mang dụng cụ bảo vệ da mắt. Pb. CO2. mang găng tay cao su. Amoniac: là một chất lỏng và khí rất ăn da. Các biện pháp an toàn như trên.. Amoni hydroxyt: chất lỏng ăn da. và muối của chúng. Tránh tạo tinh thể cứng khi hoà tan. tạo hỗn hợp nỏ với nhiều kimloại nặng: Ag. K. trong phòng thí nghiệm được gọi là hóa chất thí nghiệm. làm tiêu bản. mang mặt nạ chống độc để phòng ngừa bụi và hơi kiềm. Hoá chất thí nghiệm: Các hoá chất dùng để phân tích. mắt gây hại nghiêm trọng cho hệ hô hấp Mang găng tay cao su. đồng thời phải làm lạnh nhanh.

điều kiện bảo quản. Cách sử dụng và bảo quản hoá chất: Khi làm việc với hóa chất.Hóa chất phải được sắp xếp trong kho hay tủ theo từng loại (hữu ơ. lỏng (H2SO4. nơi sản xuất. (CH3COO)2. muối.. mức độ sạch. 5 . nhân viên phòng thí nghiệm cũng như sinh viên cần hết sức cẩn thận. C2H2 . Những điều cần nhớ khi sử dụng và bảo quản hóa chất được tóm tắt như sau: .Sạch hóa học (PC): độ sạch > 99% Hóa chất có độ tinh khiết khác nhau được sử dụng phù hợp theo những yêu cầu khác nhau và chỉ nên sử dụng hóa chất còn nhãn hiệu 2. NaOH. khối lượng tịnh. NH3. Nhãn hiệu hoá chất: Hóa chất được bảo quản trong chai lọ thủy tinh hoặc nhựa đóng kín có nhãn ghi tên hoá chất. .. công thức hóa học.) hay theo một thứ tự a..Sạch phân tích (PA): độ sạch < 99% . bazơ. b.. ethanon. 3.Hoá chất có thể ở dạng rắn (Na. N2.) hoặc khí (Cl2. c để khi cần dễ tìm. chloroform..Sạch kỹ thuật (P): độ sạch > 90% .. tạp chất.) và mức độ tinh khiết khác nhau: . tránh gây những tai nạn đáng tiếc cho mình và cho mọi người. kim loại.. MgO. . vô cơ.. KCl. acid.. khối lượng phân tử. aceton.

. Khi cần sử dụng các hóa chất dễ bốc hơi. phải đưa vào tủ hút. cổ chai.Khi làm việc với chất dễ nổ.Các loại hóa chất dễ bị thay đổi ngoài ánh sáng cần phải được giữ trong chai lọ màu vàng hoặc nâu và bảo quản vào chổ tối. Lưu ý các kí hiệu cảnh báo nguy hiểm. tránh bụi bẩn lọt vào làm hỏng hóa chất đựng trong chai. . .Chai lọ hóa chất phải có nắp. (%) 6 . muối trong phòng thí nghiệm là dung dịch nước. chú ý đậy kín nắp sau khi lấy hóa chất xong. Hàm lượng chất hòa tan trong dung dịch thể hiện ở nồng độ dung dịch. Nếu chất hòa tan ở dạng rắn thì gọi là chất tan.Tất cả các chai lọ đều phải có nhãn ghi. .. Trường hợp bị hóa chất vào miệng hay dạ dày. Không hút acid hay base bằng miệng mà phải dùng các dụng cụ riêng như ống bóp cao su.Dụng cụ dùng để lấy hóa chất phải thật sạch và dùng xong phải rửa ngay. Dung dịch Dung dịch là hỗn hợp của hai hay nhiều chất tác động tương hỗ với nhau về mặt vật lý và hóa học. base. Trường hợp bị bỏng với acid hay base rửa ngay với nước lạnh rồi bôi lên vết bỏng NaHCO3 1% (trường hợp bỏng acid) hoặc CH3COOH 1% (nếu bỏng base).. Phần lớn các dung dịch acid. dễ cháy không được để gần nơi dễ bắt lửa. . nếu là base phải súc miệng và uống nước lạnh có CH3COOH 1%. phải đọc kỹ nhãn hiệu hóa chất trước khi dùng.. phân tích và tính toán khác nhau. Trước khi mở chai hóa chất phải lau sạch nắp.Không hút bằng pipette khi chỉ còn ít hóa chất trong lọ. Mỗi cách sẽ tiện dụng trong chuẩn bị. Nếu bị bắn vào mắt. Tùy theo tính chất của dung môi mà phân thành dung dịch nước và dung dịch khan.Khi làm việc với acid hay base mạnh: Bao giờ cũng đổ acid hay base vào nước khi pha loãng (không được đổ nước vào acid hay base). . 5. Trong dung dịch gồm có chất hòa tan và dung môi. không dùng lẫn nắp đậy và dụng cụ lấy hóa chất. 1. có mùi. Một số chất khác tan trong dung môi hữu cơ. nếu là chất lỏng thì gọi là dung chất. Có nhiều cách biểu thị nồng độ khác nhau. dội mạnh với nước lạnh hoặc NaCl 1%. dùng xong phải trả đúng vị trí ban đầu. không ngửi hay nếm thử hóa chất. . dùng dung môi là nước. Các đơn vị nồng độ dung dịch * Nồng độ phần trăm. nếu là acid phải súc miệng và uống nước lạnh có MgO.

Cách pha dung dịch có nồng độ xác định * Pha dung dịch có nồng độ phần trăm theo khối lượng. Ví dụ: dung dịch KOH 0.5N là trong 1000ml dung dịch chứa 0.thể tích. .5H2O.Microgam phần trăm. % (v/v): là số ml dung chất có trong 100ml dung dịch. Ví dụ: Dung dịch KH2PO4 M/15 là trong 1000ml dung dịch chứa M/15 phân tử gam KH2PO4 * Nồng độ đương lượng gam. Ví dụ: dung dịch gycerine 10% (v/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10ml glycerin * Nồng độ gam-lit.Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO4. 7 . Ví dụ: dung dịch CuSO4 10% (w/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10g CuSO4 . (Mol/L) hay M: là số phân tử gam (hay số mol) chất tan trong 1 lít dung dịch.. 12H2O. hòa tan ta được 500g dung dịch NaOH 40% . cân 200g NaOH và đong 300 ml nước cất.) Khi pha dung dịch cần phải tính thêm lượng nước kết tinh có sẵn. % (w/w) . Ví dụ: dung dịch NH4Cl 5% (w/w) là trong 100g dung dịch có chứa 5g NH4Cl .Phần tỷ. ppb: số µg chất hòa tan có trong 1kg hay 1 lít dung dịch.khối lượng.Nồng độ phần trăm khối lượng .Chất tan là chất rắn khan: Ví dụ: 1) Pha 500g dung dịch NaOH 40% (w/w) 100g dung dịch cần 40g NaOH 500g dung dịch cần Xg? Lượng NaOH cần để pha dung dịch : X= (40*500)/100= 200g Lượng nước cần thiết: 500-200=300g (hay 300ml) Vậy. % (w/w): là số gam chất tan có trong 100g dung dịch. ppm: số mg chất hòa tan trong 1kg hay 1 lít dung dịch.Miligam phần trăm.Phần triệu..Nồng độ phần trăm thể tích . .Nồng độ mg/mL: số mg chất tan trong 1mL dung dịch .5đlg KOH * Nồng độ dung dịch bảo hòa: là khối lượng tối đa chất hòa tan trong dung dịch.Nồng độ % khối lượng thể tích (w/v): là số g chất tan có trong 100ml dung dịch. mg%: mg chất hòa tan trong 100g dung dịch.Phần nghìn.. 2. µg%: là số µg chất hòa tan trong 100g dung dịch. . Na2HPO4. * Nồng độ phân tử gam hay nồng độ mol.. Ngoài ra trong các phép phân tích vi lượng còn có một số đơn vị nồng độ khác như: . . (g/L): là số gam chất tan có trong 1 lít dung dịch. (N): là số đương lượng gam (đlg) chất tan có trong 1 lit dung dịch. 0/00: số g chất hòa tan trong 1000g dung dịch.

Tra cứu những số liệu này trong "Sổ tay các hiện tượng hóa lý". Nếu chất tan tan hết. cân 50g NaCl. Muốn pha dung dịch bão hòa cần phải biết độ tan tối đa của chất tan (nồng độ bão hòa). hòa tan và định mức thành 1 lít bằng nước cất. hòa tan ta được 320g dung dịch CuSO4 10%. chuyển sang bình định mức.Chất tan dạng lỏng: Một số chất tan ở dạng lỏng như HCl.Ví dụ: 2) Pha 320g dung dịch CuSO4 10% (w/w) từ CuSO4.. mỗi loại dung môi khác nhau thì nồng độ bão hòa của mỗi loại chất tan sẽ khác nhau. cân 50g CuSO4. Ở mỗi nhiệt độ khác nhau. * Pha dung dịch có nồng độ % theo thể tích .5H2O M(CuSO4) = 160 và M(CuSO4. Na2HPO4. cứ như thế cho đến khi chất tan không còn tan được nữa. thêm chất tan và tiếp tục khuấy. chất tan không tan hết lắng xuống thì phần dung dịch phía trên là dung dịch bão hòa... Ví dụ: 3) Pha 1 lít dung dịch NaCL 5% (w/v) Lượng NaCl cần để pha dung dịch: X = (5*1000)/100 = 50g Vậy. dùng nước cất hòa tan và định mức đến thể tích đúng. Nếu cho thêm chất tan vào dung dịch bão hòa thì lượng chất tan đó không tan được nữa và sẽ lắng xuống. 8 .Chất tan là chất rắn khan Cân lượng chất tan cần thiết.. đong 250ml nước cất và 250g dd NaOH 10%. hòa tan ta được 500g NaOH 5% . .Pha dung dịch bão hoà: Dung dịch bão hòa là dung dịch có lượng chất tan tối đa.) Khi pha dung dịch ta cần phải tính đến lượng nước kết tinh có sẵn giống như ở phần a..Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO4.5H2O) = 250 Lượng CuSO4 khan để pha dung dịch là: X = (10*320)/100 = 32g Lượng CuSO4. .5H2O. Nếu sau khi khuấy. 12H2O.5H2O cần dùng: Y = (250*32)/160 = 50g Lượng nước cất thêm vào: 320 -50 = 270g (hay ml) Vậy. đong 270ml nước cất. thêm một ít nước cất và khuấy cho tan. ta được 1lít dung dịch NaCl 5%. . H2SO4 . .Pha dung dịch loãng từ một dung dịch đậm đặc hơn: Ví dụ: 3) Pha 500g dung dịch NaOH 5% từ dung dịch NaOH 10% Lượng NaOH cần để pha dung dịch 5% là: X = (5*500)/100 = 25g Lượng dung dịch NaOH 10% cần dùng là: Y = (100*25)/10 = 250g Lượng nước cất thêm vào: 500-250 = 250g Vậy.Cách pha nhanh dung dịch bão hòa khi không tra được số liệu từ bảng: Lấy chất tan cần pha vào becher.5H2O.

lắc để hòa tan hoàn toàn và đưa nước cất tới mức.1M. Do đó khi pha các dung dịch từ các loại hóa chất nàyta phải chú ý đến nồng độ của dung dịch đậm đặc.4)/37 = 11. M: khối lượng chất lỏng cần cân. HCl . H3PO4 65%. Cho vào từng lượng nước cất nhỏ. lắc để trộn đều đồng nhất. Dung dịch nồng độ 1M là dung dịch chứa 1ptg chất hòa tan trong 1 lít. Ví dụ: 5) Pha 440ml dung dịch HCl 1% từ dung dịch HCl 37% (d=1. Khi phải đun nóng dung dịch để hòa tan.9g = 11. cho vào bình định mức 1000. và 430ml nước cất ta được 440 ml HCl 1% Do việc sử dụng các loại bình định mức làm cho việc pha chế dung dịch thí nghiệm trở nên đơn giản và chính xác vì vậy ngày nay đa số các dung dịch thí nghiệm được pha chế theo nồng độ khối lượng .thể tích (w/v). * Pha dung dịch nồng độ phân tử gam Mol (M) hay phân tử gam (ptg) là khối lượng của các chất tính ra gam bằng khối lượng phân tử của nó. dùng ống đong lấy 10ml dung dịch HCl37%. Ví dụ: 6) Pha 1 lít dung dịch KOH 1M Phân tử lượng của KOH: MKOH = 39 +16 +1 =56 Lượng KOH để pha 1 lít dung dịch 1M là: 56g Vậy. Giới hạn hòa tan tối đa được tính bằng % thể tích và thay đổi tùy theo loại hóa chất. cân 56g KOH. hoặc quá trình hòa tan có toả nhiệt thì phải chờ nhiệt độ trở lại bình thường (nhiệt độ không khí) rồi mới thêm nước tới vạch định mức. Nếu muốn pha dung dịch 2M. cần làm nguội dung dịch trước khi định mức thành 1 lít. Ví dụ như H2SO4 . Đây là phản ứng tỏa nhiệt. ta tính khối lượng phân tử chất đó ( hoặc tra bảng) theo đơn vị gam. Muốn pha dung dịch nồng độ 1M của một chất nào đó.4g Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là : Y = (100*4. NH4OH .9/1. d: tỷ trọng chất lòng Chú ý: Các hóa chất lỏng bán trên thị trường thường không ở dạng nguyên chất mà là các dung dịch đậm đặc.05M ta cũng tiến hành tương tự với lượng cân tương ứng. 0.Việc cân không thuận lợi.19 = 10 ml Lượng nước cất thêm vào:440-10 = 430ml Vậy.19g/ml) Lượng HCl cần để pha dung dịch 1% là: X= (1*440)/100 = 4. Chuyển dung dịch sang bình chứa. 3M hay 0.25%. có thể đưa về đơn vị thể tích theo công thức V = M/d V: Thể tích chất lỏng.96%. 9 .37%. hòa tan trong 1 ít nước. qua phễu cho vào bình định mức có dung tích 1 lít. Cân chính xác lượng chất tan.

65/1. Trường hợp chất rắn có ngậm nước. đong 83ml HCl 37% cho vào bình định mức 1000 có sẵn 1 ít nước.+ H2O 1ptg HCl cho ra 1 ion gam H+. vậy 1 N (HCl) = 1M (HCl) 1ptg NaOH cho ra 1 ion gam OH-.5*100)/37 = 98. Tính N theo công thức trên.75g KCl. ptg chất đó phải tính luôn cả khối lượng các phân tử nước. hòa tan trong 1 ít nước.+ Na+OH.5 Lượng HCl 37% để pha dung dịch 1M là: X = (36.5 = 36. định mức đến vạch. cho vào bình định mức 500.+ 2 (Na+OH-) → 2 Na+SO42. * Nồng độ đương lượng gam (N) Dung dịch nguyên chuẩn là dung dịch có nồng độ 1N Đương lượng gam(đlg) được định nghĩa theo mỗi trường hợp riêng biệt từ phương trình phản ứng dùng để định phân. Định mứ c thành 1 lít.19 = 83ml Vậy. Ví dụ: 9) Phản ứng giữa HCl và NaOH H+Cl.Đlg của một base là khối lượng chất đó để tạo ra trong phản ứng 1 ion gam OH-. vậy 1N (NaOH) = 1M (NaOH) Ví dụ: 10) Phản ứng giữa H2SO4 và NaOH 2H+SO42.Ví dụ: 7) Pha 500ml dung dịch KCl 3M Phân tử lượng của KCl: MKCl = 39 +35.Đlg của một axit là khối lượng chất đó để tạo ra trong phản ứng 1 ion gam H+.→ Na+Cl.5 Lượng KCl để pha 500ml dung dịch 3M là: X= (74. ta phải tính toán dựa vào nồng độ dung dịch đó. Tiến hành pha trong tủ Hotte vì hơi acid bay lên rất độc hại. Ví dụ: 8) Pha 1 lít dung dịch HCl 1M từ HCl 37% Phân tử lượng HCl: MHCl = 1+35.vậy 1N (NaOH) = 1M (NaOH) Số ion gam tạo ra từ 1 ptg được gọi là hệ số nguyên chuẩn độ (ký hiệu là n) N= M/n Phản ứng oxy hoá khử: Tùy theo số điện tích trao đổi ở từng phản ứng mà hệ số n khác nhau. Định phân acid.65g Hay 98.+ 2H2O 1ptg H2SO4 cho ra 2 ion gam H+ vậy 1N (H2SO4) = 2 M (H2SO4) 1ptg NaOH cho ra 1 ion gam OH. .5 = 74.base: . Nếu chất tan là dung dịch.5 *3*500)/1000 = 111. cân 111. Ví dụ: 11) 2 Na2S2O3 + I2 → Na2S4O6 + 2 NaI 10 .75g Vậy.

* Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Đối với các chất dễ thay đổi thành phần khi ở dạng rắn. Na2S2O3 dễ bị mất nước tinh thể khi để ngoài không khí. vì vậy phải kiểm tra nồng độ thực của các dung dịch pha sẵn dựa vào các dung dịch có nồng độ chính xác được gọi là dung dịch chuẩn (fixanal) * Dung dịch chuẩn Dung dịch chuẩn là các dung dịch được chuẩn bị sẵn.. acid oxalic.. Ví dụ: 12) NaOH thường nhiễm một lượng Na2CO3 rất dễ chảy nước. Na2S2O3. . vì vậy sau khi pha phải hiệu chỉnh lại nồng độ. .I2 + 2e → 2I2 S2O32. ta phải dùng ống chuẩn. các hóa chất không tinh khiết hay bị hút ẩm.Đối với các hợp chất bền vững. hứng lên phểu vào bình định mức. dung môi bay hơi. Ong chuẩn là một ống ampun thủy tinh hay nhựa đóng kín. đảm bảo chính xác và được dùng để định chuẩn các dung dịch tự pha chế khi làm thí nghiệm. . 3. Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Khi pha hóa chất. Bên trong chứa một lượng cân chính xác chất tan hoặc dung dịch chất tan. HCl. . sau đó hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch dựa vào phản ứng với một dung dịch chuẩn thích hợp. Các chất dùng trong dung dịch chuẩn phải khá bền vững sao cho nồng độ của chúng không thay đổi nhanh chóng theo thời gian. có thành phần không thay đổi như NaCl. Pha dung dịch chuẩn. pha loãng và định mức tới thể tích đúng.Đối với các chất như NaOH.-2e → S4O62Trong phản ứng này n =1 nên N = M/1 = M Việc pha dung dịch nồng độ đương lượng gam (N) cũng tương tự với cách pha dung dịch nồng độ phân tử gam (M)... nếu muốn pha dung dịch có nồng độ chính xác. Khi chuyển hết lượng chất tan trong ống vào bình định mức và pha thành 1 lít ta được dung dịch chuẩn có nồng độ đã ghi trên nhãn ngoài ống. do các chất này thường không bền vững và dễ thay đổi thành phần. có nhiều nguyên nhân làm cho nồng độ dung dịch không chính xác như việc cân đong không chính xác. có thể pha dung dịch chuẩn trực tiếp bằng cách cân chính xác chất cần pha. ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng. không thể pha ngay được dung dịch chuẩn. vừa thêm nước cất vừa lắc và đưa nước cất tới vạch mức. HCl dễ bay hơi. 11 . Thời gian tàng trữ lâu nên chất tan bị thăng hoa. dùng bình tia rửa sạch chất tan có trong ampun vào bình định mức 1 lit. AgNO3. bị oxy hóa.Dùng đinh thủy tinh chọc thủng ampun. * Cách pha dung dịch chuẩn từ ống chuẩn .

Dung dịch đệm: Dung dịch đệm là dung dịch tạo môi trường ổn định pH cho dung dịch.1 = 10/11 = 0. mỗi lần sử dụng lại phải xác định lại hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Xét một phản ứng trung hòa acid .091/0.+ H3O+ 12 . Nghĩa là pH thay đổi rất ít. Nếu thêm vào dung dịch 0. Về nguyên tắc thì phối hợp các loại đệm có các khoảng đệm khác nhau thành 1 dung dịch là không có vấn đề gì. thêm ba giọt chỉ thị màu phenolphtalien.base.Ví dụ: Pha dung dịch NaOH 0.1 N từ NaOH rắn và dùng dung dịch chuẩn H2SO4 0. Các phản ứng thường thấy là phản ứng tạo kết tủa hay tạo phức hoặc oxy hóa khử. chọn cặp acid .1N. dung dịch sẽ cân bằng dạng như sau: CH3COOH + H2O -----> CH3COO. Dung dịch KOH 0. Có dung dịch chứa hỗn hợp 1 acid yếu (Ví dụ: acid acetic) với muối của nó (Ví dụ: muối natri acetate). 1 ion gam H+ sẽ phản ứng với 1 ion gam OH-. dung dịch đệm đóng vai trò quan trọng.75. thì phản ứng sẽ đạt điểm cân bằng khi thể tích hai chất bằng nhau C1V1 = C2V2 Nếu gọi Cp là nồng độ dung dịch định pha và Ct là nồng độ thực của dung dịch ta có hệ số hiệu chỉnh K: K= Cp/Ct = Vp/Vt Ví dụ: 13) Dung dịch chuẩn là H2SO4 0.base CH3COOH (0. Thí dụ.091 N Hệ số điều chỉnh K: K= 0.05N tron cồn phải dung dung dịch chuẩn là H2SO4 0. ví dụ như ổn định pH của máu bằng các hệ đệm carbonate và phosphate.1N Lấy 10ml H2SO4 0.1N cho vào erlen.91 6.1N để chuẩn độ lại.1)/11 = 0. để có đệm pH ở giá trị 4. thường gồm một acid yếu và một base yếu với tỉ lệ của chúng sẽ quyết định pH của dung dịch. Tuy nhiên sử dụng các đệm nào còn tùy thuộc vào ứng dụng sao cho thành phần của đệm không phản ứng với các cấu tử trong hệ phản ứng khảo sát theo chiều hướng có hại.001 mol HCl thì pH của hệ vẫn chỉ ở mức 4. Trong cơ thể sống. dung dịch định pha là NaOH 0.05N Đối với các dung dịch dễ thay đổi trong quá trình bảo quản. Vậy nếu dùng dung dịch acid và dung dịch base có cùng nồng độ N.75.1M)/CH3COONa (0.748 gần bằng 4. Việc pha dung dịch đệm tuân theo nguyên tắc chọn cặp acid – base có hằng số phân ly pK A/B gần với pH đệm muốn pha và phối trộn chúng với số mol bằng nhau.1M). dùng burette định phân bằng NaOH được 11 ml NaOH Vậy nồng độ thực tế NaOH đã pha là : Ct = (10*0.

50 8.78 7. ion hidroni H3O+ trung hòa OH.60 6.80 9.01 g C6H8O7.20 8.0 2.94 8.1M (a): 21.50 3.75 8.6 0.40 9.25 1.5 b 3.50 7.2 0.00 7.0 b 27. .0 pH 8.00 5.Dung dịch acid boric (a): 12.8 .2H2O hòa tan và dẫn nước đến 1000 ml.0 13 a 23.50 pH 3.cho base yếu H2O.09 7.00 4.00 8.11 9.69 8.00 9. chứa hỗn hợp base yếu (Ví dụ: amoniac) với muối của nó (Ví dụ: muối amoni clorua).Có dung dịch khác chẳng hạn.41 8.00 b 3.00 10.08 a 6.70 9. acid điện li cho H3O+ (cân bằng chuyển dịch theo chiều thuận).60 8.98 9. Dung dịch đệm citrate có giá trị pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml dung dịch (b) theo bảng sau: A 46.6 1.10H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml Dung dịch đệm borat có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và dung dịch (b) theo bảng dưới đây: A 9. Kết quả pH của dung dịch tăng không đáng kể.00 7.30 2. * Dung dịch đệm borat: .H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml.00 4.00 pH 6.trong dung dịch cân bằng có dạng sau: NH3 + H2O ----------> NH4+ + OHDung dịch đệm có pH thay đổi rất ít khi thêm một lượng acid hoặc base.50 5.70 7.51 8.41 g C6H5O7Na3.50 6. Trái lại.Dung dịch trinatri citrate 0.00 0.00 5.50 5.00 2.00 1.2) .00 8.0 1.84 8. khi thêm một lượng base mạnh (OH-).Dung dịch borat (b): 19.00 b 0.1M (b): 29.24 *Dung dịch đệm citrate (pH = 3.50 7.50 6. base liên hợp kết hợp với nó cho acid yếu (cân bằng chuyển dịch theo chiều nghịch) pH của dung dịch giảm không đáng kể.88 7.60 7.00 3.0 pH 4.36 7.50 4. Khi thêm một lượng acid mạnh (H3O+).31 8.50 2.0 – 6. .404 g H3BO3 hòa tan và định mức đến 1000 ml.Dung dịch acid citric 0.77 7.50 4. Khả năng đệm của hỗn hợp đệm phụ thuộc vào hàm lượng acid và base liên hợp có trong hỗn hợp.108 g Na2B4O7.

0 67.0 5.6 20.Dung dịch kali dihydrophosphate 1/15M (b): 9.0 6.3 7.0 19.0 7.4 3.0 81.7 pH 6.5 68.5 49. a 93.5 53.0 – 8.0 18.0 5.0 4.5 3.8 a 45.43.7 11.0 15.Dung dịch dinatri hydrophosphate 0.0 72.0 36.8 7.0 37.6 7.7 85.00 10.0 87.7 – 8. .0 94. Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml dung dịch (b).8 40.5 37.Dung dịch mononatri orthophosphate 0.5 93.6 5.7 g Na2HPO4.5 6. Dung dịch đệm phosphate có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml dung dịch (b) định mức đến 200 ml.4 6.5 31.0 12.5 32.2 5.50 8.0 19.5 56.2 4.0 16.6 5.4 7.5 6.8 6.6 6.0 90.8 g NaH2PO4 hòa tan và định mức đến 1000 ml.0 81.2 3.0 87.0 10.5 22.12H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml.0 77.5 18.0 pH 5.0 25.2M (b): 53.0 b 6.5 26.6 5.0 13.00 5.0 35.0 13.5 8.4 .5 42.05 g Na2HPO4.3 38.5 77.0 28.2 - *Dung dịch đệm phosphate (pH = 5.2M (a): 27.5 7.7H2O hoặc 71.5 51.0 61.0 23.2 7.2 - 29.0 39.20 10.8 4.0 22.30 b 55.0 31.5 62.9 6.4 4.0) .2 5.0 16.5 7.07 g KH2PO4 hòa tan và định mức đến 1000 ml.6 3.5 92.2 6.8 14 a 372 492 612 726 818 b 628 508 388 274 182 pH 6. .4 5.7 7.0 13.9 7. a 10 18 30 49 79 b 990 982 970 951 921 pH 5.4 5.50 7.9 8.5 73.0 6.5 91.12H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml.1 7.0 84.1 6.8 9.0 33.0 33.9 g Na2HPO4.7 6.0 34.0 17.8 5.8 - 5.3 15.6 6.0 *Dung dịch đệm Na2HPO4 – KH2PO4 (pH = 5.2 40.Dung dịch dinatri hydrophosphate 1/15M (a): 23.0) .0 7.3 6.8 7.0 89.0 24.2 7.0 28.

4 2.8 4.6 – 5.8 ml HCl đặc (37%) pha thành 1000 ml.0 10.3H2O được hòa tan và định mức đến 1000 ml.01g glycine hòa tan và định mức đến 1000 ml.6 *Dung dịch đệm acetate (pH = 3.5 8.8 pH 8.6 7.Dung dịch acid acetic 0.4 3. X 5.2 39.4 pH 3.3 44.0 14.4 44.8 12.2 *Dung dịch đệm Glycine – NaOH (pH = 8.0 41.4 885 936 969 115 64 31 7.0 4.2 15 a 20.6) .8 10. a 46.6 3. Dung dịch đệm Glycine có pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X ml dung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml.6) .0 8.2 pH 4.8 b 3.4 8.0 5. X 4.8 24.2 6.01g glycine hòa tan và định mức đến 1000 ml.0 6.2 M (b): 8 g NaOH hòa tan và định mức đến 1000 ml.0 35.2 M (a): 15.121 184 264 879 816 736 6.Dung dịch HCl 0.2 M (b): 16.0 9.0 X 16.2 – 3.4 10.6 – 10.0 6.0 13.8 8.6) .0 6.7 6.Dung dịch glycine 0.5 41. .8 9.0 *Dung dịch đệm Glycine – HCl (pH = 2.0 36. .2 3.6 2. Dung dịch đệm Glycine có pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X ml dung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml.5 pH 9.4 .2 11.0 pH 2. Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào X ml dung dịch (a) và Y ml dung dịch (b) và định mức đến 100 ml.4 72.2 pH 3.6 45.2 9.2M (a): 11.2 M (a): 15.2 32.2 5.6 3.0 38.8 5.2 32.2 g CH3COONa.4 X 22.2M (b): 16.8 2.8 b 30.Dung dịch glycine 0. .Dung dịch NaOH 0.55 ml CH3COOH đặc và định mức đến 1000 ml.6 8.0 9.0 16.8 10.4 g CH3COONa hoặc 27.Dung dịch natri acetate 0.6 9.

(c) với thể tích bằng nhau nhận được dung dịch đệm 0.5 4.8 đến pH = 12. (b). . 16 .1M (c): hòa tan 6.1M có pH = 1. Các dung dịch đệm vạn năng nồng độ khác được chuẩn bị tương tự. Trộn lẫn các dung dịch (a). .6 4.18 g acid ortho-boric trong nước cất và định mức đến 1000 ml.0 bằng cách bổ sung dung dịch NaOH 1N (d).2 5.7 ml CH3COOH đặc và định mức bằng nước cất đến 1000 ml.Dung dịch acid phosphoric 0.4 4.5 25.5 19.1M (b): 6.45 ml H3PO4 đậm đặc và định mức bằng nước cất đến 1000 ml.8.6 *Dung dịch đệm vạn năng 0.30. Điều chỉnh giá trị pH của dung dịch đệm trong khoảng pH = 1.Dung dịch natri hydroxide 1N (d): hòa tan 40 g NaOH trong nước cất và định mức đến 1000 ml.1M .Dung dịch acid ortho-boric 0.5 24. .Dung dịch acid acetic 0.8 45.1M (a): 5.

đun hỗn hợp cách thủy trong bình cách thủy có lắp ống làm lạnh không khí.. ..) mà cách chuẩn bị dung dịch nghiên cứu dùng để định lượng đường có khác nhau đôi chút. 2. Trong trường hợp này không cần kết tủa protein bằng chì acetate vì lượng protein chuyển vào dung dịch không nhiều. Dụng cụ . Nghiền cẩn thận với bột thủy tinh hay cát sạch và 30 ml nước cất nóng 70 – 80oC. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Tiếp đó thêm nước cất tới vạch mức và đem lọc qua giấy lọc vào cốc hay bình khô... Nước lọc dùng làm dung dịch thí nghiệm. kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch chì acetate [Pb(C2H2O2)2..Trường hợp nguyên liệu chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin như khoai lang. Tránh dùng quá dư chì acetate (dùng 2 – 5 ml chì acetate). sắn.hóa chất: 1 Dụng cụ .. nhưng nguyên tắc chung như sau: . khế. Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS).. dứa. để yên hỗn hợp 10 phút. cần chiết đường bằng rượu 70 – 80oC.Trường hợp nguyên liệu thí nghiệm không chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin. Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức dung tích 1000 ml. lá hoặc quả khô. quả. chanh. khoai tây. Do đó cần xác định riêng đường khử và riêng saccharose. Đun cách thủy 70 – 80oC trong 35 – 40 phút.. Cân và cho vào cối sứ 1 g nguyên liệu hạt hay các mẫu thí nghiệm thực vật khô như cây. cần chú ý là trong quá tình đun khi chiết. Sau đó loại bỏ lượng chì acetate dư bằng dung dịch Na2SO4 bão hòa. Tùy đối tượng nghiên cứu (hạt.. ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ACID DINITRO-SALICYLIC (DNS) 1. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.3H2O] hoặc chì nitrate [Pb(NO3)2] 10%.. có thể chiết đường từ nguyên liệu bằng nước.Bình định mức 50ml 17 . quả tươi) thì cân 5 – 10 g.BÀI 2.0. Nếu là nguyên liệu tươi (như hoa. Trước khi đun cách thủy hỗn hợp phải trung hòa acid bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa tới pH 6. đã được nghiền nhỏ (và sấy khô đến khối lượng không đổi). đường saccharose có thể bị thủy phân một phần.4 – 7. .Trường hợp các nguyên liệu chứa nhiều acid hữu cơ như cà chua...

8 0.0 Từ các ống nghiệm trên lấy 1ml ở mỗi ống vào 5 ống nghiệm khác và thêm vào mỗi ống 3ml thuốc thử DNS.8.4 Ống 3 0. Để lắng cặn khi đem làm hiện màu.0 1. Cho tiếp 10ml cồn 800 vào cốc đựng bã. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng.6 9.2 0. Sau khi cho bay hơi rượu.8 Ống 5 1.Mẫu rau quả chứa đường (rau cải ngọt.04 mg glucose do glucose bị oxy hóa.6 0. 0. Đường thẳng thu được có thể cắt trục hoành ở 0. Pha loãng mẫu nếu cần sao cho mật độ quang nằm trong khoảng 0.2.4 9.6 Ống 4 0. .0 mg glucose. 1. Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang.2 9. 0. đun sôi 2 lần trên nồi đun cách thủy→ Để nguội → lọc (lặp lại 2 lần) Đưa phần bã lên lọc và rửa bằng rượu nóng (800) Rượu qua lọc được cho bay hơi ở trong phòng hoặc trên nồi cách thủy đun nhẹ. Đun sôi đúng 5 phút. Trong mỗi ống nghiệm sẽ chứa tương ứng 0.Thuốc thử DNS . 0.6. So màu rồi vẽ đồ thị mẫu (vẽ trên máy tính) Làm tương tự với mẫu dung dịch đường được chuẩn bị ở trên và một mẫu thử không (nước cất) 4. Hóa chất .4. Tính kết quả Từ phương trình đồ thị đường cong chuẩn tính được % lượng đường trong mẫu vật.8. khuấy đều. Tiến hành . mẫu có thể để lâu trong bình hút ẩm.nguyên liệu . Cặn khô trong cốc được pha loãng thành 50ml với nước cất. Và tuỳ theo nồng độ đường nhiều hay ít mà pha loãng thêm 5-10 lần.Chiết xuất đường trong thực vật 5g rau cải ngọt → nghiền nhỏ → cho vào becher 100ml + 10ml cồn 900 → đun cách thủy (sôi 3 lần) → khuấy đều bằng đũa thủy tinh → để nguội → lọc (chỉ gạn lấy phần trong).2 – 0. Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm với đối chứng là nước.4 0. trục hoành là nồng độ glucose.8 9. 18 .Dung dịch glucose chuẩn 3.Dựng đường cong chuẩn và xác định hàm lượng đường Cho vào 5 ống nghiệm sạch với các chất có thể tích như bảng sau Hoá chất Glucose (10 mg/ml) Nước cất (ml) Nồng độ Ống 1 0.0 9.2 Ống 2 0.2. dứa) .

K.1N 2NH4OH + H2SO4 → (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 dư .Bình cất đạm .Bi thủy tinh .Bình Kjeldahl phá mẫu .Chuẩn độ H2SO4 dư bằng NaOH 0.. Mg... CaO. carbon và hidro của acid amine tạo thành CO2 và H2O.Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác.1N H2SO4 dư + NaOH → Na2SO4 + H2O 2. Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau: 2H2SO4 → 2H2O +2SO2↑+ O2 ... là nitơ phi protein. Nitơ không có trong thành phần protein như của các muối vô cơ.Ống dẫn khí . chuyển thành dạng oxide: P2O5. Dụng cụ + Bộ chưng cất Kjeldahl định lượng Nitơ gồm: . các base purine và pyrimidine.Bình hứng (becher 250ml) . còn nitơ được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4 Các nguyên tố P.Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. các peptid. Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein .Bếp đun 19 .BÀI 3.NH3 bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH4OH rơi vào bình hứng. .. K2O.. bình hứng chứa H2SO4 0.. MgO.Ống sinh hàn . các alkaloid. các acid amin tự do. Nguyên tắc Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nitơ tổng số.hóa chất a.Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH (NH4)2SO4 + 2 NaOH = Na2SO4 +H2O + 2NH3↑ .. Dụng cụ . acid nitric. Ca. ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL 1. urea và các dẫn xuất của urea. Nitơ có trong thành phần acid amine của protein là nitơ protein. Ví dụ các protein bị thủy phân thành acid amine.

Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100 ml. khi thấy dung dịch gần như trong suốt thì có thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở trên thành bình còn chưa bị oxi hoá vào trong dung dịch. đậy kín để khoảng 3 phút. cho tiếp 5ml H2SO4 đậm đặc sẽ thấy xuất hiện màu nâu đen (do nguyên liệu đã bị oxi hóa).1N chuẩn + NaOH 0. dùng nước cất vô đạm tráng lại bình Kjeldahl và định mức đến vạch. Cho thêm vào 200mg chất xúc tác. lắc nhẹ.Vô cơ hóa mẫu Cân 100mg bột đậu nành đã sấy khô tuyệt đối cho vào bình Kjeldahl. Trong khi đun. đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh Lưu ý giai đoạn này phải thực hiện trong tủ Hotte.+ Pipet 20ml. khi đã sôi giữ nhiệt độ bếp đun vừa phải để tránh hóa chất trào ra ngoài và không bị bay mất amoniac. pipet 10ml + Erlen 250ml + vaseline Bộ chưng cất Kjeldahl b. Đặt bình Kjeldahl lên bếp đun. Tiến hành . tránh trường hợp khi sôi mạnh hóa chất bắn ra ngoài. đặt bình hơi nghiêng trên bếp.Cất đạm 20 . .1g) + H2SO4 đậm đặc + NaOH 40% + H2SO4 0. Hóa chất + nguyên liệu + Bột đậu nành (0.1N chuẩn + Thuốc thử Tasiro + chất xúc tác: hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 (3:1) 3. theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun. Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn.

Tính kết quả: Hàm lượng % nitơ tổng số được tính theo công thức N (mg%) = {1. . đợi hệ thống nguội mới tháo hệ thống đem đi rửa.Chuẩn độ: Chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0. dùng giấy qùy thử ở đầu ống sinh hàn. Tiếp tục cho vào bình cất 15ml NaOH 40% cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển sang màu xanh lá mạ (thêm 5ml NaOH 40% nếu dung dịch trong bình chưa chuyển hết sang màu xanh lá mạ).42 hệ số .1 N sử dụng. Đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống sinh hàn.42mg Nitơ 21 .1N và 3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng). Ghi nhận thể tích NaOH 0. Tiến hành lắp hệ thống cất đạm. 4. Bật công tắc cất đạm Sau khi cất đạm 10-12 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không.1N đã chuẩn độ a số miligam nguyên liệu 1. cứ 1 ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với 1.Chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có sẵn 50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro lúc này trong bình có màu tím hồng.42 * (V1-V2)*100/a}*2 V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứng V2: số ml NaOH 0. Ngưng cất đạm.1N cho đến khi mất màu tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ. cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0. Nếu giấy qùy không đổi sang màu xanh là được.

Để xác định protein trong mẫu. Trong dung dịch mang tính acid. Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm. Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Đó chính là lượng protein mẫu trong dung dịch đo. khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế ta được ODx.hóa chất 1. màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ.Ống nghiệm (14) . Dụng cụ .Giá để ống nghiệm .BÀI 4. 1ml (có thể thay bằng pipetteman) .Máy đo quang phổ . Dung dịch protein chuẩn thường là bovine serum albumin. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD 1. độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với lượng trong mẫu.Đồng hồ bấm giây . Dụng cụ . Thực hiện một đối chứng với nước cất (OD0).Bình tia đựng cồn 22 . Công thức phân tử của Coomasie Brilliant Blue G-250 2.Pipette 5ml. Lấy giá trị OD = ODx .OD0.Giấy thấm . khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại 465 nm. đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ. Độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein. Lượng protein mẫu trong dung dịch đo được xác định bằng cách chấm trên đường chuẩn theo OD. lấy giá trị của điểm đó trên trục hoành.

tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 595 nm. 3. Hóa chất . lắc đều cho tan. Khi dùng pha loãng ra 100 lần. 4.Dung dịch cần xác định hàm lượng protein (phòng thí nghiệm cung cấp) 3.Bổ sung các thành phần như bảng sau. Lắc đều.005g Ethanol tuyệt đối: 4.5g Phẩm màu Coomasie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong một chai đựng màu tối có nắp.9 0. ở thời điểm 21 phút đo ống 1 (OD1).. pha trong 1 ml nước cất. Bổ sung phosphoric acid và chỉnh tới 100ml bằng nước cất. Tính kết quả: .Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595 ở trên ta tính được hàm lượng protein ở trong mẫu phân tích 23 .9 0.Dung dịch protein chuẩn: cân 10 mg albumin bằng cân phân tích.5 5 50 X 5 ? ..7g Phosphoric acid 85%: 8. lắc đều để yên. Ống nghiệm Nước cất (ml) Albumin chuẩn (0. Ở thời điểm 1 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 1. lắc đều để yên.Cồn 900 .. Tiến hành .Lập một loạt 6 ống theo số thứ tự 0.5 0.Dung dịch thuốc thử Bradford: dung dịch thuốc thử có thành phần trong 100ml như sau: Coomassie Brilliant Blue: 0..2.1mg/ml) TT Bradford Nồng độ Albumin (µg/ml) 0 1 0 5 0 1 0.. Ghi lại giá trị OD.1 mg/ml.6 0.Tính thời gian ống 0 được 20 phút. 2. .Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595 . canh thời gian 0 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 0. được dung dịch có nồng độ 0.Dùng đồng hồ bấm giây. 1.3 5 30 4 0.4 5 40 5 0. 5 và 1 ống nghiệm chứa mẫu cần phân tích X . Ta có giá trị OD0. giữ ở 40C .7 0. riêng ống nghiệm X cho 1 ml mẫu cần phân tích do phòng thí nghiệm cung cấp (nếu cần sinh viên tự pha loãng mẫu trước khi phân tích) . cứ tiếp tục cho đến hết.1 5 10 2 0. tương tự cứ cách một phút đo cho hết các ống. Giữ ở -200C. 4.2 5 20 3 0..

phương pháp sắc ký và phương pháp hóa học. độ nhớt .Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm tương ứng với một nồng độ enzyme xác định. Nguyên tắc 1. . viết tắt U) do Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (International Union of Biochemistry – IUB định nghĩa: Một đơn vị chuẩn của enzyme (1 U) là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được 1 mol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn. a) Đơn vị hoạt tính thông dụng nhất là đơn vị quốc tế (Enzyme Unit.BÀI 5. độ nhớt. Hội đồng Danh pháp của IUB khuyến cáo nên sử dụng Katal làm đơn vị cơ bản của hoạt tính enzyme: Một Katal là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được 1 mol cơ chất sau 1 giây ở điều kiện tiêu chuẩn.. Một đơn vị họat tính enzyme được định nghĩa theo nhiều phương pháp. c ó n h iề u đơ n vị h o ạ t tín h e n z y m e . Vì vậy có thể đánh giá hoạt tính xúc tác của enzyme bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa cơ chất hoặc tốc độ tích lũy sản phẩm phản ứng.. Đ iề u q u a n tr ọ n g n h ấ à lcầ n đ ịn h t n g hĩa rõ rà n g đ ơ n vị h o ạ t tín h .trong một đơn vị thời gian. Enzyme và đơn vị đo hoạt tính enzyme Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và có tính đặc hiệu cao. Mỗi enzyme có khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định. 24 . áp suất. Trường hợp cơ chất và sản phẩm là một hỗn hợp phức tạp thì áp dụng đơn vị hoạt tính này. nhiều phương pháp phân tích khác nhau được sử dụng: phương pháp đo quang phổ.67 nKat (nanokatal) Đơn vị Katal được khuyến cáo vì nằm trong hệ đơn vị đo lường Quốc tế (SI). Về nguyên tắc có thể hai nhóm phương pháp chính sau: . * Đơn vị hoạt tính enzyme : Mục đích xác định hoạt tính enzyme là xác định số đơn vị hoạt tính. c) Đơn vị hoạt tính dựa vào sự thay đổi đặc tính hỗn hợp phản ứng. N h ư v ậ y . Hoạt động hay hoạt tính của enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất được chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn.Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định. 1 Kat = 1 mol cơ chất/ giây = 60 mol/ phút = 60 x 106 mol/ phút = 6 x 107 U 1 U = 1/60 x 10-6 Kat = 16. đo độ phân cực.1. Để thực hiện được mục đích trên. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME 1. ví dụ sự thay đổi độ đục. 1 U = 1 mol sản phẩm = 1 mol cơ chất (10-6 mol)/phút b) Năm 1979.

E n zy m e a m y la se v à p h ư ơ n g p h á p x á c ịn h h o ạ t tín h đ * K h a i q u á t về en zy m e a m ylase A m y la s e là c á c e n z y m e x ú c tá c c h o c á c p h ứ n g th ủ y p h â n tin h b ộ t. Động học phản ứng enzyme T r o n g b à i thự c hà n h n à y . l -3 T hờ i g ia n x á c đ ịn h h o ạ t tín h thờ n g 5-3 0 p h ú t. C á c th ô n g số n h iệ t đ ộ . * Điều kiện phản ứng để xác định hoạt tính K h i tiế n hà n h thự c n g h iệ m c ầ n trá n h n h ữ n g ế u tố c ó th ể b iế n tín h p r o te in y enzym e. V ớ i n h ữ n g e n z y m e c ầ n c ó c h ấ t h o ạ t h ó a h o ặ c c h ấ t ổ n đ ịn hì thhả i c h o c á c p c hấ t nà y v à o e n z y m e tr ư c k h i c h o cơ c hấ t và o hỗ n h ợ p p h ả n ứ n g . trong đó hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Lowry hoặc Bradford). v ì g ia iđ oạ n nà y tố c đ ộ p hả n ứ n g lớ n 0 n hấ t. n hư n g k h ô n g q u á c a o đ kìm h ã m e n z y m e . p H . Hình 1. ìn K h i x á c địn h h o ạ t tín h p h ả i àlm mẫ u đ ố i c h ứ n g s o n g s o n g v ớ i m ẫ u th í n g h iệ m . S a u k h i ể d ừ n g p h ả n ứ n g ư ợ n g cơ c hấ t đư ợ c c h u y ể n h ó a 2 0 0 % . Hoạt tính riêng được biểu thị bằng số đơn vị enzyme/mg protein protein (U/mg protein) hoặc Kat/kg protein.Hoạt tính riêng (specific activity) của enzyme Hoạt tính riêng của một chế phẩm enzyme đặc trưng cho độ tinh sạch của chế phẩm enzyme.6 0 g iâ y ). s in h v iê n là m q u e n ớ i p hư ơ n g p h á p x á c đ h h o ạ t tín h v ịn e n z y m e a m y la s e 1 . s a u đ ó b ắ t đ ầ u g iả m (H h 1 ).2 . g ly c o g e n . ớ N ồ n g đ ộ cơ c hấ t tro n g p h ả n ứ n g e n z y m e p h ả i ở tr o n g g iớ i h ạ n th íc h h ợ p . T h ử h o ạ t tín h e n z y m e p h ả ư ợđc tiế n hà n h i tro n g đ iề u k iệ n th íc h h ợ p nư đ iề u k iệ n s in h lý . đ iề u k iệ n tồ n trữ th ự c h p hẩ m h oặ c đ iề u k iệ n mà h oạ t lự c c ó th ể đ ạ t tố iư u . Tố t n h ấ t là x á c địn h tố c đ ộ ư b a n đầ u c ủ a p h ả n ứ n g (3 . T r o n g m ẫ u đ ố i c h ứ n g e n z y m e p h ả i b ị b ấ t h o ạ ư ớ c k h i tiế p x ú c t tr v ớ i cơ c hấ t. đ ủ th ừ a đ ể bã o e n z y m e . n ồ n g đ ộ io n àv th à n h p hầ n d u n g d ịc h đ ệ m ả n h h ư ở n g lê n h oạ t tín h e n z y m e . àv ản 25 .

d e x trin p h â n ửt th ấ p . Đ oc ườ n g i đ ộ m à u tạ o thà n h g iữ a tin h b ộ t v c á c sả n p h ẩ m th ủ y p h â n c ủ a n ó v ớ i io d bằ n g à e m á y s o m à u sẽ tín h đư ợ c h o ạ t tín h e n z y m e .2) có nhiều ở thực vật (hạt.và 1. ư -a m y la s e (Exo -1. EC 3. h ạ t hò a ư thả o n ả y m ầ m .1. i D u n g dịc h đ ệ m p h o s p h a te p H = 4 . D u n g dịc h tin h b ộ t 1 % :h ò a ta n 1 g tin h b t (th e o c h ấ t k h ô tu y ệ t đ ố i) v ớ i 5 0 ộ 26 . A m y la s e c h ia à m 3 loạ i c h ín h : l -a m y la s e (Endo -1.4. Enzyme này mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC.1 N D u n g dịc h io d : h ò a ta n 3 0 m g K I v à 3 m g I 2 ớv m ộ t lư ợ n g n h ỏ nư ớ c c ấ t. v i k h u ẩ n . E C 3 .9 4 .3) xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1.1 M p H = 1 0 (d n g để x á c đ ịn h h o ạ t tín h ù -a m y la s e k iề m . tụ y tạ n g .9 (x á c đ ịn h h o ạ t tín h e n z y m e cm a lt): ủ trộ n 1 0 m l d u n g d ịc h N2a P O 4 1 /1 5 M vớ i 9 9 0 m l d u n g d ịc h K HP O 4 1 /1 5 M H 2 n hậ n đư ợ c 1 l d u n g d ịc h đ ệ m p h o s p h a te p H = 4 . K iể m tra p H . -a m y la s e bề n v ớ i n h iệ t.1 ) c ó tr o n g n ớ c b ọ t. ní 2. H ó a chấ t – D ụ n g cụ : D u n g dịc h đ ệ m D u n g dịc h đ ệ m a c e ta te p H = 4 . Nhiều glucoamylase hoạt động mạnh ở pH 3. D u n g dịc h đ ệ m g ly c in e – N a O H 0 . s a uđ ó c h u yể n d u n g d ịc h s a n g bn h ò ì đ ịn h m ứ c 1 0 0 0 m l. K ể m tra p H . B ả o q u ả n d u n g d ịc h tro n g b ìn h m à u n â uđ ể c h ỗ tố i. EC 3.7 (x á c đ ịn h h o ạ t tín h e n z y m e n ấ m m ố c ): tr ộ n 1 thể tíc h C H3 C O O H 1 N vớ i 1 th ể tíc h C H3 C O O N a 1 N .4-glycoside từ đầu không khử tạo thành maltose và dextrin phân tử lớn.2. Dư ớ i tá c d ụ n g c ủ a e n z y m e à y .4-glucanase. d u n g n d ịc h tin h b ộ t n h a n h c h ó n g b ị m ấ t k h ả n ă n g tạ o à m vớ i d u n g d ịc h io d v à u e b ị g iả m đ ộ n h ớ t.1. b ổ s u n g ưnớ c c ấ t đ ế n v ạ c h m ứ c .5-5.4-glucanase. Enzyme này mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC. xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1.5.c á c p o ly s a c c h a r id e tư ơ n g ựt .2. Sản phẩm chủ yếu là glucose và dextrin.2 . Đ ơ n vị a m y la s e l lượ n g e n z y m e c ầ n th iế t đ ể th ủ y p h â n h o to à n 1 0 m g à àn tin h bộ t s a u th ờ i g ia n p h ả n ứ n g 3 0 p h ú t tr o n g đ iề u k iệ n th g h iệ m . củ). nhưng bền với acid hơn -a m y la s e .4-g lu c a n a s e. E n z y m e yn p h â n g iả i liê n kế t à 1 . Glucoamylase (Exo -1. n ấ m m ố c .4-g ly c o sid e ở g iữ a c h u ỗ i p o ly s a c c h a r id e (h o ạ t tín h e n d o a m y la s e ) tạ o th à n h m a lto s e .1 . D u n g dịc h H C l 0 . n h n g k é m b ề n v ớ i a c id . i L ắ c n h ẹ h ỗ n h ợ p đ ể h a ta n h o à n to à n . * C á c p h ư ơ n g p h á p đ o h o tín h en zym e -am ylase ạt N g u y ê n tắ c c h u n g d ự a tr n c ơ sở th ủ y p h â n tin h b ộ t b ở i e n z y m e tro n g d u n g ê d ịc h e n z y m e n g h ê n cứ u thà n h c á c d e x tr in c ó p h â n ửt lư ợ n g k h á c n h a u .6-glycoside từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.

G iữ h ỗ n h ợ p ở ư o n h iệ t đ ộ 3 0 C tr o n g thờ i g ia n 1 g iờ c ó k h u ấ y đ ả o đ ịn h k ỳ .7 .1 g c h ế p h ẩ m n g h i cứ u . Đ ặ t àv bế p c á c h th ủ y ìn o đ a n g s ô i.5 m l 27 . S a u đ ó c h u y n toà n bộ c h ế p h ẩ m v o b ìn h ta m g iá c d u n g tíc h 2 5 0 ể à m l. * D u n g dịc h e n z y m e đ ể p h â n tíc h P h a lo ã n g d u n g dc h e n z y m e g ố c (h ệ s ố p h a lon g n) bằ n g d u n g d ịc h đ ệ m ị ã s a o c h o tr o n g 1 m l d u n g ịc h e n z y m e p h â n tíc h c ó cứ a m ộ t lư ợ n g e n z y m e đ ủ đ ể d h thủ y p h â n 2 0 % .9 ) ổ s u n g nư ớ c c ấ t đ ế n v ạ c h m ứ c . L ọ c à th u hồ i d ịc h tríc h ly e n z y m e .5 m l 0 . lắ c liê n tụ c c h o đ ế n k h i tin h b ộ t ta n hàon to à n . N hvậ y . đ ộ ư p h a lo ã n g p hụ th u ộ c và o h oạ t tín h c h ế p h ẩ m e n z y m e c ầ n p h â n tíc h . lắ c đ ề u . B ả o q u ả n d u n g v o d ịc h e n z y m e g ố c ở 2– 4 C tr o n g thờ i g ia n 1 n gà y . lắ c đ ề u . cí T ríc h ly e n z y m e ừ v i k h u ẩ n : C â n m = 0 .5 m l 0 . b ổ s u n g ư ớ c cấ t tớ i v ạ c h m ứ c . T ríc h ly e n z y m e ừ m a lt : C â n m = 5 0 g m a lt đã n g h iề n n h ỏ . dù n g đũ a th ủ y tin h c h cẩ n th ậ n c h ế p h ẩ m tr o n g m ộ t c ố c d u n g th à íc 5 0 m l.7 ( h o ặ c 1 0 m l d u n gh đ ệ m d ịc p h o s p h a te p H = 4 . c h o và o b ìn h t -1 n ó n d u n g tíc h 2 5 0 m l. m ẫ u đ ố i c h ứ n g àvm ẫ u trắ ng M ẫ u th í n g h iệ m M ẫ u đ ố i c h ứ n g M ẫ u trắ n g D u n g dịc h tin h b ộ t 1 % 2 ml 2 ml 0 N ướ c c ấ t 0 0 2 ml Đệm 1 ml 1 ml 1m l D u n g dịc h N a C l 3 % 0 . m ô độ n g ư o thự c v ậ t b ằ n g d u n g d ịc h đ ệ m c ó p H th h hợ p .7 0 % tin h bộ t tr o n g d u n g d ịc h ở đ iề u k iệ n x á c đ ịn h .9 . ổb s u n g 9 0 m l n ớ c c ấ t và 1 0 m l d u n g dc h đ ệ m ư ị o p h o s p h a te p H = 4 . dù n g t ên đ ũ a th ủ y tin h c h cẩ n th ậ n c h ế p h ẩ m tr o n g m ộ t c ố c th ủ y tin h d u n g tíc h 5 0 à m l vớ i m ộ t lư ợ n g nư ớ c n h ỏ . D u n g d ịc h b đ ư ợ c c h u ẩ n b ị tr o n g n g y sử d ụ n g . à D u n g dịc h e n z y m e g ố c 3. B ả o q u ả n d u n g c h e n z y m e gố c ở 2 – 4 o C tro n g thờ i dị g ia n 1 n g à y . bổ s u n g 9 0 m l n ớ c c ấ t và dịc h đ ệ m a c e ta te p H = 4 . S a u đ ó c h u y ể n ton bộ h ỗ n h ợ p và o b ìn h đ ịn h à m ứ c d u n g tíc h 1 0 0 m l. T ríc h ly e n z y m e n m m ố c : C â n m = 5 g c h ế p h ẩ m e n z y m e th ô đ g h iề n ấ ã n s ơ bộ .m l n ướ c c ấ t tro n g b h đ ịn h m ứ c 1 0 0 m l. L ọ cà vth u hồ i d ịc h tríc h ly e n z y m e . C h uẩ n b ị m ẫ u th í n g h iệ m . T iến hà n h : T ríc h ly e n z y m e : e n z y m e đợ c tríc h ly từ c h ế p h ẩ m h a y tế à b . Gữi h ỗ n h ợ p ở n h iệ t đ ộ 3 0C tr o n g thờ i g ia n 1 g iờ c ó k h uấ y đ ả o đ ịn h k ỳ . S a u đ ó là m n g ộ i u v à bổ s u n g 1 0 m l đ ệ m a c e ta te p H = 4 . L ọ c à th u hồ i d ịc h n v o tríc h ly e n z y m e . B o q u ả n d u n g d ịc h e n z y m e g ố c ở – 4 C tr o n g thờ i g ia n ả 2 1 ngày.

3 0 p h ú t để x ả y ra p h ả n ứ n g H Cl 1N 1 ml 1 ml E nzym e 0 1m l N ướ c c ấ t 4 ml 4 ml Io de 0 . Đ o mậ t đ ộ q u a n g c ủ a c á c d u n g d ịc h bư ớ c s ó n g = 6 2 0 n m s o vớ i m ẫ u trắ n g .5 m 1 0 1 ml 1 ml 4 ml 0 . ở 4. T ín h kết q u ả : D = mậ t đ ộ q u a n g S ố m g tin h b ộ t b ị th ủ y p h â n S = H oạ t tín h e n z y m e a m y la s e : Hoạt tính chung = S n 10  m ( Do D ) x 20 Do trong đó: n = hệ số pha loãng m = khối lượng enzyme 28 .Ủ 4 0o C .5 m 1 D u n g dịc h đ ố i c h ứ n g c ó m u x a n h à D u n g dịc h th í n g h iệ m c ó m u tím vớ i cư ờ n g đ ộ k h á c n h a u ù y v à o lượ n g tin h b ộ t à t c h ư a bị th ủ y p h â n .5 m l 0 . 1 0 p h ú t để đ ạ t n h iệ t đ ộ D u n g dịc h e n z y m e 1 ml 0 o Ủ 4 0 C .

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful