Sắc kí lớp mỏng

Bách khoa toàn thư mở Wikipedia

Bước tới: menu, tìm kiếm

Sự tách biệt của mực đen bởi sắc kí lớp mỏng

Sắc kí lớp mỏng (thin layer chromatography - TLC) là một kĩ thuật sắc kí được dùng để
tách các chất trong hỗn hợp[1]. Phương pháp sắc kí lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp
mỏng các chất hấp phụ, thường là silica gel, aluminium oxide, hoặc cellulose được phủ
trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan
trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc kí bởi mao dẫn, tách dung dịch thí
nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch.
Sắc kí lớp mỏng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực:
• xét nghiệm độ tinh khiết của các hóa chất phóng xạ trong dược khoa
• xác định các sắc tố trong tế bào thực vật
• phát hiện thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng trong thức ăn, hoặc
• nhận biết những hóa chất trong một chất cho sẵn
• giám sát các phản ứng hữu cơ
Một số cải tiến có thể kết hợp phương pháp truyền thống để tự động hóa một vài bước,
làm tăng độ dung giải của sắc kí lớp mỏng và cho số liệu chính xác hơn. Phương pháp
này được gọi là sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (high performance TLC - HPTLC).
Mục lục

[ẩn]
• 1 Chuẩn bị bản sắc kí
• 2 Kĩ thuật
• 3 Phân tích
• 4 Ứng dụng
• 5 Liên kết ngoài
• 6 Xem thêm

[sửa] Chuẩn bị bản sắc kí

Bản sắc kí được làm bằng cách trộn chất hấp phụ, như silica gel, với một lượng nhỏ chất
trơ để kết dính, như calcium sulfate (thạch cao), và nước. Hỗn hợp này được trải ra như
một lớp vữa đặc trên một bề mặt chất trơ, như thủy tinh, nhôm, hoặc nhựa. Bản sắc kí này
sẽ được để khô và kích hoạt bằng cách nung nóng trong lò trong 30 phút ở nhiệt độ
110°C. Độ dày của lớp hấp phụ thường là 0.1-0.25 mm cho hóa học phân tích, và khoảng
1-2mm cho sắc kí lớp mỏng dự bị. Trong mọi kĩ thuật sắc kí đều bao gồm 1 pha động và
1 pha tĩnh.

[sửa] Kĩ thuật

Sắc phổ của 10 tinh dầu được nhuộm màu bởi thuốc thử vanillin
Phương pháp tiến hành giống với sắc kí giấy với lợi thế là nhanh hơn, tách hỗn hợp hiệu
quả hơn, và có sự lựa chọn giữa các "pha tĩnh" khác nhau. Bởi tính đơn giản và nhanh,
sắc kí lớp mỏng thường được dùng để giám sát các phản ứng hóa học và phân tích chất
lượng sản phẩm của phản ứng.
Một vệt nhỏ dung dịch chứa mẫu thử được thấm lên bản sắc kí, khoảng 1 cm từ dưới lên.
Bản sắc kí sau đó được nhúng vào một dung môi thích hợp, như ethanol hoặc nước, và
được đặt vào trong một vật chứa có nắp. Dung môi di chuyển lên bản sắc kí bởi mao dẫn,
gặp phải mẫu thử và dịch chuyển mẫu thử lên bản sắc kí. Các hợp chất khác nhau trong
hỗn hợp mẫu thử dịch chuyển với tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác nhau đối
với pha tĩnh, và độ tan khác nhau trong dung môi.
Các hợp chất được tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để có được
chỗ liên kết với pha tĩnh. Thí dụ, nếu silica gel được dùng như pha tĩnh, nó được xem là
phân cực. Cho trước 2 hợp chất có tính phân cực khác nhau, chất nào có tính phân cực
lớn hơn sẽ có sự liên kết với silica gel lớn hơn và vì thế sẽ có khả năng đẩy pha động ra
khỏi các chỗ liên kết. Do đó, hợp chất có tính phân cực nhỏ hơn sẽ di chuyển lên cao hơn
trên bản sắc kí (kết quả là hệ số lưu Rf sẽ lớn hơn). Nếu pha động được thay bằng một
dung môi phân cực hơn hoặc là một hỗn hợp các dung môi, nó sẽ có khả năng để đẩy các
chất tan ra khỏi chỗ liên kết với silica gel, và tất cả các hợp chất trên bản sắc kí sẽ dịch
chuyển lên cao hơn. Trên thực tế, nếu chúng ta dùng một hỗn hợp ethyl acetate và
heptane như là pha động, tăng thêm ethyl acetate sẽ cho hệ số lưu Rf cao hơn cho tất cả
các hợp chất trên bản sắc kí. Thay đổi độ phân cực của pha động sẽ không làm các hợp
chất có thứ tự di chuyển ngược lại trên bản sắc kí. Nếu muốn có một thứ tự ngược lại trên
bản sắc kí, một pha tĩnh không phân cực sẽ được sử dụng, như là C18-chức năng hóa
silica.

Quá trình sắc kí lớp mỏng: một hỗn hợp của một ho85p chất đỏ và một hợp chất lam
được tách biệt trong quá trình sắc kí (dung môi màu xanh nhạt di chuyển lên trên bản sắc
kí.
Dung môi thích hợp dùng trong sắc kí lớp mỏng sẽ là một dung môi có tính phân cực
khác với pha tĩnh. Nếu một dung môi phân cực được dùng để hòa tan mẫu thử trên một
pha tĩnh phân cực, vệt nhỏ mẫu thử sẽ lan tròn do mao dẫn, và các vệt khác nhau có thể
trộn lẫn vào nhau. Do đó, để hạn chế sự lan tròn của các vệt mẫu, dung môi được sử dụng
để hòa tan mẫu thử phải không phân cực, hoặc phân cực một phần, nếu pha tĩnh phân
cực, và ngược lại.

[sửa] Phân tích

Do một số hóa chất khi được tách ra sẽ trở nên không màu, một vài phương pháp được sử
dụng để quan sát những vệt này:
• Thông thường, một lượng nhỏ chất huỳnh quang, thường là maganese-
activated zinc silicate, được cho thêm vào chất hấp phụ để có thể quan sát được
những vệt này dưới ánh sáng đen (tia cực tím UV254). Lớp hấp phụ vì thế sẽ tự
phát ra ánh sáng lục, nhưng các vệt mẫu sẽ làm tắt ánh sáng này.
• Hơi Iodine cũng là một loại thuốc thử cho màu giống nhau.
• Một số thuốc thử cho màu riêng biệt được dùng để nhúng bản sắc kí vào,
hoặc phun lên bản sắc kí.
• Trong trường hợp của chất béo, sắc phổ có thể sẽ được chuyển qua một
màng polyvinylidene fluoride (PVDF) và sau đó sẽ được phân tích sâu hơn,
chẳng hạn như khối phổ.
Một khi đã trở nên quan sát được, hệ số lưu Rf của mỗi vệt mẫu sẽ được xác định bằng
cách chia khoảng cách di chuyển được của hợp chất cho khoảng cách di chuyển được của
dung môi. Những số liệu này phụ thuộc vào các loại dung môi được sử dụng và các loại
bản sắc kí, và không phải là hằng số.

[sửa] Ứng dụng

Trong hóa học hữu cơ, phản ứng được giám sát chất lượng bởi sắc kí lớp mỏng. Các mẫu
thử được thấm lên bản sắc kí bằng một ống mao dẫn: một vệt nhỏ chất ban đầu, một vệt
nhỏ từ hỗn hợp phản ứng, và một vệt nhỏ gồm cả 2 chất. Một bản sắc kí nhỏ (3 cm x 7
cm) sẽ mất khoảng khoảng hai, ba phút để vận hành. Quá trình này phân tích chất lượng
và sẽ chỉ ra nếu chất ban đầu biến mất, sản phẩm được tạo thành, và bao nhiêu sản phẩm
được tạo thành. Đáng tiếc rằng sắc kí lớp mỏng đối với các phản ứng xảy ra ở nhiệt độ
thấp có thể cho ra kết quả không đúng, bởi vì các mẫu thử sẽ được làm ấm lên trong mao
dẫn. Một trong những phản ứng như vậy là phản ứng khử ester bởi DIBALH thành
aldehyde.
Một ví dụ là sắc kí được áp dụng cho một phần lá xanh (ở đây là rau chân vịt) qua 7
bước. Carotene tách ra nhanh chóng và chỉ quan sát được cho đến bước 2. Chlorophyll A
và B hiện rõ ở giữa bản sắc kí trong bước cuối cùng và lutein là hợp chất đầu tiên nhuộm
màu vàng lên bản sắc kí.

Step 1 Step 2 Step 3 Step 4

Step 5 Step 6 Step 7

Trong một nghiên cứu, sắc kí lớp mỏng đã được sử dụng để lọc phản ứng hóa học hữu
cơ[2], như tổng hợp BINAP từ 2-naphtol. Trong phương pháp này, cồn và dung dịch xúc
tác (chẳng hạn như iron(III) chloride được đặt riêng rẽ trên đường gốc, sau đó phản ứng
với nhau và được phân tích ngay lập tức.
***********************************************************************
*Thực chất thì sắc ký bản mỏng với sắc ký lớp mỏng được thiên hạ lâu nay dùng với sự phân biệt không khác
nhau gì mấy (và vẫn coi 2 thứ là 1), cũng đúng thôi vì tên tiếng Anh của nó lại là như nhau.
Theo tôi thì có thì ta có thể hiểu như sau:
- Về bản chất thì chúng chính là một phương pháp sắc ký đơn giản nhất. Cái tên của bộ môn SẮC KÝ cũng chính
bắt nguồn từ đây mà ra.
- Sắc ký lớp mỏng được dùng với nghĩa bao hàm rộng hơn là sắc ký bản mỏng.
+ Vì đối với sắc ký bản mỏng người ta chỉ đơn thuần là dùng các bản mỏng tráng sẵn (được bán trên thị trường
với đế nhôm, nhựa (1 hộp 25 bản 20cmx20cm của Đức), kính (thường của Tàu),... để làm các phép phân tích
khảo sát độ phân cực của các chất, sơ bộ về độ tương quan hàm lượng của các chất đó với nhau.
+ Còn đối với sắc ký lớp mỏng thì bao gồm cả: Sắc ký bản mỏng và sắc ký bản mỏng điều chế. Loại bản mỏng
điều chế cũng có loại được bán sẵn nhưng rất đắt vì chúng được tráng phủ rất đều và mịn (tăng hiệu suất tách).
Nhưng ở các PTN thì để tiết kiệm (không riêng VN) người ta tự tráng lấy để làm điều chế.

Còn về kinh nghiệm chạy SKBM, SKBMDC thì thật khó nói. Mình nghĩ, bạn cứ làm đi, đến lúc vướng ở đâu, hỏi
câu hỏi cụ thể thì mọi người sẽ giúp bạn được nhiều hơn và mình sẽ trao đổi tiếp.

Về câu hỏi màu của các hợp chất tự nhiên trên SKBM:
- Các chất màu thể hiện được màu ngay khi bạn chấm trên bản mỏng đều là màu bản chất của chính nguyên liệu
của nó trong thiên nhiên. Nghĩa là, không thể nhìn vào màu mà đoán già đoán non chất đó là gì.
+ Trừ những chất khi làm hợp chất thiên nhiên không mấy ai quan tâm là Chlorophin, nó chính là chất mà mấy
ông nhà văn gọi là màu xanh của lá,hehe... nói người ta không quan tâm là vì những chất thuộc họ này rất không
phân cực và thường không có tính chất hay cấu trúc gì hay ho để nghiên cứu nữa.
+ Màu của các chất trên SKBM có hoặc là do hỗn hợp màu các chất khác, hoặc là do sau khi phun thuốc thử rồi
hơ nóng tạo ra. Nếu bạn dùng thuốc thử là Dragendoff thì chỉ nhạy với các flavonoid và nó cho màu vàng tới cam
đậm. Còn dùng với thuốc thử là axit Sulfuric 5-10% thì chất gì có trên bản mỏng cũng hiện hết và đều có màu
nâu đến đen thui vì sau khi hơ nóng, hơi nước và dung môi bay đi, H2SO4 sẽ thịt luôn các chất của bạn trên bản
mỏng thành than.
- Quan trọng là khi bạn khảo sát đối tượng gì thì bạn nên chọn loại thuốc thử phù hợp hoặc chuẩn bị tất cả các
loại thuốc thử nếu muốn khảo sát nhiều lớp chất.

*******************************************************************************
Sắc kí (chromatography) là một phương pháp phân tích hóa học để tách các chất hỗn hợp trong
một mẫu thử nghiệm, sắc kí gồm hai phần pha động (mobile phase) thường là chất lỏng (liquid)
hoặc chất khí (gas) đưa chất hỗn hợp trong dung môi qua một pha tĩnh (stationary phase ) từ đó
các chất hóa học này được tách ra do những mức độ cực tính khác nhau , các phân tử hóa chất
sẽ di chuyển với một tốc độ khác nhau tính theo thời gian duy trì (Retention time) và di chuyển
qua pha tĩnh (stationary phase).
NPA Laboratories dùng các phương pháp ứng dụng sắc khí để phân tích các hóa chất trong
dược phẩm, dược thảo, mỹ phẩm chất dinh dưỡng trong thực phẩm, thức ăn và nước uống. Các

phương pháp được dùng tại NPA Laboratories

Nutritional Phytochemical Analytical Laboratory
♦ Sắc kí lỏng hiệu năng cao – High performance Liquid Chromatography hoặc High
pressure liquid Chromatography hoặc HPLC
♦ Sắc kí khí lỏng – Gas liquid Chromatography or GLC
♦ Sắc kí khí – Gas Chromatography
♦ Sắc kí lớp mỏng – Thin Layer Chromatography or TLC
♦ Sắc kí trao đổi ion – Ion exchange Chromatography
♦ Sắc kí Ion – Ion chromatography
♦ Sắc kí thẩm thấu gel - Gel Chromatography
♦ Sắc kí giấy - Paper Chromatography