TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.

HCM

KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC

----------

----------

BÀI GIẢNG

THỰC HÀNH HOÁ SINH

Biên soạn: TS. Nguyễn Hoài Hương CN. Bùi Văn Thế Vinh

Tp. Hồ Chí Minh, 04/2009

Lời mở đầu
Bài giảng “Thực hành sinh hoá” dành cho sinh viên năm thứ hai khoa Môi trường & Công nghệ Sinh học, trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM. Với thời lượng 30 tiết và tuỳ thuộc điều kiện, cơ sở vật chất của phòng thí nghiệm cho phép, sinh viên tiến hành làm 5 bài thực hành gồm các nội dung chính của học phần lý thuyết sinh hóa cơ sở. 1. Giới thiệu phòng thí nghiệm sinh hóa, cách pha chế các dung dịch chuẩn độ và các dung dịch đệm; 2. Định lượng đường khử bằng phương pháp acid dinitro-salicylic (DNS); 3. Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl; 4. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford; 5. Xác định hoạt tính enzyme amylase.

2

Viết báo cáo ngắn gọn. phương pháp. lớp cử một tổ trực nhật có nhiệm vụ nhắc nhở các bạn giữ vệ sinh chung và làm sạch PTN sau giờ thí nghiệm. burette. bảng kết quả thô. Máy ly tâm 6. Máy đo pH 7. giữ sạch nơi làm thí nghiệm. sự hiểu bài. Nếu nghỉ học có lí do chính đáng thì sinh viên phải xin phép giáo viên sắp xếp cho làm thí nghiệm bù.Cuối mỗi buổi thí nghiệm sinh viên phải nộp bản báo cáo kết quả thí nghiệm cho giáo viên hướng dẫn. . Đạt yêu cầu.Mỗi bài thí nghiệm sẽ có điểm. Bộ chưng cất Kjendahl (hoặc máy cất nitơ tự động) 4.Sinh viên phải có mặt đủ và đúng giờ trong các buổi thí nghiệm. rất thận trọng khi sử dụng dung môi dễ cháy nổ và hóa chất độc hại.Trong PTN phải mặc áo blouse. công thức tính và kết quả tính cùng các ý kiến giải thích hay nhận xét. Cân điện tử 2.Sau khi thí nghiệm.Khi làm thí nghiệm phải trật tự. hóa chất đúng chỗ.BÀI 1: CÁCH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH CHUẨN ĐỘ VÀ CÁC DUNG DỊCH ĐỆM 1. lau sạch bàn thí nghiệm và bàn giao cho cán bộ phòng thí nghiệm.. Mỗi buổi thí nghiệm. Yêu cầu đối với sinh viên làm thí nghiệm: . . sắp xếp lại dụng cụ. cẩn thận. phương trình phản ứng.. 2.Sinh viên phải đọc kỹ. thiết bị thì phải bồi thường. tuân thủ nội quy và điểm các bài báo cáo. nắm vững nội dung bài thí nghiệm và chuẩn bị sẵn bản báo cáo kết quả trước khi đến phòng thí nghiệm (PTN). micropipet. pipet. 3 . . . Hướng dẫn sử dụng một số thiết bị trong phòng thí nghiệm 1. bình Kjendahl. Điểm môn học sẽ gồm điểm thực hành thao tác. . . Thiếu một bài thí nghiệm coi như chưa hoàn tất chương trình. sơ đồ tiến hành thí nghiệm. tiết kiệm hoá chất. . sinh viên phải rửa dụng cụ. Các dụng cụ thủy tinh khác: bình định mức. Máy khuấy từ 5. Làm vỡ hoặc gây hư hỏng dụng cụ. Trước buổi thí nghiệm giáo viên hướng dẫn sẽ kiểm tra việc chuẩn bị của sinh viên. viết tay gồm nguyên tắc. Máy đo so màu quang phổ 3.. sinh viên mới được làm thí nghiệm.

. làm tiêu bản. axit mạnh. 4. mắt gây hại nghiêm trọng cho hệ hô hấp Mang găng tay cao su. mang găng tay cao su. Hơi amoniac dễ cháy. và muối của chúng. khẩu trang. Ca: phản ứng cực mạnh với nước. Oxit canxi rất ăn da. An toàn khi làm việc với axit và kiềm 1. Các biện pháp an toàn như trên. kính bảo hộ.. Zn . 2.. tiến hành phản ứng. An toàn khi làm việc với axit: Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nóng axit hoặc thực hiện phản ứng với các hơi axit tự do Khi pha loãng. thiết bị bảo vệ hệ thống hô hấp.3. phản ứng mạnh với chất oxy hoá. halogen. khẩu trang khi làm việc với dung dịch kiềm đậm đặc Thao tác trong tủ hút. An toàn khi làm việc với kiềm Kiềm có thể làm cháy da. Tạo hơi ăn mòn khi cháy. Pb. axit mạnh. phản ứng cực mạnh với nước. Chuẩn bị thí nghiệm 1. Cần mang dụng cụ bảo vệ da mắt. luôn phải cho axit vào nước trừ phi được dùng trực tiếp Giữ để axit không bắn vào da hoặc mắt bằng cách đeo khẩu trang. cho từng viên hoặc ít bột vào nước chứ không được làm ngược lại. cần bảo vệ da mắt. mang mặt nạ chống độc để phòng ngừa bụi và hơi kiềm. dẫn xuất clo của hydrocacbon. phản ứng cực mạnh với nước. găng tay và kính bảo vệ mắt. Hoá chất thí nghiệm: Các hoá chất dùng để phân tích. Tương tự khi hoà tan với nước. CO2. Kim loại Na. cho vào từ từ. trong phòng thí nghiệm được gọi là hóa chất thí nghiệm. Chỉ sử dụng cồn khô khi tạo dung dịch natri alcoholate. Natri và kali hydroxyt: rất ăn da.. ẩm. halogen. đường hô hấp do dễ nhiểm bụi oxit. K. lập tức rửa ngay bằng một lượng nước lớn Luôn phải đọc kỹ nhãn của chai đựng và tính chất của chúng H2SO4: Luôn cho acid vào nước khi pha loãng. 4 . tạo hỗn hợp nỏ với nhiều kimloại nặng: Ag. Nếu làm văng lên da. Tránh tạo tinh thể cứng khi hoà tan. sử dụng khẩu trang và găng tay để tránh phòng khi văng acid Các acid dạng hơi (HCl) thao tác trong tủ hút và mang găng tay. đồng thời phải làm lạnh nhanh. . Amoniac: là một chất lỏng và khí rất ăn da. Amoni hydroxyt: chất lỏng ăn da. Li.

. C2H2 . tránh gây những tai nạn đáng tiếc cho mình và cho mọi người. lỏng (H2SO4. nơi sản xuất. Nhãn hiệu hoá chất: Hóa chất được bảo quản trong chai lọ thủy tinh hoặc nhựa đóng kín có nhãn ghi tên hoá chất.) hoặc khí (Cl2. Những điều cần nhớ khi sử dụng và bảo quản hóa chất được tóm tắt như sau: . ethanon... 5 .Hoá chất có thể ở dạng rắn (Na. NaOH...Hóa chất phải được sắp xếp trong kho hay tủ theo từng loại (hữu ơ.. Cách sử dụng và bảo quản hoá chất: Khi làm việc với hóa chất. điều kiện bảo quản. tạp chất. khối lượng phân tử.Sạch hóa học (PC): độ sạch > 99% Hóa chất có độ tinh khiết khác nhau được sử dụng phù hợp theo những yêu cầu khác nhau và chỉ nên sử dụng hóa chất còn nhãn hiệu 2. nhân viên phòng thí nghiệm cũng như sinh viên cần hết sức cẩn thận..) hay theo một thứ tự a. mức độ sạch. vô cơ. kim loại.. công thức hóa học. . muối.) và mức độ tinh khiết khác nhau: . chloroform.Sạch phân tích (PA): độ sạch < 99% . aceton. c để khi cần dễ tìm. acid. NH3. bazơ. MgO. ..Sạch kỹ thuật (P): độ sạch > 90% . KCl. (CH3COO)2. khối lượng tịnh. N2. b. 3.

dùng dung môi là nước. Trường hợp bị bỏng với acid hay base rửa ngay với nước lạnh rồi bôi lên vết bỏng NaHCO3 1% (trường hợp bỏng acid) hoặc CH3COOH 1% (nếu bỏng base).. Có nhiều cách biểu thị nồng độ khác nhau. Tùy theo tính chất của dung môi mà phân thành dung dịch nước và dung dịch khan. Một số chất khác tan trong dung môi hữu cơ. .Các loại hóa chất dễ bị thay đổi ngoài ánh sáng cần phải được giữ trong chai lọ màu vàng hoặc nâu và bảo quản vào chổ tối.Tất cả các chai lọ đều phải có nhãn ghi.. có mùi. muối trong phòng thí nghiệm là dung dịch nước. (%) 6 . Trong dung dịch gồm có chất hòa tan và dung môi. dễ cháy không được để gần nơi dễ bắt lửa. phải đưa vào tủ hút.Dụng cụ dùng để lấy hóa chất phải thật sạch và dùng xong phải rửa ngay. . Nếu bị bắn vào mắt. .. không dùng lẫn nắp đậy và dụng cụ lấy hóa chất. Không hút acid hay base bằng miệng mà phải dùng các dụng cụ riêng như ống bóp cao su. dội mạnh với nước lạnh hoặc NaCl 1%. 1.Không hút bằng pipette khi chỉ còn ít hóa chất trong lọ. Trường hợp bị hóa chất vào miệng hay dạ dày. . Lưu ý các kí hiệu cảnh báo nguy hiểm.Khi làm việc với acid hay base mạnh: Bao giờ cũng đổ acid hay base vào nước khi pha loãng (không được đổ nước vào acid hay base). nếu là acid phải súc miệng và uống nước lạnh có MgO. chú ý đậy kín nắp sau khi lấy hóa chất xong. Phần lớn các dung dịch acid. 5. Khi cần sử dụng các hóa chất dễ bốc hơi. Các đơn vị nồng độ dung dịch * Nồng độ phần trăm. cổ chai. phân tích và tính toán khác nhau.Chai lọ hóa chất phải có nắp. Nếu chất hòa tan ở dạng rắn thì gọi là chất tan. Mỗi cách sẽ tiện dụng trong chuẩn bị. Trước khi mở chai hóa chất phải lau sạch nắp. Hàm lượng chất hòa tan trong dung dịch thể hiện ở nồng độ dung dịch. base.. . nếu là chất lỏng thì gọi là dung chất. dùng xong phải trả đúng vị trí ban đầu. nếu là base phải súc miệng và uống nước lạnh có CH3COOH 1%. . tránh bụi bẩn lọt vào làm hỏng hóa chất đựng trong chai. phải đọc kỹ nhãn hiệu hóa chất trước khi dùng. Dung dịch Dung dịch là hỗn hợp của hai hay nhiều chất tác động tương hỗ với nhau về mặt vật lý và hóa học. không ngửi hay nếm thử hóa chất.Khi làm việc với chất dễ nổ.

thể tích. hòa tan ta được 500g dung dịch NaOH 40% . Ví dụ: Dung dịch KH2PO4 M/15 là trong 1000ml dung dịch chứa M/15 phân tử gam KH2PO4 * Nồng độ đương lượng gam. % (w/w) . (Mol/L) hay M: là số phân tử gam (hay số mol) chất tan trong 1 lít dung dịch. µg%: là số µg chất hòa tan trong 100g dung dịch. mg%: mg chất hòa tan trong 100g dung dịch. % (v/v): là số ml dung chất có trong 100ml dung dịch. Ví dụ: dung dịch KOH 0. Na2HPO4.Nồng độ phần trăm khối lượng .5đlg KOH * Nồng độ dung dịch bảo hòa: là khối lượng tối đa chất hòa tan trong dung dịch.5N là trong 1000ml dung dịch chứa 0. (g/L): là số gam chất tan có trong 1 lít dung dịch. Ví dụ: dung dịch CuSO4 10% (w/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10g CuSO4 . Ví dụ: dung dịch NH4Cl 5% (w/w) là trong 100g dung dịch có chứa 5g NH4Cl . 7 .. . (N): là số đương lượng gam (đlg) chất tan có trong 1 lit dung dịch. Ngoài ra trong các phép phân tích vi lượng còn có một số đơn vị nồng độ khác như: .) Khi pha dung dịch cần phải tính thêm lượng nước kết tinh có sẵn. 0/00: số g chất hòa tan trong 1000g dung dịch.Phần triệu.Phần tỷ.Nồng độ % khối lượng thể tích (w/v): là số g chất tan có trong 100ml dung dịch. cân 200g NaOH và đong 300 ml nước cất.Miligam phần trăm.Microgam phần trăm.5H2O. Ví dụ: dung dịch gycerine 10% (v/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10ml glycerin * Nồng độ gam-lit. 12H2O. . % (w/w): là số gam chất tan có trong 100g dung dịch. Cách pha dung dịch có nồng độ xác định * Pha dung dịch có nồng độ phần trăm theo khối lượng.Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO4. .Chất tan là chất rắn khan: Ví dụ: 1) Pha 500g dung dịch NaOH 40% (w/w) 100g dung dịch cần 40g NaOH 500g dung dịch cần Xg? Lượng NaOH cần để pha dung dịch : X= (40*500)/100= 200g Lượng nước cần thiết: 500-200=300g (hay 300ml) Vậy.khối lượng... ppb: số µg chất hòa tan có trong 1kg hay 1 lít dung dịch.Phần nghìn. ppm: số mg chất hòa tan trong 1kg hay 1 lít dung dịch.Nồng độ phần trăm thể tích . * Nồng độ phân tử gam hay nồng độ mol. 2.Nồng độ mg/mL: số mg chất tan trong 1mL dung dịch .. .

5H2O cần dùng: Y = (250*32)/160 = 50g Lượng nước cất thêm vào: 320 -50 = 270g (hay ml) Vậy.Ví dụ: 2) Pha 320g dung dịch CuSO4 10% (w/w) từ CuSO4. hòa tan ta được 320g dung dịch CuSO4 10%. đong 270ml nước cất.. .Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO4. Na2HPO4. Ở mỗi nhiệt độ khác nhau.Pha dung dịch bão hoà: Dung dịch bão hòa là dung dịch có lượng chất tan tối đa. Nếu chất tan tan hết.5H2O.) Khi pha dung dịch ta cần phải tính đến lượng nước kết tinh có sẵn giống như ở phần a. chuyển sang bình định mức. cứ như thế cho đến khi chất tan không còn tan được nữa. Tra cứu những số liệu này trong "Sổ tay các hiện tượng hóa lý".5H2O M(CuSO4) = 160 và M(CuSO4. ta được 1lít dung dịch NaCl 5%. mỗi loại dung môi khác nhau thì nồng độ bão hòa của mỗi loại chất tan sẽ khác nhau. . chất tan không tan hết lắng xuống thì phần dung dịch phía trên là dung dịch bão hòa..Cách pha nhanh dung dịch bão hòa khi không tra được số liệu từ bảng: Lấy chất tan cần pha vào becher. * Pha dung dịch có nồng độ % theo thể tích .. hòa tan và định mức thành 1 lít bằng nước cất.5H2O) = 250 Lượng CuSO4 khan để pha dung dịch là: X = (10*320)/100 = 32g Lượng CuSO4. Ví dụ: 3) Pha 1 lít dung dịch NaCL 5% (w/v) Lượng NaCl cần để pha dung dịch: X = (5*1000)/100 = 50g Vậy. Nếu cho thêm chất tan vào dung dịch bão hòa thì lượng chất tan đó không tan được nữa và sẽ lắng xuống. H2SO4 . cân 50g CuSO4. Nếu sau khi khuấy.Pha dung dịch loãng từ một dung dịch đậm đặc hơn: Ví dụ: 3) Pha 500g dung dịch NaOH 5% từ dung dịch NaOH 10% Lượng NaOH cần để pha dung dịch 5% là: X = (5*500)/100 = 25g Lượng dung dịch NaOH 10% cần dùng là: Y = (100*25)/10 = 250g Lượng nước cất thêm vào: 500-250 = 250g Vậy.Chất tan là chất rắn khan Cân lượng chất tan cần thiết... hòa tan ta được 500g NaOH 5% .5H2O. . thêm chất tan và tiếp tục khuấy. cân 50g NaCl. Muốn pha dung dịch bão hòa cần phải biết độ tan tối đa của chất tan (nồng độ bão hòa). dùng nước cất hòa tan và định mức đến thể tích đúng. 12H2O. 8 .Chất tan dạng lỏng: Một số chất tan ở dạng lỏng như HCl. đong 250ml nước cất và 250g dd NaOH 10%. thêm một ít nước cất và khuấy cho tan. .

lắc để trộn đều đồng nhất.4g Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là : Y = (100*4. NH4OH .96%. Muốn pha dung dịch nồng độ 1M của một chất nào đó.9/1. hòa tan trong 1 ít nước.Việc cân không thuận lợi.1M. Nếu muốn pha dung dịch 2M. * Pha dung dịch nồng độ phân tử gam Mol (M) hay phân tử gam (ptg) là khối lượng của các chất tính ra gam bằng khối lượng phân tử của nó.19g/ml) Lượng HCl cần để pha dung dịch 1% là: X= (1*440)/100 = 4. Do đó khi pha các dung dịch từ các loại hóa chất nàyta phải chú ý đến nồng độ của dung dịch đậm đặc. hoặc quá trình hòa tan có toả nhiệt thì phải chờ nhiệt độ trở lại bình thường (nhiệt độ không khí) rồi mới thêm nước tới vạch định mức.19 = 10 ml Lượng nước cất thêm vào:440-10 = 430ml Vậy. lắc để hòa tan hoàn toàn và đưa nước cất tới mức. có thể đưa về đơn vị thể tích theo công thức V = M/d V: Thể tích chất lỏng. Dung dịch nồng độ 1M là dung dịch chứa 1ptg chất hòa tan trong 1 lít. cân 56g KOH.9g = 11.05M ta cũng tiến hành tương tự với lượng cân tương ứng. 9 .37%. HCl . Cân chính xác lượng chất tan. 0. qua phễu cho vào bình định mức có dung tích 1 lít. 3M hay 0. Ví dụ như H2SO4 .25%. d: tỷ trọng chất lòng Chú ý: Các hóa chất lỏng bán trên thị trường thường không ở dạng nguyên chất mà là các dung dịch đậm đặc. H3PO4 65%. cho vào bình định mức 1000.thể tích (w/v). Cho vào từng lượng nước cất nhỏ. Đây là phản ứng tỏa nhiệt. Ví dụ: 6) Pha 1 lít dung dịch KOH 1M Phân tử lượng của KOH: MKOH = 39 +16 +1 =56 Lượng KOH để pha 1 lít dung dịch 1M là: 56g Vậy. Khi phải đun nóng dung dịch để hòa tan. Giới hạn hòa tan tối đa được tính bằng % thể tích và thay đổi tùy theo loại hóa chất. cần làm nguội dung dịch trước khi định mức thành 1 lít. và 430ml nước cất ta được 440 ml HCl 1% Do việc sử dụng các loại bình định mức làm cho việc pha chế dung dịch thí nghiệm trở nên đơn giản và chính xác vì vậy ngày nay đa số các dung dịch thí nghiệm được pha chế theo nồng độ khối lượng . Chuyển dung dịch sang bình chứa. M: khối lượng chất lỏng cần cân. ta tính khối lượng phân tử chất đó ( hoặc tra bảng) theo đơn vị gam.4)/37 = 11. Ví dụ: 5) Pha 440ml dung dịch HCl 1% từ dung dịch HCl 37% (d=1. dùng ống đong lấy 10ml dung dịch HCl37%.

cho vào bình định mức 500.5*100)/37 = 98. Ví dụ: 9) Phản ứng giữa HCl và NaOH H+Cl. Tính N theo công thức trên. vậy 1 N (HCl) = 1M (HCl) 1ptg NaOH cho ra 1 ion gam OH-. Ví dụ: 8) Pha 1 lít dung dịch HCl 1M từ HCl 37% Phân tử lượng HCl: MHCl = 1+35.+ 2 (Na+OH-) → 2 Na+SO42. * Nồng độ đương lượng gam (N) Dung dịch nguyên chuẩn là dung dịch có nồng độ 1N Đương lượng gam(đlg) được định nghĩa theo mỗi trường hợp riêng biệt từ phương trình phản ứng dùng để định phân.Đlg của một axit là khối lượng chất đó để tạo ra trong phản ứng 1 ion gam H+. Định mứ c thành 1 lít.65/1.vậy 1N (NaOH) = 1M (NaOH) Số ion gam tạo ra từ 1 ptg được gọi là hệ số nguyên chuẩn độ (ký hiệu là n) N= M/n Phản ứng oxy hoá khử: Tùy theo số điện tích trao đổi ở từng phản ứng mà hệ số n khác nhau. Định phân acid. định mức đến vạch.→ Na+Cl. hòa tan trong 1 ít nước. đong 83ml HCl 37% cho vào bình định mức 1000 có sẵn 1 ít nước.Đlg của một base là khối lượng chất đó để tạo ra trong phản ứng 1 ion gam OH-. .5 = 74.+ 2H2O 1ptg H2SO4 cho ra 2 ion gam H+ vậy 1N (H2SO4) = 2 M (H2SO4) 1ptg NaOH cho ra 1 ion gam OH.5 Lượng KCl để pha 500ml dung dịch 3M là: X= (74.5 = 36. Nếu chất tan là dung dịch. Trường hợp chất rắn có ngậm nước.+ Na+OH. vậy 1N (NaOH) = 1M (NaOH) Ví dụ: 10) Phản ứng giữa H2SO4 và NaOH 2H+SO42.75g KCl.65g Hay 98. ptg chất đó phải tính luôn cả khối lượng các phân tử nước.+ H2O 1ptg HCl cho ra 1 ion gam H+.5 Lượng HCl 37% để pha dung dịch 1M là: X = (36. cân 111. ta phải tính toán dựa vào nồng độ dung dịch đó. Tiến hành pha trong tủ Hotte vì hơi acid bay lên rất độc hại.75g Vậy.19 = 83ml Vậy. Ví dụ: 11) 2 Na2S2O3 + I2 → Na2S4O6 + 2 NaI 10 .base: .Ví dụ: 7) Pha 500ml dung dịch KCl 3M Phân tử lượng của KCl: MKCl = 39 +35.5 *3*500)/1000 = 111.

dung môi bay hơi. Thời gian tàng trữ lâu nên chất tan bị thăng hoa. * Cách pha dung dịch chuẩn từ ống chuẩn . các hóa chất không tinh khiết hay bị hút ẩm. acid oxalic. . 3.. Ví dụ: 12) NaOH thường nhiễm một lượng Na2CO3 rất dễ chảy nước. pha loãng và định mức tới thể tích đúng. Na2S2O3. ta phải dùng ống chuẩn. dùng bình tia rửa sạch chất tan có trong ampun vào bình định mức 1 lit.Đối với các hợp chất bền vững. không thể pha ngay được dung dịch chuẩn. AgNO3. nếu muốn pha dung dịch có nồng độ chính xác.Dùng đinh thủy tinh chọc thủng ampun.Đối với các chất như NaOH. có thành phần không thay đổi như NaCl. đảm bảo chính xác và được dùng để định chuẩn các dung dịch tự pha chế khi làm thí nghiệm. hứng lên phểu vào bình định mức. Các chất dùng trong dung dịch chuẩn phải khá bền vững sao cho nồng độ của chúng không thay đổi nhanh chóng theo thời gian. có thể pha dung dịch chuẩn trực tiếp bằng cách cân chính xác chất cần pha.. 11 . * Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Đối với các chất dễ thay đổi thành phần khi ở dạng rắn. Ong chuẩn là một ống ampun thủy tinh hay nhựa đóng kín. Khi chuyển hết lượng chất tan trong ống vào bình định mức và pha thành 1 lít ta được dung dịch chuẩn có nồng độ đã ghi trên nhãn ngoài ống. . bị oxy hóa. Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Khi pha hóa chất. vì vậy phải kiểm tra nồng độ thực của các dung dịch pha sẵn dựa vào các dung dịch có nồng độ chính xác được gọi là dung dịch chuẩn (fixanal) * Dung dịch chuẩn Dung dịch chuẩn là các dung dịch được chuẩn bị sẵn.I2 + 2e → 2I2 S2O32. có nhiều nguyên nhân làm cho nồng độ dung dịch không chính xác như việc cân đong không chính xác. ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng. . .. vừa thêm nước cất vừa lắc và đưa nước cất tới vạch mức. HCl. Pha dung dịch chuẩn. Bên trong chứa một lượng cân chính xác chất tan hoặc dung dịch chất tan.. vì vậy sau khi pha phải hiệu chỉnh lại nồng độ. HCl dễ bay hơi.-2e → S4O62Trong phản ứng này n =1 nên N = M/1 = M Việc pha dung dịch nồng độ đương lượng gam (N) cũng tương tự với cách pha dung dịch nồng độ phân tử gam (M). sau đó hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch dựa vào phản ứng với một dung dịch chuẩn thích hợp. Na2S2O3 dễ bị mất nước tinh thể khi để ngoài không khí. do các chất này thường không bền vững và dễ thay đổi thành phần.

1N Lấy 10ml H2SO4 0.1M)/CH3COONa (0.Ví dụ: Pha dung dịch NaOH 0. để có đệm pH ở giá trị 4.05N tron cồn phải dung dung dịch chuẩn là H2SO4 0.748 gần bằng 4.75.1)/11 = 0. dùng burette định phân bằng NaOH được 11 ml NaOH Vậy nồng độ thực tế NaOH đã pha là : Ct = (10*0.1N cho vào erlen.75. Việc pha dung dịch đệm tuân theo nguyên tắc chọn cặp acid – base có hằng số phân ly pK A/B gần với pH đệm muốn pha và phối trộn chúng với số mol bằng nhau.91 6. thêm ba giọt chỉ thị màu phenolphtalien.1N.1N để chuẩn độ lại. dung dịch đệm đóng vai trò quan trọng.091 N Hệ số điều chỉnh K: K= 0. thường gồm một acid yếu và một base yếu với tỉ lệ của chúng sẽ quyết định pH của dung dịch. Dung dịch KOH 0.001 mol HCl thì pH của hệ vẫn chỉ ở mức 4.05N Đối với các dung dịch dễ thay đổi trong quá trình bảo quản. Các phản ứng thường thấy là phản ứng tạo kết tủa hay tạo phức hoặc oxy hóa khử. chọn cặp acid . ví dụ như ổn định pH của máu bằng các hệ đệm carbonate và phosphate. Nghĩa là pH thay đổi rất ít.base CH3COOH (0.base.1 = 10/11 = 0. Có dung dịch chứa hỗn hợp 1 acid yếu (Ví dụ: acid acetic) với muối của nó (Ví dụ: muối natri acetate).1M). Dung dịch đệm: Dung dịch đệm là dung dịch tạo môi trường ổn định pH cho dung dịch. dung dịch sẽ cân bằng dạng như sau: CH3COOH + H2O -----> CH3COO. Vậy nếu dùng dung dịch acid và dung dịch base có cùng nồng độ N. Tuy nhiên sử dụng các đệm nào còn tùy thuộc vào ứng dụng sao cho thành phần của đệm không phản ứng với các cấu tử trong hệ phản ứng khảo sát theo chiều hướng có hại. dung dịch định pha là NaOH 0.091/0.1 N từ NaOH rắn và dùng dung dịch chuẩn H2SO4 0. Nếu thêm vào dung dịch 0. Về nguyên tắc thì phối hợp các loại đệm có các khoảng đệm khác nhau thành 1 dung dịch là không có vấn đề gì. Thí dụ. Trong cơ thể sống. mỗi lần sử dụng lại phải xác định lại hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Xét một phản ứng trung hòa acid .+ H3O+ 12 . thì phản ứng sẽ đạt điểm cân bằng khi thể tích hai chất bằng nhau C1V1 = C2V2 Nếu gọi Cp là nồng độ dung dịch định pha và Ct là nồng độ thực của dung dịch ta có hệ số hiệu chỉnh K: K= Cp/Ct = Vp/Vt Ví dụ: 13) Dung dịch chuẩn là H2SO4 0. 1 ion gam H+ sẽ phản ứng với 1 ion gam OH-.

2H2O hòa tan và dẫn nước đến 1000 ml.25 1.H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml.50 pH 3.70 7. Khi thêm một lượng acid mạnh (H3O+).20 8.0 13 a 23.trong dung dịch cân bằng có dạng sau: NH3 + H2O ----------> NH4+ + OHDung dịch đệm có pH thay đổi rất ít khi thêm một lượng acid hoặc base.60 6.00 3.09 7. khi thêm một lượng base mạnh (OH-).50 7.00 4.80 9.00 10.31 8. Kết quả pH của dung dịch tăng không đáng kể.50 6.00 7.Dung dịch acid citric 0.6 0.00 5.94 8.08 a 6.40 9. base liên hợp kết hợp với nó cho acid yếu (cân bằng chuyển dịch theo chiều nghịch) pH của dung dịch giảm không đáng kể.Dung dịch acid boric (a): 12.Có dung dịch khác chẳng hạn.404 g H3BO3 hòa tan và định mức đến 1000 ml.00 8.5 b 3.00 4. * Dung dịch đệm borat: .10H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml Dung dịch đệm borat có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và dung dịch (b) theo bảng dưới đây: A 9. Khả năng đệm của hỗn hợp đệm phụ thuộc vào hàm lượng acid và base liên hợp có trong hỗn hợp.00 8. Dung dịch đệm citrate có giá trị pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml dung dịch (b) theo bảng sau: A 46.0 1.11 9.84 8.108 g Na2B4O7.78 7.60 7.0 b 27.0 – 6.50 3.00 2.01 g C6H8O7.8 .60 8.00 5.00 pH 6.00 0.50 7. ion hidroni H3O+ trung hòa OH.88 7.00 b 0.41 g C6H5O7Na3.75 8.98 9.24 *Dung dịch đệm citrate (pH = 3.00 7.41 8.Dung dịch trinatri citrate 0.6 1.00 b 3.50 4.1M (b): 29.00 1.0 2.50 8.1M (a): 21.2 0.50 5.2) . Trái lại.77 7.Dung dịch borat (b): 19.50 6. .50 4.50 5.0 pH 4.30 2. chứa hỗn hợp base yếu (Ví dụ: amoniac) với muối của nó (Ví dụ: muối amoni clorua).36 7. . acid điện li cho H3O+ (cân bằng chuyển dịch theo chiều thuận).69 8.50 2.70 9.cho base yếu H2O.00 9.0 pH 8.51 8.

Dung dịch mononatri orthophosphate 0.7 6.2 7.3 7.5 49.6 6.7 g Na2HPO4.0 25.2 - *Dung dịch đệm phosphate (pH = 5.0 16.4 .5 53.2 4.0 22.0 84.0 28.0 31.0 36.1 7.30 b 55.0 13.4 5.5 42.8 g NaH2PO4 hòa tan và định mức đến 1000 ml.6 5.8 40.0 28.12H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml.5 37.5 8.5 51.0 18.0 94.3 15.8 a 45.5 68.7 11.0 34.6 6. a 93.6 7.0 37.5 73.0 6.Dung dịch kali dihydrophosphate 1/15M (b): 9.8 14 a 372 492 612 726 818 b 628 508 388 274 182 pH 6.0 pH 5.0 87.9 8.0 *Dung dịch đệm Na2HPO4 – KH2PO4 (pH = 5.7 – 8. .2 3.0 23.0 61.5 22.0 13.0 81.0 90.2 40.8 7.6 5.0 89.5 32.0 10.00 10.0 19.5 6.3 38.2 7.0 77.07 g KH2PO4 hòa tan và định mức đến 1000 ml.7H2O hoặc 71.7 pH 6. a 10 18 30 49 79 b 990 982 970 951 921 pH 5.0 5.2M (b): 53.5 7.5 62.5 7.5 77.1 6.0 12.6 5.5 6.0 13.5 18.0 81.8 5.8 6.5 31.05 g Na2HPO4.3 6.0 4.8 - 5.43.8 7.6 20.8 9.2 5.2 6.0 – 8.0) .0 17.20 10. .0 b 6.0 5.0 19.0 24.5 91.Dung dịch dinatri hydrophosphate 0.4 3.7 85. Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml dung dịch (b).0 67.0 87.4 7.0 33.50 7.2M (a): 27.5 92.0 33.5 56.0 7. Dung dịch đệm phosphate có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml dung dịch (b) định mức đến 200 ml.6 3.0 16.9 7.0 39.0 72.0 6.Dung dịch dinatri hydrophosphate 1/15M (a): 23.50 8.4 6.12H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml.9 g Na2HPO4.00 5.9 6.0 35.2 5.5 93.5 3.2 - 29.5 26.4 5.4 4.0 15.8 4.0) .7 7.0 7.

2 6.5 41.2 *Dung dịch đệm Glycine – NaOH (pH = 8.0 9. .4 2.6) .Dung dịch glycine 0.2 15 a 20. X 4.0 X 16.4 72.6 – 5.Dung dịch acid acetic 0.8 2.6 9.4 X 22.Dung dịch glycine 0.0 8.2 M (b): 16.121 184 264 879 816 736 6.0 pH 2.0 10.2 pH 3.0 4.8 pH 8.6 7.6 2.6 3.0 9.Dung dịch NaOH 0.0 38.Dung dịch HCl 0.2 32.2 – 3.0 6.0 13.6) . .4 g CH3COONa hoặc 27.8 24.2 9. Dung dịch đệm Glycine có pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X ml dung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml.5 pH 9.55 ml CH3COOH đặc và định mức đến 1000 ml. X 5.2M (b): 16.7 6.4 44.0 14.4 8.0 35.4 pH 3.6 3.6) .8 ml HCl đặc (37%) pha thành 1000 ml.2 11.2 39.8 4.4 10.5 8.8 10.4 885 936 969 115 64 31 7.8 9.8 b 3.2 3.2 5. .2 M (a): 15.0 16.01g glycine hòa tan và định mức đến 1000 ml.Dung dịch natri acetate 0.2 pH 4.2M (a): 11.0 *Dung dịch đệm Glycine – HCl (pH = 2.2 32.2 g CH3COONa.8 b 30.8 8.0 5. Dung dịch đệm Glycine có pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X ml dung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml. a 46.3H2O được hòa tan và định mức đến 1000 ml.3 44.8 10.6 – 10.4 .0 6.2 M (a): 15.2 M (b): 8 g NaOH hòa tan và định mức đến 1000 ml.8 5.6 *Dung dịch đệm acetate (pH = 3.4 3.6 45.0 41.8 12.01g glycine hòa tan và định mức đến 1000 ml.0 6. Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào X ml dung dịch (a) và Y ml dung dịch (b) và định mức đến 100 ml.6 8.0 36.

Các dung dịch đệm vạn năng nồng độ khác được chuẩn bị tương tự.18 g acid ortho-boric trong nước cất và định mức đến 1000 ml. Điều chỉnh giá trị pH của dung dịch đệm trong khoảng pH = 1. (c) với thể tích bằng nhau nhận được dung dịch đệm 0.8 đến pH = 12.5 24. .Dung dịch acid phosphoric 0. (b).0 bằng cách bổ sung dung dịch NaOH 1N (d).Dung dịch acid acetic 0. Trộn lẫn các dung dịch (a).7 ml CH3COOH đặc và định mức bằng nước cất đến 1000 ml.8.1M . .1M (c): hòa tan 6.5 19.1M có pH = 1.30.4 4.6 4.1M (b): 6.45 ml H3PO4 đậm đặc và định mức bằng nước cất đến 1000 ml.8 45.Dung dịch acid ortho-boric 0. . 16 .Dung dịch natri hydroxide 1N (d): hòa tan 40 g NaOH trong nước cất và định mức đến 1000 ml.6 *Dung dịch đệm vạn năng 0.1M (a): 5.5 25.5 4.2 5.

. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định.. Nghiền cẩn thận với bột thủy tinh hay cát sạch và 30 ml nước cất nóng 70 – 80oC. quả tươi) thì cân 5 – 10 g. .4 – 7. chanh.Bình định mức 50ml 17 .. Tùy đối tượng nghiên cứu (hạt.hóa chất: 1 Dụng cụ .. Nếu là nguyên liệu tươi (như hoa... Do đó cần xác định riêng đường khử và riêng saccharose. khoai tây. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. có thể chiết đường từ nguyên liệu bằng nước. ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ACID DINITRO-SALICYLIC (DNS) 1.. Tránh dùng quá dư chì acetate (dùng 2 – 5 ml chì acetate). Cân và cho vào cối sứ 1 g nguyên liệu hạt hay các mẫu thí nghiệm thực vật khô như cây. Sau đó loại bỏ lượng chì acetate dư bằng dung dịch Na2SO4 bão hòa.. đường saccharose có thể bị thủy phân một phần. .. đã được nghiền nhỏ (và sấy khô đến khối lượng không đổi)..BÀI 2.) mà cách chuẩn bị dung dịch nghiên cứu dùng để định lượng đường có khác nhau đôi chút. Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS). Trong trường hợp này không cần kết tủa protein bằng chì acetate vì lượng protein chuyển vào dung dịch không nhiều. Đun cách thủy 70 – 80oC trong 35 – 40 phút. để yên hỗn hợp 10 phút.Trường hợp nguyên liệu chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin như khoai lang.3H2O] hoặc chì nitrate [Pb(NO3)2] 10%. khế. đun hỗn hợp cách thủy trong bình cách thủy có lắp ống làm lạnh không khí. Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức dung tích 1000 ml. kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch chì acetate [Pb(C2H2O2)2.Trường hợp các nguyên liệu chứa nhiều acid hữu cơ như cà chua. quả. Trước khi đun cách thủy hỗn hợp phải trung hòa acid bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa tới pH 6.. lá hoặc quả khô. cần chiết đường bằng rượu 70 – 80oC. dứa. nhưng nguyên tắc chung như sau: . 2. Dụng cụ .0. Tiếp đó thêm nước cất tới vạch mức và đem lọc qua giấy lọc vào cốc hay bình khô.. Nước lọc dùng làm dung dịch thí nghiệm. sắn. cần chú ý là trong quá tình đun khi chiết.Trường hợp nguyên liệu thí nghiệm không chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin.

4 Ống 3 0. Pha loãng mẫu nếu cần sao cho mật độ quang nằm trong khoảng 0.2 Ống 2 0.8 Ống 5 1. đun sôi 2 lần trên nồi đun cách thủy→ Để nguội → lọc (lặp lại 2 lần) Đưa phần bã lên lọc và rửa bằng rượu nóng (800) Rượu qua lọc được cho bay hơi ở trong phòng hoặc trên nồi cách thủy đun nhẹ. Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang. Để lắng cặn khi đem làm hiện màu.8 9.Dung dịch glucose chuẩn 3. .nguyên liệu .4 9. trục hoành là nồng độ glucose.0 1.6. dứa) .04 mg glucose do glucose bị oxy hóa.2.0 Từ các ống nghiệm trên lấy 1ml ở mỗi ống vào 5 ống nghiệm khác và thêm vào mỗi ống 3ml thuốc thử DNS.6 Ống 4 0. Cặn khô trong cốc được pha loãng thành 50ml với nước cất.2 0. Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm với đối chứng là nước.8. 0. 1.Thuốc thử DNS .Mẫu rau quả chứa đường (rau cải ngọt. Đường thẳng thu được có thể cắt trục hoành ở 0. Sau khi cho bay hơi rượu. Cho tiếp 10ml cồn 800 vào cốc đựng bã.6 0. mẫu có thể để lâu trong bình hút ẩm.Dựng đường cong chuẩn và xác định hàm lượng đường Cho vào 5 ống nghiệm sạch với các chất có thể tích như bảng sau Hoá chất Glucose (10 mg/ml) Nước cất (ml) Nồng độ Ống 1 0.Chiết xuất đường trong thực vật 5g rau cải ngọt → nghiền nhỏ → cho vào becher 100ml + 10ml cồn 900 → đun cách thủy (sôi 3 lần) → khuấy đều bằng đũa thủy tinh → để nguội → lọc (chỉ gạn lấy phần trong).2 – 0. 0.6 9. khuấy đều. Trong mỗi ống nghiệm sẽ chứa tương ứng 0. 0.0 mg glucose. So màu rồi vẽ đồ thị mẫu (vẽ trên máy tính) Làm tương tự với mẫu dung dịch đường được chuẩn bị ở trên và một mẫu thử không (nước cất) 4.4.2 9.4 0.2. Tính kết quả Từ phương trình đồ thị đường cong chuẩn tính được % lượng đường trong mẫu vật. Tiến hành . Làm lạnh đến nhiệt độ phòng.8. Hóa chất . Và tuỳ theo nồng độ đường nhiều hay ít mà pha loãng thêm 5-10 lần.0 9.8 0. Đun sôi đúng 5 phút. 18 .

Chuẩn độ H2SO4 dư bằng NaOH 0...Bi thủy tinh . Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein .Bếp đun 19 . K.. là nitơ phi protein. bình hứng chứa H2SO4 0. Các phân tử chứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3.Bình cất đạm .Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác. MgO. Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau: 2H2SO4 → 2H2O +2SO2↑+ O2 . Nitơ có trong thành phần acid amine của protein là nitơ protein.BÀI 3. ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL 1. acid nitric. Ca. các alkaloid. urea và các dẫn xuất của urea. các base purine và pyrimidine.Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH (NH4)2SO4 + 2 NaOH = Na2SO4 +H2O + 2NH3↑ .NH3 bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH4OH rơi vào bình hứng..1N H2SO4 dư + NaOH → Na2SO4 + H2O 2. Nguyên tắc Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nitơ tổng số. Dụng cụ + Bộ chưng cất Kjeldahl định lượng Nitơ gồm: .Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. chuyển thành dạng oxide: P2O5...1N 2NH4OH + H2SO4 → (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 dư . CaO.Ống sinh hàn .. carbon và hidro của acid amine tạo thành CO2 và H2O. Mg.Ống dẫn khí . các acid amin tự do..Bình Kjeldahl phá mẫu . Ví dụ các protein bị thủy phân thành acid amine. Dụng cụ ..Bình hứng (becher 250ml) . các peptid.hóa chất a. . còn nitơ được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4 Các nguyên tố P. K2O. Nitơ không có trong thành phần protein như của các muối vô cơ.

+ Pipet 20ml. theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun. Hóa chất + nguyên liệu + Bột đậu nành (0.Vô cơ hóa mẫu Cân 100mg bột đậu nành đã sấy khô tuyệt đối cho vào bình Kjeldahl. cho tiếp 5ml H2SO4 đậm đặc sẽ thấy xuất hiện màu nâu đen (do nguyên liệu đã bị oxi hóa). . Cho thêm vào 200mg chất xúc tác. Trong khi đun. khi đã sôi giữ nhiệt độ bếp đun vừa phải để tránh hóa chất trào ra ngoài và không bị bay mất amoniac. Tiến hành . pipet 10ml + Erlen 250ml + vaseline Bộ chưng cất Kjeldahl b.1g) + H2SO4 đậm đặc + NaOH 40% + H2SO4 0. Đặt bình Kjeldahl lên bếp đun. dùng nước cất vô đạm tráng lại bình Kjeldahl và định mức đến vạch.1N chuẩn + NaOH 0. đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh Lưu ý giai đoạn này phải thực hiện trong tủ Hotte.1N chuẩn + Thuốc thử Tasiro + chất xúc tác: hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 (3:1) 3. đặt bình hơi nghiêng trên bếp. lắc nhẹ. đậy kín để khoảng 3 phút.Cất đạm 20 . Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100 ml. Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn. khi thấy dung dịch gần như trong suốt thì có thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở trên thành bình còn chưa bị oxi hoá vào trong dung dịch. tránh trường hợp khi sôi mạnh hóa chất bắn ra ngoài.

4. cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0.1N cho đến khi mất màu tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ.Chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có sẵn 50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro lúc này trong bình có màu tím hồng. Ngưng cất đạm. dùng giấy qùy thử ở đầu ống sinh hàn.42 hệ số .1N và 3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng). Bật công tắc cất đạm Sau khi cất đạm 10-12 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không. Tiến hành lắp hệ thống cất đạm. Ghi nhận thể tích NaOH 0. Nếu giấy qùy không đổi sang màu xanh là được. Đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống sinh hàn. . đợi hệ thống nguội mới tháo hệ thống đem đi rửa.42 * (V1-V2)*100/a}*2 V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứng V2: số ml NaOH 0.1N đã chuẩn độ a số miligam nguyên liệu 1.Chuẩn độ: Chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0. Tính kết quả: Hàm lượng % nitơ tổng số được tính theo công thức N (mg%) = {1.1 N sử dụng. Tiếp tục cho vào bình cất 15ml NaOH 40% cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển sang màu xanh lá mạ (thêm 5ml NaOH 40% nếu dung dịch trong bình chưa chuyển hết sang màu xanh lá mạ).42mg Nitơ 21 . cứ 1 ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với 1.

đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ. Dung dịch protein chuẩn thường là bovine serum albumin. Để xác định protein trong mẫu. Đó chính là lượng protein mẫu trong dung dịch đo.Đồng hồ bấm giây . Lượng protein mẫu trong dung dịch đo được xác định bằng cách chấm trên đường chuẩn theo OD. Công thức phân tử của Coomasie Brilliant Blue G-250 2. 1ml (có thể thay bằng pipetteman) .Ống nghiệm (14) . Độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein. khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm.BÀI 4.hóa chất 1.Máy đo quang phổ .OD0.Bình tia đựng cồn 22 . Thực hiện một đối chứng với nước cất (OD0). Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm. Dụng cụ . khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại 465 nm. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD 1. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế ta được ODx. Dụng cụ . Trong dung dịch mang tính acid.Giá để ống nghiệm .Giấy thấm . lấy giá trị của điểm đó trên trục hoành. độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với lượng trong mẫu. Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Lấy giá trị OD = ODx .Pipette 5ml. màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ.

được dung dịch có nồng độ 0. Ghi lại giá trị OD.1mg/ml) TT Bradford Nồng độ Albumin (µg/ml) 0 1 0 5 0 1 0.Dung dịch thuốc thử Bradford: dung dịch thuốc thử có thành phần trong 100ml như sau: Coomassie Brilliant Blue: 0. riêng ống nghiệm X cho 1 ml mẫu cần phân tích do phòng thí nghiệm cung cấp (nếu cần sinh viên tự pha loãng mẫu trước khi phân tích) .1 5 10 2 0.6 0.Bổ sung các thành phần như bảng sau. Tính kết quả: .5 0. 3. lắc đều cho tan.. pha trong 1 ml nước cất.Dung dịch cần xác định hàm lượng protein (phòng thí nghiệm cung cấp) 3. Ở thời điểm 1 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 1. Ống nghiệm Nước cất (ml) Albumin chuẩn (0. 5 và 1 ống nghiệm chứa mẫu cần phân tích X .Cồn 900 . cứ tiếp tục cho đến hết.2.5 5 50 X 5 ? ..7g Phosphoric acid 85%: 8.5g Phẩm màu Coomasie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong một chai đựng màu tối có nắp. .4 5 40 5 0.Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595 ở trên ta tính được hàm lượng protein ở trong mẫu phân tích 23 ..005g Ethanol tuyệt đối: 4. 4. 2.Dung dịch protein chuẩn: cân 10 mg albumin bằng cân phân tích.7 0. Khi dùng pha loãng ra 100 lần.2 5 20 3 0. ở thời điểm 21 phút đo ống 1 (OD1).1 mg/ml. Bổ sung phosphoric acid và chỉnh tới 100ml bằng nước cất.. Giữ ở -200C. canh thời gian 0 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 0.Dùng đồng hồ bấm giây. Tiến hành . giữ ở 40C . Lắc đều. tương tự cứ cách một phút đo cho hết các ống.3 5 30 4 0. lắc đều để yên.9 0..Lập một loạt 6 ống theo số thứ tự 0. lắc đều để yên. Ta có giá trị OD0.Tính thời gian ống 0 được 20 phút.9 0. tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 595 nm. 4.Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595 .. 1. Hóa chất .

a) Đơn vị hoạt tính thông dụng nhất là đơn vị quốc tế (Enzyme Unit. độ nhớt . phương pháp sắc ký và phương pháp hóa học. c) Đơn vị hoạt tính dựa vào sự thay đổi đặc tính hỗn hợp phản ứng. độ nhớt. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME 1. áp suất. c ó n h iề u đơ n vị h o ạ t tín h e n z y m e . Hoạt động hay hoạt tính của enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất được chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn. nhiều phương pháp phân tích khác nhau được sử dụng: phương pháp đo quang phổ. Enzyme và đơn vị đo hoạt tính enzyme Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và có tính đặc hiệu cao. 1 Kat = 1 mol cơ chất/ giây = 60 mol/ phút = 60 x 106 mol/ phút = 6 x 107 U 1 U = 1/60 x 10-6 Kat = 16. 1 U = 1 mol sản phẩm = 1 mol cơ chất (10-6 mol)/phút b) Năm 1979.Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định..67 nKat (nanokatal) Đơn vị Katal được khuyến cáo vì nằm trong hệ đơn vị đo lường Quốc tế (SI). Về nguyên tắc có thể hai nhóm phương pháp chính sau: . ví dụ sự thay đổi độ đục. Trường hợp cơ chất và sản phẩm là một hỗn hợp phức tạp thì áp dụng đơn vị hoạt tính này. Để thực hiện được mục đích trên. đo độ phân cực.trong một đơn vị thời gian. N h ư v ậ y . * Đơn vị hoạt tính enzyme : Mục đích xác định hoạt tính enzyme là xác định số đơn vị hoạt tính.. Đ iề u q u a n tr ọ n g n h ấ à lcầ n đ ịn h t n g hĩa rõ rà n g đ ơ n vị h o ạ t tín h .Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm tương ứng với một nồng độ enzyme xác định. Một đơn vị họat tính enzyme được định nghĩa theo nhiều phương pháp. 24 . Nguyên tắc 1. viết tắt U) do Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (International Union of Biochemistry – IUB định nghĩa: Một đơn vị chuẩn của enzyme (1 U) là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được 1 mol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn. Mỗi enzyme có khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định. Vì vậy có thể đánh giá hoạt tính xúc tác của enzyme bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa cơ chất hoặc tốc độ tích lũy sản phẩm phản ứng. Hội đồng Danh pháp của IUB khuyến cáo nên sử dụng Katal làm đơn vị cơ bản của hoạt tính enzyme: Một Katal là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được 1 mol cơ chất sau 1 giây ở điều kiện tiêu chuẩn.BÀI 5.1. .

n ồ n g đ ộ io n àv th à n h p hầ n d u n g d ịc h đ ệ m ả n h h ư ở n g lê n h oạ t tín h e n z y m e . ớ N ồ n g đ ộ cơ c hấ t tro n g p h ả n ứ n g e n z y m e p h ả i ở tr o n g g iớ i h ạ n th íc h h ợ p . S a u k h i ể d ừ n g p h ả n ứ n g ư ợ n g cơ c hấ t đư ợ c c h u y ể n h ó a 2 0 0 % . trong đó hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Lowry hoặc Bradford). T h ử h o ạ t tín h e n z y m e p h ả ư ợđc tiế n hà n h i tro n g đ iề u k iệ n th íc h h ợ p nư đ iề u k iệ n s in h lý . Hoạt tính riêng được biểu thị bằng số đơn vị enzyme/mg protein protein (U/mg protein) hoặc Kat/kg protein.Hoạt tính riêng (specific activity) của enzyme Hoạt tính riêng của một chế phẩm enzyme đặc trưng cho độ tinh sạch của chế phẩm enzyme. Động học phản ứng enzyme T r o n g b à i thự c hà n h n à y . E n zy m e a m y la se v à p h ư ơ n g p h á p x á c ịn h h o ạ t tín h đ * K h a i q u á t về en zy m e a m ylase A m y la s e là c á c e n z y m e x ú c tá c c h o c á c p h ứ n g th ủ y p h â n tin h b ộ t. s a u đ ó b ắ t đ ầ u g iả m (H h 1 ). C á c th ô n g số n h iệ t đ ộ . V ớ i n h ữ n g e n z y m e c ầ n c ó c h ấ t h o ạ t h ó a h o ặ c c h ấ t ổ n đ ịn hì thhả i c h o c á c p c hấ t nà y v à o e n z y m e tr ư c k h i c h o cơ c hấ t và o hỗ n h ợ p p h ả n ứ n g . đ ủ th ừ a đ ể bã o e n z y m e . g ly c o g e n . * Điều kiện phản ứng để xác định hoạt tính K h i tiế n hà n h thự c n g h iệ m c ầ n trá n h n h ữ n g ế u tố c ó th ể b iế n tín h p r o te in y enzym e. T r o n g m ẫ u đ ố i c h ứ n g e n z y m e p h ả i b ị b ấ t h o ạ ư ớ c k h i tiế p x ú c t tr v ớ i cơ c hấ t.2 . ìn K h i x á c địn h h o ạ t tín h p h ả i àlm mẫ u đ ố i c h ứ n g s o n g s o n g v ớ i m ẫ u th í n g h iệ m . Hình 1. v ì g ia iđ oạ n nà y tố c đ ộ p hả n ứ n g lớ n 0 n hấ t.6 0 g iâ y ). Tố t n h ấ t là x á c địn h tố c đ ộ ư b a n đầ u c ủ a p h ả n ứ n g (3 . p H . s in h v iê n là m q u e n ớ i p hư ơ n g p h á p x á c đ h h o ạ t tín h v ịn e n z y m e a m y la s e 1 . n hư n g k h ô n g q u á c a o đ kìm h ã m e n z y m e . đ iề u k iệ n tồ n trữ th ự c h p hẩ m h oặ c đ iề u k iệ n mà h oạ t lự c c ó th ể đ ạ t tố iư u . l -3 T hờ i g ia n x á c đ ịn h h o ạ t tín h thờ n g 5-3 0 p h ú t. àv ản 25 .

h ạ t hò a ư thả o n ả y m ầ m .c á c p o ly s a c c h a r id e tư ơ n g ựt .9 4 . B ả o q u ả n d u n g d ịc h tro n g b ìn h m à u n â uđ ể c h ỗ tố i. i D u n g dịc h đ ệ m p h o s p h a te p H = 4 .1.2. b ổ s u n g ưnớ c c ấ t đ ế n v ạ c h m ứ c . D u n g dịc h tin h b ộ t 1 % :h ò a ta n 1 g tin h b t (th e o c h ấ t k h ô tu y ệ t đ ố i) v ớ i 5 0 ộ 26 .5-5.9 (x á c đ ịn h h o ạ t tín h e n z y m e cm a lt): ủ trộ n 1 0 m l d u n g d ịc h N2a P O 4 1 /1 5 M vớ i 9 9 0 m l d u n g d ịc h K HP O 4 1 /1 5 M H 2 n hậ n đư ợ c 1 l d u n g d ịc h đ ệ m p h o s p h a te p H = 4 .4-glucanase. * C á c p h ư ơ n g p h á p đ o h o tín h en zym e -am ylase ạt N g u y ê n tắ c c h u n g d ự a tr n c ơ sở th ủ y p h â n tin h b ộ t b ở i e n z y m e tro n g d u n g ê d ịc h e n z y m e n g h ê n cứ u thà n h c á c d e x tr in c ó p h â n ửt lư ợ n g k h á c n h a u . EC 3.4-glycoside từ đầu không khử tạo thành maltose và dextrin phân tử lớn. d u n g n d ịc h tin h b ộ t n h a n h c h ó n g b ị m ấ t k h ả n ă n g tạ o à m vớ i d u n g d ịc h io d v à u e b ị g iả m đ ộ n h ớ t. n h n g k é m b ề n v ớ i a c id .4-glucanase.2 .6-glycoside từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. Đ oc ườ n g i đ ộ m à u tạ o thà n h g iữ a tin h b ộ t v c á c sả n p h ẩ m th ủ y p h â n c ủ a n ó v ớ i io d bằ n g à e m á y s o m à u sẽ tín h đư ợ c h o ạ t tín h e n z y m e . xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1.1 N D u n g dịc h io d : h ò a ta n 3 0 m g K I v à 3 m g I 2 ớv m ộ t lư ợ n g n h ỏ nư ớ c c ấ t.4. Enzyme này mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC. D u n g dịc h H C l 0 . ní 2.4-g ly c o sid e ở g iữ a c h u ỗ i p o ly s a c c h a r id e (h o ạ t tín h e n d o a m y la s e ) tạ o th à n h m a lto s e . củ). Enzyme này mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC.1 . Đ ơ n vị a m y la s e l lượ n g e n z y m e c ầ n th iế t đ ể th ủ y p h â n h o to à n 1 0 m g à àn tin h bộ t s a u th ờ i g ia n p h ả n ứ n g 3 0 p h ú t tr o n g đ iề u k iệ n th g h iệ m . nhưng bền với acid hơn -a m y la s e . E C 3 . Dư ớ i tá c d ụ n g c ủ a e n z y m e à y . Sản phẩm chủ yếu là glucose và dextrin. ư -a m y la s e (Exo -1. E n z y m e yn p h â n g iả i liê n kế t à 1 .1.3) xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1. s a uđ ó c h u yể n d u n g d ịc h s a n g bn h ò ì đ ịn h m ứ c 1 0 0 0 m l. Glucoamylase (Exo -1. v i k h u ẩ n .5. H ó a chấ t – D ụ n g cụ : D u n g dịc h đ ệ m D u n g dịc h đ ệ m a c e ta te p H = 4 . n ấ m m ố c .2. K iể m tra p H .1 M p H = 1 0 (d n g để x á c đ ịn h h o ạ t tín h ù -a m y la s e k iề m .và 1. tụ y tạ n g . A m y la s e c h ia à m 3 loạ i c h ín h : l -a m y la s e (Endo -1.4-g lu c a n a s e. Nhiều glucoamylase hoạt động mạnh ở pH 3.1 ) c ó tr o n g n ớ c b ọ t. d e x trin p h â n ửt th ấ p . EC 3. K ể m tra p H . -a m y la s e bề n v ớ i n h iệ t.2) có nhiều ở thực vật (hạt. D u n g dịc h đ ệ m g ly c in e – N a O H 0 .7 (x á c đ ịn h h o ạ t tín h e n z y m e n ấ m m ố c ): tr ộ n 1 thể tíc h C H3 C O O H 1 N vớ i 1 th ể tíc h C H3 C O O N a 1 N . i L ắ c n h ẹ h ỗ n h ợ p đ ể h a ta n h o à n to à n .

c h o và o b ìn h t -1 n ó n d u n g tíc h 2 5 0 m l. lắ c đ ề u . T ríc h ly e n z y m e n m m ố c : C â n m = 5 g c h ế p h ẩ m e n z y m e th ô đ g h iề n ấ ã n s ơ bộ . m ẫ u đ ố i c h ứ n g àvm ẫ u trắ ng M ẫ u th í n g h iệ m M ẫ u đ ố i c h ứ n g M ẫ u trắ n g D u n g dịc h tin h b ộ t 1 % 2 ml 2 ml 0 N ướ c c ấ t 0 0 2 ml Đệm 1 ml 1 ml 1m l D u n g dịc h N a C l 3 % 0 . N hvậ y . dù n g đũ a th ủ y tin h c h cẩ n th ậ n c h ế p h ẩ m tr o n g m ộ t c ố c d u n g th à íc 5 0 m l. m ô độ n g ư o thự c v ậ t b ằ n g d u n g d ịc h đ ệ m c ó p H th h hợ p . B ả o q u ả n d u n g c h e n z y m e gố c ở 2 – 4 o C tro n g thờ i dị g ia n 1 n g à y .7 0 % tin h bộ t tr o n g d u n g d ịc h ở đ iề u k iệ n x á c đ ịn h . Gữi h ỗ n h ợ p ở n h iệ t đ ộ 3 0C tr o n g thờ i g ia n 1 g iờ c ó k h uấ y đ ả o đ ịn h k ỳ .5 m l 0 . C h uẩ n b ị m ẫ u th í n g h iệ m . bổ s u n g 9 0 m l n ớ c c ấ t và dịc h đ ệ m a c e ta te p H = 4 . ổb s u n g 9 0 m l n ớ c c ấ t và 1 0 m l d u n g dc h đ ệ m ư ị o p h o s p h a te p H = 4 .7 . B o q u ả n d u n g d ịc h e n z y m e g ố c ở – 4 C tr o n g thờ i g ia n ả 2 1 ngày. * D u n g dịc h e n z y m e đ ể p h â n tíc h P h a lo ã n g d u n g dc h e n z y m e g ố c (h ệ s ố p h a lon g n) bằ n g d u n g d ịc h đ ệ m ị ã s a o c h o tr o n g 1 m l d u n g ịc h e n z y m e p h â n tíc h c ó cứ a m ộ t lư ợ n g e n z y m e đ ủ đ ể d h thủ y p h â n 2 0 % . Đ ặ t àv bế p c á c h th ủ y ìn o đ a n g s ô i. S a u đ ó c h u y n toà n bộ c h ế p h ẩ m v o b ìn h ta m g iá c d u n g tíc h 2 5 0 ể à m l. T iến hà n h : T ríc h ly e n z y m e : e n z y m e đợ c tríc h ly từ c h ế p h ẩ m h a y tế à b .7 ( h o ặ c 1 0 m l d u n gh đ ệ m d ịc p h o s p h a te p H = 4 . S a u đ ó c h u y ể n ton bộ h ỗ n h ợ p và o b ìn h đ ịn h à m ứ c d u n g tíc h 1 0 0 m l. b ổ s u n g ư ớ c cấ t tớ i v ạ c h m ứ c . L ọ cà vth u hồ i d ịc h tríc h ly e n z y m e .1 g c h ế p h ẩ m n g h i cứ u .5 m l 27 . lắ c đ ề u . cí T ríc h ly e n z y m e ừ v i k h u ẩ n : C â n m = 0 .9 . S a u đ ó là m n g ộ i u v à bổ s u n g 1 0 m l đ ệ m a c e ta te p H = 4 . lắ c liê n tụ c c h o đ ế n k h i tin h b ộ t ta n hàon to à n . L ọ c à th u hồ i d ịc h n v o tríc h ly e n z y m e . L ọ c à th u hồ i d ịc h tríc h ly e n z y m e .m l n ướ c c ấ t tro n g b h đ ịn h m ứ c 1 0 0 m l. dù n g t ên đ ũ a th ủ y tin h c h cẩ n th ậ n c h ế p h ẩ m tr o n g m ộ t c ố c th ủ y tin h d u n g tíc h 5 0 à m l vớ i m ộ t lư ợ n g nư ớ c n h ỏ .9 ) ổ s u n g nư ớ c c ấ t đ ế n v ạ c h m ứ c . B ả o q u ả n d u n g v o d ịc h e n z y m e g ố c ở 2– 4 C tr o n g thờ i g ia n 1 n gà y . G iữ h ỗ n h ợ p ở ư o n h iệ t đ ộ 3 0 C tr o n g thờ i g ia n 1 g iờ c ó k h u ấ y đ ả o đ ịn h k ỳ . D u n g d ịc h b đ ư ợ c c h u ẩ n b ị tr o n g n g y sử d ụ n g .5 m l 0 . đ ộ ư p h a lo ã n g p hụ th u ộ c và o h oạ t tín h c h ế p h ẩ m e n z y m e c ầ n p h â n tíc h . à D u n g dịc h e n z y m e g ố c 3. T ríc h ly e n z y m e ừ m a lt : C â n m = 5 0 g m a lt đã n g h iề n n h ỏ .

ở 4. Đ o mậ t đ ộ q u a n g c ủ a c á c d u n g d ịc h bư ớ c s ó n g = 6 2 0 n m s o vớ i m ẫ u trắ n g .5 m 1 0 1 ml 1 ml 4 ml 0 .Ủ 4 0o C .5 m l 0 .5 m 1 D u n g dịc h đ ố i c h ứ n g c ó m u x a n h à D u n g dịc h th í n g h iệ m c ó m u tím vớ i cư ờ n g đ ộ k h á c n h a u ù y v à o lượ n g tin h b ộ t à t c h ư a bị th ủ y p h â n . 3 0 p h ú t để x ả y ra p h ả n ứ n g H Cl 1N 1 ml 1 ml E nzym e 0 1m l N ướ c c ấ t 4 ml 4 ml Io de 0 . T ín h kết q u ả : D = mậ t đ ộ q u a n g S ố m g tin h b ộ t b ị th ủ y p h â n S = H oạ t tín h e n z y m e a m y la s e : Hoạt tính chung = S n 10  m ( Do D ) x 20 Do trong đó: n = hệ số pha loãng m = khối lượng enzyme 28 . 1 0 p h ú t để đ ạ t n h iệ t đ ộ D u n g dịc h e n z y m e 1 ml 0 o Ủ 4 0 C .

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful