TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.

HCM

KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC

----------

----------

BÀI GIẢNG

THỰC HÀNH HOÁ SINH

Biên soạn: TS. Nguyễn Hoài Hương CN. Bùi Văn Thế Vinh

Tp. Hồ Chí Minh, 04/2009

Lời mở đầu
Bài giảng “Thực hành sinh hoá” dành cho sinh viên năm thứ hai khoa Môi trường & Công nghệ Sinh học, trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM. Với thời lượng 30 tiết và tuỳ thuộc điều kiện, cơ sở vật chất của phòng thí nghiệm cho phép, sinh viên tiến hành làm 5 bài thực hành gồm các nội dung chính của học phần lý thuyết sinh hóa cơ sở. 1. Giới thiệu phòng thí nghiệm sinh hóa, cách pha chế các dung dịch chuẩn độ và các dung dịch đệm; 2. Định lượng đường khử bằng phương pháp acid dinitro-salicylic (DNS); 3. Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl; 4. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford; 5. Xác định hoạt tính enzyme amylase.

2

Điểm môn học sẽ gồm điểm thực hành thao tác.Sinh viên phải có mặt đủ và đúng giờ trong các buổi thí nghiệm. lau sạch bàn thí nghiệm và bàn giao cho cán bộ phòng thí nghiệm.Cuối mỗi buổi thí nghiệm sinh viên phải nộp bản báo cáo kết quả thí nghiệm cho giáo viên hướng dẫn. tuân thủ nội quy và điểm các bài báo cáo.Mỗi bài thí nghiệm sẽ có điểm. micropipet. 2. thiết bị thì phải bồi thường. burette. phương trình phản ứng.Sau khi thí nghiệm..Sinh viên phải đọc kỹ. cẩn thận. . Thiếu một bài thí nghiệm coi như chưa hoàn tất chương trình. Viết báo cáo ngắn gọn. . Cân điện tử 2. . bình Kjendahl. Máy ly tâm 6.Trong PTN phải mặc áo blouse. . Làm vỡ hoặc gây hư hỏng dụng cụ.Khi làm thí nghiệm phải trật tự. sắp xếp lại dụng cụ. Bộ chưng cất Kjendahl (hoặc máy cất nitơ tự động) 4. Các dụng cụ thủy tinh khác: bình định mức. tiết kiệm hoá chất. . Máy đo so màu quang phổ 3. Yêu cầu đối với sinh viên làm thí nghiệm: . . rất thận trọng khi sử dụng dung môi dễ cháy nổ và hóa chất độc hại. Đạt yêu cầu. . viết tay gồm nguyên tắc. 3 . Máy đo pH 7. phương pháp. Hướng dẫn sử dụng một số thiết bị trong phòng thí nghiệm 1. sự hiểu bài. hóa chất đúng chỗ. lớp cử một tổ trực nhật có nhiệm vụ nhắc nhở các bạn giữ vệ sinh chung và làm sạch PTN sau giờ thí nghiệm. sinh viên phải rửa dụng cụ. sơ đồ tiến hành thí nghiệm. Mỗi buổi thí nghiệm. công thức tính và kết quả tính cùng các ý kiến giải thích hay nhận xét. sinh viên mới được làm thí nghiệm.. Trước buổi thí nghiệm giáo viên hướng dẫn sẽ kiểm tra việc chuẩn bị của sinh viên.BÀI 1: CÁCH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH CHUẨN ĐỘ VÀ CÁC DUNG DỊCH ĐỆM 1. Máy khuấy từ 5. giữ sạch nơi làm thí nghiệm. pipet.. bảng kết quả thô. nắm vững nội dung bài thí nghiệm và chuẩn bị sẵn bản báo cáo kết quả trước khi đến phòng thí nghiệm (PTN). Nếu nghỉ học có lí do chính đáng thì sinh viên phải xin phép giáo viên sắp xếp cho làm thí nghiệm bù.

Tránh tạo tinh thể cứng khi hoà tan. K. thiết bị bảo vệ hệ thống hô hấp. An toàn khi làm việc với axit và kiềm 1. Tạo hơi ăn mòn khi cháy. halogen. mang mặt nạ chống độc để phòng ngừa bụi và hơi kiềm.. halogen.3. và muối của chúng. CO2. luôn phải cho axit vào nước trừ phi được dùng trực tiếp Giữ để axit không bắn vào da hoặc mắt bằng cách đeo khẩu trang. Các biện pháp an toàn như trên. ẩm. mắt gây hại nghiêm trọng cho hệ hô hấp Mang găng tay cao su. Li.. tiến hành phản ứng. phản ứng cực mạnh với nước.. Cần mang dụng cụ bảo vệ da mắt. Ca: phản ứng cực mạnh với nước. găng tay và kính bảo vệ mắt. trong phòng thí nghiệm được gọi là hóa chất thí nghiệm. kính bảo hộ. axit mạnh. Kim loại Na. đường hô hấp do dễ nhiểm bụi oxit. Hoá chất thí nghiệm: Các hoá chất dùng để phân tích. cho từng viên hoặc ít bột vào nước chứ không được làm ngược lại. cho vào từ từ. khẩu trang. dẫn xuất clo của hydrocacbon. mang găng tay cao su.. Amoniac: là một chất lỏng và khí rất ăn da. 4 . Amoni hydroxyt: chất lỏng ăn da. Zn . An toàn khi làm việc với axit: Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nóng axit hoặc thực hiện phản ứng với các hơi axit tự do Khi pha loãng. Pb. 4. Chuẩn bị thí nghiệm 1. 2. cần bảo vệ da mắt. phản ứng mạnh với chất oxy hoá. . Hơi amoniac dễ cháy. Tương tự khi hoà tan với nước. Natri và kali hydroxyt: rất ăn da. Nếu làm văng lên da. tạo hỗn hợp nỏ với nhiều kimloại nặng: Ag. Chỉ sử dụng cồn khô khi tạo dung dịch natri alcoholate. Oxit canxi rất ăn da. khẩu trang khi làm việc với dung dịch kiềm đậm đặc Thao tác trong tủ hút. axit mạnh. An toàn khi làm việc với kiềm Kiềm có thể làm cháy da. sử dụng khẩu trang và găng tay để tránh phòng khi văng acid Các acid dạng hơi (HCl) thao tác trong tủ hút và mang găng tay. phản ứng cực mạnh với nước. làm tiêu bản. lập tức rửa ngay bằng một lượng nước lớn Luôn phải đọc kỹ nhãn của chai đựng và tính chất của chúng H2SO4: Luôn cho acid vào nước khi pha loãng. đồng thời phải làm lạnh nhanh.

vô cơ. C2H2 .Sạch hóa học (PC): độ sạch > 99% Hóa chất có độ tinh khiết khác nhau được sử dụng phù hợp theo những yêu cầu khác nhau và chỉ nên sử dụng hóa chất còn nhãn hiệu 2. 5 . khối lượng phân tử.Sạch phân tích (PA): độ sạch < 99% .. Những điều cần nhớ khi sử dụng và bảo quản hóa chất được tóm tắt như sau: . NaOH. . .. Cách sử dụng và bảo quản hoá chất: Khi làm việc với hóa chất. (CH3COO)2.) hoặc khí (Cl2.) hay theo một thứ tự a. acid. ethanon. KCl. nơi sản xuất.Sạch kỹ thuật (P): độ sạch > 90% . nhân viên phòng thí nghiệm cũng như sinh viên cần hết sức cẩn thận. NH3. aceton. b. MgO.. điều kiện bảo quản.. chloroform. tạp chất.Hoá chất có thể ở dạng rắn (Na. bazơ. muối. N2.. lỏng (H2SO4... c để khi cần dễ tìm. khối lượng tịnh.) và mức độ tinh khiết khác nhau: ...Hóa chất phải được sắp xếp trong kho hay tủ theo từng loại (hữu ơ. công thức hóa học. mức độ sạch. 3. tránh gây những tai nạn đáng tiếc cho mình và cho mọi người. kim loại. Nhãn hiệu hoá chất: Hóa chất được bảo quản trong chai lọ thủy tinh hoặc nhựa đóng kín có nhãn ghi tên hoá chất.

. không ngửi hay nếm thử hóa chất.Các loại hóa chất dễ bị thay đổi ngoài ánh sáng cần phải được giữ trong chai lọ màu vàng hoặc nâu và bảo quản vào chổ tối. nếu là chất lỏng thì gọi là dung chất. Nếu bị bắn vào mắt. nếu là base phải súc miệng và uống nước lạnh có CH3COOH 1%.Tất cả các chai lọ đều phải có nhãn ghi. base. .Không hút bằng pipette khi chỉ còn ít hóa chất trong lọ.Chai lọ hóa chất phải có nắp. có mùi. Nếu chất hòa tan ở dạng rắn thì gọi là chất tan. không dùng lẫn nắp đậy và dụng cụ lấy hóa chất.Khi làm việc với chất dễ nổ. Không hút acid hay base bằng miệng mà phải dùng các dụng cụ riêng như ống bóp cao su. Hàm lượng chất hòa tan trong dung dịch thể hiện ở nồng độ dung dịch. muối trong phòng thí nghiệm là dung dịch nước. 1. nếu là acid phải súc miệng và uống nước lạnh có MgO. Khi cần sử dụng các hóa chất dễ bốc hơi. Lưu ý các kí hiệu cảnh báo nguy hiểm. Dung dịch Dung dịch là hỗn hợp của hai hay nhiều chất tác động tương hỗ với nhau về mặt vật lý và hóa học. . phân tích và tính toán khác nhau. dội mạnh với nước lạnh hoặc NaCl 1%.Dụng cụ dùng để lấy hóa chất phải thật sạch và dùng xong phải rửa ngay. (%) 6 . . dễ cháy không được để gần nơi dễ bắt lửa. Trường hợp bị hóa chất vào miệng hay dạ dày. chú ý đậy kín nắp sau khi lấy hóa chất xong.. dùng xong phải trả đúng vị trí ban đầu. Trường hợp bị bỏng với acid hay base rửa ngay với nước lạnh rồi bôi lên vết bỏng NaHCO3 1% (trường hợp bỏng acid) hoặc CH3COOH 1% (nếu bỏng base). phải đọc kỹ nhãn hiệu hóa chất trước khi dùng. cổ chai. .Khi làm việc với acid hay base mạnh: Bao giờ cũng đổ acid hay base vào nước khi pha loãng (không được đổ nước vào acid hay base). Trước khi mở chai hóa chất phải lau sạch nắp. dùng dung môi là nước. . 5. tránh bụi bẩn lọt vào làm hỏng hóa chất đựng trong chai.. Một số chất khác tan trong dung môi hữu cơ. Các đơn vị nồng độ dung dịch * Nồng độ phần trăm. Có nhiều cách biểu thị nồng độ khác nhau. Trong dung dịch gồm có chất hòa tan và dung môi. phải đưa vào tủ hút. Phần lớn các dung dịch acid... Tùy theo tính chất của dung môi mà phân thành dung dịch nước và dung dịch khan. Mỗi cách sẽ tiện dụng trong chuẩn bị.

Phần nghìn.khối lượng... hòa tan ta được 500g dung dịch NaOH 40% . (Mol/L) hay M: là số phân tử gam (hay số mol) chất tan trong 1 lít dung dịch.5H2O.5N là trong 1000ml dung dịch chứa 0. Ví dụ: Dung dịch KH2PO4 M/15 là trong 1000ml dung dịch chứa M/15 phân tử gam KH2PO4 * Nồng độ đương lượng gam..Phần tỷ.Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO4. . Ví dụ: dung dịch gycerine 10% (v/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10ml glycerin * Nồng độ gam-lit. µg%: là số µg chất hòa tan trong 100g dung dịch.Nồng độ mg/mL: số mg chất tan trong 1mL dung dịch .Nồng độ phần trăm thể tích .Microgam phần trăm. mg%: mg chất hòa tan trong 100g dung dịch.5đlg KOH * Nồng độ dung dịch bảo hòa: là khối lượng tối đa chất hòa tan trong dung dịch. Ví dụ: dung dịch KOH 0. % (v/v): là số ml dung chất có trong 100ml dung dịch.Chất tan là chất rắn khan: Ví dụ: 1) Pha 500g dung dịch NaOH 40% (w/w) 100g dung dịch cần 40g NaOH 500g dung dịch cần Xg? Lượng NaOH cần để pha dung dịch : X= (40*500)/100= 200g Lượng nước cần thiết: 500-200=300g (hay 300ml) Vậy. 2.Miligam phần trăm. 0/00: số g chất hòa tan trong 1000g dung dịch. cân 200g NaOH và đong 300 ml nước cất.Nồng độ phần trăm khối lượng . 12H2O. (N): là số đương lượng gam (đlg) chất tan có trong 1 lit dung dịch. .) Khi pha dung dịch cần phải tính thêm lượng nước kết tinh có sẵn. ppb: số µg chất hòa tan có trong 1kg hay 1 lít dung dịch. .Nồng độ % khối lượng thể tích (w/v): là số g chất tan có trong 100ml dung dịch. % (w/w) . Cách pha dung dịch có nồng độ xác định * Pha dung dịch có nồng độ phần trăm theo khối lượng. Na2HPO4. 7 . Ngoài ra trong các phép phân tích vi lượng còn có một số đơn vị nồng độ khác như: .thể tích.. Ví dụ: dung dịch NH4Cl 5% (w/w) là trong 100g dung dịch có chứa 5g NH4Cl .Phần triệu. . ppm: số mg chất hòa tan trong 1kg hay 1 lít dung dịch. * Nồng độ phân tử gam hay nồng độ mol. Ví dụ: dung dịch CuSO4 10% (w/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10g CuSO4 . (g/L): là số gam chất tan có trong 1 lít dung dịch. % (w/w): là số gam chất tan có trong 100g dung dịch.

Nếu chất tan tan hết.) Khi pha dung dịch ta cần phải tính đến lượng nước kết tinh có sẵn giống như ở phần a. hòa tan và định mức thành 1 lít bằng nước cất. .Cách pha nhanh dung dịch bão hòa khi không tra được số liệu từ bảng: Lấy chất tan cần pha vào becher.5H2O) = 250 Lượng CuSO4 khan để pha dung dịch là: X = (10*320)/100 = 32g Lượng CuSO4. Nếu sau khi khuấy. Na2HPO4. cân 50g NaCl.. dùng nước cất hòa tan và định mức đến thể tích đúng.5H2O. Nếu cho thêm chất tan vào dung dịch bão hòa thì lượng chất tan đó không tan được nữa và sẽ lắng xuống.Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO4. Muốn pha dung dịch bão hòa cần phải biết độ tan tối đa của chất tan (nồng độ bão hòa).5H2O M(CuSO4) = 160 và M(CuSO4.. . Tra cứu những số liệu này trong "Sổ tay các hiện tượng hóa lý". ta được 1lít dung dịch NaCl 5%. đong 270ml nước cất. Ở mỗi nhiệt độ khác nhau. cân 50g CuSO4. thêm một ít nước cất và khuấy cho tan.Ví dụ: 2) Pha 320g dung dịch CuSO4 10% (w/w) từ CuSO4. . . hòa tan ta được 320g dung dịch CuSO4 10%.5H2O cần dùng: Y = (250*32)/160 = 50g Lượng nước cất thêm vào: 320 -50 = 270g (hay ml) Vậy.Pha dung dịch bão hoà: Dung dịch bão hòa là dung dịch có lượng chất tan tối đa. cứ như thế cho đến khi chất tan không còn tan được nữa. chuyển sang bình định mức. thêm chất tan và tiếp tục khuấy. H2SO4 . chất tan không tan hết lắng xuống thì phần dung dịch phía trên là dung dịch bão hòa.Chất tan là chất rắn khan Cân lượng chất tan cần thiết. 8 .5H2O. 12H2O. đong 250ml nước cất và 250g dd NaOH 10%. mỗi loại dung môi khác nhau thì nồng độ bão hòa của mỗi loại chất tan sẽ khác nhau.. hòa tan ta được 500g NaOH 5% . * Pha dung dịch có nồng độ % theo thể tích ..Chất tan dạng lỏng: Một số chất tan ở dạng lỏng như HCl.. Ví dụ: 3) Pha 1 lít dung dịch NaCL 5% (w/v) Lượng NaCl cần để pha dung dịch: X = (5*1000)/100 = 50g Vậy.Pha dung dịch loãng từ một dung dịch đậm đặc hơn: Ví dụ: 3) Pha 500g dung dịch NaOH 5% từ dung dịch NaOH 10% Lượng NaOH cần để pha dung dịch 5% là: X = (5*500)/100 = 25g Lượng dung dịch NaOH 10% cần dùng là: Y = (100*25)/10 = 250g Lượng nước cất thêm vào: 500-250 = 250g Vậy.

HCl . Muốn pha dung dịch nồng độ 1M của một chất nào đó.4g Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là : Y = (100*4. H3PO4 65%. NH4OH . Nếu muốn pha dung dịch 2M. lắc để trộn đều đồng nhất. Dung dịch nồng độ 1M là dung dịch chứa 1ptg chất hòa tan trong 1 lít. 0. qua phễu cho vào bình định mức có dung tích 1 lít. dùng ống đong lấy 10ml dung dịch HCl37%. lắc để hòa tan hoàn toàn và đưa nước cất tới mức. 9 .19g/ml) Lượng HCl cần để pha dung dịch 1% là: X= (1*440)/100 = 4. cần làm nguội dung dịch trước khi định mức thành 1 lít. hoặc quá trình hòa tan có toả nhiệt thì phải chờ nhiệt độ trở lại bình thường (nhiệt độ không khí) rồi mới thêm nước tới vạch định mức. Giới hạn hòa tan tối đa được tính bằng % thể tích và thay đổi tùy theo loại hóa chất. cho vào bình định mức 1000.9g = 11. có thể đưa về đơn vị thể tích theo công thức V = M/d V: Thể tích chất lỏng.thể tích (w/v).1M. cân 56g KOH.19 = 10 ml Lượng nước cất thêm vào:440-10 = 430ml Vậy. ta tính khối lượng phân tử chất đó ( hoặc tra bảng) theo đơn vị gam.4)/37 = 11.25%. * Pha dung dịch nồng độ phân tử gam Mol (M) hay phân tử gam (ptg) là khối lượng của các chất tính ra gam bằng khối lượng phân tử của nó. hòa tan trong 1 ít nước. Đây là phản ứng tỏa nhiệt. M: khối lượng chất lỏng cần cân.Việc cân không thuận lợi. Khi phải đun nóng dung dịch để hòa tan. Chuyển dung dịch sang bình chứa. Cân chính xác lượng chất tan. Ví dụ: 5) Pha 440ml dung dịch HCl 1% từ dung dịch HCl 37% (d=1. Do đó khi pha các dung dịch từ các loại hóa chất nàyta phải chú ý đến nồng độ của dung dịch đậm đặc.9/1.05M ta cũng tiến hành tương tự với lượng cân tương ứng. Cho vào từng lượng nước cất nhỏ. d: tỷ trọng chất lòng Chú ý: Các hóa chất lỏng bán trên thị trường thường không ở dạng nguyên chất mà là các dung dịch đậm đặc. và 430ml nước cất ta được 440 ml HCl 1% Do việc sử dụng các loại bình định mức làm cho việc pha chế dung dịch thí nghiệm trở nên đơn giản và chính xác vì vậy ngày nay đa số các dung dịch thí nghiệm được pha chế theo nồng độ khối lượng . Ví dụ như H2SO4 .96%. 3M hay 0. Ví dụ: 6) Pha 1 lít dung dịch KOH 1M Phân tử lượng của KOH: MKOH = 39 +16 +1 =56 Lượng KOH để pha 1 lít dung dịch 1M là: 56g Vậy.37%.

+ 2 (Na+OH-) → 2 Na+SO42. ta phải tính toán dựa vào nồng độ dung dịch đó. đong 83ml HCl 37% cho vào bình định mức 1000 có sẵn 1 ít nước.5 Lượng KCl để pha 500ml dung dịch 3M là: X= (74. định mức đến vạch.19 = 83ml Vậy.Ví dụ: 7) Pha 500ml dung dịch KCl 3M Phân tử lượng của KCl: MKCl = 39 +35. Nếu chất tan là dung dịch. Định mứ c thành 1 lít.75g Vậy. Ví dụ: 9) Phản ứng giữa HCl và NaOH H+Cl.65/1.Đlg của một base là khối lượng chất đó để tạo ra trong phản ứng 1 ion gam OH-. Trường hợp chất rắn có ngậm nước. Ví dụ: 8) Pha 1 lít dung dịch HCl 1M từ HCl 37% Phân tử lượng HCl: MHCl = 1+35. . * Nồng độ đương lượng gam (N) Dung dịch nguyên chuẩn là dung dịch có nồng độ 1N Đương lượng gam(đlg) được định nghĩa theo mỗi trường hợp riêng biệt từ phương trình phản ứng dùng để định phân. Định phân acid. cho vào bình định mức 500. Ví dụ: 11) 2 Na2S2O3 + I2 → Na2S4O6 + 2 NaI 10 .+ 2H2O 1ptg H2SO4 cho ra 2 ion gam H+ vậy 1N (H2SO4) = 2 M (H2SO4) 1ptg NaOH cho ra 1 ion gam OH.+ Na+OH. vậy 1N (NaOH) = 1M (NaOH) Ví dụ: 10) Phản ứng giữa H2SO4 và NaOH 2H+SO42. cân 111.Đlg của một axit là khối lượng chất đó để tạo ra trong phản ứng 1 ion gam H+.5 = 74.base: . hòa tan trong 1 ít nước.+ H2O 1ptg HCl cho ra 1 ion gam H+.5 Lượng HCl 37% để pha dung dịch 1M là: X = (36.→ Na+Cl.75g KCl.5*100)/37 = 98.65g Hay 98. Tính N theo công thức trên. vậy 1 N (HCl) = 1M (HCl) 1ptg NaOH cho ra 1 ion gam OH-.5 *3*500)/1000 = 111. ptg chất đó phải tính luôn cả khối lượng các phân tử nước. Tiến hành pha trong tủ Hotte vì hơi acid bay lên rất độc hại.vậy 1N (NaOH) = 1M (NaOH) Số ion gam tạo ra từ 1 ptg được gọi là hệ số nguyên chuẩn độ (ký hiệu là n) N= M/n Phản ứng oxy hoá khử: Tùy theo số điện tích trao đổi ở từng phản ứng mà hệ số n khác nhau.5 = 36.

Na2S2O3. ta phải dùng ống chuẩn. vì vậy phải kiểm tra nồng độ thực của các dung dịch pha sẵn dựa vào các dung dịch có nồng độ chính xác được gọi là dung dịch chuẩn (fixanal) * Dung dịch chuẩn Dung dịch chuẩn là các dung dịch được chuẩn bị sẵn. . vì vậy sau khi pha phải hiệu chỉnh lại nồng độ.I2 + 2e → 2I2 S2O32. HCl.. Các chất dùng trong dung dịch chuẩn phải khá bền vững sao cho nồng độ của chúng không thay đổi nhanh chóng theo thời gian. dung môi bay hơi. Pha dung dịch chuẩn. vừa thêm nước cất vừa lắc và đưa nước cất tới vạch mức. có thành phần không thay đổi như NaCl. ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng. AgNO3. sau đó hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch dựa vào phản ứng với một dung dịch chuẩn thích hợp. nếu muốn pha dung dịch có nồng độ chính xác. Ví dụ: 12) NaOH thường nhiễm một lượng Na2CO3 rất dễ chảy nước.Dùng đinh thủy tinh chọc thủng ampun.. Ong chuẩn là một ống ampun thủy tinh hay nhựa đóng kín. các hóa chất không tinh khiết hay bị hút ẩm. acid oxalic. HCl dễ bay hơi. 3.-2e → S4O62Trong phản ứng này n =1 nên N = M/1 = M Việc pha dung dịch nồng độ đương lượng gam (N) cũng tương tự với cách pha dung dịch nồng độ phân tử gam (M). . * Cách pha dung dịch chuẩn từ ống chuẩn .. không thể pha ngay được dung dịch chuẩn. dùng bình tia rửa sạch chất tan có trong ampun vào bình định mức 1 lit. .Đối với các hợp chất bền vững. * Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Đối với các chất dễ thay đổi thành phần khi ở dạng rắn. Na2S2O3 dễ bị mất nước tinh thể khi để ngoài không khí. pha loãng và định mức tới thể tích đúng. hứng lên phểu vào bình định mức. do các chất này thường không bền vững và dễ thay đổi thành phần.Đối với các chất như NaOH. Khi chuyển hết lượng chất tan trong ống vào bình định mức và pha thành 1 lít ta được dung dịch chuẩn có nồng độ đã ghi trên nhãn ngoài ống. có thể pha dung dịch chuẩn trực tiếp bằng cách cân chính xác chất cần pha. Thời gian tàng trữ lâu nên chất tan bị thăng hoa. Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Khi pha hóa chất.. đảm bảo chính xác và được dùng để định chuẩn các dung dịch tự pha chế khi làm thí nghiệm. bị oxy hóa. có nhiều nguyên nhân làm cho nồng độ dung dịch không chính xác như việc cân đong không chính xác. . Bên trong chứa một lượng cân chính xác chất tan hoặc dung dịch chất tan. 11 .

ví dụ như ổn định pH của máu bằng các hệ đệm carbonate và phosphate. dung dịch đệm đóng vai trò quan trọng. Vậy nếu dùng dung dịch acid và dung dịch base có cùng nồng độ N. Có dung dịch chứa hỗn hợp 1 acid yếu (Ví dụ: acid acetic) với muối của nó (Ví dụ: muối natri acetate).base. dùng burette định phân bằng NaOH được 11 ml NaOH Vậy nồng độ thực tế NaOH đã pha là : Ct = (10*0. Việc pha dung dịch đệm tuân theo nguyên tắc chọn cặp acid – base có hằng số phân ly pK A/B gần với pH đệm muốn pha và phối trộn chúng với số mol bằng nhau.1M)/CH3COONa (0.05N tron cồn phải dung dung dịch chuẩn là H2SO4 0. Nghĩa là pH thay đổi rất ít.748 gần bằng 4. Các phản ứng thường thấy là phản ứng tạo kết tủa hay tạo phức hoặc oxy hóa khử.75. Nếu thêm vào dung dịch 0.1M). Thí dụ.001 mol HCl thì pH của hệ vẫn chỉ ở mức 4. mỗi lần sử dụng lại phải xác định lại hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Xét một phản ứng trung hòa acid .75. thường gồm một acid yếu và một base yếu với tỉ lệ của chúng sẽ quyết định pH của dung dịch. Trong cơ thể sống.1)/11 = 0.1N cho vào erlen.base CH3COOH (0.Ví dụ: Pha dung dịch NaOH 0.1 = 10/11 = 0. dung dịch định pha là NaOH 0.1N.1N để chuẩn độ lại. để có đệm pH ở giá trị 4.05N Đối với các dung dịch dễ thay đổi trong quá trình bảo quản. Về nguyên tắc thì phối hợp các loại đệm có các khoảng đệm khác nhau thành 1 dung dịch là không có vấn đề gì.91 6. 1 ion gam H+ sẽ phản ứng với 1 ion gam OH-.1 N từ NaOH rắn và dùng dung dịch chuẩn H2SO4 0. Tuy nhiên sử dụng các đệm nào còn tùy thuộc vào ứng dụng sao cho thành phần của đệm không phản ứng với các cấu tử trong hệ phản ứng khảo sát theo chiều hướng có hại.1N Lấy 10ml H2SO4 0. Dung dịch đệm: Dung dịch đệm là dung dịch tạo môi trường ổn định pH cho dung dịch. thì phản ứng sẽ đạt điểm cân bằng khi thể tích hai chất bằng nhau C1V1 = C2V2 Nếu gọi Cp là nồng độ dung dịch định pha và Ct là nồng độ thực của dung dịch ta có hệ số hiệu chỉnh K: K= Cp/Ct = Vp/Vt Ví dụ: 13) Dung dịch chuẩn là H2SO4 0. dung dịch sẽ cân bằng dạng như sau: CH3COOH + H2O -----> CH3COO.091/0. Dung dịch KOH 0.+ H3O+ 12 .091 N Hệ số điều chỉnh K: K= 0. chọn cặp acid . thêm ba giọt chỉ thị màu phenolphtalien.

. Khi thêm một lượng acid mạnh (H3O+).00 9.00 b 3.50 7.00 5.41 8.8 .00 5.31 8.24 *Dung dịch đệm citrate (pH = 3.2) .2 0.00 2.50 pH 3.70 9.Có dung dịch khác chẳng hạn.75 8. * Dung dịch đệm borat: .94 8.00 7.50 5.50 6.60 8. chứa hỗn hợp base yếu (Ví dụ: amoniac) với muối của nó (Ví dụ: muối amoni clorua).1M (a): 21.00 8.88 7.Dung dịch borat (b): 19.08 a 6. Kết quả pH của dung dịch tăng không đáng kể.00 0. Dung dịch đệm citrate có giá trị pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml dung dịch (b) theo bảng sau: A 46.0 2.51 8.00 4.00 4.50 7.2H2O hòa tan và dẫn nước đến 1000 ml.0 pH 4. ion hidroni H3O+ trung hòa OH.6 0.00 b 0.50 8.40 9.0 pH 8.00 10.00 1.50 2.09 7.25 1.1M (b): 29.6 1.10H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml Dung dịch đệm borat có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và dung dịch (b) theo bảng dưới đây: A 9.30 2. base liên hợp kết hợp với nó cho acid yếu (cân bằng chuyển dịch theo chiều nghịch) pH của dung dịch giảm không đáng kể.80 9.5 b 3.00 3.404 g H3BO3 hòa tan và định mức đến 1000 ml.108 g Na2B4O7.0 – 6.69 8.00 7.Dung dịch trinatri citrate 0.trong dung dịch cân bằng có dạng sau: NH3 + H2O ----------> NH4+ + OHDung dịch đệm có pH thay đổi rất ít khi thêm một lượng acid hoặc base.0 b 27.84 8.98 9.60 6.50 4.00 pH 6.41 g C6H5O7Na3.36 7. Trái lại. .cho base yếu H2O.78 7. khi thêm một lượng base mạnh (OH-).70 7.0 1. Khả năng đệm của hỗn hợp đệm phụ thuộc vào hàm lượng acid và base liên hợp có trong hỗn hợp.H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml.01 g C6H8O7. acid điện li cho H3O+ (cân bằng chuyển dịch theo chiều thuận).Dung dịch acid boric (a): 12.0 13 a 23.00 8.20 8.50 6.60 7.50 4.50 5.Dung dịch acid citric 0.50 3.11 9.77 7.

7 85.5 6. .0 13.0 22.0 7.8 6.Dung dịch dinatri hydrophosphate 0.20 10.8 g NaH2PO4 hòa tan và định mức đến 1000 ml.0 pH 5.0 5.2 7. Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml dung dịch (b).0 24.0 81.2 6.12H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml.5 62.5 7.0 13.5 3.0 28.2 40.9 6.00 10.7 7.8 9.0) .8 a 45.9 8.7 pH 6.5 32.30 b 55.5 49.2 - 29.0 72.3 7.0 94.8 4.0) .5 7.0 – 8.0 87.5 42.50 7.2M (a): 27.0 61.5 92.0 16.0 67.0 25.4 4.6 7.50 8.9 g Na2HPO4.0 81.2M (b): 53.5 91.5 22.2 - *Dung dịch đệm phosphate (pH = 5.0 4.43.6 20.05 g Na2HPO4.5 18.7 g Na2HPO4.0 28.0 77.8 14 a 372 492 612 726 818 b 628 508 388 274 182 pH 6. a 93.Dung dịch dinatri hydrophosphate 1/15M (a): 23.0 19.4 .5 8.0 33.6 5.0 18.8 7.2 4.0 31.5 68.4 5.7H2O hoặc 71.1 6.3 38.0 87.0 b 6.0 23.5 26.5 77.8 5.0 19. Dung dịch đệm phosphate có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml dung dịch (b) định mức đến 200 ml.0 16.8 - 5.5 51.Dung dịch kali dihydrophosphate 1/15M (b): 9.3 6.8 7.0 6.0 *Dung dịch đệm Na2HPO4 – KH2PO4 (pH = 5.0 84.0 37. .4 3.Dung dịch mononatri orthophosphate 0.2 5.0 15.00 5.4 7.0 6.5 6.0 12.5 93.0 36.6 5.5 56.4 6.0 89.5 31.9 7.12H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml.1 7.0 39.2 7.0 17.0 90.6 6.5 37.5 53.8 40.0 13.7 – 8.7 6.07 g KH2PO4 hòa tan và định mức đến 1000 ml.6 6.6 5.0 34.0 5.4 5.5 73.0 33.2 3.0 10.0 7.6 3.3 15.7 11.2 5. a 10 18 30 49 79 b 990 982 970 951 921 pH 5.0 35.

.2 pH 3.8 2.4 pH 3.5 8.2 M (a): 15.01g glycine hòa tan và định mức đến 1000 ml.6) .0 38.4 g CH3COONa hoặc 27.8 10.121 184 264 879 816 736 6.8 5.0 13.3 44.6 *Dung dịch đệm acetate (pH = 3.5 41. a 46.2 pH 4. .8 9.2 11.0 pH 2.4 .5 pH 9.6) .4 72.4 8.6 2.2 39.6 – 5.2 g CH3COONa.8 ml HCl đặc (37%) pha thành 1000 ml.0 4.2M (a): 11.0 14.8 10.4 2.0 10.2 6.0 41.0 16.2 32.6 – 10.Dung dịch acid acetic 0.4 10.0 5.8 pH 8.2 M (b): 16.8 12.4 885 936 969 115 64 31 7.Dung dịch NaOH 0. Dung dịch đệm Glycine có pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X ml dung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml.01g glycine hòa tan và định mức đến 1000 ml.0 X 16. Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào X ml dung dịch (a) và Y ml dung dịch (b) và định mức đến 100 ml. X 4.3H2O được hòa tan và định mức đến 1000 ml.55 ml CH3COOH đặc và định mức đến 1000 ml.2 5.0 6.2 M (b): 8 g NaOH hòa tan và định mức đến 1000 ml.Dung dịch natri acetate 0.8 4.6 8.4 44.Dung dịch glycine 0.0 6.6 3.4 X 22.0 36.8 8.6) .8 b 30.2 3.2 M (a): 15.0 35.0 6.6 45.0 *Dung dịch đệm Glycine – HCl (pH = 2.0 9.7 6. X 5.2 – 3.2 32.2 *Dung dịch đệm Glycine – NaOH (pH = 8.0 8. . Dung dịch đệm Glycine có pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X ml dung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml.4 3.8 b 3.6 9.6 7.2 15 a 20.2 9.2M (b): 16.8 24.6 3.Dung dịch glycine 0.0 9.Dung dịch HCl 0.

(c) với thể tích bằng nhau nhận được dung dịch đệm 0. 16 .6 *Dung dịch đệm vạn năng 0.8 45.1M (b): 6.30.0 bằng cách bổ sung dung dịch NaOH 1N (d).5 24. . Các dung dịch đệm vạn năng nồng độ khác được chuẩn bị tương tự.8 đến pH = 12.Dung dịch acid phosphoric 0. (b).1M (c): hòa tan 6.7 ml CH3COOH đặc và định mức bằng nước cất đến 1000 ml.1M .45 ml H3PO4 đậm đặc và định mức bằng nước cất đến 1000 ml.5 25.18 g acid ortho-boric trong nước cất và định mức đến 1000 ml.2 5.Dung dịch natri hydroxide 1N (d): hòa tan 40 g NaOH trong nước cất và định mức đến 1000 ml.5 4.1M (a): 5. Trộn lẫn các dung dịch (a). . .5 19.1M có pH = 1.4 4.6 4.Dung dịch acid acetic 0.8. Điều chỉnh giá trị pH của dung dịch đệm trong khoảng pH = 1.Dung dịch acid ortho-boric 0.

Tùy đối tượng nghiên cứu (hạt. Trong trường hợp này không cần kết tủa protein bằng chì acetate vì lượng protein chuyển vào dung dịch không nhiều... có thể chiết đường từ nguyên liệu bằng nước. Sau đó loại bỏ lượng chì acetate dư bằng dung dịch Na2SO4 bão hòa. Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS). cần chiết đường bằng rượu 70 – 80oC. Trước khi đun cách thủy hỗn hợp phải trung hòa acid bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa tới pH 6..Bình định mức 50ml 17 .) mà cách chuẩn bị dung dịch nghiên cứu dùng để định lượng đường có khác nhau đôi chút. khế.Trường hợp các nguyên liệu chứa nhiều acid hữu cơ như cà chua.4 – 7. đun hỗn hợp cách thủy trong bình cách thủy có lắp ống làm lạnh không khí. để yên hỗn hợp 10 phút. cần chú ý là trong quá tình đun khi chiết.BÀI 2. quả. quả tươi) thì cân 5 – 10 g.. nhưng nguyên tắc chung như sau: . . ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ACID DINITRO-SALICYLIC (DNS) 1.Trường hợp nguyên liệu thí nghiệm không chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin. khoai tây. sắn... Nghiền cẩn thận với bột thủy tinh hay cát sạch và 30 ml nước cất nóng 70 – 80oC. Đun cách thủy 70 – 80oC trong 35 – 40 phút. 2..hóa chất: 1 Dụng cụ . chanh. Tránh dùng quá dư chì acetate (dùng 2 – 5 ml chì acetate). Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức dung tích 1000 ml.0. Cân và cho vào cối sứ 1 g nguyên liệu hạt hay các mẫu thí nghiệm thực vật khô như cây. Dụng cụ .. dứa. lá hoặc quả khô.3H2O] hoặc chì nitrate [Pb(NO3)2] 10%. đường saccharose có thể bị thủy phân một phần. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. . Nếu là nguyên liệu tươi (như hoa. Do đó cần xác định riêng đường khử và riêng saccharose.Trường hợp nguyên liệu chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin như khoai lang.. kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch chì acetate [Pb(C2H2O2)2. Tiếp đó thêm nước cất tới vạch mức và đem lọc qua giấy lọc vào cốc hay bình khô. đã được nghiền nhỏ (và sấy khô đến khối lượng không đổi).. Nước lọc dùng làm dung dịch thí nghiệm. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định...

0. Đường thẳng thu được có thể cắt trục hoành ở 0. Pha loãng mẫu nếu cần sao cho mật độ quang nằm trong khoảng 0. dứa) .4. Cặn khô trong cốc được pha loãng thành 50ml với nước cất. Hóa chất . Để lắng cặn khi đem làm hiện màu.8.Dựng đường cong chuẩn và xác định hàm lượng đường Cho vào 5 ống nghiệm sạch với các chất có thể tích như bảng sau Hoá chất Glucose (10 mg/ml) Nước cất (ml) Nồng độ Ống 1 0.2 9. . 0.8.8 0. So màu rồi vẽ đồ thị mẫu (vẽ trên máy tính) Làm tương tự với mẫu dung dịch đường được chuẩn bị ở trên và một mẫu thử không (nước cất) 4. mẫu có thể để lâu trong bình hút ẩm.0 1.8 Ống 5 1.4 0.0 9.6 9.2 – 0.6 0.2.nguyên liệu . Làm lạnh đến nhiệt độ phòng.Thuốc thử DNS . Đun sôi đúng 5 phút. Tiến hành . Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang.6 Ống 4 0. Trong mỗi ống nghiệm sẽ chứa tương ứng 0. Sau khi cho bay hơi rượu. 1.2 0.0 mg glucose. khuấy đều. Tính kết quả Từ phương trình đồ thị đường cong chuẩn tính được % lượng đường trong mẫu vật. Cho tiếp 10ml cồn 800 vào cốc đựng bã.04 mg glucose do glucose bị oxy hóa.8 9. đun sôi 2 lần trên nồi đun cách thủy→ Để nguội → lọc (lặp lại 2 lần) Đưa phần bã lên lọc và rửa bằng rượu nóng (800) Rượu qua lọc được cho bay hơi ở trong phòng hoặc trên nồi cách thủy đun nhẹ.0 Từ các ống nghiệm trên lấy 1ml ở mỗi ống vào 5 ống nghiệm khác và thêm vào mỗi ống 3ml thuốc thử DNS. Và tuỳ theo nồng độ đường nhiều hay ít mà pha loãng thêm 5-10 lần.2 Ống 2 0.Dung dịch glucose chuẩn 3.Chiết xuất đường trong thực vật 5g rau cải ngọt → nghiền nhỏ → cho vào becher 100ml + 10ml cồn 900 → đun cách thủy (sôi 3 lần) → khuấy đều bằng đũa thủy tinh → để nguội → lọc (chỉ gạn lấy phần trong).Mẫu rau quả chứa đường (rau cải ngọt. 0. trục hoành là nồng độ glucose.6.2.4 Ống 3 0. Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm với đối chứng là nước.4 9. 18 .

Ống dẫn khí . chuyển thành dạng oxide: P2O5.Ống sinh hàn . urea và các dẫn xuất của urea. CaO.hóa chất a. K2O..Bình hứng (becher 250ml) . các acid amin tự do. .1N H2SO4 dư + NaOH → Na2SO4 + H2O 2.Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH (NH4)2SO4 + 2 NaOH = Na2SO4 +H2O + 2NH3↑ . Ca.. Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau: 2H2SO4 → 2H2O +2SO2↑+ O2 . các base purine và pyrimidine.Bình Kjeldahl phá mẫu .. Nitơ không có trong thành phần protein như của các muối vô cơ.. ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL 1. các alkaloid.. Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein .BÀI 3... bình hứng chứa H2SO4 0. K. các peptid.Bếp đun 19 . là nitơ phi protein..Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác..1N 2NH4OH + H2SO4 → (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 dư . Mg. Ví dụ các protein bị thủy phân thành acid amine. Các phân tử chứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3.Chuẩn độ H2SO4 dư bằng NaOH 0. Nitơ có trong thành phần acid amine của protein là nitơ protein. Dụng cụ .Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác. acid nitric. Nguyên tắc Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nitơ tổng số.Bi thủy tinh .Bình cất đạm . còn nitơ được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4 Các nguyên tố P. carbon và hidro của acid amine tạo thành CO2 và H2O.NH3 bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH4OH rơi vào bình hứng. Dụng cụ + Bộ chưng cất Kjeldahl định lượng Nitơ gồm: . MgO.

tránh trường hợp khi sôi mạnh hóa chất bắn ra ngoài. Cho thêm vào 200mg chất xúc tác. dùng nước cất vô đạm tráng lại bình Kjeldahl và định mức đến vạch.1N chuẩn + NaOH 0. lắc nhẹ. đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh Lưu ý giai đoạn này phải thực hiện trong tủ Hotte. Đặt bình Kjeldahl lên bếp đun. đậy kín để khoảng 3 phút. đặt bình hơi nghiêng trên bếp. khi thấy dung dịch gần như trong suốt thì có thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở trên thành bình còn chưa bị oxi hoá vào trong dung dịch. cho tiếp 5ml H2SO4 đậm đặc sẽ thấy xuất hiện màu nâu đen (do nguyên liệu đã bị oxi hóa).+ Pipet 20ml.1N chuẩn + Thuốc thử Tasiro + chất xúc tác: hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 (3:1) 3. theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun. Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100 ml.Vô cơ hóa mẫu Cân 100mg bột đậu nành đã sấy khô tuyệt đối cho vào bình Kjeldahl.1g) + H2SO4 đậm đặc + NaOH 40% + H2SO4 0.Cất đạm 20 . Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn. Tiến hành . Trong khi đun. pipet 10ml + Erlen 250ml + vaseline Bộ chưng cất Kjeldahl b. Hóa chất + nguyên liệu + Bột đậu nành (0. khi đã sôi giữ nhiệt độ bếp đun vừa phải để tránh hóa chất trào ra ngoài và không bị bay mất amoniac. .

. Đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống sinh hàn. 4.1N và 3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng).1 N sử dụng.Chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có sẵn 50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro lúc này trong bình có màu tím hồng.42mg Nitơ 21 . Tính kết quả: Hàm lượng % nitơ tổng số được tính theo công thức N (mg%) = {1. Ngưng cất đạm.42 * (V1-V2)*100/a}*2 V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứng V2: số ml NaOH 0. cứ 1 ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với 1.42 hệ số .1N cho đến khi mất màu tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ. Tiếp tục cho vào bình cất 15ml NaOH 40% cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển sang màu xanh lá mạ (thêm 5ml NaOH 40% nếu dung dịch trong bình chưa chuyển hết sang màu xanh lá mạ). dùng giấy qùy thử ở đầu ống sinh hàn. Tiến hành lắp hệ thống cất đạm. đợi hệ thống nguội mới tháo hệ thống đem đi rửa. cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0. Ghi nhận thể tích NaOH 0. Bật công tắc cất đạm Sau khi cất đạm 10-12 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không. Nếu giấy qùy không đổi sang màu xanh là được.Chuẩn độ: Chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0.1N đã chuẩn độ a số miligam nguyên liệu 1.

Công thức phân tử của Coomasie Brilliant Blue G-250 2.OD0.hóa chất 1.Đồng hồ bấm giây . Dụng cụ . Trong dung dịch mang tính acid. Độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein. Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm. Thực hiện một đối chứng với nước cất (OD0). Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Để xác định protein trong mẫu.BÀI 4. Dụng cụ .Giá để ống nghiệm .Bình tia đựng cồn 22 . khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế ta được ODx. 1ml (có thể thay bằng pipetteman) . Lấy giá trị OD = ODx . Lượng protein mẫu trong dung dịch đo được xác định bằng cách chấm trên đường chuẩn theo OD.Ống nghiệm (14) . ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD 1.Giấy thấm .Máy đo quang phổ . độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với lượng trong mẫu. Đó chính là lượng protein mẫu trong dung dịch đo. lấy giá trị của điểm đó trên trục hoành. đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ. khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại 465 nm. màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Dung dịch protein chuẩn thường là bovine serum albumin.Pipette 5ml.

Giữ ở -200C.005g Ethanol tuyệt đối: 4.Dùng đồng hồ bấm giây. Tiến hành .4 5 40 5 0.6 0. Bổ sung phosphoric acid và chỉnh tới 100ml bằng nước cất.. Hóa chất .Lập một loạt 6 ống theo số thứ tự 0. Ghi lại giá trị OD.9 0.5 5 50 X 5 ? . 4. canh thời gian 0 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 0.1mg/ml) TT Bradford Nồng độ Albumin (µg/ml) 0 1 0 5 0 1 0.2. pha trong 1 ml nước cất.Cồn 900 .Dung dịch protein chuẩn: cân 10 mg albumin bằng cân phân tích.Bổ sung các thành phần như bảng sau. cứ tiếp tục cho đến hết. giữ ở 40C .3 5 30 4 0. Khi dùng pha loãng ra 100 lần. lắc đều để yên.7g Phosphoric acid 85%: 8.Tính thời gian ống 0 được 20 phút.1 mg/ml.Dung dịch cần xác định hàm lượng protein (phòng thí nghiệm cung cấp) 3. lắc đều cho tan. Ở thời điểm 1 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 1. 3. 5 và 1 ống nghiệm chứa mẫu cần phân tích X . 1.Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595 ở trên ta tính được hàm lượng protein ở trong mẫu phân tích 23 . riêng ống nghiệm X cho 1 ml mẫu cần phân tích do phòng thí nghiệm cung cấp (nếu cần sinh viên tự pha loãng mẫu trước khi phân tích) . lắc đều để yên. Tính kết quả: . Ta có giá trị OD0.Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595 .9 0.1 5 10 2 0. 4.7 0.5g Phẩm màu Coomasie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong một chai đựng màu tối có nắp.Dung dịch thuốc thử Bradford: dung dịch thuốc thử có thành phần trong 100ml như sau: Coomassie Brilliant Blue: 0..2 5 20 3 0. được dung dịch có nồng độ 0. Ống nghiệm Nước cất (ml) Albumin chuẩn (0. tương tự cứ cách một phút đo cho hết các ống.. Lắc đều. .. 2.5 0.. tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 595 nm. ở thời điểm 21 phút đo ống 1 (OD1)..

đo độ phân cực. viết tắt U) do Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (International Union of Biochemistry – IUB định nghĩa: Một đơn vị chuẩn của enzyme (1 U) là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được 1 mol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn. áp suất.trong một đơn vị thời gian. Một đơn vị họat tính enzyme được định nghĩa theo nhiều phương pháp. 24 . . Mỗi enzyme có khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định. phương pháp sắc ký và phương pháp hóa học. a) Đơn vị hoạt tính thông dụng nhất là đơn vị quốc tế (Enzyme Unit.Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm tương ứng với một nồng độ enzyme xác định. Hội đồng Danh pháp của IUB khuyến cáo nên sử dụng Katal làm đơn vị cơ bản của hoạt tính enzyme: Một Katal là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được 1 mol cơ chất sau 1 giây ở điều kiện tiêu chuẩn. Hoạt động hay hoạt tính của enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất được chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn. Nguyên tắc 1.. độ nhớt . Enzyme và đơn vị đo hoạt tính enzyme Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và có tính đặc hiệu cao. c ó n h iề u đơ n vị h o ạ t tín h e n z y m e . c) Đơn vị hoạt tính dựa vào sự thay đổi đặc tính hỗn hợp phản ứng. độ nhớt. Trường hợp cơ chất và sản phẩm là một hỗn hợp phức tạp thì áp dụng đơn vị hoạt tính này. * Đơn vị hoạt tính enzyme : Mục đích xác định hoạt tính enzyme là xác định số đơn vị hoạt tính..Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định. nhiều phương pháp phân tích khác nhau được sử dụng: phương pháp đo quang phổ. Để thực hiện được mục đích trên. Vì vậy có thể đánh giá hoạt tính xúc tác của enzyme bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa cơ chất hoặc tốc độ tích lũy sản phẩm phản ứng. Đ iề u q u a n tr ọ n g n h ấ à lcầ n đ ịn h t n g hĩa rõ rà n g đ ơ n vị h o ạ t tín h . N h ư v ậ y .1.BÀI 5. Về nguyên tắc có thể hai nhóm phương pháp chính sau: .67 nKat (nanokatal) Đơn vị Katal được khuyến cáo vì nằm trong hệ đơn vị đo lường Quốc tế (SI). PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME 1. ví dụ sự thay đổi độ đục. 1 U = 1 mol sản phẩm = 1 mol cơ chất (10-6 mol)/phút b) Năm 1979. 1 Kat = 1 mol cơ chất/ giây = 60 mol/ phút = 60 x 106 mol/ phút = 6 x 107 U 1 U = 1/60 x 10-6 Kat = 16.

* Điều kiện phản ứng để xác định hoạt tính K h i tiế n hà n h thự c n g h iệ m c ầ n trá n h n h ữ n g ế u tố c ó th ể b iế n tín h p r o te in y enzym e. v ì g ia iđ oạ n nà y tố c đ ộ p hả n ứ n g lớ n 0 n hấ t. trong đó hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Lowry hoặc Bradford). ớ N ồ n g đ ộ cơ c hấ t tro n g p h ả n ứ n g e n z y m e p h ả i ở tr o n g g iớ i h ạ n th íc h h ợ p . g ly c o g e n . Tố t n h ấ t là x á c địn h tố c đ ộ ư b a n đầ u c ủ a p h ả n ứ n g (3 . C á c th ô n g số n h iệ t đ ộ . s in h v iê n là m q u e n ớ i p hư ơ n g p h á p x á c đ h h o ạ t tín h v ịn e n z y m e a m y la s e 1 . s a u đ ó b ắ t đ ầ u g iả m (H h 1 ). đ ủ th ừ a đ ể bã o e n z y m e .Hoạt tính riêng (specific activity) của enzyme Hoạt tính riêng của một chế phẩm enzyme đặc trưng cho độ tinh sạch của chế phẩm enzyme. ìn K h i x á c địn h h o ạ t tín h p h ả i àlm mẫ u đ ố i c h ứ n g s o n g s o n g v ớ i m ẫ u th í n g h iệ m . T h ử h o ạ t tín h e n z y m e p h ả ư ợđc tiế n hà n h i tro n g đ iề u k iệ n th íc h h ợ p nư đ iề u k iệ n s in h lý . n hư n g k h ô n g q u á c a o đ kìm h ã m e n z y m e . n ồ n g đ ộ io n àv th à n h p hầ n d u n g d ịc h đ ệ m ả n h h ư ở n g lê n h oạ t tín h e n z y m e .6 0 g iâ y ). E n zy m e a m y la se v à p h ư ơ n g p h á p x á c ịn h h o ạ t tín h đ * K h a i q u á t về en zy m e a m ylase A m y la s e là c á c e n z y m e x ú c tá c c h o c á c p h ứ n g th ủ y p h â n tin h b ộ t. V ớ i n h ữ n g e n z y m e c ầ n c ó c h ấ t h o ạ t h ó a h o ặ c c h ấ t ổ n đ ịn hì thhả i c h o c á c p c hấ t nà y v à o e n z y m e tr ư c k h i c h o cơ c hấ t và o hỗ n h ợ p p h ả n ứ n g . àv ản 25 . p H . đ iề u k iệ n tồ n trữ th ự c h p hẩ m h oặ c đ iề u k iệ n mà h oạ t lự c c ó th ể đ ạ t tố iư u . Hình 1. T r o n g m ẫ u đ ố i c h ứ n g e n z y m e p h ả i b ị b ấ t h o ạ ư ớ c k h i tiế p x ú c t tr v ớ i cơ c hấ t.2 . S a u k h i ể d ừ n g p h ả n ứ n g ư ợ n g cơ c hấ t đư ợ c c h u y ể n h ó a 2 0 0 % . l -3 T hờ i g ia n x á c đ ịn h h o ạ t tín h thờ n g 5-3 0 p h ú t. Động học phản ứng enzyme T r o n g b à i thự c hà n h n à y . Hoạt tính riêng được biểu thị bằng số đơn vị enzyme/mg protein protein (U/mg protein) hoặc Kat/kg protein.

K iể m tra p H .2. củ).3) xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1. E n z y m e yn p h â n g iả i liê n kế t à 1 . v i k h u ẩ n . d u n g n d ịc h tin h b ộ t n h a n h c h ó n g b ị m ấ t k h ả n ă n g tạ o à m vớ i d u n g d ịc h io d v à u e b ị g iả m đ ộ n h ớ t. D u n g dịc h H C l 0 . E C 3 .4.1. Dư ớ i tá c d ụ n g c ủ a e n z y m e à y . nhưng bền với acid hơn -a m y la s e .và 1. EC 3. Enzyme này mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC. H ó a chấ t – D ụ n g cụ : D u n g dịc h đ ệ m D u n g dịc h đ ệ m a c e ta te p H = 4 . i L ắ c n h ẹ h ỗ n h ợ p đ ể h a ta n h o à n to à n . Đ ơ n vị a m y la s e l lượ n g e n z y m e c ầ n th iế t đ ể th ủ y p h â n h o to à n 1 0 m g à àn tin h bộ t s a u th ờ i g ia n p h ả n ứ n g 3 0 p h ú t tr o n g đ iề u k iệ n th g h iệ m .1 M p H = 1 0 (d n g để x á c đ ịn h h o ạ t tín h ù -a m y la s e k iề m . Đ oc ườ n g i đ ộ m à u tạ o thà n h g iữ a tin h b ộ t v c á c sả n p h ẩ m th ủ y p h â n c ủ a n ó v ớ i io d bằ n g à e m á y s o m à u sẽ tín h đư ợ c h o ạ t tín h e n z y m e . b ổ s u n g ưnớ c c ấ t đ ế n v ạ c h m ứ c . h ạ t hò a ư thả o n ả y m ầ m .1 ) c ó tr o n g n ớ c b ọ t. K ể m tra p H .9 4 .5-5.2) có nhiều ở thực vật (hạt. Sản phẩm chủ yếu là glucose và dextrin.c á c p o ly s a c c h a r id e tư ơ n g ựt . d e x trin p h â n ửt th ấ p . n ấ m m ố c .4-glucanase. D u n g dịc h đ ệ m g ly c in e – N a O H 0 . ní 2. n h n g k é m b ề n v ớ i a c id . Glucoamylase (Exo -1. A m y la s e c h ia à m 3 loạ i c h ín h : l -a m y la s e (Endo -1.4-g lu c a n a s e.1.1 N D u n g dịc h io d : h ò a ta n 3 0 m g K I v à 3 m g I 2 ớv m ộ t lư ợ n g n h ỏ nư ớ c c ấ t.7 (x á c đ ịn h h o ạ t tín h e n z y m e n ấ m m ố c ): tr ộ n 1 thể tíc h C H3 C O O H 1 N vớ i 1 th ể tíc h C H3 C O O N a 1 N . ư -a m y la s e (Exo -1.1 . tụ y tạ n g . D u n g dịc h tin h b ộ t 1 % :h ò a ta n 1 g tin h b t (th e o c h ấ t k h ô tu y ệ t đ ố i) v ớ i 5 0 ộ 26 . * C á c p h ư ơ n g p h á p đ o h o tín h en zym e -am ylase ạt N g u y ê n tắ c c h u n g d ự a tr n c ơ sở th ủ y p h â n tin h b ộ t b ở i e n z y m e tro n g d u n g ê d ịc h e n z y m e n g h ê n cứ u thà n h c á c d e x tr in c ó p h â n ửt lư ợ n g k h á c n h a u .6-glycoside từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. i D u n g dịc h đ ệ m p h o s p h a te p H = 4 .4-glycoside từ đầu không khử tạo thành maltose và dextrin phân tử lớn. Nhiều glucoamylase hoạt động mạnh ở pH 3. B ả o q u ả n d u n g d ịc h tro n g b ìn h m à u n â uđ ể c h ỗ tố i. -a m y la s e bề n v ớ i n h iệ t.2 .2.4-g ly c o sid e ở g iữ a c h u ỗ i p o ly s a c c h a r id e (h o ạ t tín h e n d o a m y la s e ) tạ o th à n h m a lto s e . EC 3.9 (x á c đ ịn h h o ạ t tín h e n z y m e cm a lt): ủ trộ n 1 0 m l d u n g d ịc h N2a P O 4 1 /1 5 M vớ i 9 9 0 m l d u n g d ịc h K HP O 4 1 /1 5 M H 2 n hậ n đư ợ c 1 l d u n g d ịc h đ ệ m p h o s p h a te p H = 4 .5. s a uđ ó c h u yể n d u n g d ịc h s a n g bn h ò ì đ ịn h m ứ c 1 0 0 0 m l.4-glucanase. xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1. Enzyme này mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC.

dù n g đũ a th ủ y tin h c h cẩ n th ậ n c h ế p h ẩ m tr o n g m ộ t c ố c d u n g th à íc 5 0 m l. N hvậ y . đ ộ ư p h a lo ã n g p hụ th u ộ c và o h oạ t tín h c h ế p h ẩ m e n z y m e c ầ n p h â n tíc h . Đ ặ t àv bế p c á c h th ủ y ìn o đ a n g s ô i. D u n g d ịc h b đ ư ợ c c h u ẩ n b ị tr o n g n g y sử d ụ n g .m l n ướ c c ấ t tro n g b h đ ịn h m ứ c 1 0 0 m l. S a u đ ó c h u y ể n ton bộ h ỗ n h ợ p và o b ìn h đ ịn h à m ứ c d u n g tíc h 1 0 0 m l. S a u đ ó là m n g ộ i u v à bổ s u n g 1 0 m l đ ệ m a c e ta te p H = 4 . lắ c đ ề u . m ô độ n g ư o thự c v ậ t b ằ n g d u n g d ịc h đ ệ m c ó p H th h hợ p . T ríc h ly e n z y m e n m m ố c : C â n m = 5 g c h ế p h ẩ m e n z y m e th ô đ g h iề n ấ ã n s ơ bộ . m ẫ u đ ố i c h ứ n g àvm ẫ u trắ ng M ẫ u th í n g h iệ m M ẫ u đ ố i c h ứ n g M ẫ u trắ n g D u n g dịc h tin h b ộ t 1 % 2 ml 2 ml 0 N ướ c c ấ t 0 0 2 ml Đệm 1 ml 1 ml 1m l D u n g dịc h N a C l 3 % 0 . dù n g t ên đ ũ a th ủ y tin h c h cẩ n th ậ n c h ế p h ẩ m tr o n g m ộ t c ố c th ủ y tin h d u n g tíc h 5 0 à m l vớ i m ộ t lư ợ n g nư ớ c n h ỏ . c h o và o b ìn h t -1 n ó n d u n g tíc h 2 5 0 m l.9 . à D u n g dịc h e n z y m e g ố c 3. S a u đ ó c h u y n toà n bộ c h ế p h ẩ m v o b ìn h ta m g iá c d u n g tíc h 2 5 0 ể à m l.7 0 % tin h bộ t tr o n g d u n g d ịc h ở đ iề u k iệ n x á c đ ịn h . T ríc h ly e n z y m e ừ m a lt : C â n m = 5 0 g m a lt đã n g h iề n n h ỏ .5 m l 0 .5 m l 0 . cí T ríc h ly e n z y m e ừ v i k h u ẩ n : C â n m = 0 . bổ s u n g 9 0 m l n ớ c c ấ t và dịc h đ ệ m a c e ta te p H = 4 .9 ) ổ s u n g nư ớ c c ấ t đ ế n v ạ c h m ứ c . lắ c liê n tụ c c h o đ ế n k h i tin h b ộ t ta n hàon to à n . B o q u ả n d u n g d ịc h e n z y m e g ố c ở – 4 C tr o n g thờ i g ia n ả 2 1 ngày.7 . C h uẩ n b ị m ẫ u th í n g h iệ m . * D u n g dịc h e n z y m e đ ể p h â n tíc h P h a lo ã n g d u n g dc h e n z y m e g ố c (h ệ s ố p h a lon g n) bằ n g d u n g d ịc h đ ệ m ị ã s a o c h o tr o n g 1 m l d u n g ịc h e n z y m e p h â n tíc h c ó cứ a m ộ t lư ợ n g e n z y m e đ ủ đ ể d h thủ y p h â n 2 0 % . B ả o q u ả n d u n g c h e n z y m e gố c ở 2 – 4 o C tro n g thờ i dị g ia n 1 n g à y . L ọ c à th u hồ i d ịc h tríc h ly e n z y m e . Gữi h ỗ n h ợ p ở n h iệ t đ ộ 3 0C tr o n g thờ i g ia n 1 g iờ c ó k h uấ y đ ả o đ ịn h k ỳ . L ọ cà vth u hồ i d ịc h tríc h ly e n z y m e .1 g c h ế p h ẩ m n g h i cứ u . G iữ h ỗ n h ợ p ở ư o n h iệ t đ ộ 3 0 C tr o n g thờ i g ia n 1 g iờ c ó k h u ấ y đ ả o đ ịn h k ỳ . T iến hà n h : T ríc h ly e n z y m e : e n z y m e đợ c tríc h ly từ c h ế p h ẩ m h a y tế à b . B ả o q u ả n d u n g v o d ịc h e n z y m e g ố c ở 2– 4 C tr o n g thờ i g ia n 1 n gà y .5 m l 27 . L ọ c à th u hồ i d ịc h n v o tríc h ly e n z y m e . ổb s u n g 9 0 m l n ớ c c ấ t và 1 0 m l d u n g dc h đ ệ m ư ị o p h o s p h a te p H = 4 . b ổ s u n g ư ớ c cấ t tớ i v ạ c h m ứ c . lắ c đ ề u .7 ( h o ặ c 1 0 m l d u n gh đ ệ m d ịc p h o s p h a te p H = 4 .

T ín h kết q u ả : D = mậ t đ ộ q u a n g S ố m g tin h b ộ t b ị th ủ y p h â n S = H oạ t tín h e n z y m e a m y la s e : Hoạt tính chung = S n 10  m ( Do D ) x 20 Do trong đó: n = hệ số pha loãng m = khối lượng enzyme 28 .5 m 1 0 1 ml 1 ml 4 ml 0 . Đ o mậ t đ ộ q u a n g c ủ a c á c d u n g d ịc h bư ớ c s ó n g = 6 2 0 n m s o vớ i m ẫ u trắ n g .5 m l 0 . 3 0 p h ú t để x ả y ra p h ả n ứ n g H Cl 1N 1 ml 1 ml E nzym e 0 1m l N ướ c c ấ t 4 ml 4 ml Io de 0 . ở 4.Ủ 4 0o C .5 m 1 D u n g dịc h đ ố i c h ứ n g c ó m u x a n h à D u n g dịc h th í n g h iệ m c ó m u tím vớ i cư ờ n g đ ộ k h á c n h a u ù y v à o lượ n g tin h b ộ t à t c h ư a bị th ủ y p h â n . 1 0 p h ú t để đ ạ t n h iệ t đ ộ D u n g dịc h e n z y m e 1 ml 0 o Ủ 4 0 C .

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful