TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.

HCM

KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC

----------

----------

BÀI GIẢNG

THỰC HÀNH HOÁ SINH

Biên soạn: TS. Nguyễn Hoài Hương CN. Bùi Văn Thế Vinh

Tp. Hồ Chí Minh, 04/2009

Lời mở đầu
Bài giảng “Thực hành sinh hoá” dành cho sinh viên năm thứ hai khoa Môi trường & Công nghệ Sinh học, trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM. Với thời lượng 30 tiết và tuỳ thuộc điều kiện, cơ sở vật chất của phòng thí nghiệm cho phép, sinh viên tiến hành làm 5 bài thực hành gồm các nội dung chính của học phần lý thuyết sinh hóa cơ sở. 1. Giới thiệu phòng thí nghiệm sinh hóa, cách pha chế các dung dịch chuẩn độ và các dung dịch đệm; 2. Định lượng đường khử bằng phương pháp acid dinitro-salicylic (DNS); 3. Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl; 4. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford; 5. Xác định hoạt tính enzyme amylase.

2

Điểm môn học sẽ gồm điểm thực hành thao tác.BÀI 1: CÁCH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH CHUẨN ĐỘ VÀ CÁC DUNG DỊCH ĐỆM 1.. tiết kiệm hoá chất. .Khi làm thí nghiệm phải trật tự..Sau khi thí nghiệm. Máy đo so màu quang phổ 3. sinh viên phải rửa dụng cụ. Nếu nghỉ học có lí do chính đáng thì sinh viên phải xin phép giáo viên sắp xếp cho làm thí nghiệm bù. . Cân điện tử 2. hóa chất đúng chỗ.Sinh viên phải có mặt đủ và đúng giờ trong các buổi thí nghiệm. . sơ đồ tiến hành thí nghiệm. bảng kết quả thô.. Viết báo cáo ngắn gọn. Bộ chưng cất Kjendahl (hoặc máy cất nitơ tự động) 4. phương trình phản ứng. Đạt yêu cầu. Yêu cầu đối với sinh viên làm thí nghiệm: . phương pháp. sắp xếp lại dụng cụ. viết tay gồm nguyên tắc. lớp cử một tổ trực nhật có nhiệm vụ nhắc nhở các bạn giữ vệ sinh chung và làm sạch PTN sau giờ thí nghiệm. rất thận trọng khi sử dụng dung môi dễ cháy nổ và hóa chất độc hại. nắm vững nội dung bài thí nghiệm và chuẩn bị sẵn bản báo cáo kết quả trước khi đến phòng thí nghiệm (PTN).Trong PTN phải mặc áo blouse. . sinh viên mới được làm thí nghiệm. Hướng dẫn sử dụng một số thiết bị trong phòng thí nghiệm 1. 3 . Trước buổi thí nghiệm giáo viên hướng dẫn sẽ kiểm tra việc chuẩn bị của sinh viên. Làm vỡ hoặc gây hư hỏng dụng cụ. giữ sạch nơi làm thí nghiệm. micropipet. Máy ly tâm 6. thiết bị thì phải bồi thường. Máy khuấy từ 5. burette. tuân thủ nội quy và điểm các bài báo cáo.Sinh viên phải đọc kỹ. lau sạch bàn thí nghiệm và bàn giao cho cán bộ phòng thí nghiệm. cẩn thận. Máy đo pH 7. Mỗi buổi thí nghiệm. sự hiểu bài.Mỗi bài thí nghiệm sẽ có điểm. 2. Thiếu một bài thí nghiệm coi như chưa hoàn tất chương trình. . bình Kjendahl. pipet.Cuối mỗi buổi thí nghiệm sinh viên phải nộp bản báo cáo kết quả thí nghiệm cho giáo viên hướng dẫn. công thức tính và kết quả tính cùng các ý kiến giải thích hay nhận xét. . . Các dụng cụ thủy tinh khác: bình định mức.

Tránh tạo tinh thể cứng khi hoà tan. 4. tạo hỗn hợp nỏ với nhiều kimloại nặng: Ag. 2. Kim loại Na. Amoniac: là một chất lỏng và khí rất ăn da. Ca: phản ứng cực mạnh với nước. luôn phải cho axit vào nước trừ phi được dùng trực tiếp Giữ để axit không bắn vào da hoặc mắt bằng cách đeo khẩu trang. trong phòng thí nghiệm được gọi là hóa chất thí nghiệm. và muối của chúng. làm tiêu bản. Amoni hydroxyt: chất lỏng ăn da. Natri và kali hydroxyt: rất ăn da. Zn . Pb... găng tay và kính bảo vệ mắt. phản ứng cực mạnh với nước. halogen. CO2. Li. dẫn xuất clo của hydrocacbon. mắt gây hại nghiêm trọng cho hệ hô hấp Mang găng tay cao su. Hơi amoniac dễ cháy. Nếu làm văng lên da.. mang mặt nạ chống độc để phòng ngừa bụi và hơi kiềm. Hoá chất thí nghiệm: Các hoá chất dùng để phân tích. 4 . Tương tự khi hoà tan với nước. lập tức rửa ngay bằng một lượng nước lớn Luôn phải đọc kỹ nhãn của chai đựng và tính chất của chúng H2SO4: Luôn cho acid vào nước khi pha loãng. Các biện pháp an toàn như trên. kính bảo hộ. phản ứng mạnh với chất oxy hoá. An toàn khi làm việc với axit và kiềm 1. K. axit mạnh. thiết bị bảo vệ hệ thống hô hấp. mang găng tay cao su. Oxit canxi rất ăn da. An toàn khi làm việc với axit: Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nóng axit hoặc thực hiện phản ứng với các hơi axit tự do Khi pha loãng. Cần mang dụng cụ bảo vệ da mắt. An toàn khi làm việc với kiềm Kiềm có thể làm cháy da.. cần bảo vệ da mắt. đồng thời phải làm lạnh nhanh. . Chuẩn bị thí nghiệm 1. phản ứng cực mạnh với nước. tiến hành phản ứng. Tạo hơi ăn mòn khi cháy.3. cho từng viên hoặc ít bột vào nước chứ không được làm ngược lại. halogen. ẩm. Chỉ sử dụng cồn khô khi tạo dung dịch natri alcoholate. khẩu trang. axit mạnh. khẩu trang khi làm việc với dung dịch kiềm đậm đặc Thao tác trong tủ hút. sử dụng khẩu trang và găng tay để tránh phòng khi văng acid Các acid dạng hơi (HCl) thao tác trong tủ hút và mang găng tay. đường hô hấp do dễ nhiểm bụi oxit. cho vào từ từ.

. (CH3COO)2. khối lượng phân tử.) hoặc khí (Cl2. .Sạch hóa học (PC): độ sạch > 99% Hóa chất có độ tinh khiết khác nhau được sử dụng phù hợp theo những yêu cầu khác nhau và chỉ nên sử dụng hóa chất còn nhãn hiệu 2. acid. Cách sử dụng và bảo quản hoá chất: Khi làm việc với hóa chất. NaOH. NH3..... nhân viên phòng thí nghiệm cũng như sinh viên cần hết sức cẩn thận. MgO. 3. tạp chất. 5 . c để khi cần dễ tìm.Hóa chất phải được sắp xếp trong kho hay tủ theo từng loại (hữu ơ. khối lượng tịnh. b.) hay theo một thứ tự a. N2. bazơ. lỏng (H2SO4. vô cơ. muối. Những điều cần nhớ khi sử dụng và bảo quản hóa chất được tóm tắt như sau: . .. KCl.) và mức độ tinh khiết khác nhau: . chloroform. Nhãn hiệu hoá chất: Hóa chất được bảo quản trong chai lọ thủy tinh hoặc nhựa đóng kín có nhãn ghi tên hoá chất..Sạch kỹ thuật (P): độ sạch > 90% . điều kiện bảo quản.. công thức hóa học.Sạch phân tích (PA): độ sạch < 99% . kim loại. nơi sản xuất. aceton. ethanon.. tránh gây những tai nạn đáng tiếc cho mình và cho mọi người. mức độ sạch.Hoá chất có thể ở dạng rắn (Na. C2H2 .

không dùng lẫn nắp đậy và dụng cụ lấy hóa chất. Trường hợp bị hóa chất vào miệng hay dạ dày. Khi cần sử dụng các hóa chất dễ bốc hơi. . muối trong phòng thí nghiệm là dung dịch nước. dễ cháy không được để gần nơi dễ bắt lửa. nếu là acid phải súc miệng và uống nước lạnh có MgO. phải đọc kỹ nhãn hiệu hóa chất trước khi dùng.. Nếu bị bắn vào mắt.Tất cả các chai lọ đều phải có nhãn ghi.. . dùng dung môi là nước. không ngửi hay nếm thử hóa chất. dội mạnh với nước lạnh hoặc NaCl 1%. . cổ chai.Các loại hóa chất dễ bị thay đổi ngoài ánh sáng cần phải được giữ trong chai lọ màu vàng hoặc nâu và bảo quản vào chổ tối. .. Nếu chất hòa tan ở dạng rắn thì gọi là chất tan. Dung dịch Dung dịch là hỗn hợp của hai hay nhiều chất tác động tương hỗ với nhau về mặt vật lý và hóa học. phải đưa vào tủ hút. . Trong dung dịch gồm có chất hòa tan và dung môi. . Lưu ý các kí hiệu cảnh báo nguy hiểm. có mùi. phân tích và tính toán khác nhau. 5. Có nhiều cách biểu thị nồng độ khác nhau.Chai lọ hóa chất phải có nắp.Dụng cụ dùng để lấy hóa chất phải thật sạch và dùng xong phải rửa ngay.Không hút bằng pipette khi chỉ còn ít hóa chất trong lọ.Khi làm việc với chất dễ nổ.Khi làm việc với acid hay base mạnh: Bao giờ cũng đổ acid hay base vào nước khi pha loãng (không được đổ nước vào acid hay base). (%) 6 . tránh bụi bẩn lọt vào làm hỏng hóa chất đựng trong chai. Hàm lượng chất hòa tan trong dung dịch thể hiện ở nồng độ dung dịch. dùng xong phải trả đúng vị trí ban đầu. chú ý đậy kín nắp sau khi lấy hóa chất xong. Các đơn vị nồng độ dung dịch * Nồng độ phần trăm. Trường hợp bị bỏng với acid hay base rửa ngay với nước lạnh rồi bôi lên vết bỏng NaHCO3 1% (trường hợp bỏng acid) hoặc CH3COOH 1% (nếu bỏng base). Trước khi mở chai hóa chất phải lau sạch nắp. Một số chất khác tan trong dung môi hữu cơ. 1. Tùy theo tính chất của dung môi mà phân thành dung dịch nước và dung dịch khan. Phần lớn các dung dịch acid. Mỗi cách sẽ tiện dụng trong chuẩn bị.. nếu là chất lỏng thì gọi là dung chất. base. Không hút acid hay base bằng miệng mà phải dùng các dụng cụ riêng như ống bóp cao su. nếu là base phải súc miệng và uống nước lạnh có CH3COOH 1%.

Chất tan là chất rắn khan: Ví dụ: 1) Pha 500g dung dịch NaOH 40% (w/w) 100g dung dịch cần 40g NaOH 500g dung dịch cần Xg? Lượng NaOH cần để pha dung dịch : X= (40*500)/100= 200g Lượng nước cần thiết: 500-200=300g (hay 300ml) Vậy.5H2O.Nồng độ mg/mL: số mg chất tan trong 1mL dung dịch . mg%: mg chất hòa tan trong 100g dung dịch.5N là trong 1000ml dung dịch chứa 0.. . 12H2O.Nồng độ % khối lượng thể tích (w/v): là số g chất tan có trong 100ml dung dịch. ppb: số µg chất hòa tan có trong 1kg hay 1 lít dung dịch. (N): là số đương lượng gam (đlg) chất tan có trong 1 lit dung dịch.Nồng độ phần trăm thể tích . Ví dụ: dung dịch CuSO4 10% (w/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10g CuSO4 .Miligam phần trăm.Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO4. % (v/v): là số ml dung chất có trong 100ml dung dịch..Phần nghìn. 2. (Mol/L) hay M: là số phân tử gam (hay số mol) chất tan trong 1 lít dung dịch. 0/00: số g chất hòa tan trong 1000g dung dịch.Nồng độ phần trăm khối lượng .. µg%: là số µg chất hòa tan trong 100g dung dịch. .khối lượng. Ví dụ: dung dịch gycerine 10% (v/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10ml glycerin * Nồng độ gam-lit.) Khi pha dung dịch cần phải tính thêm lượng nước kết tinh có sẵn. Ví dụ: dung dịch NH4Cl 5% (w/w) là trong 100g dung dịch có chứa 5g NH4Cl . cân 200g NaOH và đong 300 ml nước cất. Ví dụ: dung dịch KOH 0. hòa tan ta được 500g dung dịch NaOH 40% . % (w/w): là số gam chất tan có trong 100g dung dịch.thể tích. Na2HPO4. (g/L): là số gam chất tan có trong 1 lít dung dịch. .. * Nồng độ phân tử gam hay nồng độ mol. Cách pha dung dịch có nồng độ xác định * Pha dung dịch có nồng độ phần trăm theo khối lượng. ppm: số mg chất hòa tan trong 1kg hay 1 lít dung dịch.5đlg KOH * Nồng độ dung dịch bảo hòa: là khối lượng tối đa chất hòa tan trong dung dịch. .Microgam phần trăm. Ngoài ra trong các phép phân tích vi lượng còn có một số đơn vị nồng độ khác như: . % (w/w) . 7 .Phần tỷ. Ví dụ: Dung dịch KH2PO4 M/15 là trong 1000ml dung dịch chứa M/15 phân tử gam KH2PO4 * Nồng độ đương lượng gam.Phần triệu.

. . thêm chất tan và tiếp tục khuấy.Pha dung dịch loãng từ một dung dịch đậm đặc hơn: Ví dụ: 3) Pha 500g dung dịch NaOH 5% từ dung dịch NaOH 10% Lượng NaOH cần để pha dung dịch 5% là: X = (5*500)/100 = 25g Lượng dung dịch NaOH 10% cần dùng là: Y = (100*25)/10 = 250g Lượng nước cất thêm vào: 500-250 = 250g Vậy.Chất tan là chất rắn khan Cân lượng chất tan cần thiết.. . Tra cứu những số liệu này trong "Sổ tay các hiện tượng hóa lý". cân 50g NaCl.. .5H2O) = 250 Lượng CuSO4 khan để pha dung dịch là: X = (10*320)/100 = 32g Lượng CuSO4. * Pha dung dịch có nồng độ % theo thể tích . H2SO4 . đong 270ml nước cất. hòa tan và định mức thành 1 lít bằng nước cất. chuyển sang bình định mức. 8 . Ví dụ: 3) Pha 1 lít dung dịch NaCL 5% (w/v) Lượng NaCl cần để pha dung dịch: X = (5*1000)/100 = 50g Vậy. Nếu cho thêm chất tan vào dung dịch bão hòa thì lượng chất tan đó không tan được nữa và sẽ lắng xuống. Na2HPO4.Cách pha nhanh dung dịch bão hòa khi không tra được số liệu từ bảng: Lấy chất tan cần pha vào becher. cứ như thế cho đến khi chất tan không còn tan được nữa. dùng nước cất hòa tan và định mức đến thể tích đúng.5H2O M(CuSO4) = 160 và M(CuSO4. 12H2O. Muốn pha dung dịch bão hòa cần phải biết độ tan tối đa của chất tan (nồng độ bão hòa).Pha dung dịch bão hoà: Dung dịch bão hòa là dung dịch có lượng chất tan tối đa.Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO4.Chất tan dạng lỏng: Một số chất tan ở dạng lỏng như HCl.5H2O.Ví dụ: 2) Pha 320g dung dịch CuSO4 10% (w/w) từ CuSO4..5H2O cần dùng: Y = (250*32)/160 = 50g Lượng nước cất thêm vào: 320 -50 = 270g (hay ml) Vậy. Nếu chất tan tan hết. đong 250ml nước cất và 250g dd NaOH 10%. ta được 1lít dung dịch NaCl 5%. Ở mỗi nhiệt độ khác nhau. . mỗi loại dung môi khác nhau thì nồng độ bão hòa của mỗi loại chất tan sẽ khác nhau. hòa tan ta được 320g dung dịch CuSO4 10%.5H2O.. cân 50g CuSO4.) Khi pha dung dịch ta cần phải tính đến lượng nước kết tinh có sẵn giống như ở phần a. chất tan không tan hết lắng xuống thì phần dung dịch phía trên là dung dịch bão hòa. thêm một ít nước cất và khuấy cho tan. hòa tan ta được 500g NaOH 5% . Nếu sau khi khuấy.

có thể đưa về đơn vị thể tích theo công thức V = M/d V: Thể tích chất lỏng. Chuyển dung dịch sang bình chứa. cân 56g KOH. hoặc quá trình hòa tan có toả nhiệt thì phải chờ nhiệt độ trở lại bình thường (nhiệt độ không khí) rồi mới thêm nước tới vạch định mức. cho vào bình định mức 1000.9g = 11. M: khối lượng chất lỏng cần cân. lắc để hòa tan hoàn toàn và đưa nước cất tới mức. dùng ống đong lấy 10ml dung dịch HCl37%.thể tích (w/v). lắc để trộn đều đồng nhất. qua phễu cho vào bình định mức có dung tích 1 lít. Ví dụ như H2SO4 .9/1.19g/ml) Lượng HCl cần để pha dung dịch 1% là: X= (1*440)/100 = 4. HCl .4)/37 = 11. Cân chính xác lượng chất tan. Do đó khi pha các dung dịch từ các loại hóa chất nàyta phải chú ý đến nồng độ của dung dịch đậm đặc. và 430ml nước cất ta được 440 ml HCl 1% Do việc sử dụng các loại bình định mức làm cho việc pha chế dung dịch thí nghiệm trở nên đơn giản và chính xác vì vậy ngày nay đa số các dung dịch thí nghiệm được pha chế theo nồng độ khối lượng . hòa tan trong 1 ít nước. H3PO4 65%. Khi phải đun nóng dung dịch để hòa tan. Ví dụ: 5) Pha 440ml dung dịch HCl 1% từ dung dịch HCl 37% (d=1.37%. * Pha dung dịch nồng độ phân tử gam Mol (M) hay phân tử gam (ptg) là khối lượng của các chất tính ra gam bằng khối lượng phân tử của nó. Đây là phản ứng tỏa nhiệt. Cho vào từng lượng nước cất nhỏ.25%.19 = 10 ml Lượng nước cất thêm vào:440-10 = 430ml Vậy. 3M hay 0. NH4OH . Dung dịch nồng độ 1M là dung dịch chứa 1ptg chất hòa tan trong 1 lít. 0. Nếu muốn pha dung dịch 2M. Giới hạn hòa tan tối đa được tính bằng % thể tích và thay đổi tùy theo loại hóa chất. 9 .4g Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là : Y = (100*4.05M ta cũng tiến hành tương tự với lượng cân tương ứng. Ví dụ: 6) Pha 1 lít dung dịch KOH 1M Phân tử lượng của KOH: MKOH = 39 +16 +1 =56 Lượng KOH để pha 1 lít dung dịch 1M là: 56g Vậy.1M.Việc cân không thuận lợi.96%. d: tỷ trọng chất lòng Chú ý: Các hóa chất lỏng bán trên thị trường thường không ở dạng nguyên chất mà là các dung dịch đậm đặc. cần làm nguội dung dịch trước khi định mức thành 1 lít. ta tính khối lượng phân tử chất đó ( hoặc tra bảng) theo đơn vị gam. Muốn pha dung dịch nồng độ 1M của một chất nào đó.

+ 2 (Na+OH-) → 2 Na+SO42. hòa tan trong 1 ít nước. Tiến hành pha trong tủ Hotte vì hơi acid bay lên rất độc hại.5 *3*500)/1000 = 111. Ví dụ: 9) Phản ứng giữa HCl và NaOH H+Cl.Đlg của một axit là khối lượng chất đó để tạo ra trong phản ứng 1 ion gam H+. Ví dụ: 11) 2 Na2S2O3 + I2 → Na2S4O6 + 2 NaI 10 .5 Lượng HCl 37% để pha dung dịch 1M là: X = (36.+ 2H2O 1ptg H2SO4 cho ra 2 ion gam H+ vậy 1N (H2SO4) = 2 M (H2SO4) 1ptg NaOH cho ra 1 ion gam OH. Trường hợp chất rắn có ngậm nước.65g Hay 98. vậy 1 N (HCl) = 1M (HCl) 1ptg NaOH cho ra 1 ion gam OH-.Ví dụ: 7) Pha 500ml dung dịch KCl 3M Phân tử lượng của KCl: MKCl = 39 +35.+ Na+OH.5 = 74. ta phải tính toán dựa vào nồng độ dung dịch đó. Định phân acid. đong 83ml HCl 37% cho vào bình định mức 1000 có sẵn 1 ít nước. cân 111.75g KCl. Định mứ c thành 1 lít.5 Lượng KCl để pha 500ml dung dịch 3M là: X= (74.19 = 83ml Vậy.+ H2O 1ptg HCl cho ra 1 ion gam H+. . Tính N theo công thức trên. Ví dụ: 8) Pha 1 lít dung dịch HCl 1M từ HCl 37% Phân tử lượng HCl: MHCl = 1+35.5 = 36.65/1.Đlg của một base là khối lượng chất đó để tạo ra trong phản ứng 1 ion gam OH-.→ Na+Cl. * Nồng độ đương lượng gam (N) Dung dịch nguyên chuẩn là dung dịch có nồng độ 1N Đương lượng gam(đlg) được định nghĩa theo mỗi trường hợp riêng biệt từ phương trình phản ứng dùng để định phân.base: . Nếu chất tan là dung dịch.5*100)/37 = 98.vậy 1N (NaOH) = 1M (NaOH) Số ion gam tạo ra từ 1 ptg được gọi là hệ số nguyên chuẩn độ (ký hiệu là n) N= M/n Phản ứng oxy hoá khử: Tùy theo số điện tích trao đổi ở từng phản ứng mà hệ số n khác nhau. cho vào bình định mức 500. vậy 1N (NaOH) = 1M (NaOH) Ví dụ: 10) Phản ứng giữa H2SO4 và NaOH 2H+SO42. định mức đến vạch. ptg chất đó phải tính luôn cả khối lượng các phân tử nước.75g Vậy.

các hóa chất không tinh khiết hay bị hút ẩm. không thể pha ngay được dung dịch chuẩn. có thể pha dung dịch chuẩn trực tiếp bằng cách cân chính xác chất cần pha. Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Khi pha hóa chất. vừa thêm nước cất vừa lắc và đưa nước cất tới vạch mức. HCl dễ bay hơi. 3. sau đó hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch dựa vào phản ứng với một dung dịch chuẩn thích hợp. vì vậy sau khi pha phải hiệu chỉnh lại nồng độ. dung môi bay hơi. Bên trong chứa một lượng cân chính xác chất tan hoặc dung dịch chất tan. Na2S2O3. bị oxy hóa. có thành phần không thay đổi như NaCl. * Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Đối với các chất dễ thay đổi thành phần khi ở dạng rắn.. .Đối với các hợp chất bền vững. hứng lên phểu vào bình định mức. ta phải dùng ống chuẩn. . ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng. Pha dung dịch chuẩn. vì vậy phải kiểm tra nồng độ thực của các dung dịch pha sẵn dựa vào các dung dịch có nồng độ chính xác được gọi là dung dịch chuẩn (fixanal) * Dung dịch chuẩn Dung dịch chuẩn là các dung dịch được chuẩn bị sẵn.. HCl. Ong chuẩn là một ống ampun thủy tinh hay nhựa đóng kín..Đối với các chất như NaOH. Khi chuyển hết lượng chất tan trong ống vào bình định mức và pha thành 1 lít ta được dung dịch chuẩn có nồng độ đã ghi trên nhãn ngoài ống. Na2S2O3 dễ bị mất nước tinh thể khi để ngoài không khí. có nhiều nguyên nhân làm cho nồng độ dung dịch không chính xác như việc cân đong không chính xác.-2e → S4O62Trong phản ứng này n =1 nên N = M/1 = M Việc pha dung dịch nồng độ đương lượng gam (N) cũng tương tự với cách pha dung dịch nồng độ phân tử gam (M). AgNO3.I2 + 2e → 2I2 S2O32. do các chất này thường không bền vững và dễ thay đổi thành phần. đảm bảo chính xác và được dùng để định chuẩn các dung dịch tự pha chế khi làm thí nghiệm. .Dùng đinh thủy tinh chọc thủng ampun. Ví dụ: 12) NaOH thường nhiễm một lượng Na2CO3 rất dễ chảy nước. pha loãng và định mức tới thể tích đúng. dùng bình tia rửa sạch chất tan có trong ampun vào bình định mức 1 lit. Thời gian tàng trữ lâu nên chất tan bị thăng hoa. Các chất dùng trong dung dịch chuẩn phải khá bền vững sao cho nồng độ của chúng không thay đổi nhanh chóng theo thời gian. acid oxalic. 11 . * Cách pha dung dịch chuẩn từ ống chuẩn . .. nếu muốn pha dung dịch có nồng độ chính xác.

75. Thí dụ. để có đệm pH ở giá trị 4. thêm ba giọt chỉ thị màu phenolphtalien.91 6.1M). Dung dịch KOH 0.base. thì phản ứng sẽ đạt điểm cân bằng khi thể tích hai chất bằng nhau C1V1 = C2V2 Nếu gọi Cp là nồng độ dung dịch định pha và Ct là nồng độ thực của dung dịch ta có hệ số hiệu chỉnh K: K= Cp/Ct = Vp/Vt Ví dụ: 13) Dung dịch chuẩn là H2SO4 0. Nếu thêm vào dung dịch 0.1)/11 = 0. chọn cặp acid .1N Lấy 10ml H2SO4 0. dung dịch định pha là NaOH 0.75. Có dung dịch chứa hỗn hợp 1 acid yếu (Ví dụ: acid acetic) với muối của nó (Ví dụ: muối natri acetate).05N tron cồn phải dung dung dịch chuẩn là H2SO4 0.1M)/CH3COONa (0. Dung dịch đệm: Dung dịch đệm là dung dịch tạo môi trường ổn định pH cho dung dịch. Các phản ứng thường thấy là phản ứng tạo kết tủa hay tạo phức hoặc oxy hóa khử. dung dịch đệm đóng vai trò quan trọng.+ H3O+ 12 .001 mol HCl thì pH của hệ vẫn chỉ ở mức 4. Trong cơ thể sống.base CH3COOH (0. dung dịch sẽ cân bằng dạng như sau: CH3COOH + H2O -----> CH3COO.091/0. 1 ion gam H+ sẽ phản ứng với 1 ion gam OH-.1N. Nghĩa là pH thay đổi rất ít. Việc pha dung dịch đệm tuân theo nguyên tắc chọn cặp acid – base có hằng số phân ly pK A/B gần với pH đệm muốn pha và phối trộn chúng với số mol bằng nhau.1 N từ NaOH rắn và dùng dung dịch chuẩn H2SO4 0.748 gần bằng 4. dùng burette định phân bằng NaOH được 11 ml NaOH Vậy nồng độ thực tế NaOH đã pha là : Ct = (10*0. mỗi lần sử dụng lại phải xác định lại hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Xét một phản ứng trung hòa acid . Tuy nhiên sử dụng các đệm nào còn tùy thuộc vào ứng dụng sao cho thành phần của đệm không phản ứng với các cấu tử trong hệ phản ứng khảo sát theo chiều hướng có hại.1N cho vào erlen.1N để chuẩn độ lại.1 = 10/11 = 0. Về nguyên tắc thì phối hợp các loại đệm có các khoảng đệm khác nhau thành 1 dung dịch là không có vấn đề gì. Vậy nếu dùng dung dịch acid và dung dịch base có cùng nồng độ N.05N Đối với các dung dịch dễ thay đổi trong quá trình bảo quản.091 N Hệ số điều chỉnh K: K= 0. thường gồm một acid yếu và một base yếu với tỉ lệ của chúng sẽ quyết định pH của dung dịch. ví dụ như ổn định pH của máu bằng các hệ đệm carbonate và phosphate.Ví dụ: Pha dung dịch NaOH 0.

00 0.78 7. base liên hợp kết hợp với nó cho acid yếu (cân bằng chuyển dịch theo chiều nghịch) pH của dung dịch giảm không đáng kể.51 8.84 8.36 7.Dung dịch acid boric (a): 12. .50 8.2) .00 pH 6.00 5.09 7.01 g C6H8O7.60 7.00 3.Dung dịch trinatri citrate 0.50 6. Kết quả pH của dung dịch tăng không đáng kể.50 2.50 6.1M (b): 29.H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml.80 9.trong dung dịch cân bằng có dạng sau: NH3 + H2O ----------> NH4+ + OHDung dịch đệm có pH thay đổi rất ít khi thêm một lượng acid hoặc base.108 g Na2B4O7.0 – 6.94 8.50 5.70 9. * Dung dịch đệm borat: . Trái lại.50 4. acid điện li cho H3O+ (cân bằng chuyển dịch theo chiều thuận).2 0. Khả năng đệm của hỗn hợp đệm phụ thuộc vào hàm lượng acid và base liên hợp có trong hỗn hợp.60 6.00 7. khi thêm một lượng base mạnh (OH-).00 b 3.10H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml Dung dịch đệm borat có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và dung dịch (b) theo bảng dưới đây: A 9.30 2.00 8.Dung dịch acid citric 0.24 *Dung dịch đệm citrate (pH = 3. Dung dịch đệm citrate có giá trị pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml dung dịch (b) theo bảng sau: A 46.69 8.50 5.0 13 a 23.0 b 27.88 7.50 pH 3.5 b 3.00 4.8 .75 8. Khi thêm một lượng acid mạnh (H3O+).00 b 0.00 7.00 5.00 4.6 1. .31 8.41 8.50 3.0 1.08 a 6.40 9.1M (a): 21.00 2.50 7.20 8.50 4. chứa hỗn hợp base yếu (Ví dụ: amoniac) với muối của nó (Ví dụ: muối amoni clorua).41 g C6H5O7Na3.0 pH 4.11 9.00 1.Dung dịch borat (b): 19.0 pH 8.50 7.77 7.Có dung dịch khác chẳng hạn.00 9.60 8.00 8.2H2O hòa tan và dẫn nước đến 1000 ml.00 10.25 1. ion hidroni H3O+ trung hòa OH.0 2.6 0.404 g H3BO3 hòa tan và định mức đến 1000 ml.cho base yếu H2O.98 9.70 7.

2 5.0 22.8 6.30 b 55.0 13.07 g KH2PO4 hòa tan và định mức đến 1000 ml.0 33.12H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml.50 7.0 81.0 24.05 g Na2HPO4.5 37.5 56.0 33.5 3.6 5.0 12.0 7.8 a 45.0 19. Dung dịch đệm phosphate có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml dung dịch (b) định mức đến 200 ml.0 10.6 5.1 6.5 51.0 16.2 7.5 91.0 15.Dung dịch mononatri orthophosphate 0.0 72.0 90.0 *Dung dịch đệm Na2HPO4 – KH2PO4 (pH = 5. a 93.5 22.2 4.5 8.2 5.0 6.0 87.6 3.0) .0 25.Dung dịch kali dihydrophosphate 1/15M (b): 9.5 42.2M (b): 53.6 20.5 62.7 g Na2HPO4.0 13.8 14 a 372 492 612 726 818 b 628 508 388 274 182 pH 6.8 5.5 6.0) .3 15.6 6.4 7.5 68.0 18.2 40.0 16.1 7.4 4.8 40.4 6.0 34.9 6.0 35.5 31.0 39.0 77.0 7.0 19.5 77.7 pH 6.5 73.0 94.9 7.4 .5 26.0 37.5 6.5 18.3 38.9 8.0 23.5 32.7 11.8 g NaH2PO4 hòa tan và định mức đến 1000 ml.2M (a): 27.7 7.5 93.5 7.7 – 8.7 6.5 53.8 9.0 36. Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml dung dịch (b).0 6.0 31.2 7.2 - 29.2 3.4 3.8 7.8 7.0 13.0 – 8. a 10 18 30 49 79 b 990 982 970 951 921 pH 5.0 81.0 84.Dung dịch dinatri hydrophosphate 1/15M (a): 23.00 10.7 85.0 pH 5.6 5.0 17.0 61.0 4.0 b 6.0 5.7H2O hoặc 71.5 7.6 6.0 28.50 8.0 5.12H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml.4 5.0 89.0 28.4 5.43.2 - *Dung dịch đệm phosphate (pH = 5.5 92.3 6.6 7.3 7.5 49.Dung dịch dinatri hydrophosphate 0.2 6. .9 g Na2HPO4.0 67.8 4.20 10. .0 87.8 - 5.00 5.

2 M (b): 8 g NaOH hòa tan và định mức đến 1000 ml.0 14.6) .6 8. Dung dịch đệm Glycine có pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X ml dung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml.8 10.8 9.8 pH 8.0 5.2M (a): 11.8 24.Dung dịch HCl 0.121 184 264 879 816 736 6.8 5.4 8.6 7.2 15 a 20.4 .0 6.2 39.6 – 10.0 38.0 16.8 2.Dung dịch NaOH 0.6 *Dung dịch đệm acetate (pH = 3.2 – 3.0 10.0 35. Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào X ml dung dịch (a) và Y ml dung dịch (b) và định mức đến 100 ml.2 6.2 pH 4.Dung dịch acid acetic 0.55 ml CH3COOH đặc và định mức đến 1000 ml.0 pH 2. X 5.4 3.8 4.0 6. a 46.0 13.6 2.2 *Dung dịch đệm Glycine – NaOH (pH = 8. .2M (b): 16.3 44.2 pH 3.Dung dịch natri acetate 0. .01g glycine hòa tan và định mức đến 1000 ml.Dung dịch glycine 0.8 12.0 X 16.6) .0 41.6 3.2 M (a): 15.2 3.2 11. .8 8.2 32.6 9. Dung dịch đệm Glycine có pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X ml dung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml.0 8.8 10.4 X 22.4 g CH3COONa hoặc 27.2 M (a): 15.2 5.6 – 5.6) .7 6.0 *Dung dịch đệm Glycine – HCl (pH = 2.2 M (b): 16. X 4.8 b 3.0 9.5 41.2 g CH3COONa.6 3.3H2O được hòa tan và định mức đến 1000 ml.01g glycine hòa tan và định mức đến 1000 ml.4 10.0 36.4 2.2 32.5 8.Dung dịch glycine 0.0 4.0 6.4 44.8 b 30.2 9.4 885 936 969 115 64 31 7.6 45.4 pH 3.4 72.8 ml HCl đặc (37%) pha thành 1000 ml.0 9.5 pH 9.

5 19. .45 ml H3PO4 đậm đặc và định mức bằng nước cất đến 1000 ml. (c) với thể tích bằng nhau nhận được dung dịch đệm 0. 16 .30.6 *Dung dịch đệm vạn năng 0.1M . Các dung dịch đệm vạn năng nồng độ khác được chuẩn bị tương tự.5 25.18 g acid ortho-boric trong nước cất và định mức đến 1000 ml.4 4.Dung dịch acid phosphoric 0.5 24. Điều chỉnh giá trị pH của dung dịch đệm trong khoảng pH = 1.Dung dịch natri hydroxide 1N (d): hòa tan 40 g NaOH trong nước cất và định mức đến 1000 ml.8. .8 đến pH = 12. .7 ml CH3COOH đặc và định mức bằng nước cất đến 1000 ml. (b).5 4.Dung dịch acid ortho-boric 0.2 5.1M (b): 6.1M (a): 5.8 45.0 bằng cách bổ sung dung dịch NaOH 1N (d).1M có pH = 1. Trộn lẫn các dung dịch (a).1M (c): hòa tan 6.6 4.Dung dịch acid acetic 0.

Đun cách thủy 70 – 80oC trong 35 – 40 phút. 2. khoai tây. lá hoặc quả khô. kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch chì acetate [Pb(C2H2O2)2. để yên hỗn hợp 10 phút. Do đó cần xác định riêng đường khử và riêng saccharose. . có thể chiết đường từ nguyên liệu bằng nước. Trước khi đun cách thủy hỗn hợp phải trung hòa acid bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa tới pH 6. cần chú ý là trong quá tình đun khi chiết.hóa chất: 1 Dụng cụ .BÀI 2.0. Dụng cụ . ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ACID DINITRO-SALICYLIC (DNS) 1. nhưng nguyên tắc chung như sau: . Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. Cân và cho vào cối sứ 1 g nguyên liệu hạt hay các mẫu thí nghiệm thực vật khô như cây. Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS). Tùy đối tượng nghiên cứu (hạt..Bình định mức 50ml 17 . Sau đó loại bỏ lượng chì acetate dư bằng dung dịch Na2SO4 bão hòa. đường saccharose có thể bị thủy phân một phần... Trong trường hợp này không cần kết tủa protein bằng chì acetate vì lượng protein chuyển vào dung dịch không nhiều.. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. dứa. Tiếp đó thêm nước cất tới vạch mức và đem lọc qua giấy lọc vào cốc hay bình khô. đã được nghiền nhỏ (và sấy khô đến khối lượng không đổi). Nghiền cẩn thận với bột thủy tinh hay cát sạch và 30 ml nước cất nóng 70 – 80oC.. quả tươi) thì cân 5 – 10 g. Nếu là nguyên liệu tươi (như hoa. khế. đun hỗn hợp cách thủy trong bình cách thủy có lắp ống làm lạnh không khí.. ...) mà cách chuẩn bị dung dịch nghiên cứu dùng để định lượng đường có khác nhau đôi chút... quả. sắn.. Nước lọc dùng làm dung dịch thí nghiệm. cần chiết đường bằng rượu 70 – 80oC.Trường hợp nguyên liệu thí nghiệm không chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin. chanh.. Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức dung tích 1000 ml.3H2O] hoặc chì nitrate [Pb(NO3)2] 10%.Trường hợp nguyên liệu chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin như khoai lang.4 – 7.Trường hợp các nguyên liệu chứa nhiều acid hữu cơ như cà chua. Tránh dùng quá dư chì acetate (dùng 2 – 5 ml chì acetate).

0.6 9.Dựng đường cong chuẩn và xác định hàm lượng đường Cho vào 5 ống nghiệm sạch với các chất có thể tích như bảng sau Hoá chất Glucose (10 mg/ml) Nước cất (ml) Nồng độ Ống 1 0.6. Sau khi cho bay hơi rượu.2.2 9. khuấy đều. mẫu có thể để lâu trong bình hút ẩm.6 0. Và tuỳ theo nồng độ đường nhiều hay ít mà pha loãng thêm 5-10 lần. 18 . Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang. Trong mỗi ống nghiệm sẽ chứa tương ứng 0. Tính kết quả Từ phương trình đồ thị đường cong chuẩn tính được % lượng đường trong mẫu vật.Thuốc thử DNS . So màu rồi vẽ đồ thị mẫu (vẽ trên máy tính) Làm tương tự với mẫu dung dịch đường được chuẩn bị ở trên và một mẫu thử không (nước cất) 4. 0.2 0.nguyên liệu . Cho tiếp 10ml cồn 800 vào cốc đựng bã. Để lắng cặn khi đem làm hiện màu.0 1.Chiết xuất đường trong thực vật 5g rau cải ngọt → nghiền nhỏ → cho vào becher 100ml + 10ml cồn 900 → đun cách thủy (sôi 3 lần) → khuấy đều bằng đũa thủy tinh → để nguội → lọc (chỉ gạn lấy phần trong).0 9. Tiến hành . trục hoành là nồng độ glucose. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Đun sôi đúng 5 phút.4.4 Ống 3 0. Pha loãng mẫu nếu cần sao cho mật độ quang nằm trong khoảng 0.04 mg glucose do glucose bị oxy hóa.8.8 9.8 Ống 5 1.0 Từ các ống nghiệm trên lấy 1ml ở mỗi ống vào 5 ống nghiệm khác và thêm vào mỗi ống 3ml thuốc thử DNS.Dung dịch glucose chuẩn 3.0 mg glucose.Mẫu rau quả chứa đường (rau cải ngọt. 1. Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm với đối chứng là nước.2 Ống 2 0.4 9. Hóa chất . 0. dứa) . Cặn khô trong cốc được pha loãng thành 50ml với nước cất.8. đun sôi 2 lần trên nồi đun cách thủy→ Để nguội → lọc (lặp lại 2 lần) Đưa phần bã lên lọc và rửa bằng rượu nóng (800) Rượu qua lọc được cho bay hơi ở trong phòng hoặc trên nồi cách thủy đun nhẹ.4 0.6 Ống 4 0. Đường thẳng thu được có thể cắt trục hoành ở 0.2.2 – 0.8 0. .

Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein .. Ca... K2O. các acid amin tự do. các peptid. Nguyên tắc Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nitơ tổng số. bình hứng chứa H2SO4 0. carbon và hidro của acid amine tạo thành CO2 và H2O. acid nitric. CaO. Dụng cụ .Bếp đun 19 . các base purine và pyrimidine.1N H2SO4 dư + NaOH → Na2SO4 + H2O 2. Dụng cụ + Bộ chưng cất Kjeldahl định lượng Nitơ gồm: . Nitơ có trong thành phần acid amine của protein là nitơ protein..1N 2NH4OH + H2SO4 → (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 dư .Ống sinh hàn .Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH (NH4)2SO4 + 2 NaOH = Na2SO4 +H2O + 2NH3↑ . các alkaloid..Ống dẫn khí ..Bi thủy tinh . Các phân tử chứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. chuyển thành dạng oxide: P2O5.. ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL 1.Bình cất đạm . .Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. urea và các dẫn xuất của urea.BÀI 3. Ví dụ các protein bị thủy phân thành acid amine. còn nitơ được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch 2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4 Các nguyên tố P..Bình Kjeldahl phá mẫu . K.Chuẩn độ H2SO4 dư bằng NaOH 0.hóa chất a.. là nitơ phi protein.NH3 bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH4OH rơi vào bình hứng. Nitơ không có trong thành phần protein như của các muối vô cơ. MgO. Mg. Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau: 2H2SO4 → 2H2O +2SO2↑+ O2 .Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác.Bình hứng (becher 250ml) .

theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun. Tiến hành . dùng nước cất vô đạm tráng lại bình Kjeldahl và định mức đến vạch.+ Pipet 20ml. lắc nhẹ. Hóa chất + nguyên liệu + Bột đậu nành (0. Trong khi đun. khi thấy dung dịch gần như trong suốt thì có thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở trên thành bình còn chưa bị oxi hoá vào trong dung dịch.Cất đạm 20 . Đặt bình Kjeldahl lên bếp đun. cho tiếp 5ml H2SO4 đậm đặc sẽ thấy xuất hiện màu nâu đen (do nguyên liệu đã bị oxi hóa). tránh trường hợp khi sôi mạnh hóa chất bắn ra ngoài. khi đã sôi giữ nhiệt độ bếp đun vừa phải để tránh hóa chất trào ra ngoài và không bị bay mất amoniac. đặt bình hơi nghiêng trên bếp.1N chuẩn + Thuốc thử Tasiro + chất xúc tác: hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 (3:1) 3.Vô cơ hóa mẫu Cân 100mg bột đậu nành đã sấy khô tuyệt đối cho vào bình Kjeldahl. đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh Lưu ý giai đoạn này phải thực hiện trong tủ Hotte.1g) + H2SO4 đậm đặc + NaOH 40% + H2SO4 0.1N chuẩn + NaOH 0. đậy kín để khoảng 3 phút. Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100 ml. Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn. pipet 10ml + Erlen 250ml + vaseline Bộ chưng cất Kjeldahl b. . Cho thêm vào 200mg chất xúc tác.

42mg Nitơ 21 . Tính kết quả: Hàm lượng % nitơ tổng số được tính theo công thức N (mg%) = {1.Chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có sẵn 50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro lúc này trong bình có màu tím hồng. Nếu giấy qùy không đổi sang màu xanh là được. đợi hệ thống nguội mới tháo hệ thống đem đi rửa.1N và 3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng). cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0. dùng giấy qùy thử ở đầu ống sinh hàn.42 hệ số . Tiến hành lắp hệ thống cất đạm.42 * (V1-V2)*100/a}*2 V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứng V2: số ml NaOH 0.1N đã chuẩn độ a số miligam nguyên liệu 1.1N cho đến khi mất màu tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ. Bật công tắc cất đạm Sau khi cất đạm 10-12 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không.Chuẩn độ: Chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0. cứ 1 ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với 1. Ghi nhận thể tích NaOH 0. . Đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống sinh hàn. 4. Tiếp tục cho vào bình cất 15ml NaOH 40% cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển sang màu xanh lá mạ (thêm 5ml NaOH 40% nếu dung dịch trong bình chưa chuyển hết sang màu xanh lá mạ). Ngưng cất đạm.1 N sử dụng.

lấy giá trị của điểm đó trên trục hoành. Độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein. Dung dịch protein chuẩn thường là bovine serum albumin. Dụng cụ . Thực hiện một đối chứng với nước cất (OD0).Máy đo quang phổ .Pipette 5ml. Lấy giá trị OD = ODx .hóa chất 1. độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với lượng trong mẫu. Công thức phân tử của Coomasie Brilliant Blue G-250 2. Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm. 1ml (có thể thay bằng pipetteman) .Đồng hồ bấm giây .Giá để ống nghiệm . Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein.Bình tia đựng cồn 22 . Đó chính là lượng protein mẫu trong dung dịch đo. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD 1.BÀI 4.Giấy thấm . đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ. Trong dung dịch mang tính acid. màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Lượng protein mẫu trong dung dịch đo được xác định bằng cách chấm trên đường chuẩn theo OD.Ống nghiệm (14) . khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm. khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại 465 nm. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế ta được ODx.OD0. Để xác định protein trong mẫu. Dụng cụ .

. Ở thời điểm 1 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 1.Dung dịch thuốc thử Bradford: dung dịch thuốc thử có thành phần trong 100ml như sau: Coomassie Brilliant Blue: 0.. Hóa chất . cứ tiếp tục cho đến hết.Lập một loạt 6 ống theo số thứ tự 0.Dùng đồng hồ bấm giây. 4. Tính kết quả: . tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 595 nm. ở thời điểm 21 phút đo ống 1 (OD1). lắc đều để yên. Tiến hành . được dung dịch có nồng độ 0..Tính thời gian ống 0 được 20 phút.9 0. lắc đều cho tan.6 0.7 0. Bổ sung phosphoric acid và chỉnh tới 100ml bằng nước cất.1 5 10 2 0. 5 và 1 ống nghiệm chứa mẫu cần phân tích X .1 mg/ml.1mg/ml) TT Bradford Nồng độ Albumin (µg/ml) 0 1 0 5 0 1 0.Cồn 900 . Ghi lại giá trị OD. Giữ ở -200C. canh thời gian 0 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 0..Dung dịch protein chuẩn: cân 10 mg albumin bằng cân phân tích.Dung dịch cần xác định hàm lượng protein (phòng thí nghiệm cung cấp) 3.5 0. Ta có giá trị OD0.Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595 ở trên ta tính được hàm lượng protein ở trong mẫu phân tích 23 .7g Phosphoric acid 85%: 8.005g Ethanol tuyệt đối: 4. . giữ ở 40C . tương tự cứ cách một phút đo cho hết các ống. 3. 1. 4.. Lắc đều. 2.2..Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595 . Ống nghiệm Nước cất (ml) Albumin chuẩn (0.5g Phẩm màu Coomasie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong một chai đựng màu tối có nắp. riêng ống nghiệm X cho 1 ml mẫu cần phân tích do phòng thí nghiệm cung cấp (nếu cần sinh viên tự pha loãng mẫu trước khi phân tích) .2 5 20 3 0.4 5 40 5 0.3 5 30 4 0. lắc đều để yên.5 5 50 X 5 ? . pha trong 1 ml nước cất. Khi dùng pha loãng ra 100 lần.Bổ sung các thành phần như bảng sau.9 0.

a) Đơn vị hoạt tính thông dụng nhất là đơn vị quốc tế (Enzyme Unit. Một đơn vị họat tính enzyme được định nghĩa theo nhiều phương pháp. Hội đồng Danh pháp của IUB khuyến cáo nên sử dụng Katal làm đơn vị cơ bản của hoạt tính enzyme: Một Katal là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được 1 mol cơ chất sau 1 giây ở điều kiện tiêu chuẩn. Để thực hiện được mục đích trên.Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm tương ứng với một nồng độ enzyme xác định. Nguyên tắc 1. . c) Đơn vị hoạt tính dựa vào sự thay đổi đặc tính hỗn hợp phản ứng. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME 1. Hoạt động hay hoạt tính của enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất được chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn. 1 U = 1 mol sản phẩm = 1 mol cơ chất (10-6 mol)/phút b) Năm 1979. 1 Kat = 1 mol cơ chất/ giây = 60 mol/ phút = 60 x 106 mol/ phút = 6 x 107 U 1 U = 1/60 x 10-6 Kat = 16. Mỗi enzyme có khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định. nhiều phương pháp phân tích khác nhau được sử dụng: phương pháp đo quang phổ. đo độ phân cực. Đ iề u q u a n tr ọ n g n h ấ à lcầ n đ ịn h t n g hĩa rõ rà n g đ ơ n vị h o ạ t tín h . áp suất. độ nhớt.trong một đơn vị thời gian. ví dụ sự thay đổi độ đục. c ó n h iề u đơ n vị h o ạ t tín h e n z y m e . Enzyme và đơn vị đo hoạt tính enzyme Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và có tính đặc hiệu cao.1.67 nKat (nanokatal) Đơn vị Katal được khuyến cáo vì nằm trong hệ đơn vị đo lường Quốc tế (SI).Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định. Về nguyên tắc có thể hai nhóm phương pháp chính sau: . độ nhớt . N h ư v ậ y .. phương pháp sắc ký và phương pháp hóa học. Vì vậy có thể đánh giá hoạt tính xúc tác của enzyme bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa cơ chất hoặc tốc độ tích lũy sản phẩm phản ứng. viết tắt U) do Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (International Union of Biochemistry – IUB định nghĩa: Một đơn vị chuẩn của enzyme (1 U) là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được 1 mol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn. Trường hợp cơ chất và sản phẩm là một hỗn hợp phức tạp thì áp dụng đơn vị hoạt tính này. 24 .BÀI 5. * Đơn vị hoạt tính enzyme : Mục đích xác định hoạt tính enzyme là xác định số đơn vị hoạt tính..

E n zy m e a m y la se v à p h ư ơ n g p h á p x á c ịn h h o ạ t tín h đ * K h a i q u á t về en zy m e a m ylase A m y la s e là c á c e n z y m e x ú c tá c c h o c á c p h ứ n g th ủ y p h â n tin h b ộ t. C á c th ô n g số n h iệ t đ ộ . s a u đ ó b ắ t đ ầ u g iả m (H h 1 ).6 0 g iâ y ). v ì g ia iđ oạ n nà y tố c đ ộ p hả n ứ n g lớ n 0 n hấ t. * Điều kiện phản ứng để xác định hoạt tính K h i tiế n hà n h thự c n g h iệ m c ầ n trá n h n h ữ n g ế u tố c ó th ể b iế n tín h p r o te in y enzym e.Hoạt tính riêng (specific activity) của enzyme Hoạt tính riêng của một chế phẩm enzyme đặc trưng cho độ tinh sạch của chế phẩm enzyme. S a u k h i ể d ừ n g p h ả n ứ n g ư ợ n g cơ c hấ t đư ợ c c h u y ể n h ó a 2 0 0 % . T h ử h o ạ t tín h e n z y m e p h ả ư ợđc tiế n hà n h i tro n g đ iề u k iệ n th íc h h ợ p nư đ iề u k iệ n s in h lý . l -3 T hờ i g ia n x á c đ ịn h h o ạ t tín h thờ n g 5-3 0 p h ú t. ớ N ồ n g đ ộ cơ c hấ t tro n g p h ả n ứ n g e n z y m e p h ả i ở tr o n g g iớ i h ạ n th íc h h ợ p . T r o n g m ẫ u đ ố i c h ứ n g e n z y m e p h ả i b ị b ấ t h o ạ ư ớ c k h i tiế p x ú c t tr v ớ i cơ c hấ t. Hình 1. àv ản 25 . Động học phản ứng enzyme T r o n g b à i thự c hà n h n à y . đ iề u k iệ n tồ n trữ th ự c h p hẩ m h oặ c đ iề u k iệ n mà h oạ t lự c c ó th ể đ ạ t tố iư u .2 . n hư n g k h ô n g q u á c a o đ kìm h ã m e n z y m e . n ồ n g đ ộ io n àv th à n h p hầ n d u n g d ịc h đ ệ m ả n h h ư ở n g lê n h oạ t tín h e n z y m e . ìn K h i x á c địn h h o ạ t tín h p h ả i àlm mẫ u đ ố i c h ứ n g s o n g s o n g v ớ i m ẫ u th í n g h iệ m . s in h v iê n là m q u e n ớ i p hư ơ n g p h á p x á c đ h h o ạ t tín h v ịn e n z y m e a m y la s e 1 . trong đó hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Lowry hoặc Bradford). g ly c o g e n . Tố t n h ấ t là x á c địn h tố c đ ộ ư b a n đầ u c ủ a p h ả n ứ n g (3 . Hoạt tính riêng được biểu thị bằng số đơn vị enzyme/mg protein protein (U/mg protein) hoặc Kat/kg protein. đ ủ th ừ a đ ể bã o e n z y m e . V ớ i n h ữ n g e n z y m e c ầ n c ó c h ấ t h o ạ t h ó a h o ặ c c h ấ t ổ n đ ịn hì thhả i c h o c á c p c hấ t nà y v à o e n z y m e tr ư c k h i c h o cơ c hấ t và o hỗ n h ợ p p h ả n ứ n g . p H .

9 (x á c đ ịn h h o ạ t tín h e n z y m e cm a lt): ủ trộ n 1 0 m l d u n g d ịc h N2a P O 4 1 /1 5 M vớ i 9 9 0 m l d u n g d ịc h K HP O 4 1 /1 5 M H 2 n hậ n đư ợ c 1 l d u n g d ịc h đ ệ m p h o s p h a te p H = 4 .3) xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1.4-glucanase. D u n g dịc h tin h b ộ t 1 % :h ò a ta n 1 g tin h b t (th e o c h ấ t k h ô tu y ệ t đ ố i) v ớ i 5 0 ộ 26 . D u n g dịc h đ ệ m g ly c in e – N a O H 0 . EC 3.5. Dư ớ i tá c d ụ n g c ủ a e n z y m e à y . A m y la s e c h ia à m 3 loạ i c h ín h : l -a m y la s e (Endo -1. tụ y tạ n g .1 . K iể m tra p H . E n z y m e yn p h â n g iả i liê n kế t à 1 .2 .9 4 . Enzyme này mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC.1. Đ oc ườ n g i đ ộ m à u tạ o thà n h g iữ a tin h b ộ t v c á c sả n p h ẩ m th ủ y p h â n c ủ a n ó v ớ i io d bằ n g à e m á y s o m à u sẽ tín h đư ợ c h o ạ t tín h e n z y m e . b ổ s u n g ưnớ c c ấ t đ ế n v ạ c h m ứ c . d e x trin p h â n ửt th ấ p . EC 3.c á c p o ly s a c c h a r id e tư ơ n g ựt .và 1. -a m y la s e bề n v ớ i n h iệ t. s a uđ ó c h u yể n d u n g d ịc h s a n g bn h ò ì đ ịn h m ứ c 1 0 0 0 m l.5-5.1.2) có nhiều ở thực vật (hạt.6-glycoside từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.4-glucanase. h ạ t hò a ư thả o n ả y m ầ m .4. H ó a chấ t – D ụ n g cụ : D u n g dịc h đ ệ m D u n g dịc h đ ệ m a c e ta te p H = 4 .2. ư -a m y la s e (Exo -1. i D u n g dịc h đ ệ m p h o s p h a te p H = 4 .4-g ly c o sid e ở g iữ a c h u ỗ i p o ly s a c c h a r id e (h o ạ t tín h e n d o a m y la s e ) tạ o th à n h m a lto s e . ní 2. xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1.7 (x á c đ ịn h h o ạ t tín h e n z y m e n ấ m m ố c ): tr ộ n 1 thể tíc h C H3 C O O H 1 N vớ i 1 th ể tíc h C H3 C O O N a 1 N . D u n g dịc h H C l 0 . d u n g n d ịc h tin h b ộ t n h a n h c h ó n g b ị m ấ t k h ả n ă n g tạ o à m vớ i d u n g d ịc h io d v à u e b ị g iả m đ ộ n h ớ t.1 M p H = 1 0 (d n g để x á c đ ịn h h o ạ t tín h ù -a m y la s e k iề m . Glucoamylase (Exo -1.4-g lu c a n a s e. B ả o q u ả n d u n g d ịc h tro n g b ìn h m à u n â uđ ể c h ỗ tố i. v i k h u ẩ n .1 ) c ó tr o n g n ớ c b ọ t. * C á c p h ư ơ n g p h á p đ o h o tín h en zym e -am ylase ạt N g u y ê n tắ c c h u n g d ự a tr n c ơ sở th ủ y p h â n tin h b ộ t b ở i e n z y m e tro n g d u n g ê d ịc h e n z y m e n g h ê n cứ u thà n h c á c d e x tr in c ó p h â n ửt lư ợ n g k h á c n h a u . Sản phẩm chủ yếu là glucose và dextrin. Enzyme này mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC. Đ ơ n vị a m y la s e l lượ n g e n z y m e c ầ n th iế t đ ể th ủ y p h â n h o to à n 1 0 m g à àn tin h bộ t s a u th ờ i g ia n p h ả n ứ n g 3 0 p h ú t tr o n g đ iề u k iệ n th g h iệ m . n h n g k é m b ề n v ớ i a c id .1 N D u n g dịc h io d : h ò a ta n 3 0 m g K I v à 3 m g I 2 ớv m ộ t lư ợ n g n h ỏ nư ớ c c ấ t. E C 3 .2. củ).4-glycoside từ đầu không khử tạo thành maltose và dextrin phân tử lớn. nhưng bền với acid hơn -a m y la s e . K ể m tra p H . i L ắ c n h ẹ h ỗ n h ợ p đ ể h a ta n h o à n to à n . Nhiều glucoamylase hoạt động mạnh ở pH 3. n ấ m m ố c .

T ríc h ly e n z y m e n m m ố c : C â n m = 5 g c h ế p h ẩ m e n z y m e th ô đ g h iề n ấ ã n s ơ bộ . S a u đ ó là m n g ộ i u v à bổ s u n g 1 0 m l đ ệ m a c e ta te p H = 4 . dù n g t ên đ ũ a th ủ y tin h c h cẩ n th ậ n c h ế p h ẩ m tr o n g m ộ t c ố c th ủ y tin h d u n g tíc h 5 0 à m l vớ i m ộ t lư ợ n g nư ớ c n h ỏ . L ọ c à th u hồ i d ịc h tríc h ly e n z y m e . B o q u ả n d u n g d ịc h e n z y m e g ố c ở – 4 C tr o n g thờ i g ia n ả 2 1 ngày.9 ) ổ s u n g nư ớ c c ấ t đ ế n v ạ c h m ứ c .5 m l 0 . N hvậ y . Gữi h ỗ n h ợ p ở n h iệ t đ ộ 3 0C tr o n g thờ i g ia n 1 g iờ c ó k h uấ y đ ả o đ ịn h k ỳ . S a u đ ó c h u y n toà n bộ c h ế p h ẩ m v o b ìn h ta m g iá c d u n g tíc h 2 5 0 ể à m l.m l n ướ c c ấ t tro n g b h đ ịn h m ứ c 1 0 0 m l. Đ ặ t àv bế p c á c h th ủ y ìn o đ a n g s ô i. b ổ s u n g ư ớ c cấ t tớ i v ạ c h m ứ c . B ả o q u ả n d u n g c h e n z y m e gố c ở 2 – 4 o C tro n g thờ i dị g ia n 1 n g à y . L ọ cà vth u hồ i d ịc h tríc h ly e n z y m e . B ả o q u ả n d u n g v o d ịc h e n z y m e g ố c ở 2– 4 C tr o n g thờ i g ia n 1 n gà y .9 . lắ c đ ề u .1 g c h ế p h ẩ m n g h i cứ u . S a u đ ó c h u y ể n ton bộ h ỗ n h ợ p và o b ìn h đ ịn h à m ứ c d u n g tíc h 1 0 0 m l.7 ( h o ặ c 1 0 m l d u n gh đ ệ m d ịc p h o s p h a te p H = 4 . D u n g d ịc h b đ ư ợ c c h u ẩ n b ị tr o n g n g y sử d ụ n g . c h o và o b ìn h t -1 n ó n d u n g tíc h 2 5 0 m l.5 m l 0 .7 . đ ộ ư p h a lo ã n g p hụ th u ộ c và o h oạ t tín h c h ế p h ẩ m e n z y m e c ầ n p h â n tíc h . lắ c liê n tụ c c h o đ ế n k h i tin h b ộ t ta n hàon to à n . cí T ríc h ly e n z y m e ừ v i k h u ẩ n : C â n m = 0 . lắ c đ ề u . L ọ c à th u hồ i d ịc h n v o tríc h ly e n z y m e . T ríc h ly e n z y m e ừ m a lt : C â n m = 5 0 g m a lt đã n g h iề n n h ỏ . T iến hà n h : T ríc h ly e n z y m e : e n z y m e đợ c tríc h ly từ c h ế p h ẩ m h a y tế à b . à D u n g dịc h e n z y m e g ố c 3.5 m l 27 . G iữ h ỗ n h ợ p ở ư o n h iệ t đ ộ 3 0 C tr o n g thờ i g ia n 1 g iờ c ó k h u ấ y đ ả o đ ịn h k ỳ . dù n g đũ a th ủ y tin h c h cẩ n th ậ n c h ế p h ẩ m tr o n g m ộ t c ố c d u n g th à íc 5 0 m l. * D u n g dịc h e n z y m e đ ể p h â n tíc h P h a lo ã n g d u n g dc h e n z y m e g ố c (h ệ s ố p h a lon g n) bằ n g d u n g d ịc h đ ệ m ị ã s a o c h o tr o n g 1 m l d u n g ịc h e n z y m e p h â n tíc h c ó cứ a m ộ t lư ợ n g e n z y m e đ ủ đ ể d h thủ y p h â n 2 0 % .7 0 % tin h bộ t tr o n g d u n g d ịc h ở đ iề u k iệ n x á c đ ịn h . m ô độ n g ư o thự c v ậ t b ằ n g d u n g d ịc h đ ệ m c ó p H th h hợ p . m ẫ u đ ố i c h ứ n g àvm ẫ u trắ ng M ẫ u th í n g h iệ m M ẫ u đ ố i c h ứ n g M ẫ u trắ n g D u n g dịc h tin h b ộ t 1 % 2 ml 2 ml 0 N ướ c c ấ t 0 0 2 ml Đệm 1 ml 1 ml 1m l D u n g dịc h N a C l 3 % 0 . C h uẩ n b ị m ẫ u th í n g h iệ m . bổ s u n g 9 0 m l n ớ c c ấ t và dịc h đ ệ m a c e ta te p H = 4 . ổb s u n g 9 0 m l n ớ c c ấ t và 1 0 m l d u n g dc h đ ệ m ư ị o p h o s p h a te p H = 4 .

ở 4.Ủ 4 0o C . T ín h kết q u ả : D = mậ t đ ộ q u a n g S ố m g tin h b ộ t b ị th ủ y p h â n S = H oạ t tín h e n z y m e a m y la s e : Hoạt tính chung = S n 10  m ( Do D ) x 20 Do trong đó: n = hệ số pha loãng m = khối lượng enzyme 28 . 1 0 p h ú t để đ ạ t n h iệ t đ ộ D u n g dịc h e n z y m e 1 ml 0 o Ủ 4 0 C .5 m 1 0 1 ml 1 ml 4 ml 0 .5 m l 0 . Đ o mậ t đ ộ q u a n g c ủ a c á c d u n g d ịc h bư ớ c s ó n g = 6 2 0 n m s o vớ i m ẫ u trắ n g . 3 0 p h ú t để x ả y ra p h ả n ứ n g H Cl 1N 1 ml 1 ml E nzym e 0 1m l N ướ c c ấ t 4 ml 4 ml Io de 0 .5 m 1 D u n g dịc h đ ố i c h ứ n g c ó m u x a n h à D u n g dịc h th í n g h iệ m c ó m u tím vớ i cư ờ n g đ ộ k h á c n h a u ù y v à o lượ n g tin h b ộ t à t c h ư a bị th ủ y p h â n .

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful