TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.

HCM

KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC

----------

----------

BÀI GIẢNG

THỰC HÀNH HOÁ SINH

Biên soạn: TS. Nguyễn Hoài Hương CN. Bùi Văn Thế Vinh

Tp. Hồ Chí Minh, 04/2009

Lời mở đầu
Bài giảng “Thực hành sinh hoá” dành cho sinh viên năm thứ hai khoa Môi trường & Công nghệ Sinh học, trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM. Với thời lượng 30 tiết và tuỳ thuộc điều kiện, cơ sở vật chất của phòng thí nghiệm cho phép, sinh viên tiến hành làm 5 bài thực hành gồm các nội dung chính của học phần lý thuyết sinh hóa cơ sở. 1. Giới thiệu phòng thí nghiệm sinh hóa, cách pha chế các dung dịch chuẩn độ và các dung dịch đệm; 2. Định lượng đường khử bằng phương pháp acid dinitro-salicylic (DNS); 3. Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl; 4. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford; 5. Xác định hoạt tính enzyme amylase.

2

bảng kết quả thô. hóa chất đúng chỗ. Yêu cầu đối với sinh viên làm thí nghiệm: . Máy đo pH 7. Nếu nghỉ học có lí do chính đáng thì sinh viên phải xin phép giáo viên sắp xếp cho làm thí nghiệm bù. Làm vỡ hoặc gây hư hỏng dụng cụ. bình Kjendahl.Sinh viên phải đọc kỹ. burette. phương trình phản ứng. Máy ly tâm 6. . sự hiểu bài. công thức tính và kết quả tính cùng các ý kiến giải thích hay nhận xét.Sau khi thí nghiệm. lớp cử một tổ trực nhật có nhiệm vụ nhắc nhở các bạn giữ vệ sinh chung và làm sạch PTN sau giờ thí nghiệm.BÀI 1: CÁCH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH CHUẨN ĐỘ VÀ CÁC DUNG DỊCH ĐỆM 1. micropipet. Các dụng cụ thủy tinh khác: bình định mức. Máy đo so màu quang phổ 3. tiết kiệm hoá chất. Mỗi buổi thí nghiệm. lau sạch bàn thí nghiệm và bàn giao cho cán bộ phòng thí nghiệm.Mỗi bài thí nghiệm sẽ có điểm. . Bộ chưng cất Kjendahl (hoặc máy cất nitơ tự động) 4. Cân điện tử 2.. 2.Khi làm thí nghiệm phải trật tự. sơ đồ tiến hành thí nghiệm. Hướng dẫn sử dụng một số thiết bị trong phòng thí nghiệm 1.Cuối mỗi buổi thí nghiệm sinh viên phải nộp bản báo cáo kết quả thí nghiệm cho giáo viên hướng dẫn. cẩn thận. thiết bị thì phải bồi thường. .Trong PTN phải mặc áo blouse. . Máy khuấy từ 5. . sinh viên mới được làm thí nghiệm. Thiếu một bài thí nghiệm coi như chưa hoàn tất chương trình.. . Điểm môn học sẽ gồm điểm thực hành thao tác. Viết báo cáo ngắn gọn.. rất thận trọng khi sử dụng dung môi dễ cháy nổ và hóa chất độc hại. 3 . pipet. viết tay gồm nguyên tắc. sinh viên phải rửa dụng cụ. Trước buổi thí nghiệm giáo viên hướng dẫn sẽ kiểm tra việc chuẩn bị của sinh viên. phương pháp. tuân thủ nội quy và điểm các bài báo cáo. giữ sạch nơi làm thí nghiệm. Đạt yêu cầu. nắm vững nội dung bài thí nghiệm và chuẩn bị sẵn bản báo cáo kết quả trước khi đến phòng thí nghiệm (PTN). . sắp xếp lại dụng cụ.Sinh viên phải có mặt đủ và đúng giờ trong các buổi thí nghiệm.

Ca: phản ứng cực mạnh với nước. . phản ứng cực mạnh với nước. axit mạnh. Natri và kali hydroxyt: rất ăn da. Các biện pháp an toàn như trên. và muối của chúng. lập tức rửa ngay bằng một lượng nước lớn Luôn phải đọc kỹ nhãn của chai đựng và tính chất của chúng H2SO4: Luôn cho acid vào nước khi pha loãng. luôn phải cho axit vào nước trừ phi được dùng trực tiếp Giữ để axit không bắn vào da hoặc mắt bằng cách đeo khẩu trang. 4 . tạo hỗn hợp nỏ với nhiều kimloại nặng: Ag.3. trong phòng thí nghiệm được gọi là hóa chất thí nghiệm. làm tiêu bản. dẫn xuất clo của hydrocacbon. thiết bị bảo vệ hệ thống hô hấp. cần bảo vệ da mắt. 2. Cần mang dụng cụ bảo vệ da mắt. kính bảo hộ. ẩm. phản ứng cực mạnh với nước. CO2. mắt gây hại nghiêm trọng cho hệ hô hấp Mang găng tay cao su. An toàn khi làm việc với axit: Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nóng axit hoặc thực hiện phản ứng với các hơi axit tự do Khi pha loãng. Li. phản ứng mạnh với chất oxy hoá. An toàn khi làm việc với axit và kiềm 1. đồng thời phải làm lạnh nhanh. khẩu trang khi làm việc với dung dịch kiềm đậm đặc Thao tác trong tủ hút. Tương tự khi hoà tan với nước. Hơi amoniac dễ cháy. Amoni hydroxyt: chất lỏng ăn da. Tránh tạo tinh thể cứng khi hoà tan. khẩu trang. Hoá chất thí nghiệm: Các hoá chất dùng để phân tích.. cho vào từ từ... Chuẩn bị thí nghiệm 1. Tạo hơi ăn mòn khi cháy. mang găng tay cao su. Amoniac: là một chất lỏng và khí rất ăn da. K. Pb. halogen. An toàn khi làm việc với kiềm Kiềm có thể làm cháy da. Zn . Chỉ sử dụng cồn khô khi tạo dung dịch natri alcoholate. Kim loại Na. Oxit canxi rất ăn da. sử dụng khẩu trang và găng tay để tránh phòng khi văng acid Các acid dạng hơi (HCl) thao tác trong tủ hút và mang găng tay. găng tay và kính bảo vệ mắt. 4. cho từng viên hoặc ít bột vào nước chứ không được làm ngược lại. Nếu làm văng lên da. axit mạnh. halogen. tiến hành phản ứng. mang mặt nạ chống độc để phòng ngừa bụi và hơi kiềm. đường hô hấp do dễ nhiểm bụi oxit..

công thức hóa học.Sạch hóa học (PC): độ sạch > 99% Hóa chất có độ tinh khiết khác nhau được sử dụng phù hợp theo những yêu cầu khác nhau và chỉ nên sử dụng hóa chất còn nhãn hiệu 2. N2. kim loại... Những điều cần nhớ khi sử dụng và bảo quản hóa chất được tóm tắt như sau: . NH3. acid. khối lượng phân tử.. aceton. . NaOH. nhân viên phòng thí nghiệm cũng như sinh viên cần hết sức cẩn thận. tránh gây những tai nạn đáng tiếc cho mình và cho mọi người. lỏng (H2SO4.Sạch kỹ thuật (P): độ sạch > 90% . tạp chất..Sạch phân tích (PA): độ sạch < 99% .Hóa chất phải được sắp xếp trong kho hay tủ theo từng loại (hữu ơ.. Nhãn hiệu hoá chất: Hóa chất được bảo quản trong chai lọ thủy tinh hoặc nhựa đóng kín có nhãn ghi tên hoá chất. C2H2 ..Hoá chất có thể ở dạng rắn (Na. chloroform. Cách sử dụng và bảo quản hoá chất: Khi làm việc với hóa chất..) và mức độ tinh khiết khác nhau: .. (CH3COO)2. khối lượng tịnh.. vô cơ. 3. muối. .) hoặc khí (Cl2.) hay theo một thứ tự a. KCl. bazơ. ethanon. 5 . nơi sản xuất. b. MgO. mức độ sạch. c để khi cần dễ tìm. điều kiện bảo quản.

chú ý đậy kín nắp sau khi lấy hóa chất xong. Các đơn vị nồng độ dung dịch * Nồng độ phần trăm.Tất cả các chai lọ đều phải có nhãn ghi. .Khi làm việc với chất dễ nổ. không ngửi hay nếm thử hóa chất. phải đưa vào tủ hút. dội mạnh với nước lạnh hoặc NaCl 1%. Nếu chất hòa tan ở dạng rắn thì gọi là chất tan. phải đọc kỹ nhãn hiệu hóa chất trước khi dùng. Nếu bị bắn vào mắt. nếu là chất lỏng thì gọi là dung chất. muối trong phòng thí nghiệm là dung dịch nước. Khi cần sử dụng các hóa chất dễ bốc hơi. . 1.Chai lọ hóa chất phải có nắp. Dung dịch Dung dịch là hỗn hợp của hai hay nhiều chất tác động tương hỗ với nhau về mặt vật lý và hóa học. Mỗi cách sẽ tiện dụng trong chuẩn bị. Không hút acid hay base bằng miệng mà phải dùng các dụng cụ riêng như ống bóp cao su. cổ chai.Không hút bằng pipette khi chỉ còn ít hóa chất trong lọ. Tùy theo tính chất của dung môi mà phân thành dung dịch nước và dung dịch khan... . có mùi. nếu là base phải súc miệng và uống nước lạnh có CH3COOH 1%. Trường hợp bị bỏng với acid hay base rửa ngay với nước lạnh rồi bôi lên vết bỏng NaHCO3 1% (trường hợp bỏng acid) hoặc CH3COOH 1% (nếu bỏng base). phân tích và tính toán khác nhau. Có nhiều cách biểu thị nồng độ khác nhau. Trường hợp bị hóa chất vào miệng hay dạ dày. dùng dung môi là nước. dùng xong phải trả đúng vị trí ban đầu. Trong dung dịch gồm có chất hòa tan và dung môi.Khi làm việc với acid hay base mạnh: Bao giờ cũng đổ acid hay base vào nước khi pha loãng (không được đổ nước vào acid hay base).. . base. . tránh bụi bẩn lọt vào làm hỏng hóa chất đựng trong chai. Trước khi mở chai hóa chất phải lau sạch nắp.. . không dùng lẫn nắp đậy và dụng cụ lấy hóa chất. (%) 6 . Phần lớn các dung dịch acid. Lưu ý các kí hiệu cảnh báo nguy hiểm. dễ cháy không được để gần nơi dễ bắt lửa.Các loại hóa chất dễ bị thay đổi ngoài ánh sáng cần phải được giữ trong chai lọ màu vàng hoặc nâu và bảo quản vào chổ tối. 5. nếu là acid phải súc miệng và uống nước lạnh có MgO.Dụng cụ dùng để lấy hóa chất phải thật sạch và dùng xong phải rửa ngay. Hàm lượng chất hòa tan trong dung dịch thể hiện ở nồng độ dung dịch. Một số chất khác tan trong dung môi hữu cơ.

. ppb: số µg chất hòa tan có trong 1kg hay 1 lít dung dịch. Ví dụ: dung dịch CuSO4 10% (w/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10g CuSO4 . Cách pha dung dịch có nồng độ xác định * Pha dung dịch có nồng độ phần trăm theo khối lượng. 0/00: số g chất hòa tan trong 1000g dung dịch. * Nồng độ phân tử gam hay nồng độ mol.5H2O. µg%: là số µg chất hòa tan trong 100g dung dịch. % (w/w): là số gam chất tan có trong 100g dung dịch.. hòa tan ta được 500g dung dịch NaOH 40% .Nồng độ phần trăm thể tích .Phần tỷ.khối lượng. Ví dụ: dung dịch NH4Cl 5% (w/w) là trong 100g dung dịch có chứa 5g NH4Cl . 12H2O.5N là trong 1000ml dung dịch chứa 0. cân 200g NaOH và đong 300 ml nước cất. (N): là số đương lượng gam (đlg) chất tan có trong 1 lit dung dịch.Chất tan là chất rắn khan: Ví dụ: 1) Pha 500g dung dịch NaOH 40% (w/w) 100g dung dịch cần 40g NaOH 500g dung dịch cần Xg? Lượng NaOH cần để pha dung dịch : X= (40*500)/100= 200g Lượng nước cần thiết: 500-200=300g (hay 300ml) Vậy.Nồng độ mg/mL: số mg chất tan trong 1mL dung dịch . Ví dụ: dung dịch gycerine 10% (v/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10ml glycerin * Nồng độ gam-lit. (g/L): là số gam chất tan có trong 1 lít dung dịch. ppm: số mg chất hòa tan trong 1kg hay 1 lít dung dịch. .thể tích. Ngoài ra trong các phép phân tích vi lượng còn có một số đơn vị nồng độ khác như: ..Miligam phần trăm.Phần nghìn. (Mol/L) hay M: là số phân tử gam (hay số mol) chất tan trong 1 lít dung dịch. 2.5đlg KOH * Nồng độ dung dịch bảo hòa: là khối lượng tối đa chất hòa tan trong dung dịch.Microgam phần trăm.. mg%: mg chất hòa tan trong 100g dung dịch. Ví dụ: dung dịch KOH 0. . . % (v/v): là số ml dung chất có trong 100ml dung dịch.) Khi pha dung dịch cần phải tính thêm lượng nước kết tinh có sẵn.Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO4. Na2HPO4..Phần triệu. 7 . % (w/w) .Nồng độ % khối lượng thể tích (w/v): là số g chất tan có trong 100ml dung dịch. Ví dụ: Dung dịch KH2PO4 M/15 là trong 1000ml dung dịch chứa M/15 phân tử gam KH2PO4 * Nồng độ đương lượng gam.Nồng độ phần trăm khối lượng .

Ví dụ: 2) Pha 320g dung dịch CuSO4 10% (w/w) từ CuSO4. chất tan không tan hết lắng xuống thì phần dung dịch phía trên là dung dịch bão hòa.Pha dung dịch bão hoà: Dung dịch bão hòa là dung dịch có lượng chất tan tối đa.Chất tan dạng lỏng: Một số chất tan ở dạng lỏng như HCl.5H2O) = 250 Lượng CuSO4 khan để pha dung dịch là: X = (10*320)/100 = 32g Lượng CuSO4.5H2O cần dùng: Y = (250*32)/160 = 50g Lượng nước cất thêm vào: 320 -50 = 270g (hay ml) Vậy. đong 250ml nước cất và 250g dd NaOH 10%..Pha dung dịch loãng từ một dung dịch đậm đặc hơn: Ví dụ: 3) Pha 500g dung dịch NaOH 5% từ dung dịch NaOH 10% Lượng NaOH cần để pha dung dịch 5% là: X = (5*500)/100 = 25g Lượng dung dịch NaOH 10% cần dùng là: Y = (100*25)/10 = 250g Lượng nước cất thêm vào: 500-250 = 250g Vậy. Na2HPO4. mỗi loại dung môi khác nhau thì nồng độ bão hòa của mỗi loại chất tan sẽ khác nhau. Nếu chất tan tan hết. Tra cứu những số liệu này trong "Sổ tay các hiện tượng hóa lý". chuyển sang bình định mức. thêm một ít nước cất và khuấy cho tan.Chất tan là chất rắn khan Cân lượng chất tan cần thiết. hòa tan ta được 500g NaOH 5% . Muốn pha dung dịch bão hòa cần phải biết độ tan tối đa của chất tan (nồng độ bão hòa). cứ như thế cho đến khi chất tan không còn tan được nữa.Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO4.. . H2SO4 .5H2O. Ở mỗi nhiệt độ khác nhau. . thêm chất tan và tiếp tục khuấy. 12H2O.Cách pha nhanh dung dịch bão hòa khi không tra được số liệu từ bảng: Lấy chất tan cần pha vào becher. ta được 1lít dung dịch NaCl 5%. Ví dụ: 3) Pha 1 lít dung dịch NaCL 5% (w/v) Lượng NaCl cần để pha dung dịch: X = (5*1000)/100 = 50g Vậy. cân 50g NaCl. đong 270ml nước cất.5H2O... * Pha dung dịch có nồng độ % theo thể tích . 8 .5H2O M(CuSO4) = 160 và M(CuSO4. dùng nước cất hòa tan và định mức đến thể tích đúng. hòa tan và định mức thành 1 lít bằng nước cất. Nếu cho thêm chất tan vào dung dịch bão hòa thì lượng chất tan đó không tan được nữa và sẽ lắng xuống. cân 50g CuSO4. . . Nếu sau khi khuấy. hòa tan ta được 320g dung dịch CuSO4 10%..) Khi pha dung dịch ta cần phải tính đến lượng nước kết tinh có sẵn giống như ở phần a.

dùng ống đong lấy 10ml dung dịch HCl37%.19g/ml) Lượng HCl cần để pha dung dịch 1% là: X= (1*440)/100 = 4. 3M hay 0.4)/37 = 11. qua phễu cho vào bình định mức có dung tích 1 lít. Khi phải đun nóng dung dịch để hòa tan. Do đó khi pha các dung dịch từ các loại hóa chất nàyta phải chú ý đến nồng độ của dung dịch đậm đặc.Việc cân không thuận lợi.thể tích (w/v). Nếu muốn pha dung dịch 2M. và 430ml nước cất ta được 440 ml HCl 1% Do việc sử dụng các loại bình định mức làm cho việc pha chế dung dịch thí nghiệm trở nên đơn giản và chính xác vì vậy ngày nay đa số các dung dịch thí nghiệm được pha chế theo nồng độ khối lượng . 9 . H3PO4 65%. Cho vào từng lượng nước cất nhỏ. * Pha dung dịch nồng độ phân tử gam Mol (M) hay phân tử gam (ptg) là khối lượng của các chất tính ra gam bằng khối lượng phân tử của nó.9g = 11.05M ta cũng tiến hành tương tự với lượng cân tương ứng.25%. M: khối lượng chất lỏng cần cân. Dung dịch nồng độ 1M là dung dịch chứa 1ptg chất hòa tan trong 1 lít. lắc để trộn đều đồng nhất. cân 56g KOH. 0. Chuyển dung dịch sang bình chứa. cho vào bình định mức 1000.1M.9/1. HCl .37%.4g Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là : Y = (100*4. cần làm nguội dung dịch trước khi định mức thành 1 lít.19 = 10 ml Lượng nước cất thêm vào:440-10 = 430ml Vậy. Cân chính xác lượng chất tan. ta tính khối lượng phân tử chất đó ( hoặc tra bảng) theo đơn vị gam. hoặc quá trình hòa tan có toả nhiệt thì phải chờ nhiệt độ trở lại bình thường (nhiệt độ không khí) rồi mới thêm nước tới vạch định mức. Giới hạn hòa tan tối đa được tính bằng % thể tích và thay đổi tùy theo loại hóa chất. Đây là phản ứng tỏa nhiệt. d: tỷ trọng chất lòng Chú ý: Các hóa chất lỏng bán trên thị trường thường không ở dạng nguyên chất mà là các dung dịch đậm đặc.96%. Ví dụ như H2SO4 . hòa tan trong 1 ít nước. Ví dụ: 5) Pha 440ml dung dịch HCl 1% từ dung dịch HCl 37% (d=1. có thể đưa về đơn vị thể tích theo công thức V = M/d V: Thể tích chất lỏng. Muốn pha dung dịch nồng độ 1M của một chất nào đó. Ví dụ: 6) Pha 1 lít dung dịch KOH 1M Phân tử lượng của KOH: MKOH = 39 +16 +1 =56 Lượng KOH để pha 1 lít dung dịch 1M là: 56g Vậy. NH4OH . lắc để hòa tan hoàn toàn và đưa nước cất tới mức.

5 *3*500)/1000 = 111. Tính N theo công thức trên. Tiến hành pha trong tủ Hotte vì hơi acid bay lên rất độc hại. vậy 1N (NaOH) = 1M (NaOH) Ví dụ: 10) Phản ứng giữa H2SO4 và NaOH 2H+SO42. định mức đến vạch.5 Lượng HCl 37% để pha dung dịch 1M là: X = (36.65/1. Nếu chất tan là dung dịch.5 = 36. hòa tan trong 1 ít nước. ptg chất đó phải tính luôn cả khối lượng các phân tử nước.Đlg của một axit là khối lượng chất đó để tạo ra trong phản ứng 1 ion gam H+. ta phải tính toán dựa vào nồng độ dung dịch đó.5 Lượng KCl để pha 500ml dung dịch 3M là: X= (74.base: . cho vào bình định mức 500. Định mứ c thành 1 lít.vậy 1N (NaOH) = 1M (NaOH) Số ion gam tạo ra từ 1 ptg được gọi là hệ số nguyên chuẩn độ (ký hiệu là n) N= M/n Phản ứng oxy hoá khử: Tùy theo số điện tích trao đổi ở từng phản ứng mà hệ số n khác nhau.+ 2 (Na+OH-) → 2 Na+SO42. Ví dụ: 9) Phản ứng giữa HCl và NaOH H+Cl. .5*100)/37 = 98. Ví dụ: 8) Pha 1 lít dung dịch HCl 1M từ HCl 37% Phân tử lượng HCl: MHCl = 1+35.65g Hay 98. Trường hợp chất rắn có ngậm nước.75g Vậy.19 = 83ml Vậy.Đlg của một base là khối lượng chất đó để tạo ra trong phản ứng 1 ion gam OH-.+ Na+OH. Định phân acid. cân 111. Ví dụ: 11) 2 Na2S2O3 + I2 → Na2S4O6 + 2 NaI 10 .5 = 74. * Nồng độ đương lượng gam (N) Dung dịch nguyên chuẩn là dung dịch có nồng độ 1N Đương lượng gam(đlg) được định nghĩa theo mỗi trường hợp riêng biệt từ phương trình phản ứng dùng để định phân.→ Na+Cl. vậy 1 N (HCl) = 1M (HCl) 1ptg NaOH cho ra 1 ion gam OH-.+ H2O 1ptg HCl cho ra 1 ion gam H+.Ví dụ: 7) Pha 500ml dung dịch KCl 3M Phân tử lượng của KCl: MKCl = 39 +35.75g KCl.+ 2H2O 1ptg H2SO4 cho ra 2 ion gam H+ vậy 1N (H2SO4) = 2 M (H2SO4) 1ptg NaOH cho ra 1 ion gam OH. đong 83ml HCl 37% cho vào bình định mức 1000 có sẵn 1 ít nước.

dùng bình tia rửa sạch chất tan có trong ampun vào bình định mức 1 lit. nếu muốn pha dung dịch có nồng độ chính xác. Các chất dùng trong dung dịch chuẩn phải khá bền vững sao cho nồng độ của chúng không thay đổi nhanh chóng theo thời gian. bị oxy hóa.. ta phải dùng ống chuẩn. dung môi bay hơi.Đối với các hợp chất bền vững. pha loãng và định mức tới thể tích đúng.Dùng đinh thủy tinh chọc thủng ampun.-2e → S4O62Trong phản ứng này n =1 nên N = M/1 = M Việc pha dung dịch nồng độ đương lượng gam (N) cũng tương tự với cách pha dung dịch nồng độ phân tử gam (M). 11 . Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Khi pha hóa chất. Na2S2O3 dễ bị mất nước tinh thể khi để ngoài không khí. * Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Đối với các chất dễ thay đổi thành phần khi ở dạng rắn.Đối với các chất như NaOH. các hóa chất không tinh khiết hay bị hút ẩm. . Bên trong chứa một lượng cân chính xác chất tan hoặc dung dịch chất tan. Ví dụ: 12) NaOH thường nhiễm một lượng Na2CO3 rất dễ chảy nước. ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng. vì vậy phải kiểm tra nồng độ thực của các dung dịch pha sẵn dựa vào các dung dịch có nồng độ chính xác được gọi là dung dịch chuẩn (fixanal) * Dung dịch chuẩn Dung dịch chuẩn là các dung dịch được chuẩn bị sẵn. có thành phần không thay đổi như NaCl. . có thể pha dung dịch chuẩn trực tiếp bằng cách cân chính xác chất cần pha. . HCl. . AgNO3.. Khi chuyển hết lượng chất tan trong ống vào bình định mức và pha thành 1 lít ta được dung dịch chuẩn có nồng độ đã ghi trên nhãn ngoài ống. không thể pha ngay được dung dịch chuẩn. Ong chuẩn là một ống ampun thủy tinh hay nhựa đóng kín. * Cách pha dung dịch chuẩn từ ống chuẩn .. Pha dung dịch chuẩn. đảm bảo chính xác và được dùng để định chuẩn các dung dịch tự pha chế khi làm thí nghiệm. hứng lên phểu vào bình định mức. có nhiều nguyên nhân làm cho nồng độ dung dịch không chính xác như việc cân đong không chính xác.. vì vậy sau khi pha phải hiệu chỉnh lại nồng độ. sau đó hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch dựa vào phản ứng với một dung dịch chuẩn thích hợp. acid oxalic. HCl dễ bay hơi. vừa thêm nước cất vừa lắc và đưa nước cất tới vạch mức. Thời gian tàng trữ lâu nên chất tan bị thăng hoa. do các chất này thường không bền vững và dễ thay đổi thành phần. 3. Na2S2O3.I2 + 2e → 2I2 S2O32.

Trong cơ thể sống. 1 ion gam H+ sẽ phản ứng với 1 ion gam OH-. Dung dịch KOH 0. để có đệm pH ở giá trị 4.1N Lấy 10ml H2SO4 0. dùng burette định phân bằng NaOH được 11 ml NaOH Vậy nồng độ thực tế NaOH đã pha là : Ct = (10*0. Nghĩa là pH thay đổi rất ít. Dung dịch đệm: Dung dịch đệm là dung dịch tạo môi trường ổn định pH cho dung dịch. mỗi lần sử dụng lại phải xác định lại hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Xét một phản ứng trung hòa acid . Các phản ứng thường thấy là phản ứng tạo kết tủa hay tạo phức hoặc oxy hóa khử. thêm ba giọt chỉ thị màu phenolphtalien. dung dịch định pha là NaOH 0. chọn cặp acid .1N để chuẩn độ lại.91 6. ví dụ như ổn định pH của máu bằng các hệ đệm carbonate và phosphate.1N cho vào erlen.1N.1)/11 = 0.091/0.Ví dụ: Pha dung dịch NaOH 0.75.1 N từ NaOH rắn và dùng dung dịch chuẩn H2SO4 0. dung dịch sẽ cân bằng dạng như sau: CH3COOH + H2O -----> CH3COO.base CH3COOH (0.75.base.091 N Hệ số điều chỉnh K: K= 0. thường gồm một acid yếu và một base yếu với tỉ lệ của chúng sẽ quyết định pH của dung dịch.1M). Về nguyên tắc thì phối hợp các loại đệm có các khoảng đệm khác nhau thành 1 dung dịch là không có vấn đề gì. Thí dụ. Nếu thêm vào dung dịch 0.748 gần bằng 4.05N Đối với các dung dịch dễ thay đổi trong quá trình bảo quản.1M)/CH3COONa (0. Việc pha dung dịch đệm tuân theo nguyên tắc chọn cặp acid – base có hằng số phân ly pK A/B gần với pH đệm muốn pha và phối trộn chúng với số mol bằng nhau. Vậy nếu dùng dung dịch acid và dung dịch base có cùng nồng độ N. Tuy nhiên sử dụng các đệm nào còn tùy thuộc vào ứng dụng sao cho thành phần của đệm không phản ứng với các cấu tử trong hệ phản ứng khảo sát theo chiều hướng có hại. thì phản ứng sẽ đạt điểm cân bằng khi thể tích hai chất bằng nhau C1V1 = C2V2 Nếu gọi Cp là nồng độ dung dịch định pha và Ct là nồng độ thực của dung dịch ta có hệ số hiệu chỉnh K: K= Cp/Ct = Vp/Vt Ví dụ: 13) Dung dịch chuẩn là H2SO4 0.1 = 10/11 = 0.001 mol HCl thì pH của hệ vẫn chỉ ở mức 4. Có dung dịch chứa hỗn hợp 1 acid yếu (Ví dụ: acid acetic) với muối của nó (Ví dụ: muối natri acetate). dung dịch đệm đóng vai trò quan trọng.05N tron cồn phải dung dung dịch chuẩn là H2SO4 0.+ H3O+ 12 .

acid điện li cho H3O+ (cân bằng chuyển dịch theo chiều thuận).0 pH 4. Khả năng đệm của hỗn hợp đệm phụ thuộc vào hàm lượng acid và base liên hợp có trong hỗn hợp.51 8.50 7.00 5.Dung dịch acid boric (a): 12.84 8.00 1.Dung dịch trinatri citrate 0.88 7. Kết quả pH của dung dịch tăng không đáng kể.50 7.94 8.5 b 3. chứa hỗn hợp base yếu (Ví dụ: amoniac) với muối của nó (Ví dụ: muối amoni clorua).Dung dịch acid citric 0.00 4.60 8.1M (b): 29.60 6.50 4.6 1.1M (a): 21.24 *Dung dịch đệm citrate (pH = 3.41 g C6H5O7Na3.0 – 6.H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml.00 3. .09 7.00 9.404 g H3BO3 hòa tan và định mức đến 1000 ml.75 8.50 6.2 0.00 0. .80 9.00 b 3.77 7.70 7.20 8.41 8.11 9.36 7.69 8.00 7.2) . Trái lại.50 5.50 3. Dung dịch đệm citrate có giá trị pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml dung dịch (b) theo bảng sau: A 46.50 8.0 13 a 23.00 8. Khi thêm một lượng acid mạnh (H3O+).00 7.0 1.0 pH 8.00 8.50 4.0 b 27. * Dung dịch đệm borat: .00 5.6 0.98 9.50 6.2H2O hòa tan và dẫn nước đến 1000 ml.70 9.50 2.00 10.60 7. khi thêm một lượng base mạnh (OH-).50 5.40 9. ion hidroni H3O+ trung hòa OH.trong dung dịch cân bằng có dạng sau: NH3 + H2O ----------> NH4+ + OHDung dịch đệm có pH thay đổi rất ít khi thêm một lượng acid hoặc base.31 8.0 2.00 pH 6.30 2.08 a 6. base liên hợp kết hợp với nó cho acid yếu (cân bằng chuyển dịch theo chiều nghịch) pH của dung dịch giảm không đáng kể.8 .00 b 0.78 7.00 4.25 1.10H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml Dung dịch đệm borat có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và dung dịch (b) theo bảng dưới đây: A 9.Có dung dịch khác chẳng hạn.50 pH 3.00 2.01 g C6H8O7.108 g Na2B4O7.cho base yếu H2O.Dung dịch borat (b): 19.

6 6.2 7.5 73.0 4.8 g NaH2PO4 hòa tan và định mức đến 1000 ml.0 – 8.7 – 8.9 8.6 5.4 5. a 10 18 30 49 79 b 990 982 970 951 921 pH 5.7 7. a 93.5 3.05 g Na2HPO4.8 4.0 33.50 7.7 85.5 31.0 89.0) .6 5.0 87. .5 62.7 pH 6.3 15.9 6.0 33.5 91.0 b 6.4 4.0 23.00 10.5 51.2 6. Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml dung dịch (b).5 49.0 10.0 12.0 81.4 7.5 93.0 *Dung dịch đệm Na2HPO4 – KH2PO4 (pH = 5.5 77.2 7.30 b 55.4 5.2 4.5 68.8 - 5.4 .5 37.07 g KH2PO4 hòa tan và định mức đến 1000 ml.0 19.8 6.00 5.50 8. Dung dịch đệm phosphate có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml dung dịch (b) định mức đến 200 ml.8 9.5 7.0 28.0 13.0 87.0 13.0 31.3 7.8 7.5 42.0 36.0 24.9 g Na2HPO4.0 35.0 81.6 7.0 22.Dung dịch dinatri hydrophosphate 1/15M (a): 23.8 14 a 372 492 612 726 818 b 628 508 388 274 182 pH 6.5 8.6 20.2 - *Dung dịch đệm phosphate (pH = 5.0 7.Dung dịch mononatri orthophosphate 0.8 40.8 5.5 22.9 7.2M (b): 53.0) .7H2O hoặc 71.43.0 28.0 94.5 92.Dung dịch dinatri hydrophosphate 0.6 5.8 7.2 - 29.20 10.4 3.5 7.0 61.1 6.7 6.0 7.12H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml.0 72. .0 19.6 3.5 32.5 53.0 17.6 6.0 13.1 7.8 a 45.2 5.0 39.0 34.0 5.7 g Na2HPO4.0 67.0 6.0 77.0 16.0 pH 5.0 37.5 26.12H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml.0 90.0 16.5 6.0 6.2 3.3 6.0 15.2 5.7 11.0 5.0 25.2M (a): 27.0 84.5 56.Dung dịch kali dihydrophosphate 1/15M (b): 9.2 40.4 6.5 18.0 18.5 6.3 38.

X 5.8 9.2 M (a): 15.4 pH 3.2 M (a): 15.4 X 22.8 ml HCl đặc (37%) pha thành 1000 ml.4 72.6 – 10.2 M (b): 8 g NaOH hòa tan và định mức đến 1000 ml.0 6.0 10.Dung dịch natri acetate 0.6 – 5.4 .121 184 264 879 816 736 6.0 13.Dung dịch glycine 0.8 24.4 10.6 3.8 pH 8.6) .0 6.8 12.4 3.2 39.Dung dịch glycine 0.6 9.2 11.2 5.0 41.0 4.Dung dịch NaOH 0.8 10.2M (a): 11. Dung dịch đệm Glycine có pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X ml dung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml.2 32.3 44. Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào X ml dung dịch (a) và Y ml dung dịch (b) và định mức đến 100 ml.0 38.0 *Dung dịch đệm Glycine – HCl (pH = 2.8 2.01g glycine hòa tan và định mức đến 1000 ml.2 3. Dung dịch đệm Glycine có pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X ml dung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml.01g glycine hòa tan và định mức đến 1000 ml.2 *Dung dịch đệm Glycine – NaOH (pH = 8.2 32.5 8. a 46.0 X 16.6 45.0 9.2 g CH3COONa.0 8.6) .2 15 a 20.Dung dịch HCl 0.6 3. .2 pH 4.2 9.0 5.0 36. .0 16.0 14.5 pH 9.7 6.8 10.8 5.Dung dịch acid acetic 0.0 pH 2.2M (b): 16.4 8.8 4.0 6.8 8.4 g CH3COONa hoặc 27.6 7.6 8.2 – 3.2 M (b): 16.55 ml CH3COOH đặc và định mức đến 1000 ml. .8 b 3. X 4.4 2.6 *Dung dịch đệm acetate (pH = 3.4 44.0 35.4 885 936 969 115 64 31 7.3H2O được hòa tan và định mức đến 1000 ml.2 pH 3.8 b 30.2 6.6) .0 9.5 41.6 2.

Điều chỉnh giá trị pH của dung dịch đệm trong khoảng pH = 1.6 *Dung dịch đệm vạn năng 0.4 4.1M (a): 5.5 4.6 4.1M có pH = 1.8 45. Trộn lẫn các dung dịch (a).18 g acid ortho-boric trong nước cất và định mức đến 1000 ml.1M (b): 6.5 24. . .7 ml CH3COOH đặc và định mức bằng nước cất đến 1000 ml.1M .45 ml H3PO4 đậm đặc và định mức bằng nước cất đến 1000 ml.5 19.2 5. . (c) với thể tích bằng nhau nhận được dung dịch đệm 0.Dung dịch acid phosphoric 0.Dung dịch acid ortho-boric 0.30. (b). Các dung dịch đệm vạn năng nồng độ khác được chuẩn bị tương tự.5 25.0 bằng cách bổ sung dung dịch NaOH 1N (d).8.8 đến pH = 12.Dung dịch natri hydroxide 1N (d): hòa tan 40 g NaOH trong nước cất và định mức đến 1000 ml. 16 .1M (c): hòa tan 6.Dung dịch acid acetic 0.

Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS). quả.. để yên hỗn hợp 10 phút. khoai tây. Tùy đối tượng nghiên cứu (hạt..Trường hợp nguyên liệu chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin như khoai lang. có thể chiết đường từ nguyên liệu bằng nước. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. cần chú ý là trong quá tình đun khi chiết. Trong trường hợp này không cần kết tủa protein bằng chì acetate vì lượng protein chuyển vào dung dịch không nhiều..4 – 7.. Dụng cụ .Trường hợp các nguyên liệu chứa nhiều acid hữu cơ như cà chua.3H2O] hoặc chì nitrate [Pb(NO3)2] 10%. Nếu là nguyên liệu tươi (như hoa.Bình định mức 50ml 17 . Nghiền cẩn thận với bột thủy tinh hay cát sạch và 30 ml nước cất nóng 70 – 80oC... Trước khi đun cách thủy hỗn hợp phải trung hòa acid bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa tới pH 6. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. .BÀI 2.. quả tươi) thì cân 5 – 10 g. ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ACID DINITRO-SALICYLIC (DNS) 1. Đun cách thủy 70 – 80oC trong 35 – 40 phút. Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức dung tích 1000 ml. kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch chì acetate [Pb(C2H2O2)2. Tiếp đó thêm nước cất tới vạch mức và đem lọc qua giấy lọc vào cốc hay bình khô...Trường hợp nguyên liệu thí nghiệm không chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin. lá hoặc quả khô. đun hỗn hợp cách thủy trong bình cách thủy có lắp ống làm lạnh không khí.hóa chất: 1 Dụng cụ . Do đó cần xác định riêng đường khử và riêng saccharose. Nước lọc dùng làm dung dịch thí nghiệm. nhưng nguyên tắc chung như sau: .. Tránh dùng quá dư chì acetate (dùng 2 – 5 ml chì acetate).. khế. đường saccharose có thể bị thủy phân một phần. cần chiết đường bằng rượu 70 – 80oC. chanh. Cân và cho vào cối sứ 1 g nguyên liệu hạt hay các mẫu thí nghiệm thực vật khô như cây. dứa. 2.0. đã được nghiền nhỏ (và sấy khô đến khối lượng không đổi). Sau đó loại bỏ lượng chì acetate dư bằng dung dịch Na2SO4 bão hòa. .) mà cách chuẩn bị dung dịch nghiên cứu dùng để định lượng đường có khác nhau đôi chút. sắn..

Cho tiếp 10ml cồn 800 vào cốc đựng bã.4 9. mẫu có thể để lâu trong bình hút ẩm. đun sôi 2 lần trên nồi đun cách thủy→ Để nguội → lọc (lặp lại 2 lần) Đưa phần bã lên lọc và rửa bằng rượu nóng (800) Rượu qua lọc được cho bay hơi ở trong phòng hoặc trên nồi cách thủy đun nhẹ. dứa) .nguyên liệu .4. 0.6 0.8 0. Tính kết quả Từ phương trình đồ thị đường cong chuẩn tính được % lượng đường trong mẫu vật. So màu rồi vẽ đồ thị mẫu (vẽ trên máy tính) Làm tương tự với mẫu dung dịch đường được chuẩn bị ở trên và một mẫu thử không (nước cất) 4. 1. Và tuỳ theo nồng độ đường nhiều hay ít mà pha loãng thêm 5-10 lần.8.0 9.0 Từ các ống nghiệm trên lấy 1ml ở mỗi ống vào 5 ống nghiệm khác và thêm vào mỗi ống 3ml thuốc thử DNS.0 1. trục hoành là nồng độ glucose.2 – 0.0 mg glucose. Cặn khô trong cốc được pha loãng thành 50ml với nước cất.2.04 mg glucose do glucose bị oxy hóa.6 9.Chiết xuất đường trong thực vật 5g rau cải ngọt → nghiền nhỏ → cho vào becher 100ml + 10ml cồn 900 → đun cách thủy (sôi 3 lần) → khuấy đều bằng đũa thủy tinh → để nguội → lọc (chỉ gạn lấy phần trong). khuấy đều.Dung dịch glucose chuẩn 3. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm với đối chứng là nước. Đun sôi đúng 5 phút. 18 . Tiến hành . Sau khi cho bay hơi rượu. Hóa chất .8 Ống 5 1.8 9.2 9.8.Mẫu rau quả chứa đường (rau cải ngọt. 0.Dựng đường cong chuẩn và xác định hàm lượng đường Cho vào 5 ống nghiệm sạch với các chất có thể tích như bảng sau Hoá chất Glucose (10 mg/ml) Nước cất (ml) Nồng độ Ống 1 0.2.4 0.2 0. Để lắng cặn khi đem làm hiện màu.Thuốc thử DNS . 0. Pha loãng mẫu nếu cần sao cho mật độ quang nằm trong khoảng 0. . Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang. Trong mỗi ống nghiệm sẽ chứa tương ứng 0.6.2 Ống 2 0.6 Ống 4 0. Đường thẳng thu được có thể cắt trục hoành ở 0.4 Ống 3 0.

. bình hứng chứa H2SO4 0. Nguyên tắc Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nitơ tổng số. MgO..Bi thủy tinh . carbon và hidro của acid amine tạo thành CO2 và H2O.Bình hứng (becher 250ml) . các acid amin tự do. Dụng cụ .1N H2SO4 dư + NaOH → Na2SO4 + H2O 2. Dụng cụ + Bộ chưng cất Kjeldahl định lượng Nitơ gồm: . acid nitric. các peptid. Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau: 2H2SO4 → 2H2O +2SO2↑+ O2 .Ống dẫn khí .Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác. Các phân tử chứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. Nitơ có trong thành phần acid amine của protein là nitơ protein. Mg.Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH (NH4)2SO4 + 2 NaOH = Na2SO4 +H2O + 2NH3↑ .. là nitơ phi protein.Bếp đun 19 . K.. .Bình cất đạm ..Ống sinh hàn .hóa chất a. CaO. Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein . chuyển thành dạng oxide: P2O5. các base purine và pyrimidine.NH3 bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH4OH rơi vào bình hứng.. Ca. Ví dụ các protein bị thủy phân thành acid amine.Chuẩn độ H2SO4 dư bằng NaOH 0.Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác.1N 2NH4OH + H2SO4 → (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 dư ..BÀI 3.. ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL 1.. các alkaloid. Nitơ không có trong thành phần protein như của các muối vô cơ. còn nitơ được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4 Các nguyên tố P.Bình Kjeldahl phá mẫu . urea và các dẫn xuất của urea. K2O.

đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh Lưu ý giai đoạn này phải thực hiện trong tủ Hotte.Cất đạm 20 .1N chuẩn + NaOH 0. lắc nhẹ. Hóa chất + nguyên liệu + Bột đậu nành (0.1g) + H2SO4 đậm đặc + NaOH 40% + H2SO4 0.Vô cơ hóa mẫu Cân 100mg bột đậu nành đã sấy khô tuyệt đối cho vào bình Kjeldahl. tránh trường hợp khi sôi mạnh hóa chất bắn ra ngoài. Cho thêm vào 200mg chất xúc tác. Tiến hành . Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn. khi đã sôi giữ nhiệt độ bếp đun vừa phải để tránh hóa chất trào ra ngoài và không bị bay mất amoniac. Trong khi đun. đậy kín để khoảng 3 phút. Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100 ml. theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun. pipet 10ml + Erlen 250ml + vaseline Bộ chưng cất Kjeldahl b.+ Pipet 20ml. khi thấy dung dịch gần như trong suốt thì có thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở trên thành bình còn chưa bị oxi hoá vào trong dung dịch. cho tiếp 5ml H2SO4 đậm đặc sẽ thấy xuất hiện màu nâu đen (do nguyên liệu đã bị oxi hóa). Đặt bình Kjeldahl lên bếp đun. . đặt bình hơi nghiêng trên bếp.1N chuẩn + Thuốc thử Tasiro + chất xúc tác: hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 (3:1) 3. dùng nước cất vô đạm tráng lại bình Kjeldahl và định mức đến vạch.

Tiến hành lắp hệ thống cất đạm. Ghi nhận thể tích NaOH 0.42 hệ số . cứ 1 ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với 1. đợi hệ thống nguội mới tháo hệ thống đem đi rửa. . cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0.42mg Nitơ 21 . 4.Chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có sẵn 50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro lúc này trong bình có màu tím hồng. Nếu giấy qùy không đổi sang màu xanh là được.1N đã chuẩn độ a số miligam nguyên liệu 1.1N và 3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng). Tiếp tục cho vào bình cất 15ml NaOH 40% cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển sang màu xanh lá mạ (thêm 5ml NaOH 40% nếu dung dịch trong bình chưa chuyển hết sang màu xanh lá mạ). Bật công tắc cất đạm Sau khi cất đạm 10-12 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không.1N cho đến khi mất màu tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ.Chuẩn độ: Chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0.1 N sử dụng. Đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống sinh hàn. Ngưng cất đạm. Tính kết quả: Hàm lượng % nitơ tổng số được tính theo công thức N (mg%) = {1. dùng giấy qùy thử ở đầu ống sinh hàn.42 * (V1-V2)*100/a}*2 V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứng V2: số ml NaOH 0.

hóa chất 1.BÀI 4. khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại 465 nm. Lấy giá trị OD = ODx . Thực hiện một đối chứng với nước cất (OD0).Bình tia đựng cồn 22 . Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế ta được ODx. Lượng protein mẫu trong dung dịch đo được xác định bằng cách chấm trên đường chuẩn theo OD. 1ml (có thể thay bằng pipetteman) .Ống nghiệm (14) . Trong dung dịch mang tính acid. Công thức phân tử của Coomasie Brilliant Blue G-250 2. Dụng cụ . Độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein.Đồng hồ bấm giây . Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein.Giá để ống nghiệm . màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Để xác định protein trong mẫu. đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ. Đó chính là lượng protein mẫu trong dung dịch đo. khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm. Dụng cụ . Dung dịch protein chuẩn thường là bovine serum albumin.Máy đo quang phổ . lấy giá trị của điểm đó trên trục hoành.OD0.Giấy thấm . ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD 1.Pipette 5ml. độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với lượng trong mẫu.

2 5 20 3 0. tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 595 nm. .1 5 10 2 0. 2. Tính kết quả: .2.. tương tự cứ cách một phút đo cho hết các ống. 1. Ở thời điểm 1 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 1.9 0. 4.Bổ sung các thành phần như bảng sau.7g Phosphoric acid 85%: 8. ở thời điểm 21 phút đo ống 1 (OD1). được dung dịch có nồng độ 0.. Tiến hành .1 mg/ml.. Lắc đều.005g Ethanol tuyệt đối: 4.1mg/ml) TT Bradford Nồng độ Albumin (µg/ml) 0 1 0 5 0 1 0. 3.Dùng đồng hồ bấm giây.3 5 30 4 0. Ghi lại giá trị OD. 4. Giữ ở -200C. lắc đều để yên.5g Phẩm màu Coomasie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong một chai đựng màu tối có nắp.5 5 50 X 5 ? . Hóa chất . Khi dùng pha loãng ra 100 lần. lắc đều cho tan. Ta có giá trị OD0. canh thời gian 0 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 0. cứ tiếp tục cho đến hết.7 0. riêng ống nghiệm X cho 1 ml mẫu cần phân tích do phòng thí nghiệm cung cấp (nếu cần sinh viên tự pha loãng mẫu trước khi phân tích) ..Cồn 900 .Dung dịch protein chuẩn: cân 10 mg albumin bằng cân phân tích.Dung dịch cần xác định hàm lượng protein (phòng thí nghiệm cung cấp) 3... 5 và 1 ống nghiệm chứa mẫu cần phân tích X .4 5 40 5 0. giữ ở 40C .6 0. Bổ sung phosphoric acid và chỉnh tới 100ml bằng nước cất.5 0.Dung dịch thuốc thử Bradford: dung dịch thuốc thử có thành phần trong 100ml như sau: Coomassie Brilliant Blue: 0.Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595 .9 0. pha trong 1 ml nước cất. Ống nghiệm Nước cất (ml) Albumin chuẩn (0.Lập một loạt 6 ống theo số thứ tự 0. lắc đều để yên.Tính thời gian ống 0 được 20 phút.Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595 ở trên ta tính được hàm lượng protein ở trong mẫu phân tích 23 .

viết tắt U) do Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (International Union of Biochemistry – IUB định nghĩa: Một đơn vị chuẩn của enzyme (1 U) là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được 1 mol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn. Hoạt động hay hoạt tính của enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất được chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn. 1 U = 1 mol sản phẩm = 1 mol cơ chất (10-6 mol)/phút b) Năm 1979. Mỗi enzyme có khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định.trong một đơn vị thời gian. độ nhớt. c) Đơn vị hoạt tính dựa vào sự thay đổi đặc tính hỗn hợp phản ứng. Nguyên tắc 1.67 nKat (nanokatal) Đơn vị Katal được khuyến cáo vì nằm trong hệ đơn vị đo lường Quốc tế (SI).. Vì vậy có thể đánh giá hoạt tính xúc tác của enzyme bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa cơ chất hoặc tốc độ tích lũy sản phẩm phản ứng. áp suất. Đ iề u q u a n tr ọ n g n h ấ à lcầ n đ ịn h t n g hĩa rõ rà n g đ ơ n vị h o ạ t tín h . * Đơn vị hoạt tính enzyme : Mục đích xác định hoạt tính enzyme là xác định số đơn vị hoạt tính. đo độ phân cực. độ nhớt . ví dụ sự thay đổi độ đục. Trường hợp cơ chất và sản phẩm là một hỗn hợp phức tạp thì áp dụng đơn vị hoạt tính này. 1 Kat = 1 mol cơ chất/ giây = 60 mol/ phút = 60 x 106 mol/ phút = 6 x 107 U 1 U = 1/60 x 10-6 Kat = 16. a) Đơn vị hoạt tính thông dụng nhất là đơn vị quốc tế (Enzyme Unit.BÀI 5. phương pháp sắc ký và phương pháp hóa học..Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định.1. Enzyme và đơn vị đo hoạt tính enzyme Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và có tính đặc hiệu cao. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME 1. Để thực hiện được mục đích trên. N h ư v ậ y . nhiều phương pháp phân tích khác nhau được sử dụng: phương pháp đo quang phổ. 24 . c ó n h iề u đơ n vị h o ạ t tín h e n z y m e . . Một đơn vị họat tính enzyme được định nghĩa theo nhiều phương pháp. Về nguyên tắc có thể hai nhóm phương pháp chính sau: .Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm tương ứng với một nồng độ enzyme xác định. Hội đồng Danh pháp của IUB khuyến cáo nên sử dụng Katal làm đơn vị cơ bản của hoạt tính enzyme: Một Katal là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được 1 mol cơ chất sau 1 giây ở điều kiện tiêu chuẩn.

Động học phản ứng enzyme T r o n g b à i thự c hà n h n à y . l -3 T hờ i g ia n x á c đ ịn h h o ạ t tín h thờ n g 5-3 0 p h ú t. T r o n g m ẫ u đ ố i c h ứ n g e n z y m e p h ả i b ị b ấ t h o ạ ư ớ c k h i tiế p x ú c t tr v ớ i cơ c hấ t. C á c th ô n g số n h iệ t đ ộ . s a u đ ó b ắ t đ ầ u g iả m (H h 1 ). đ iề u k iệ n tồ n trữ th ự c h p hẩ m h oặ c đ iề u k iệ n mà h oạ t lự c c ó th ể đ ạ t tố iư u . g ly c o g e n . Hình 1.6 0 g iâ y ). v ì g ia iđ oạ n nà y tố c đ ộ p hả n ứ n g lớ n 0 n hấ t. n hư n g k h ô n g q u á c a o đ kìm h ã m e n z y m e . n ồ n g đ ộ io n àv th à n h p hầ n d u n g d ịc h đ ệ m ả n h h ư ở n g lê n h oạ t tín h e n z y m e . đ ủ th ừ a đ ể bã o e n z y m e . Tố t n h ấ t là x á c địn h tố c đ ộ ư b a n đầ u c ủ a p h ả n ứ n g (3 . ìn K h i x á c địn h h o ạ t tín h p h ả i àlm mẫ u đ ố i c h ứ n g s o n g s o n g v ớ i m ẫ u th í n g h iệ m . T h ử h o ạ t tín h e n z y m e p h ả ư ợđc tiế n hà n h i tro n g đ iề u k iệ n th íc h h ợ p nư đ iề u k iệ n s in h lý .2 . * Điều kiện phản ứng để xác định hoạt tính K h i tiế n hà n h thự c n g h iệ m c ầ n trá n h n h ữ n g ế u tố c ó th ể b iế n tín h p r o te in y enzym e. àv ản 25 . ớ N ồ n g đ ộ cơ c hấ t tro n g p h ả n ứ n g e n z y m e p h ả i ở tr o n g g iớ i h ạ n th íc h h ợ p . V ớ i n h ữ n g e n z y m e c ầ n c ó c h ấ t h o ạ t h ó a h o ặ c c h ấ t ổ n đ ịn hì thhả i c h o c á c p c hấ t nà y v à o e n z y m e tr ư c k h i c h o cơ c hấ t và o hỗ n h ợ p p h ả n ứ n g . Hoạt tính riêng được biểu thị bằng số đơn vị enzyme/mg protein protein (U/mg protein) hoặc Kat/kg protein. s in h v iê n là m q u e n ớ i p hư ơ n g p h á p x á c đ h h o ạ t tín h v ịn e n z y m e a m y la s e 1 .Hoạt tính riêng (specific activity) của enzyme Hoạt tính riêng của một chế phẩm enzyme đặc trưng cho độ tinh sạch của chế phẩm enzyme. p H . S a u k h i ể d ừ n g p h ả n ứ n g ư ợ n g cơ c hấ t đư ợ c c h u y ể n h ó a 2 0 0 % . E n zy m e a m y la se v à p h ư ơ n g p h á p x á c ịn h h o ạ t tín h đ * K h a i q u á t về en zy m e a m ylase A m y la s e là c á c e n z y m e x ú c tá c c h o c á c p h ứ n g th ủ y p h â n tin h b ộ t. trong đó hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Lowry hoặc Bradford).

s a uđ ó c h u yể n d u n g d ịc h s a n g bn h ò ì đ ịn h m ứ c 1 0 0 0 m l.1.1 .1 ) c ó tr o n g n ớ c b ọ t. H ó a chấ t – D ụ n g cụ : D u n g dịc h đ ệ m D u n g dịc h đ ệ m a c e ta te p H = 4 . K ể m tra p H . h ạ t hò a ư thả o n ả y m ầ m .2 .1 M p H = 1 0 (d n g để x á c đ ịn h h o ạ t tín h ù -a m y la s e k iề m . Nhiều glucoamylase hoạt động mạnh ở pH 3.4-glycoside từ đầu không khử tạo thành maltose và dextrin phân tử lớn. xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1. EC 3.4. v i k h u ẩ n .3) xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1. Sản phẩm chủ yếu là glucose và dextrin. Enzyme này mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC.5.5-5. i D u n g dịc h đ ệ m p h o s p h a te p H = 4 . Dư ớ i tá c d ụ n g c ủ a e n z y m e à y . ư -a m y la s e (Exo -1.4-g ly c o sid e ở g iữ a c h u ỗ i p o ly s a c c h a r id e (h o ạ t tín h e n d o a m y la s e ) tạ o th à n h m a lto s e .2. * C á c p h ư ơ n g p h á p đ o h o tín h en zym e -am ylase ạt N g u y ê n tắ c c h u n g d ự a tr n c ơ sở th ủ y p h â n tin h b ộ t b ở i e n z y m e tro n g d u n g ê d ịc h e n z y m e n g h ê n cứ u thà n h c á c d e x tr in c ó p h â n ửt lư ợ n g k h á c n h a u . ní 2. -a m y la s e bề n v ớ i n h iệ t. n ấ m m ố c .9 (x á c đ ịn h h o ạ t tín h e n z y m e cm a lt): ủ trộ n 1 0 m l d u n g d ịc h N2a P O 4 1 /1 5 M vớ i 9 9 0 m l d u n g d ịc h K HP O 4 1 /1 5 M H 2 n hậ n đư ợ c 1 l d u n g d ịc h đ ệ m p h o s p h a te p H = 4 . nhưng bền với acid hơn -a m y la s e . B ả o q u ả n d u n g d ịc h tro n g b ìn h m à u n â uđ ể c h ỗ tố i. d e x trin p h â n ửt th ấ p .c á c p o ly s a c c h a r id e tư ơ n g ựt .1 N D u n g dịc h io d : h ò a ta n 3 0 m g K I v à 3 m g I 2 ớv m ộ t lư ợ n g n h ỏ nư ớ c c ấ t. i L ắ c n h ẹ h ỗ n h ợ p đ ể h a ta n h o à n to à n .4-g lu c a n a s e. D u n g dịc h đ ệ m g ly c in e – N a O H 0 .6-glycoside từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. Đ oc ườ n g i đ ộ m à u tạ o thà n h g iữ a tin h b ộ t v c á c sả n p h ẩ m th ủ y p h â n c ủ a n ó v ớ i io d bằ n g à e m á y s o m à u sẽ tín h đư ợ c h o ạ t tín h e n z y m e . Enzyme này mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC.1. tụ y tạ n g . b ổ s u n g ưnớ c c ấ t đ ế n v ạ c h m ứ c .4-glucanase. K iể m tra p H . n h n g k é m b ề n v ớ i a c id . Glucoamylase (Exo -1. D u n g dịc h H C l 0 .2) có nhiều ở thực vật (hạt. Đ ơ n vị a m y la s e l lượ n g e n z y m e c ầ n th iế t đ ể th ủ y p h â n h o to à n 1 0 m g à àn tin h bộ t s a u th ờ i g ia n p h ả n ứ n g 3 0 p h ú t tr o n g đ iề u k iệ n th g h iệ m . E n z y m e yn p h â n g iả i liê n kế t à 1 .2. d u n g n d ịc h tin h b ộ t n h a n h c h ó n g b ị m ấ t k h ả n ă n g tạ o à m vớ i d u n g d ịc h io d v à u e b ị g iả m đ ộ n h ớ t.4-glucanase. E C 3 .7 (x á c đ ịn h h o ạ t tín h e n z y m e n ấ m m ố c ): tr ộ n 1 thể tíc h C H3 C O O H 1 N vớ i 1 th ể tíc h C H3 C O O N a 1 N .và 1. D u n g dịc h tin h b ộ t 1 % :h ò a ta n 1 g tin h b t (th e o c h ấ t k h ô tu y ệ t đ ố i) v ớ i 5 0 ộ 26 . A m y la s e c h ia à m 3 loạ i c h ín h : l -a m y la s e (Endo -1. củ).9 4 . EC 3.

b ổ s u n g ư ớ c cấ t tớ i v ạ c h m ứ c . B ả o q u ả n d u n g c h e n z y m e gố c ở 2 – 4 o C tro n g thờ i dị g ia n 1 n g à y .7 ( h o ặ c 1 0 m l d u n gh đ ệ m d ịc p h o s p h a te p H = 4 .5 m l 27 . T ríc h ly e n z y m e n m m ố c : C â n m = 5 g c h ế p h ẩ m e n z y m e th ô đ g h iề n ấ ã n s ơ bộ .7 . C h uẩ n b ị m ẫ u th í n g h iệ m .9 ) ổ s u n g nư ớ c c ấ t đ ế n v ạ c h m ứ c . dù n g t ên đ ũ a th ủ y tin h c h cẩ n th ậ n c h ế p h ẩ m tr o n g m ộ t c ố c th ủ y tin h d u n g tíc h 5 0 à m l vớ i m ộ t lư ợ n g nư ớ c n h ỏ . L ọ c à th u hồ i d ịc h n v o tríc h ly e n z y m e . lắ c liê n tụ c c h o đ ế n k h i tin h b ộ t ta n hàon to à n . * D u n g dịc h e n z y m e đ ể p h â n tíc h P h a lo ã n g d u n g dc h e n z y m e g ố c (h ệ s ố p h a lon g n) bằ n g d u n g d ịc h đ ệ m ị ã s a o c h o tr o n g 1 m l d u n g ịc h e n z y m e p h â n tíc h c ó cứ a m ộ t lư ợ n g e n z y m e đ ủ đ ể d h thủ y p h â n 2 0 % . lắ c đ ề u . dù n g đũ a th ủ y tin h c h cẩ n th ậ n c h ế p h ẩ m tr o n g m ộ t c ố c d u n g th à íc 5 0 m l. B ả o q u ả n d u n g v o d ịc h e n z y m e g ố c ở 2– 4 C tr o n g thờ i g ia n 1 n gà y . B o q u ả n d u n g d ịc h e n z y m e g ố c ở – 4 C tr o n g thờ i g ia n ả 2 1 ngày. T iến hà n h : T ríc h ly e n z y m e : e n z y m e đợ c tríc h ly từ c h ế p h ẩ m h a y tế à b .7 0 % tin h bộ t tr o n g d u n g d ịc h ở đ iề u k iệ n x á c đ ịn h . lắ c đ ề u . L ọ cà vth u hồ i d ịc h tríc h ly e n z y m e .m l n ướ c c ấ t tro n g b h đ ịn h m ứ c 1 0 0 m l. N hvậ y . S a u đ ó c h u y n toà n bộ c h ế p h ẩ m v o b ìn h ta m g iá c d u n g tíc h 2 5 0 ể à m l.5 m l 0 . S a u đ ó c h u y ể n ton bộ h ỗ n h ợ p và o b ìn h đ ịn h à m ứ c d u n g tíc h 1 0 0 m l.9 . Gữi h ỗ n h ợ p ở n h iệ t đ ộ 3 0C tr o n g thờ i g ia n 1 g iờ c ó k h uấ y đ ả o đ ịn h k ỳ . D u n g d ịc h b đ ư ợ c c h u ẩ n b ị tr o n g n g y sử d ụ n g . à D u n g dịc h e n z y m e g ố c 3. G iữ h ỗ n h ợ p ở ư o n h iệ t đ ộ 3 0 C tr o n g thờ i g ia n 1 g iờ c ó k h u ấ y đ ả o đ ịn h k ỳ . m ô độ n g ư o thự c v ậ t b ằ n g d u n g d ịc h đ ệ m c ó p H th h hợ p . ổb s u n g 9 0 m l n ớ c c ấ t và 1 0 m l d u n g dc h đ ệ m ư ị o p h o s p h a te p H = 4 .1 g c h ế p h ẩ m n g h i cứ u .5 m l 0 . cí T ríc h ly e n z y m e ừ v i k h u ẩ n : C â n m = 0 . bổ s u n g 9 0 m l n ớ c c ấ t và dịc h đ ệ m a c e ta te p H = 4 . m ẫ u đ ố i c h ứ n g àvm ẫ u trắ ng M ẫ u th í n g h iệ m M ẫ u đ ố i c h ứ n g M ẫ u trắ n g D u n g dịc h tin h b ộ t 1 % 2 ml 2 ml 0 N ướ c c ấ t 0 0 2 ml Đệm 1 ml 1 ml 1m l D u n g dịc h N a C l 3 % 0 . S a u đ ó là m n g ộ i u v à bổ s u n g 1 0 m l đ ệ m a c e ta te p H = 4 . Đ ặ t àv bế p c á c h th ủ y ìn o đ a n g s ô i. đ ộ ư p h a lo ã n g p hụ th u ộ c và o h oạ t tín h c h ế p h ẩ m e n z y m e c ầ n p h â n tíc h . T ríc h ly e n z y m e ừ m a lt : C â n m = 5 0 g m a lt đã n g h iề n n h ỏ . c h o và o b ìn h t -1 n ó n d u n g tíc h 2 5 0 m l. L ọ c à th u hồ i d ịc h tríc h ly e n z y m e .

Đ o mậ t đ ộ q u a n g c ủ a c á c d u n g d ịc h bư ớ c s ó n g = 6 2 0 n m s o vớ i m ẫ u trắ n g . 3 0 p h ú t để x ả y ra p h ả n ứ n g H Cl 1N 1 ml 1 ml E nzym e 0 1m l N ướ c c ấ t 4 ml 4 ml Io de 0 .5 m 1 D u n g dịc h đ ố i c h ứ n g c ó m u x a n h à D u n g dịc h th í n g h iệ m c ó m u tím vớ i cư ờ n g đ ộ k h á c n h a u ù y v à o lượ n g tin h b ộ t à t c h ư a bị th ủ y p h â n .5 m 1 0 1 ml 1 ml 4 ml 0 .Ủ 4 0o C . T ín h kết q u ả : D = mậ t đ ộ q u a n g S ố m g tin h b ộ t b ị th ủ y p h â n S = H oạ t tín h e n z y m e a m y la s e : Hoạt tính chung = S n 10  m ( Do D ) x 20 Do trong đó: n = hệ số pha loãng m = khối lượng enzyme 28 . 1 0 p h ú t để đ ạ t n h iệ t đ ộ D u n g dịc h e n z y m e 1 ml 0 o Ủ 4 0 C .5 m l 0 . ở 4.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful