http://www.sinhhocvietnam.com/vn/modules.php?

name=Pages1&go=page&pid=99

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT THU THẬP TỪ MÃ ĐÀ VÀ CÁT TIÊN (TỈNH
ĐỒNG NAI)

Hà Thị Phúc, Đặng Quang Hưng, Phạm Bảo Yên, Nguyễn Quang Huy, Nguyễn Vũ Minh Hạnh, Phan Tuấn
Nghĩa
Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.

2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Nguyên liệu

Các mẫu thực vật dùng cho nghiên cứu bao gồm các loài: Trung quân (Ancistocladus tectorius), Quế bì
(Cinnamomum cassia), Săng mây (Segeraea elliptica) và Lộc Vừng (Barringtonia acutangula). Mẫu được thu thập
thành từng cặp loài từ Lâm trường Mã Đà và rừng Quốc gia Cát Tiên, được TS. Trần Đình Nghĩa giúp định tên khoa
học.

Các oligonucleotide (mồi) được mua của Operon Technologies Inc. (Mỹ), các hoá chất còn lại dùng cho nghiên cứu
đều đạt độ tinh khiết phân tích.

2.2.Phương pháp

- Tách chiết ADN tổng số từ các mẫu thực vật theo quy trình của Stacey và Isaac [7] có cải tiến.

- Định lượng ADN bằng đo độ hấp phụ tử ngoại ở bước sóng 260 nm (A260)

- Phân tích phổ băng ADN bằng phương pháp các đoạn ADN đa hình được nhân bản ngẫu nhiên (RAPD) bằng kỹ th
PCR. Một phản ứng RAPD-PCR bao gồm đệm PCR 1x và nồng độ cuối cùng của các chất thành phần là: MgCl2 2,5
dNTPs 0,2 mM, mồi ngẫu nhiên 0,5 mM, 2,5 đơn vị Taq ADN polymerase và 10-20 ng ADN khuôn. Phản ứng được
hiện qua 45 chu kì lặp lại của 3 bước chính: biến tính ADN khuôn ở 940C, 35 giây, gắn mồi ở 370C, 30 giây và kéo d
chuỗi ở 720C, 1 phút. Sản phẩm của RAPD sau đó được điện di trên gel agarose 2%, nhuộm băng bằng ethidium brom
và chụp ảnh để phân tích.

3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Xây dựng quy trình tách chiết ADN từ mẫu thực vật

Để tách chiết ADN từ các mẫu thực vật chúng tôi đã sử dụng qui trình của Stacey và Issac [7], là qui trình đã được dù
với nhiều đối tượng thực vật khác nhau. Tuy vậy khi áp dụng qui trình tách chiết này, chúng tôi không thu được ADN
vậy chúng tôi đã thay đổi một số thành phần đệm tách chiết, cụ thể là tăng nồng độ EDTA trong hệ đệm lên 50 mM n
loại trừ hoàn toàn tác động phân cắt ADN bởi các nuclease nội bào, tăng nồng độ NaCl từ 0,7M lên gấp đôi nhằm hạ
sự tạo phức giữa ADN và CTAB, bổ sung thêm polyvinyl pirrolidone (PVP) và sodium dodecyl sulfate (SDS) để làm
khả năng giải phóng ADN cũng như tăng kết tủa một số hợp chất polyphenol, polysacharide và protein...
Qui trình tách chiết tóm tắt gồm các bước: mẫu lá được nghiền với nitơ lỏng, sau đó bổ sung đệm nghiền (Tris HCl 1
mM, pH 8.0, EDTA 50 mM pH8.0, NaCl 1,4 M; CTAB 2%; PVP 2%; SDS 2%; beta-mecaptoethanol 2%) đã được l
nóng tới 650C. Hỗn hợp được ủ ở 650C trong 1 giờ kết hợp lắc nhẹ. Sau khi để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung mộ
tích tương đương hỗn hợp phenol: chloroforrm: isoamylalcohol (trộn theo tỷ lệ 25:24:1 về thể tích), lắc mạnh mẫu tro
phút và ly tâm ở 6000 vòng/ phút ở 250C trong 10 phút để thu phần dịch trên tủa. Bổ sung tiếp 0,1 thể tích tương ứng
3M cùng hai thể tích ethanol tuyệt đối và chuyển nhanh sang ủ ở –200C trong 1 giờ. Ly tâm hỗn hợp để thu tủa ADN
14.000 vòng/phút ở 40C trong 15 phút. Hoà tan kết tủa trong TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0 có chứa EDTA 2 mM), loạ
ARN bằng RNAse, tái kết tủa ADN bằng 0,7 lần thể tích isopropanol và hoà tan trở lại trong đệm TE.

Kết quả đo độ hấp phụ ở bước sóng 260 nm (A260) và 280 nm (A280) của các chế phẩm ADN thu được (bảng 2) chứng
có mặt của ADN, tỷ số A260/A280 của cả 4 đối tượng đạt khoảng 1,9 đến 2,1. Khi phân tích chất lượng ADN bằng điện
trên gel agarose (hình 1) cho thấy tất cả 4 mẫu thực vật chọn nghiên cứu thu ở Mã Đà hay Cát Tiên đều chỉ chứa một
ADN có kích thước lớn, không lẫn ARN. Các kết quả phân tích về độ hấp thụ tử ngoại và điện di khẳng định qui trìn
các cải tiến về thành phần cũng như bước tách chiết kể trên đã cho phép thu được chế phẩm ADN có chất lượng tốt.

Bảng 2: Độ hấp phụ ở bước sóng 260 nm và 280 nm của các chế phẩm ADN thực vật

Hình 1: Điện di gel agarose các chế phẩm ADN thực vật
 A: Trung Quân , B: Quế Bì,
C: Lộc Vừng, D: Săng Mây.
M: Thang chuẩn ADN l HindIII
MĐ: Mã Đà, CT: Cát Tiên

2. Nghiên cứu phổ băng ADN của các mẫu thực vật thu thập từ Mã Đà và Cát Tiên

Để thu nhận phổ băng ADN của 4 loài thực vật đã lựa chọn chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật RAPD- PCR với các mồi n
nhiên khác nhau có ký hiệu và trình tự được ghi trong bảng 1. Kết quả điện di sản phẩm RAPD-PCR của cả 4 loài vớ
mồi khác nhau (hình 2, 3, 4 và 5) đều cho thấy có tính đồng hình cao về phổ băng ADN giữa các mẫu cùng loài thu n
từ Mã Đà và Cát Tiên. Tuy vậy, chúng tôi cũng đã bước đầu phát hiện được một số băng đa hình giữa các mẫu cùng
thu được từ hai vùng này.

Khi sử dụng các mồi D5, D6, D7, OPA4, OPA10 và OPA12 để tìm hiểu phổ băng của loài Trung Quân (hình 2) chún
đã phát hiện thấy rằng mồi D6 cho kết quả đa hình rõ nét nhất, trong đó có 2 băng với kích thước khoảng 0,8 kb và 1
chỉ thấy ở mẫu Mã Đà và các băng có kích thước khoảng 0,8 kb và 1,0 kb chỉ xuất hiện ở mẫu Cát Tiên. Ngoài ra mồ
cho 2 băng với kích thước khoảng 1,3 kb và 1,4 kb chỉ có ở mẫu Mã Đà. Tương tự, mồi OPA12 cho một băng đa hìn
kích thước khoảng 1,3 kb chỉ có ở mẫu Cát Tiên.

Đối với loài Quế bì, chúng tôi cũng đã phát hiện được 2 băng đa hình với kích thước khoảng 1,4 kb với mồi OPA4 v
OPA12, một băng có kích thước khoảng 1,6 kb với mồi OPA10. Các băng này chỉ có ở mẫu Mã Đà, không có ở Mẫu
Tiên (hình 3).

Các mồi OPA4, OPA10 và OPA12 khi được sử dụng với loài Lộc Vừng và Săng Mây đã không có băng nhân bản đi
hình vì vậy chúng tôi đã sử dụng các mồi P4, P10, Z16, Z17, Z18 và Z19. Kết quả thu được với loài Lộc Vừng (hình
cho thấy có 3 băng đa hình được thể hiện, trong đó các băng có kích thước khoảng 2 kb với mồi Z17 và 1 kb với mồi
chỉ thấy ở mẫu Mã Đà còn băng 1 kb với mồi Z19 chỉ có ở mẫu Cát Tiên.

Tương tự, chúng tôi cũng đã phát hiện được 4 băng đa hình ở mẫu Săng Mây (hình 5), cụ thể các băng có kích thước
khoảng 1,3 kb, 1,5 kb với mồi P4 và băng 1,7 kb với mồi Z18 chỉ thấy ở mẫu Mã Đà còn băng có kích thước khoảng
kb với mồi P4 chỉ xuất hiện ở mẫu Cát Tiên

4. THẢO LUẬN

Qua nghiên cứu này chúng tôi đã xây dựng được một qui trình tách chiết ADN cải tiến cho các mẫu thực vật. Mặc dầ
đến nay đã có rất nhiều qui trình tách chiết ADN khác nhau từ nguyên liệu thực vật [5, 7], nhưng sự đa dạng về tính c
của mẫu thực vật, đặc biệt là với mẫu có chứa hàm lượng cao các chất polyphenol, polysacharide...thì những qui trìn
thông thường ít khi cho kết quả. Chính vì vậy, những cải tiến trong qui trình mà chúng tôi thiết lập như loại bỏ sự ph
của nuclease, kết tủa chọn lọc các tạp chất thông qua sự phối hợp CTAB và nồng độ NaCl cũng như bổ sung SDS đã
phép chúng tôi thu nhận được chế phẩm ADN chất lượng tốt từ 4 mẫu thực vật khác nhau và qui trình được thiết lập
dùng cho việc tách chiết ADN từ nhiều mẫu thực vật khác.
RAPD là kỹ thuật đã được sử dụng khá phổ biến trong nghiên cứu tính đa hình di truyền của các loài sinh vật [1, 2, 3
đặc biệt khi mà hệ gen của chúng còn ít được nghiên cứu về trình tự [4, 8]. Bằng việc sử dụng kỹ thuật này, chúng tô
đã phát hiện thấy loài ốc cạn Bradybaena similaris được thu từ Mã Đà có những sai khác về phổ băng ADN so với p
băng của cùng loài ốc này nhưng được thu được từ Cát Tiên. Ngoài ra, chúng tôi cũng đã phát hiện thấy có sự khác b
hoạt độ của enzym catalase, superoxit dismuatse, NADH oxidase cũng như phổ băng protein giữa hai loại mẫu ốc nà

Các số liệu thu được về phổ băng ADN của Trung Quân, Quế Bì, Lộc Vùng và Săng Mây trên đây là những dẫn liệu
sung về những sai khác trong hệ gen của các sinh vật cùng loài nhưng sống trong các điều kiện môi trường khác nhau
vậy, liệu những sai khác này có liên quan và liên quan như thế nào đến các yếu tố môi trường hay không là vấn đề cầ
được tiếp tục nghiên cứu. Xác định trình tự của những đoạn ADN sai khác cũng như nghiên cứu các protein được biể
có thể là cơ sở tốt nhất để trả lời câu hỏi vừa nêu.

Hình 2: Điện di gel agarose các sản phẩm RAPD-PCR của mẫu Trung Quân với các mồi D5, D6, D7, OPA4, OPA1
OPA12
M: Thang chuẩn ADN 1 kb, MĐ: Mã Đà, CT: Cát Tiên
 Hình 3: Điện di gel agarose sản phẩm RAPD-PCR của mẫu Quế Bì với các mồi OPA4, OPA10 và OPA12
M: Thang chuẩn ADN 1 kb, MĐ: Mã Đà, CT: Cát Tiên

Hình 4: Điện di gel agarose sản phẩm RAPD-PCR của mẫu Lộc Vừng với các mồi P4, P10, Z16, Z17, Z18 và Z1
M: Thang chuẩn ADN 1 kb, MĐ: Mã Đà, CT: Cát Tiên
Hình 5: Điện di gel agarose sản phẩm RAPD-PCR của mẫu Săng Mây với các mồi P4, P10, Z16, Z17, Z18 và Z1
M: Thang chuẩn ADN 1 kb, MĐ: Mã Đà, CT: Cát Tiên

Kỹ thuật PCR trong chẩn đoán lao

KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR)
PHÁT HIỆN M. TUBERCULOSIS TRỰC TIẾP TRONG MẪU BỆNH
PHẨM

Kỹ thuật PCR cho phép xác định tác nhân gây bệnh trực tiếp trong bệnh phẩm nhờ khả
năng nhận biết và sao chép để khuyếch đại về mặt số lượng đoạn trình tự đặc hiệu trên
genom của vi khuẩn. Đối với M.tuberculosis, kỹ thuật PCR phát hiện trình tự 249 đôi
bazơ nằm trên đoạn IS 6110, là trình tự gắn (IS-insert sequence) đặc hiệu và có khả năng
tự sao chép với số lượng lớn (1-25 lần) trong genome vi khuẩn thuộc nhóm
M.tuberculosis (M.tuberculosis, M.microti, M.bovis và M.africanum).

Quá trình sao chép được thực hiện trong một chu trình nhiệt lặp lại với sự tham gia của
enzyme chịu nhiệu Taq polymerase có bản chất là ADN polymeraza, các
deoxynucleotide triphosphat tự do (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) và cặp đoạn mồi đặc hiệu
cho đoạn trình tự định sao chép.
Sản phẩm PCR được phát hiện bằng kỹ thuật điện di trên gen agarosa hoặc các kỹ thuật
lai ghép miễn dịch khác như lai ghép Dot plot (dot blot hybridzation), lai ghép Southern
blot hoặc lai ghép với cơ chất trên phiến nhựa, v.v.

I. CÁC THÔNG TIN CHUNG CẦN BIẾT VỀ PCR

I.1. Nguyên lý của PCR

PCR là kỹ thuật khuyếch đại số lượng ADN dựa trên trình tự ADN khuôn mẫu với quy
trình tiến hành gồm 3 giai đoạn: biến tính, gắn mồi và tổng hợp kéo dài với sự trợ giúp
của ADN polymerase chịu nhiệt, primers và deoxy-nucleotide triphosphates (dNTPs)
I.2. Thông số chu kỳ PCR

PCR được thực hiện với các chu trình ủ bệnh phẩm đã xử lý ở 3 nhiệt độ khác nhau tương
ứng với 3 giai đoạn cần thiết cho việc tổng hợp ADN. Mỗi chu kỳ bao gồm 3 giai đoạn:
Biến tính ở 90-950C, gắn mồi ở 40-650C và tổng hợp kéo dài ở 70-750C. Tuỳ theo nồng
độ ADN đích có trong bệnh phẩm mà xác định số lượng chu kỳ cần thực hiện, số lượng
trình tự khuyếch đại càng nhiều nếu số chu kỳ càng tăng.

I.3. Các bước cần thiết để tránh nhiễm với M.tuberculosis hoặc sản phẩm
PCR (amplicon) từ đợt trước
I.3.1. Yêu cầu đối với phòng thí nghiệm:

Quy trình thực hiện PCR cần được tiến hành tại 3 phòng thí nghiệm khác nhau và theo
nguyên tắc lưu thông một chiều để giảm thiểu lây nhiễm gây dương tính giả. Phòng thứ
nhất: chuẩn bị hỗn dịch nền (Mix) chạy PCR; phòng thứ hai: chuẩn bị và xử lý mẫu bệnh
phẩm và cho bệnh phẩm vào ống chứa mix; phòng thứ ba: phân tích sản phẩm PCR. Vận
chuyển dụng cụ và hoá chất cần theo chiều từ phòng thứ nhất (chuẩn bị mix) đến phòng
thứ ba, không được theo hướng ngược lại.

Các dung dịch hoá chất pha chế và xử lý cần được khử trùng bằng hấp ướt ở 121 0C trong
20 phút. Nguyên vật liệu như ống chạy PCR, đầu côn, pipet Pasteur, ống đựng bệnh
phẩm, găng tay, v.v. cần được vô trùng và chỉ được dùng 1 lần, không dùng lại.
I.3.2. Sử dụng enzyme tiêu diệt lây nhiễm sản phẩm PCR (amplicon) của những
đợt trước:

Enzyme uracil ADN glycosylasa (UDG) có tác dụng nhận biết và cắt trình tự ADN-sản
phẩm PCR ở vị trí Uracil (U) và tạo những mảnh ADN gãy vụn, vô hiệu hoá amplicon
nhiễm từ những đợt PCR trước đó. Do vậy, trước khi thực hiện các chu kỳ khuyếch đại
trong chu trình PCR, cần ủ bệnh phẩm ở 400C trong 10 phút với enzyme UDG để phá các
trình tự sản phẩm PCR nhiễm từ các đợt trước. Các chu trình khuyếch đại tiếp theo sẽ
làm bất hoạt hoạt tính của UDG với nhiệt độ > 550C. Sau khi chạy xong các chu kỳ
khuyếch đại, ủ mẫu ở 720C trong thời gian hơn 30 phút để bất hoạt hoàn toàn hoạt tính
của UDG, không gây cản trở cho việc đọc kết quả PCR.
II. KỸ THUẬT PCR XÁC ĐỊNH M.TUBERCULOSIS
II.1. Pha hỗn dịch Mix (thực hiện tại phòng chuẩn bị Mix)

Để pha chế hỗn dịch mix, tính số lượng mẫu cần xét nghiệm và tính toán lượng Mix cần
thiết với các thành phần tương ứng. Dưới đây là ví dụ cách tính để pha đủ cho 50 ống
PCR với lượng 50ul mix/ống.
Trình tự cho Số lượng (ul) cho
Thành phần Nồng độ cuối cùng
vào tổng 50ul/ống

Nước cất 2 lần Milli Q (a) Tính lượng cần thiết 10mM TrisHCl
Đệm phản ứng (10x) (b) 5 50 mM NaCl
Tris 100mM, pH 8,3 (c) 5 0,01%
NaCl 500 mM (d) 4 hoặc 6 2-3 mM
Gelatin 0,1% (w/v) (e) 0,5 0,2 mM/loại
MgCl2 25mM (g) 0,2 0,2 uM
dNTP (hỗn hợp) (h) 0,2 1U/50ul
- dATP 20mM (i) 0,2 0,2/ống
- dCTP 20mM (k) 5-15 5-15ul/ống
- dGTP 20mM
- dUTP 20mM
Mồi: 50uM 330ug/ml
Ampli Taq polymerasa
Uracil-ADN-glycosylase (UDG) 1U/ul
Bệnh phẩm, ADN hoặc TE

II.2. Xử lý bệnh phẩm

Bước 1:
- Dịch : Ly tâm lấy cặn trong ống Eppendorf, 12000 v/ phút x10 phút
- Đờm : Khử nhiễm bằng 1 thể tích NaOH 1M (40gr NaOH/lit) + 1 thể tích Natri Citrat
0,1M (29,4gr Na-citrat.2H2O/lit) và 30mM N-acetyl-L-cystein (NALC) (15mg/100ml),
lắc cho đờm loãng đều trong 15 phút, ly tâm tách cặn như đối với dịch
- Mảnh sinh thiết và mủ: Ly giải bằng Protease K qua đêm ở 560C
Bước 2: Xử lý bệnh phẩm có máu bằng TTE (1% Triton X 100, 20mM Tris-
HCl pH 8.3, 1m EDTA): cho 1 ml dung dịch TTE vào mẫu đã tách cặn, lắc
kỹ cho tan máu, ly tâm loại bỏ nước nổi.
Bước 3: Bất hoạt 100OC trong 10 phút
II.3. Tách ADN của vi khuẩn lao trong bệnh phẩm (Phương pháp BOOM)

Bước 1: Phá tế bào giải phóng ADN

Cho 0,9ml dung dịch ly giải tế bào L6 (120g GuSCN, 100ml 0.1 M Tris-
HCl pH 6.4, 22ml 0.2M EDTA pH 8.0 và 2.6 ml Triton X 100) và 20µ l
diatom 20% vào mỗi bệnh phẩm
Lắc kỹ bằng máy lắc trong ít nhất 10phút
Ly tâm, lấy cặn
Bước 2: Tinh sạch ADN
 Rửa 2 lần bằng dung dịch L2 (120g GuSCN, 100ml 0.1 M Tris-HCl pH
6.4)
Rửa 2 lần bằng Ethanol 70%
Rửa 1 lần bằng acetone
Phơi khô trong bể nước 56oC (10-15 phút )
Bước 3: Thu hồi ADN
Cho 70µ l TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA) vào mỗi mẫu, ủ 56
0
C, 10 phút .
Lắc kỹ, ly tâm 12000 vòng / 2 phút
Tách nước nổi chứa ADN và sử dụng để chạy PCR
II.4. Cho mẫu vào ống phản ứng PCR

Dung dịch có chứa ADN sau khi được tách từ bệnh phẩm được cho vào ống phản ứng đã
chứa sẵn 35 ul hỗn dịch mix. Mỗi bệnh phẩm cần có hai ống phản ứng (ống a và ống b).
ống a sử dụng để chạy phản ứng với bệnh phẩm, ống b dùng để kiểm tra chất ức chế nếu
có trong bệnh phẩm. ống b ngoài ADN tách từ bệnh phẩm còn được cho thêm ADN của
M.smegmatis đã được biễn đổi bằng gắn thêm một đoạn trình tự IS6110. Cặp mồi Pt18 và
INS2 có khả năng khuyếch đại trình tự 249 đôi bazỏ trên IS 6110 của M. tuberculosis, và
khuyếch đại cả trình tự 305 đôi bazơ trên IS6110 của M. smegmatis.
- ống a: 10µ l d2 ADN đã tách từ bệnh phẩm
- ống b: 5µ l d2 ADN đã tách từ bệnh phẩm + 5µ l d2 ADN M. smegmatis 10-
11
g/ml
- ống chứng dương : 10 µ l ADN của M. tuberculosis 10-12g/ml (hay 10
femtogram trong một ống phản ứng tương đương lượng ADN tách từ 2-3 vi
khuẩn)
- ống chứng âm : 10 µ l d2 TE

II.5. Chương trình chạy PCR

II.6. Điện di sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2% (2 gr agarose/100 ml đệm TBE pH 8,3
với 0,89M Tris, 0,89M axit boric và 0,02 EDTA): 20ul/giếng, ở hiệu điện thế 110V, dòng
 điện 40 mA, từ 30 đến 45 phút. Gel được lấy ra và nhuộm trong dung dịch ethidium
bromide 0.2µ g/ml (20 phút)
II.7. Chụp ảnh và đọc kết quả

Soi gel dưới đèn UV, chụp ảnh bằng phim Polaroid

Phân tích kết quả: Bệnh phẩm có kết quả PCR dương tính nếu cả 2 ống phản ứng a và b
cùng dương tính, ống thứ nhất cho vạch đặc hiệu của đoạn ADN có độ dài phân tử là 249
đôi bazơ và ống thứ hai cho vạch đặc hiệu ứng với các phân tử có độ dài 305 đôi bazơ,
PCR cho kết quả âm tính nếu ống thứ nhất âm tính (không có vạch) và ống thứ hai dương
tính, nếu cả hai ống cùng cho kết quả âm tính thì bệnh phẩm có chất ức chế phản ứng
(hình 1).

Chứng dương cho phép đảm bảo độ nhạy của hỗn dịch phản ứng có thể xác định được ở
nồng độ 10fg ADN của M. tuberculosis trong một ống phản ứng (hình 1

http://www.medinet.hochiminhcity.gov.vn/data/news/2007/5/4657/PCR-
RFLP.htm

Áp dụng kỹ thuật PCR-RFLP để xác định

một số vi khuẩn là căn nguyên chính
gây viêm màng não ở trẻ em
BS. Lê Nhật Minh
BS. Phan Lê Thanh Hương
BS. Lê Thị Kim Tuyến
Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương – Hà Nội
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
Đối tượng:
Mẫu vi khuẩn chuẩn được cung cấp từ phòng thí nghiệm hô hấp và viêm màng não vi
khuẩn, Viện Vệ sinh Dịch tễ TW.
Các hóa chất chuẩn của các hãng New EnglADN Biolab, Invitrogen, Sigma,
Promega…
Phương pháp nghiên cứu: toàn bộ ADN vi khuẩn chuẩn nuôi cấy trên đĩa thạch được
tách theo thường qui của Bộ Kít DNA Qiagen. Phản ứng PCR với cặp mồi được thiết kế
trên vùng gen mã hóa cho yếu tố 16S ribosom là chung cho 10 loài vi khuẩn khác nhau.
Sản phẩm PCR có kích thước 996bp được kiểm tra kết quả trên gel agaroza 1% cùng với
thang ADN chuẩn, nhuộm Ethidium bromit và quan sát dưới đèn cực tím. Sản phẩm sau
phản ứng PCR, tiếp tục tiến hành phản ứng phân tích đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn
(RFLP) với enzym giới hạn HaeIII. Kiểm tra kết quả trên gel agarose low melting 3% và
nhuộm Bet.
Kết quả:
Phản ứng PCR
Kỹ thuật PCR với cặp mồi chung được thiết kế dựa trên vùng ADN mã hóa cho yếu tố
16S ribosom chung cho 11 loài vi khuẩn khác nhau cho phép nhân lên đoạn ADN có kích
thước 996 bp.
RFLP để xác định các chủng vi khuẩn chuẩn
Sản phẩm ADN dài 996bp của 10 loài vi khuẩn khác nhau được phân tích đa hình độ
dài đoạn cắt giới hạn sử dụng enzym giới hạn Hae III. Các hình vạch ADN sau khi xử lý
với enzym giới hạn Hae III, cho phép phân biệt được các loài vi khuẩn gây viêm màng
não.
BÀN LUẬN
Trong nghiên cứu này một cặp primer được sử dụng để nhân lên đoạn sản phẩm PCR
dài 996bp của yếu tố 16S ribosom cho 11 loài vi khuẩn khác nhau. Thực tế là các loài vi
khuẩn này rất khác nhau về vật liệu di truyền, trình tự các nucleotid trong bộ genom. Tuy
nhiên, trong quá trình tiến hóa các loài vi khuẩn vẫn duy trì những đặc điểm chung như
các quá trình sao mã, phiên mã và dịch mã tổng hợp protêin của tế bào. Điển hình là các
gen mã hóa cho các ARN ribosom như 16S, 23S, 5S. Trong nghiên cứu này, sản phẩm
PCR có độ dài 996bp trên gen mã hóa cho các yếu tố ARN ribosom 16S của 11 loài vi
khuẩn được nhân lên với độ nhậy và độ đặc hiệu thích hợp. Kết quả PCR cũng cho phép
sơ bộ kết luận về sự tồn tại của một trong những loài vi khuẩn là căn nguyên gây viêm
màng não trong các mẫu bệnh phẩm dịch não tủy.
Việc xác định chính xác từng loài vi khuẩn khác nhau được thực hiện nhờ enzym giới
hạn. Enzym giới hạn là một loại protein có khả năng nhận ra và cắt phân tử ADN ở
những vị trí đặc hiệu. Như chúng ta đã biết, sản phẩm PCR là một đoạn ADN nằm trên
gen mã hóa cho yếu tố 16S của ARN ribosom là đặc trưng cho nhóm vi khuẩn và có tính
bảo thủ cao. Tuy nhiên đối với từng loài vi khuẩn khác nhau trên đoạn ADN có tính bảo
thủ cao này vẫn có sự khác nhau ở một vài nucleotid và chính những đoạn khác nhau này
đã cho phép enzym giới hạn nhận ra và xúc tác cho các phản ứng cắt đoạn ADN nay
thành những đoạn ADN nhỏ hơn có kích thước khác nhau. Với từng loài vi khuẩn do sự
khác nhau ở những vị trí nucleotid nhất định là vị trí nhận biết và cắt của enzym giới hạn
sẽ tạo nên sự khác nhau về độ dài và kích thước của các đoạn ADN do enzym giới hạn để
lại.
Trong nghiên cứu của chúng tôi một enzym giới hạn là Hae III nhận ra trình tự
nucleotid là GGCC đã được sử dụng để phân tích sự đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn trên
đoạn ADN là sản phẩm PCR. Sau khi phân tích hình vạch ADN của các loài vi khuẩn
chuẩn trên gel agarose low meting 3% cho phép chúng tôi xác định được sự khác nhau
của 10 loài vi khuẩn khác nhau là những loài vi khuẩn chính trong những căn nguyên vi
sinh vật gây VMNVK. Kết quả này cho phép chúng tôi tiến hành phân tích trên mẫu dịch
não tủy để xác định nhanh chóng, chính xác một số căn nguyên vi khuẩn chính gây viêm
màng não ở trẻ em.
KẾT LUẬN
Kỹ thuật PCR sử dụng một cặp mồi chung cho phép nhân lên một đoạn ADN có kích
thước 996bp trên gen mã hóa cho yếu tố 16S ribosom với độ nhậy và độ đặc hiệu cao. Kỹ
thuật RFLP cho phép phân biệt được 11 loài vi khuẩn chuẩn khác nhau và xác định chính
xác 9 loài vi khuẩn là căn nguyên chính gây viêm màng não ở trẻ em.
http://www.pasteur-
hcm.org.vn/ng_cuu/benh_nhiem_moi/BARTONELLA.htm

PHÁT HIỆN VI KHUẨN BARTONELLA ĐẦU TIÊN TRÊN CHUỘT Ở VIỆT

NAM

Hoàng Kim Loan1, Michael Kosoy2, Cao Bảo Vân1,

Nguyễn Thái Hiệp1 và Nguyễn Thị Kim Tiến1.
1
Viện Pasteur TP HCM,
2
Trung tâm ngăn ngừa và phòng chống dịch bệnh Hoa Kỳ, Ft. Collins,
Colorad

VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP

1. Phân lập

Qui trình nuôi cấy và định danh vi khuẩn Bartonella được thực hiện theo đúng tiêu chuẩn nghiên
cứu về vi khuẩn Bartonella trên chuột tại Hoa Kỳ.
Mẫu máu chuột từ thực địa được bảo quản trong Nitơ lỏng cho đến khi chuyển đến Trung tâm
kiểm soát dịch bệnh Hoa Kỳ, Colorado. Máu chuột được pha loãng 1:4 trong BHI lỏng có bổ sung
thuốc chống nấm, sau đó cấy lên môi trường thạch máu thỏ, ủ 35°C, 5% CO2, tiến hành ủ và theo
dõi khoảng 3 tuần. Vi khuẩn Bartonella được gặt lấy sau một đến bốn lần cấy chuyển.(5)

2. Định danh bằng kỹ thuật PCR

Phản ứng khuếch đại chuỗi (Polymerase chain reaction –PCR) sẽ được tiến hành để xác định
những vi khuẩn từ môi trường phân lập có hình dạng khuẩn lạc được nhận biết là Bartonella.
Phản ứng PCR khuếch đại một trình tự đặc hiệu của gen tổng hợp citrate (citrate synthase gene
- gltA) của vi khuẩn Bartonella, có kích thước 379 bp.
DNA được tách chiết sẽ tiến hành phản ứng PCR trên máy PTC 200 DNA_Engine, gồm 35 chu
kỳ như sau:
 95°C trong 30 giây
 45°C trong 30 giây
 72°C trong 30 giây
Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên gel agarose 1% theo các phương pháp chuẩn(3)

3. Sequencing sản phẩm PCR, phân tích kết quả

Tiến hành thực hiện phản ứng phân tích trình tự gen bằng máy CEQ 8000XL (Beckman Coulter).
Quá trình được thực hiện như sau:
− Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng PCR Purification Kit (Quiagen, Santa Clarita)
− Phản ứng đánh dấu huỳnh quang đoạn DNA:
 96°C trong 15 giây
  50°C trong 5 giây
 60°C trong 4 giây
được thực hiện trên máy Gene Amp PCR Syctem 9600 thermocycler.
− Sản phẩm của phản ứng này sẽ được tinh sạch loại bỏ chất nhuộm màu bằng Dye
Terminator Removal (Quiage)
− Tiến hành giải trình tự DNA.
Kết quả giải trình tự đoạn gen glt A được phân tích bằng phần mềm Clustal V (DNASTAR) để
phân tích và so sánh những trình tự từ chủng đã phân lập với những chủng Bartonella hiện
có trong Genbank.(5),(6),(7).

KẾT QUẢ

1. Phân lập
Phân lập được 8 chủng vi khuẩn Bartonella trong tổng số 100 mẫu máu chuột. Trong đó có:
1 chủng phân lập từ S.murinus
2 chủng phân lập từ R. norvegicus
5 chủng phân lập được từ R. exullan

2. Xác định bằng PCR

Kết quả PCR khuếch đại đoạn gen glt A đã xác định các vi khuẩn phân lập được là Bartonella.

3. Phân tích kết quả giải trình tự DNA

Những chủng sau khi được xác định là Bartonella bằng kỹ thuật PCR được tiến hành giải trình tự
DNA và phân tích kết quả trên phần mềm Clustal V, sau đó so sánh với các trình tự của vi khuẩn
Bartonella có trong GenBank.
Kết quả: Tất cả các mẫu Bartonella phân lập được từ Việt nam đều nằm trong cùng một nhánh
song song với B. Elizabethae U28072 (phân lập trên bệnh nhân ở Massachusetts) và Bartonella
khác phân lập từ R.norvegicus (phân lập ở Lousiana) trong cây phát sinh loài của vi khuẩn
Bartonella.
Đáng chú ý, có một chủng phân lập từ S.murinus cho kết quả là chủng B.elizabethae (phần trăm
định danh là 96.7%).
http://www.sinhhocvietnam.com/vn/modules.php?
go=page&name=Pages1&pid=56

TẠO DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ĐOẠN ADN ĐẶC HIỆU THUỘC GEN CRY1AB TỪ
MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS KURSTAKI PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

Bùi Thị Hương, Nguyễn Thuỳ Châu

Bộ môn Vi Sinh, Viện Công Nghệ Sau Thu hoạch.
Đinh Duy Kháng
Phòng Vi Sinh Phân tử, Viện Công Nghệ Sinh học, Trung Tâm Khoa học Tự nhiên và
Công Nghệ Quốc gia.
I.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
I.1. Tách chiết ADN tổng số:
Tiến hành theo phương pháp của Sambrook và Maniatis [10]: các chủng B. thuringiensis
được lên men lắc trên môi trường LB ở 370C qua đêm. Ly tâm ở 6.000v /phút, thu cặn tế
bào. Bổ sung 567µ l TE(10:1), 30µ l SDS 10%, 3µ l proteinaza K, ủ ở 370C trong 1 giờ.
Bổ sung 180 µ l NaCl 5M, ủ ở 650C trong 10 phút. Bổ sung 800µ l chloroform, ly tâm ở
10000v/10phút, thu 600 µ l dịch nổi, bổ sung 300µ l chloroform và 300µ l phenol, trộn
đều rồi ly tâm 10.000v/10phút, thu 600µ l dịch nổi. Bổ sung 600µ l chloroform để loại
phenol, ly tâm 10000v/10phút, thu 400µ l dịch nổi. Bổ sung 40µ l NaOAC và 1ml cồn
100%, ủ ở - 200C sau 4 giờ, ly tâm 14000v/20phút, thu cặn ADN. Rửa lại với 1ml cồn
70% tiếp tục thu cặn bằng ly tâm 14000v/20phút. Sấy khô cặn trong tủ cấy vô trùng, loại
RNaza bằng cách bổ sung 20µ lTE-RNaza và ủ ở 370C/ 1 giờ.

Nồng độ ADN được xác định bằng phương pháp đo độ hấp phụ ở bước sóng 260 nm
(A260) và được tính bằng biểu thức:

A260 x 50 x hệ số pha loãng = µ g ADN/ml

Sau khi xác định nồng độ, ADN được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.

I.2. Nhân bản đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab bằng kỹ thuật PCR

Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25µ l đựng trong ống Eppendorf bao gồm
các thành phần: nước khử ion 13,6µ l, dNTP 2,5µ l, buffer 2,5µ l, primer 2µ l, enzim
Tag-polymeraza 0,4µ l, MgCl2: 2µ l, ADN 2µ l ( nồng độ 50ng/µ l).

Sử dụng cặp mồi TY6(5’-GGTCGTGGCTATATCCTTCGTGTCACAGC-3’) và

TY14(5’-GAATTGCTTTCATAGGCTCCGTC-3’) để nhân bản đoạn ADN đặc hiệu nằm
trong gen cry1Ab. Các sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trên gel agarose
1%
I.3. Tạo dòng đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry1Ab.

Tạo vectơ tái tổ hợp: tiến hành theo phương pháp của Sambrook và cs [10]: gắn trực tiếp
sản phẩm PCR được tạo ra ở mục I.2 vào vectơ tách dòng PCRTM 2.1. Phản ứng gắn
gồm: nước khử ion: 3µ l; Dung dịch đệm gắn: 1µ l; Sản phẩm PCR:3µ l; vectơ
PCRTM2.1: 2µ l; T4- ligaza: 1µ l. Ủ qua đêm ở nhiệt độ 140C. Sau đó biến nạp sản phẩm
gắn vào vi khuẩn E. coli chủng DH5α . Các khuẩn lạc E. coli chứa vectơ pCRTM 2.1 tái
tổ hợp được chọn lọc trên môi trường LB chứa ampixillin, IPTG (Isopropyl- β -D-
Thiogalactopyranoside) và X-gal. Sau đó tách chiết ADN plasmid từ tế bào vi khuẩn
bằng cách xử lý với dung dịch chứa NaOH, SDS để phá vỡ tế bào. Thu dịch nổi chứa
ADN plasmid, kết tủa bằng cồn rồi hoà lại cặn trong dung dịch đệm TE, ARN được loại
bằng RNaza nồng độ 100µ g/ml.
I.4. Phân tích trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab.
Sau khi tách chiết và tinh sạch vectơ tái tổ hợp từ tế bào chủ, gen được xác định trình tự
theo phương pháp enzim học của Sanger nhờ bộ kit của Hãng Amersham-Pharmacia
Biotech với máy xác định trình tự ADN tự động ALF-Express của Hãng Pharmacia. Phân
tích kết quả được tiến hành với chương trình PC/Gene.
II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN:
Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu 10 chủng B. thuringiensis var. kurstaki phân lập ở
Việt Nam nhận được từ bộ sưu tập chủng giống B. thuringiensis của Bộ môn Vi sinh,
Viện Công Nghệ Sau Thu Hoạch. Các chủng B. thuringiensis này đã được công bố là có
hiệu lực diệt đặc hiệu cao 100% đối với các loài sâu ngài gạo, và 90%-100% đối với sâu
tơ, sâu keo. Hiệu quả diệt giảm hơn đối với sâu khoang 80-90% và giảm hơn nữa trên đối
tượng sâu bông 50-60%.
II.1. Kiểm tra ADN của 10 chủng B. thuringiensis var. kurstaki bằng điện di trên gel
agarose 1%
ADN tổng số sau khi đã tách chiết từ 10 chủng B. thuringiensis var. kurstaki phân lập
được điện di trên gel agarose 1% với đệm TAE, sau đó nhuộm gel với Ethidium bromid
(EtBr). Gel được soi dưới ánh sáng tử ngoại, nếu ADN nguyên vẹn sẽ tạo thành một băng
sáng tập trung ở vị trí trên cùng của bản gel do chúng có kích thước và trọng lượng phân
tử lớn nên chạy chậm và ở vị trí cao nhất. Nếu ADN bị đứt gãy thành các đoạn có kích
thước nhỏ hơn thì chúng sẽ chạy nhanh hơn và tạo thành một dải sáng dài gồm nhiều
băng phân bố ở các vị trí khác nhau trên bản gel. Dựa vào hình ảnh điện di, chúng ta có
thể đánh giá chất lượng của các mẫu ADN được tách chiết.

Hình 1: Điện di trên gel agarose 1% kiểm tra

ADN TỔNG SỐ TÁCH TỪ CÁC CHỦNG B. THURINGIENSIS var. kurstaki phân lập:
từ kênh (1-10) theo thứ tự (47S, 50S, H22, H15, 29S, T58, H8, H3, 28S, H13 ).

Qua ảnh điện di ở hình 1 chúng tôi nhận thấy các mẫu ADN tổng số tách được từ 10
chủng B. thuringiensis kurstaki phân lập đều có một dải băng sáng tập trung rõ nét ở phía
trên của bản gel, không có các vạch phụ, các mẫu ADN tách được là nguyên vẹn và
không bị đứt gãy, đảm bảo chất lượng cho các nghiên cứu tiếp theo.
II.2. Nhân bản đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry1Ab từ các chủng B. thuringiensis
kurstaki phân lập bằng kỹ thuật PCR:
Tiến hành sử dụng cặp mồi: TY6 và TY14 để nhân bản đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen
cry1Ab của 10 chủng B. thuringiensis var. kurstaki phân lập và hai chủng chuẩn B.
thuringiensis var. kurstaki A1 và B. thuringiensis var. aizawai M1. Kết quả thể hiện ở
hình 2.
Kết quả ở hình 2 cho thấy: sản phẩm PCR thu được rất đặc hiệu, không có sản phẩm phụ.
Ở cả 10 chủng B. thuringiensis var. kurstaki phân lập có duy nhất một sản phẩm PCR đặc
hiệu vào khoảng 238 bp theo lý thuyết giống với sản phẩm PCR của chủng B.
thuringiensis var. kurstaki chuẩn (kênh 2, 4-13). Như vậy cả 10 chủng B. thuringiensis
var. kurstaki phân lập đã mang gen cry1Ab. Riêng chủng chuẩn B. thuringiensis aizawai
M1 không có sản phẩm PCR đặc hiệu, vì vậy chủng này không chứa gen cry1Ab.
 Hình 2. Điện di đồ sản phẩm PCR đặc hiệu của gen cry1Ab của các chủng B.
thuringiensis
phân lập và chủng B. thuringiensis chuẩn.

Chú thích: Kênh (1-2): chủng chuẩn B. thuringiensi var. aizawai M1, B. thuringiensis
var. kurstaki A1; Kênh 3: chỉ thị phân tử (ADN λ cắt bằng Hind III và EcoR I) từ trên
xuống (21226, 5148, 4973, 4277, 3530, 2027, 1904, 1584, 1330, 983, 831, 564 bp); kênh
(4-13) các chủng phân lập theo thứ tự (47S, 50S, H22, H15, 29S, T58, H8, H3, 28S, H13
II.3. Tạo dòng đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry1Ab từ chủng B. thuringiensis var.
kurstaki phân lập.
Tiến hành gắn sản phẩm PCR đặc hiệu của gen cry1Ab từ chủng B. thuringiensis var.
kurstaki H15 phân lập vào vectơ PCRTM2.1 để tạo vectơ tái tổ hợp. Sau đó biến nạp vectơ
tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH5α . Nhờ quá trình nhân lên của vi khuẩn mà vectơ tái
tổ hợp cũng được nhân theo. Sau đó tiến hành tách chiết và tinh sạch plasmid tái tổ hợp
từ vi khuẩn E. coli đã biến nạp. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng cách cắt với enzim giới
hạn EcoR I, sản phẩm cắt được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Kết quả được
thể hiện ở hình 3.

Hình 3. Điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra các plasmid tái tổ hợp mang sản phẩm
PCR đặc hiệu của gen cry1Ab cắt bằng EcoR I.

Chú thích: Kênh 1: sản phẩm PCR của đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab; Kênh 2,3,5:
Plasmid cắt bằng EcoR I ; Kênh 4: plasmid của khuẩn lạc xanh; Kênh 6: Chỉ thị phân tử
(ADN λ cắt bằng Hind III và EcoR I , từ trên xuống 21226, 5148, 4973, 4277, 3530,
2027, 1904, 1584, 1330, 983, 831, 564 bp).
 Kết quả ở hình 3 cho thấy: khi plasmid tái tổ hợp được cắt bởi enzim EcoR I đoạn ADN
đặc hiệu của gen cry1Ab được tách ra khỏi plasmid có kích thước đúng bằng với sản
phẩm PCR của đoạn ADN này ( Kênh 1 và 2, 3, 5). Kênh 2 cho thấy plasmid của khuẩn
lạc xanh không mang đoạn ADN ngoại lai, và chỉ có một băng duy nhất có kích thước
vào khoảng 3,9kb là trọng lượng phân tử của plasmid. Như vậy chúng tôi đã chọn được 3
dòng có đính sản phẩm PCR là đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab và được vi khuẩn E.
coli nhân lên theo mong muốn. Tuy nhiên để khẳng định một cách chắc chắn điều này,
cần xác định trình tự đoạn ADN đã được gắn vào vectơ.

II.4. Xác định trình tự nucleotid đoạn ADN đặc hiệu của gen cry 1Ab.

Kết quả ở hình 4 cho thấy: trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab tạo dòng từ
chủng B. thuringiensis var. kurstaki H15 phân lập được xác định có chiều dài 236 cặp
bazơ bao gồm số lượng các nucleotid như sau: 81A, 39 C, 62G, 54T.

Hình 4. Trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab tạo dòng từ chủng B. thuringiensis.
kurstaki H15 phân lập, đoạn ADN này dài 236 cặp bazơ.

II.5. So sánh trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab.

Chúng tôi đã tiến hành so sánh độ tương đồng giữa trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen
cry1Ab tạo dòng từ chủng B. thuringiensis var. kurstaki H15 phân lập ở Việt Nam so với
trình tự cùng đoạn gen này đã được công bố trong ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế, kết quả
được thể hiện ở hình 5.
 Hình 5. So sánh trình tự nucleotid giữa đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab tạo dòng từ
chủng B. thuringiensis var. kurstaki H15 phân lập ở Việt Nam (VNCRYIAb) và đoạn
ADN đặc hiệu của gen cry1Ab do Geiser và cs công bố trong Ngân hàng dữ liệu gen
Quốc tế (QTCRYIAb).
Kết quả ở hình 5 cho thấy trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab tạo dòng từ chủng
B. thuringiensis var. kurstaki H15 phân lập của Việt nam có độ tương đồng cao so với
đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab do Geiser và cs công bố năm 1986 trong Ngân hàng
dữ liệu gen Quốc tế mã số ACM 15271. Độ tương đồng đạt 98,73%. Chúng chỉ khác
nhau bởi 3 nucleotid, đó là các nucleotid ở vị trí thứ 84, 167, 222.
http://www.sinhhocvietnam.com/vn/modules.php?
name=Pages1&go=page&pid=58

TINH CHẾ LECTIN TỪ HẠT ĐẬU LĂNG (LENS CULINARIS, L.) BẰNG SẮC KÍ ÁI LỰC
SEPHADEX – G75

Đỗ Ngọc Liên, Phạm Tuấn Anh

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Nguyễn Văn Lợi, Đào Kim Chi
Trường Đại học Dược Hà Nội

ĐẶT VẤN ĐỀDịch chiết bằng đệm của hạt đậu lăng (Lens culinaris, L.) lần đầu tiên
được Landsteiner và Raubitchek (1907) thông báo là có hoạt động ngưng kết hồng cầu,
sau này lectin của hạt đậu lăng châu Âu (LCA) đã được một số nhà khoa học tinh chế và
được sử dụng trong nghiên cứu y sinh học và miễn dịch (6). Mới đây LCA tinh khiết đã
được Taketa và cộng sự sử dụng làm nguyên liệu tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán miễn dịch
dấu hiệu AFP trong ung thư biểu mô tế bào gan nhằm phân biệt với bệnh viêm gan siêu
vi trùng thông thường (7).
Ở Việt Nam đậu lăng cũng đã được trồng nhập nội và sử dụng từ thời Pháp thuộc (1)
nhưng chưa có tài liệu nào công bố về khả năng khai thác nguồn tài nguyên lectin quý
hiếm này dùng cho nghiên cứu sinh y học và miễn dịch. Xuất phát từ ý tưởng đó chúng
tôi bước đầu thực hiện công việc nghiên cứu tinh chế lectin đậu lăng (LCA) và quy trình
thử nghiệm chế tạo bộ sinh phẩm lectin dùng trong chẩn đoán y học.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Hạt đậu lăng khô được mua ở siêu thị là sản phẩm tiêu dùng trong thực phẩm ở nước ta
cũng như nhiêù nước trên thế giới, đã được định tên khoa học là Lens culinaris, L, (theo
Tiến sĩ phân loại học Nguyễn Đăng Khôi), được bóc vỏ cứng và nghiền thành bột mịn.
Hồng cầu các nhóm máu được Viện huyết học truyền máu Trung ương và bệnh viện
Bạch Mai cung cấp đã xác định là không có yếu tố vi sinh vật truyền bệnh. Việc xác định
hoạt tính ngưng kết hồng cầu (HAA), biểu thị cho hoạt tính lectin được thực hiện thường
quy ở phòng thí nghiệm sinh y học thuộc Trung tâm sinh học phân tử và công nghệ tế
bào, ĐHQG Hà nội như đã mô tả trước đây(2,6). Các phương pháp xác định hàm lượnh
protein theo Lowry (5), kiểm tra đáng giá mức độ tinh sạch của chế phẩm lectin tinh chế
được thực hiện theo kỹ thuật điện di gel polyacrylamid ( SDS-PAGE) của Laemmli như
đã mô tả trước đây (4). Việc tinh chế lectin đậu lăng đã được hoàn thiện nhờ kỹ thuật sắc
ký ái lực trên cột Sephadex G-75 (3).
3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.
3.1 Hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin đậu lăng
Sau khi chiết rút LCA từ bột hạt bằng đệm phốtphát chứa NaCl 1M, có CaCl2 và MnCl2
1mM, chúng tôi tiến hành xác định hoạt tính ngưng kết hồng cầu và hàm lượng protein
trong dịch chiết. Kết quả được thể hiện ở bảng 1.

Bảng 1 : Hàm lượng Protein và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của dịch chiết đậu lăng

Kết quả trình bày ở bảng 1 cho thấy LCA thể hiện hoạt tính cao nhất ở nhóm máu A.
Trong các thí nghiệm tiếp theo chúng tôi chỉ tiến hành thử hoạt độ ngưng kết với hồng
cầu nhóm máu A.
3.2. Tinh chế lectin đậu lăng
a) Dùng HCl 1M điều chỉnh pH dịch chiết về 4,5 để loại protein không có hoạt tính. Sau
khi li tâm, điều chỉnh pH về trung tính bằng NaOH 1M.
b) Kết tủa phân đoạn protein đậu lăng bằng (NH4)2SO4 75% bão hoà.
Sử dụng dung dịch muối trung tính (NH4)2SO4 ở trên đã kết tủa toàn bộ protein - lectin
trong dịch chiết. Điều này được chứng minh là HAA ở dịch nổi sau kết tủa hầu như
không có. Như vậy nồng độ (NH4)2SO4 75% bão hoà đựơc sử dụng là thích hợp nhất để
kết tủa thuận nghịch lectin.
c)Tinh sạch lectin đậu lăng qua cột sắc kí ái lực Sephadex G-75 :
Phần kết tủa lectin bằng (NH4)2SO4 được thu lại và hoà trong đệm phốtphát và thẩm tích 3
lần sau đó sẽ nạp vào cột sắc ký ái lực Sephadex G75 ( kích thước 2x20 cm) đã cân bằng
với đệm chứa NaCl 1M, có CaCl2 và MnCl2 1mM. Phản hấp phụ bằng dung dịch đệm
photphat chứa NaCl 1M, bổ sung glucose 1M và EDTA 1mM. Thu phân đoạn 3 ml, tốc
độ chảy 20 ml/h. Xác định hàm lượng protein ở các phân đoạn. Dồn các phân đoạn có
hàm lượng protein cao, thẩm tích và đông khô ở – 45oC trong 8 giờ. Toàn bộ kết quả tinh
chế được thể hiện trên bảng 2.

Bảng 2: Tóm tắt kết quả tách chiết và tinh chế lectin đậu Lens culinaris

Kết quả ở bảng 2 cho thấy từ 2g (2000 mg) bột hạt đậu lăng (Lens culinaris L.), qua quá
trình tách và tinh chế chúng tôi thu được 0.42 mg LCA tinh khiết, hiệu suất thu hồi hoạt
độ 5% và độ sạch tăng lên 57.69 lần. Mặc dù LCA đã được tinh chế có độ sạch tăng lên
rất cao nhưng khả năng thu hồi lectin còn thấp. Do đó đây là một vấn đề đặt ra cho chúng
tôi là cần phải tiếp tục nghiên cứu để tăng hiệu suất của quá trình tinh chế.
3.3.Kiểm tra độ tinh sạch của LCA:
Chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide để kiểm tra độ tinh sạch
của lectin đậu lăng và xác định trọng lượng phân tử của lectin này. Kết quả thể hiện ở hì

Hình 1: Ảnh kết quả điện di các chế phẩm LCA trên gel polyacrylamid

- Dãy 1: Chế phẩm lectin đậu lăng đã tinh chế qua cột ái lực Sephadex G75 thể hiện
chủ yếu 1 băng có khối lượng phân tử xấp xỉ 25 KDa, một băng nhỏ có khối lượng xấp xỉ
12 KDa
- Dãy 2: Dịch nổi sau khi kết tủa dịch chiết đậu lăng bằng (NH4)2SO4 75% bão h

Dãy 3: Dịch chiết bằng đệm của bột đậu lăng chưa qua tinh sạch.
- Dãy 4: Các protein tiêu chuẩn gồm: BSA(66 kDa), Ovalbumin (45kDa), Lyzozym
 (14,3 kDa)
Qua ảnh điện di chúng tôi thấy lectin đậu lăng đã tinh chế qua sắc kí ái lực Sephadex G-
75 có hai băng, trọng lượng phân tử khoảng 25 kDa và 12 KDa. Trong đó băng 25 KDa
chiếm ưu thế (đậm hơn nhiều so với băng 12 KDa). Việc tính toán khối lượng phân tử
được thực hiện theo kỹ thuật của Laemmli với việc xây dựng đường đồ thị các protein
tiêu chuẩn đã biết trước khối lượng phân tử (3,4). Kết quả này phù hợp với các nghiên
cứu trước đây của nhiều tác giả cho rằng phân tử LCA có thể bao gồm 2 chuỗi α và 2
chuỗi β có khối lượng tương đương từ 24 kDa và từ 10-12 kDa. Phân tử LCA có thể kết
hợp giữa các chuỗi α và β để hình thành các mức độ khối lượng phân tử từ 25 kDa đến
45 kDa (6). Điều quan trọng là lectin đậu lăng sau khi được chúng tôi tinh chế có mức độ
tinh sạch cao có thể so sánh với thương phẩm ngoại nhập với giá mua vào rất đắt (610
USD cho 100 mg chế phẩm của hãng Sigma năm 2001), vẫn đảm bảo hoạt tính sinh học
ở điều kiện bảo đảm tiêu chuẩn.
Quy trình tinh chế LCA được mô tả tóm tắt theo sơ đồ sau:

KẾT LUẬN

1. Lectin từ hạt đậu lăng (Lens culinaris L.) không gây ngưng kết hồng cầu đặc hiệu
nhóm máu, tuy nhiên hoạt độ ngưng kết hồng cầu nhóm máu A là cao nhất so với các
nhóm máu khác.
2. Sử dụng dung dịch đường glucose 1M/NaCl 1M, EDTA 1mM là thích hợp cho việc
phản hấp phụ LCA ra khỏi cột sắc ký ái lực Sephadex G-75.

3. Bằng kỹ thuật sắc ký ái lực trên cột Sephadex G-75 đã tinh chế được LCA có độ tinh
khiết cao. Chế phẩm LCA thu được có độ sạch tăng 57,69 lần, hiệu suất thu hồi 0,52%.

4. Kết quả điện di chế phẩm LCA tinh sạch trên gel polyacrylamide chỉ phát hiện được 2
băng protein có khối lượng phân tử khoảng 25 KDa và một băng nhỏ khoảng 12 KDa
Đề tài này được hỗ trợ kinh phí của chương trình nghiên cứu khoa học cơ bản Nhà nước
do Bộ khoa học và công nghệ quản lý.
http://www.sinhhocvietnam.com/vn/modules.php?go=page&name=Pages1&pid=77

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR KHẢO SÁT SƠ BỘ TẦN SUẤT PHÂN BỐ CÁC ALEN CỦA
LOCUS D7S820 Ở NGƯỜI VIỆT NAM
Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn,Lương Thị Yến, Lê thị Bích Trâm.
Cục Kỹ thuật Hóa-Sinh và Tài liệu nghiệp vụ, Tổng cục KHKT & CN- Bộ Công an
Nhận dạng cá thể bằng kỹ thuật phân tích ADN trong công tác hình sự là một phương
pháp được quan tâm và đi sâu nghiên cứu từ nhiều năm nay bởi các nhà khoa học ở nhiều
nước trên thế giới. So với các phương pháp trước đây, phương pháp này có nhiều ưu
điểm nổi bật như khắc phục được tình trạng số lượng mẫu quá ít, mẫu bị suy giảm
nghiêm trọng do tác động của môi trường và sự che dấu của thủ phạm. Mặt khác, phương
pháp phân tích ADN còn cho kết quả với độ chính xác cao, nếu sử dụng từ 6 đến 9 đoạn
gen sẽ cho một kết quả gần như tuyệt đối [9].
Ở Việt Nam đã có những nghiên cứu về các locus gen đa hình như D1S80 [1], TH01
[1,4], TPOX [3], D17S5 và ApoB [1]... Trên thế giới, khoảng 12 locus đã được sử dụng
rộng rãi trong y học hình sự như TH01, TPOX, D5S818, D7S820... Các locus được lựa
chọn này đều mang các alen có trình tự lặp lại ngắn (kích thước cách nhau 4bp). So với
các đoạn ADN có trình tự lặp lại dài, đoạn lặp lại ngắn có khả năng ít bị biến tính nên rất
có ích lợi trong công tác giám định.
Tại Phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử - Cục Kỹ thuật Hoá-Sinh và Tài liệu nghiệp vụ-
Tổng cục VI-Bộ Công an, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR khảo
sát sơ bộ tần suất phân bố các alen của locus D7S820 ở một nhóm cá thể người Việt Nam
phục vụ công tác nhận dạng cá thể.
I. Phương pháp nghiên cứu
1. Nguyên liệu:
- Máu tươi của những người khoẻ mạnh không có cùng quan hệ huyết thống do Viện
Quân y 108 cung cấp.
- Hoá chất: Hoá chất cho tách chiết ADN (hãng Sigma); hoá chất dùng cho quá trình PCR
đối với locus D7S820 (mồi đặc hiệu cho locus D7S820 của hãng Pharmacia-Thuỵ Điển;
Taq ADN polymeraza-của Viện Sốt rét Ký sinh trùng và Côn trùng Trung ương); hoá
chất dùng cho điện di và nhuộm băng ADN (của các hãng Promega, Pharmacia, Sigma,
MERCK).
2. Phương pháp:
a. Tách ADN:
ADN từ máu được tách chiết theo phương pháp chuẩn dùng phenol và chloroform để tinh
sạch [4]. Kết quả tách chiết thu được ADN có độ tinh sạch khá cao với OD trung bình
1,75 và hàm lượng >50ng/µ l.
b. Kỹ thuật PCR:
Quá trình PCR với các giai đoạn cơ bản: biến tính, gắn mồi và tổng hợp. Quá trình được
thực hiện với các nhiệt độ gắn mồi khác nhau được lựa chọn từ 50oC đến 58oC. Sản phẩm
PCR sau đó được kiểm tra trên gel agaroza 2%, nhuộm ethidium bromide (25µ g/ml).
c. Kỹ thuật điện di:
Các mẫu sau khi thực hiện quá trình PCR đã được kiểm tra trên gel agaroza 2% sau đó
được điện di trên gel polyacrylamide 6% sử dụng ure 7M. Băng ADN được phát hiện
bằng phương pháp nhuộm bạc của Bassam, 1991 [6].
d. Phương pháp chọn lọc và xây dựng thang alen
* Đánh số alen theo quy ước riêng: Dựa vào các alen quan sát được của các mẫu khác
nhau trên bản điện di, chúng tôi chọn ra các mẫu mang các alen khác nhau và đánh số
alen theo thứ tự từ dưới lên trên (đánh số alen từ băng ADN có trọng lượng phân tử thấp
nhất đến băng ADN có trọng lượng phân tử cao nhất). Việc đánh số ở đây chỉ mang tính
quy ước sao cho mỗi alen xác định được có ký hiệu riêng, vì đây là quá trình khảo sát ban
đầu chưa có thang alen chuẩn để so sánh.
* Xây dựng thang alen: Trong quá trình đánh số, chúng tôi đồng thời chọn ra những mẫu
mang những alen khác nhau tập hợp lại để tạo thang alen. Thang alen được tạo bằng
phương pháp trộn mẫu.
* Chuẩn thang alen: ký hiệu lại các alen đã khảo sát được theo quy ước quốc tế. Alen của
locus D7S820 được ký hiệu từ 6 đến 14 căn cứ vào số đoạn lặp của mỗi alen.
Chúng tôi tiến hành chuẩn thang alen như sau: lấy kết quả tần suất alen tính được so
sánh với tần suất alen đã khảo sát bằng thang alen chuẩn ở một nhóm người Đông Nam
Á. Chuẩn trước hai alen theo tần suất tương đương (thường chọn alen có tần suất lớn nhất
và nhỏ nhất), từ đó ký hiệu lại các alen khác theo alen đã chuẩn.
II. Kết quả và bàn luận
1. Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi quá trình PCR :
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR ở các nhiệt độ gắn mồi khác nhau cho thấy: ở tất
cả các điều kiện nhiệt độ gắn mồi từ 50oC đến 58oC đều có sự hình thành sản phẩm PCR
thể hiện ở sự có mặt của các băng ADN trên bản gel agaroza. Tuy nhiên, ở nhiệt độ gắn
mồi 50oC, 52oC, 54oC và 56oC băng ADN xuất hiện mờ hơn hẳn so với ở nhiệt độ gắn
mồi 58oC. Điều này chứng tỏ ở nhiệt độ gắn mồi 58oC, quá trình PCR là tối ưu nhất (sản
phẩm tạo ra nhiều nhất so với các nhiệt độ gắn mồi còn lại). Vì vậy, điều kiện đã tối ưu
này được chúng tôi sử dụng để thực hiện quá trình PCR đối với các mẫu nghiên cứu (hình
1).
 Hình 1. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR ở một số mẫu trên gel agaroza theo điều kiện
nhiệt độ gắn mồi 58oC

2. Kết quả chọn lọc alen và tạo thang alen :

Sử dụng các phương pháp đã nêu chúng tôi đã tạo được thang alen chuẩn cho locus
D7S820. Thang alen này (ký hiệu L) bao gồm 7 alen khác nhau (hình2) được ký hiệu từ
alen số 1 đến alen số 7.

Hình 2. Thang alen chuẩn của locus D7S820 với 7 alen khác nhau được phân tách bằng
kỹ thuật điện trên gel PA biến tính.

3. Kết quả tính tần suất alen của locus D7S820:

Căn cứ vào thang alen đã tạo được ở trên, chúng tôi đã xác định và tính tần suất alen của
64 mẫu ADN khác nhau. Đồng thời, chúng tôi cũng so sánh tần suất tính được với tần
suất tương đương của người Việt Nam đã được khảo sát [1].
* Kết quả tính toán và so sánh tần suất và chuẩn alen như sau:

Trong số 64 mẫu chúng tôi đã khảo sát, có 61 mẫu đã xác định được alen, trong đó:
- Số cá thể đồng hợp tử : 16 (chiếm 26,2%)

- Số các thể dị hợp tử : 45 (73,8%)

- Số alen xác định được : 7 alen (ký hiệu từ alen số 7 đến alen số 13).

- Alen có tần suất cao nhất là alen số 11 (32%)

- Alen có tần suất thấp nhất là alen số 7 (0,8%).

- Chưa phát hiện thấy alen số 14. Số mẫu mà chúng tôi khảo sát bước đầu còn ít nên có
thể chưa phát hiện được alen này.

Với tần số khảo sát alen số 7 là 0,8% và chưa phát hiện thấy alen số 14 trong số 122 alen,
có thể coi alen số 7 và 14 là các alen hiếm của locus D7S820 ở người Việt Nam.

III. Kết luận

1. Đã tối ưu được điều kiện PCR đối với locus D7S820 với điều kiện nhiệt độ gắn mồi là
58oC.

2. Đã xây dựng được thang alen cho locus di truyền D7S820 với 7 alen khác nhau.

4. Đã khảo sát sơ bộ tần suất alen của locus D7S820 ở 64 mẫu ADN người Việt Nam dựa
vào thang alen tạo được. Tần suất khảo sát thu được cao nhất ở alen số 11 và thấp nhất ở
alen số 7. Alen số 14 chưa thấy xuất hiện trong số mẫu đã khảo sát.

Kết quả khảo sát tần suất của locus D7S820 sẽ góp phần phục vụ công tác nhận dạng cá
thể người và tiến tới làm tàng thư ADN ở người Việt nam.

5. Với kết quả trên, trong thời gian tiếp theo, chúng tôi mong muốn:
- Nghiên cứu tạo thang alen bằng kỹ thuật PCR sử dụng phương pháp trộn ADN khuôn.
- Tiến hành khảo sát bổ xung để xây dựng được bảng phân bố tần suất các alen của locus
D7S820 ở các mẫu ADN người Việt Nam.
- Tiếp tục khảo sát tần suất các alen đối với các locus ADN đa hình khác để tăng khả
năng phân biệt cá thể ở người Việt Nam.http://botanyvn.com/cnt.asp?
param=news&newsid=503

Định vị các gen kháng rầy nâu bph4 và bph6 trên nhiễm sắc thể lúa
Cập nhật ngày 4/12/2008 lúc 4:22:00 PM. Số lượt đọc: 138.

Cho đến nay vẫn chưa có công trình nào xác định xem gen Bph6 nằm trên nhiễm sắc thể
nào. Còn việc định vị gen bph4 trên nhiễm sắc thể thì lại không có sự thống nhất giữa các
nhà khoa học: gen bph4 nằm trên nhiễm sắc thể số 4 qua phân tích di truyền (Sidhu and
Khush, 1978), hoặc trên nhiễm sắc thể số 6 dựa theo phương pháp chỉ thị phân tử
Mở đầu

Rầy nâu là côn trùng gây hại lớn nhất đối với cây lúa ở nước ta cũng như các nước trồng
lúa khác. Sử dụng giống lúa kháng rầy là biện pháp quan trọng được các nhà chọn giống
quan tâm. Việc sử dụng giống kháng một mặt làm giảm thiệt hại năng suất, tiết kiệm chi
phí phòng trừ, mặt khác hạn chế được việc dùng thuốc hoá học gây ô nhiễm môi trường
và góp phần ổn định môi trường sinh thái. Do vậy việc chọn tạo nhanh chóng những
giống lúa vừa có năng suất cao, chất lượng tốt, lại mang nhiều gen kháng là công việc
được quan tâm không chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiều quốc gia khác. Với sự phát triển
mạnh mẽ của công nghệ chỉ thị phân tử, các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm nhiều hơn
tới vấn đề “chọn giống nhờ chỉ thị phân tử” (Marker-assisted selection) với ý đồ sử dụng
các chỉ thị phân tử liên kết với các gen mong muốn trong chọn tạo giống mới. Như vậy
việc tìm các chỉ thị phân tử liên kết gần với gen quan tâm và lập bản đồ các gen đó trên
nhiễm sắc thể mang ý nghĩa lý thuyết và thực tiễn sâu sắc.

Đối với đặc tính kháng rầy, đến nay người ta đã tìm được khoảng trên 10 gen kháng
chính (major genes) và một số gen kháng phụ khác (minor genes hay QTLs) dựa vào sự
khảo sát phản ứng của các giống lúa đối với các biotype rầy nâu cũng như các thí nghiệm
phân tích di truyền và lập bản đồ phân tử (Sidhu and Khush, 1978; Ikeda, 1985; Ishii et
al., 1994; Lưu Thị Ngọc Huyền và ctv, 2001). Trong công trình trước (Thiều Văn Đường
và ctv, 2000) đã xác định các gen kháng rầy nâu bph4 ở dòng lúa DG5 và Bph6 ở dòng
lúa GC9 kháng khá hiệu quả đối với quần thể rầy nâu ở đồng bằng sông Hồng và đồng
bằng sông Cửu Long. Cho đến nay vẫn chưa có công trình nào xác định xem gen Bph6
nằm trên nhiễm sắc thể nào. Còn việc định vị gen bph4 trên nhiễm sắc thể thì lại không
có sự thống nhất giữa các nhà khoa học: gen bph4 nằm trên nhiễm sắc thể số 4 qua phân
tích di truyền (Sidhu and Khush, 1978), hoặc trên nhiễm sắc thể số 6 dựa theo phương
pháp chỉ thị phân tử (Kawaguchi et al, 2001).

Công trình này được đặt ra với mục đích định vị các gen bph4 và Bph6 trên nhiễm sắc thể
của lúa, sử dụng kỹ thuật chỉ thị phân tử vi vệ tinh (SSR).
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Vật liệu
- DG5: dòng lúa kháng rầy nâu mang gen kháng bph4; GC9: dòng lúa kháng rầy nâu
mang gen kháng Bph6; TN1: giống lúa nhiễm rầy nâu.
- Quần thể F2 và F3 từ 2 tổ hợp lai TN1xDG5 và TN1xGC9.
- Mồi SSR đặt từ hãng Genset của Mỹ.
- Hoá chất nhuộm bạc của hãng Promega.
- Các vật liệu hóa chất khác sử dụng trong nghiên cứu được mua từ các hãng Sigma,
Biorad (Mỹ), Pharmacia (Thụy điển), Boehringer (Đức).
Phương pháp
- ADN của TN1, DG5, GC9 và các cá thể F2 được tách và tinh sạch theo phương
pháp CTAB (Phòng Thí nghiệm Di truyền học, Trường ĐHTH Ghent, Bỉ).
- Kiểu gen kháng nhiễm rầy nâu của các cá thể F2 (kháng đồng hợp, nhiễm đồng
hợp và dị hợp) được xác định dựa theo kết quả thử rầy trên các họ F3.
- Phân tích thể phân ly nhóm theo Michelmore và ctv (1991).
- Kỹ thuật SSR được thực hiện theo phương pháp của Phòng thí nghiệm Khoa học
Thực vật và Thổ nhưỡng, Trường ĐHTH Texas Tech, Hoa Kỳ.
- Sản phẩm phản ứng PCR được điện di trên gel polyacrylamide 4,5%. Phát hiện
băng ADN bằng phương pháp nhuộm bạc.
- Các dữ liệu kiểu gen kháng nhiễm rầy được kết hợp với dữ liệu SSR để phân
tích nhóm liên kết và lập bản đồ phân tử theo chương trình MapMaker.
Kết quả và thảo luận
Phân tích thể phân ly nhóm
a/ Quần thể TN1xDG5
Từ thí nghiệm sử dụng 108 chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng di truyền của 6 dòng,
giống lúa trong công trình trước (Thiều Văn Đường và ctv, 2001), chúng tôi chọn ra
được 50 chỉ thị SSR (bảng 1) được xác định là cho đa hình SSR giữa TN1 và DG5 để
sử dụng trong thí nghiệm xác định nhóm liên kết của gen bph4. Phương pháp phân
tích thể phân ly nhóm (BSA) kết hợp với phương pháp phân tích SSR được áp dụng.
Từ thí nghiệm đánh giá tính kháng rầy ở các họ F3, chúng tôi suy ra các kiểu gen
kháng đồng hợp, nhiễm đồng hợp và dị hợp đối với từng cá thể F2. Từ đó chọn ra 20
cây kháng đồng hợp và 20 cây nhiễm đồng hợp. Tiếp theo, 40 cây này (gồm 20 cây
nhiễm hoàn toàn và 20 cây kháng hoàn toàn) được sử dụng để lập thành hai nhóm
kháng hoàn toàn R1, R2 và hai nhóm nhiễm hoàn toàn S1, S2. Sau đó, ADN của
TN1, DG5 và 4 nhóm này đã được làm phản ứng PCR với 50 cặp mồi SSR, chạy gel
polyacrylamide và nhuộm bạc. Kết quả phân tích thể phân ly nhóm với 50 cặp mồi
SSR cho thấy chỉ có 1 số chỉ thị SSR trên nhiễm sắc thể số 4 như RM335, RM261,
RM185, RM273... dường như có liên kết với lôcut gen bph4 (2 nhóm kháng có băng
ADN gần tương tự như DG5, còn 2 nhóm nhiễm có băng ADN gần tương tự như
TN1). Còn tất cả các chỉ thị còn lại trên các nhiễm sắc thể khác đều không liên kết
với lôcut gen bph4 do tất cả 4 nhóm kháng nhiễm đều cho 2 băng (dị hợp tử) - 1 băng
đặc thù cho cây bố, còn băng kia đặc thù cho cây mẹ.
b/ Quần thể TN1xGC9
Tương tự như đối với quần thể TN1xDG5, trong trường hợp quần thể TN1xGC9 chúng
tôi chọn ra 51 chỉ thị SSR (bảng 2) được xác định là cho đa hình SSR giữa TN1 và GC9
để sử dụng trong thí nghiệm xác định nhóm liên kết của gen Bph6. Phương pháp phân
tích thể phân ly nhóm kết hợp với phương pháp phân tích SSR được áp dụng. Cũng giống
như thí nghiệm trên, chúng tôi chọn ra 20 cây kháng đồng hợp và 20 cây nhiễm đồng
hợp. Tiếp theo 40 cây này (gồm 20 cây nhiễm hoàn toàn và 20 cây kháng hoàn toàn)
được sử dụng để lập thành hai nhóm kháng hoàn toàn R1, R2 và hai nhóm nhiễm hoàn
toàn S1, S2. Sau đó, ADN của TN1, DC9 và 4 nhóm này đã được làm phản ứng PCR với
51 cặp mồi SSR (bảng 2), chạy gel polyacrylamide và nhuộm bạc. Kết quả phân tích thể
phân ly nhóm với 51 cặp mồi SSR cho thấy chỉ có 1 số chỉ thị SSR trên nhiễm sắc thể số
4 như RM185, RM119, RM317... dường như có liên kết với lôcut gen Bph6 (2 nhóm
kháng có băng ADN gần tương tự như GC9, còn 2 nhóm nhiễm có băng ADN gần tương
tự như TN1). Còn tất cả các chỉ thị còn lại trên các nhiễm sắc thể khác đều không liên kết
với lôcut gen Bph6 do tất cả 4 nhóm kháng nhiễm đều cho 2 băng (dị hợp tử).
Phân tích SSR với các cá thể F2
a/ Quần thể TN1xDG5
Tiếp theo, chúng tôi làm thí nghiệm phân tích SSR cho 108 cá thể F2, sử dụng các cặp
mồi PCR là các chỉ thị RM335, RM261, RM185, RM119 trên nhiễm sắc thể số 4 của lúa.
Kết quả cho thấy đa số các cá thể kháng có băng ADN tương tự như băng ADN có ở cây
DG5, và đa số các cá thể nhiễm có băng ADN tương tự như băng ADN ở cây TN1, còn
các cây dị hợp cho 2 băng ADN giống như ở DG5 và TN1 (hình 1).
b/ Quần thể TN1xGC9
Tương tự như trên, các phân tích SSR cho 110 cá thể F2 đã được tiến hành, sử dụng các
cặp mồi PCR là các chỉ thị RM185, RM119, RM317, RM349 trên nhiễm sắc thể số 4.
Kết quả cho thấy đa số các cá thể kháng có băng ADN giống như băng ADN có mặt ở
cây GC9, và đa số các cá thể nhiễm có băng ADN giống như băng ADN có ở cây TN1,
còn các cây dị hợp cho 2 băng ADN giống như ở GC9 và TN1 (hình 2).
Định vị các gen kháng rầy nâu bph4 và Bph6 trên nhiễm sắc thể lúa
a/ Định vị gen bph4 trên nhiễm sắc thể lúa
Các dữ liệu kiểu gen theo các chỉ thị RM335, RM261, RM185 và RM119 được phối hợp
với dữ liệu kiểu gen kháng nhiễm (kháng đồng hợp, nhiễm đồng hợp và dị hợp) ở 108 cá
thể F2 của tổ hợp lai TN1xDG5 rồi được đưa vào chương trình MapMaker trên máy tính
để phân tích. Với LOD = 3 và Max. distance = 50, các chỉ thị RM335, RM261, RM185
và RM119 đều liên kết với lôcut bph4. Như vậy nhóm liên kết của gen kháng rầy nâu
bph4 bao gồm 4 chỉ thị SSR: RM335, RM261, RM185 và RM119 với tổng chiều dài là
87,1 cM trên nhiễm sắc thể số 4. Lôcut bph4 nằm giữa 2 chỉ thị RM335 và RM261 (gần
với RM261 hơn). Vị trí lôcut gen bph4 cách chỉ thị RM335 là 32 cM, và cách chỉ thị
RM261 là 11,1 cM. (Chú ý: chỉ thị RM335 nằm không xa đầu mút trên của NST số 4).
Từ các kết quả trên chúng tôi xác định được vị trí của gen kháng rầy nâu bph4 trên nhiễm
sắc thể số 4 của lúa (xem hình 3).
b/ Định vị gen Bph6 trên nhiễm sắc thể lúa
Các dữ liệu của 110 cá thể F2 của tổ hợp lai TN1xGC9, bao gồm kiểu gen theo các chỉ
thị RM185, RM119, RM317 và RM349 được phối hợp với kiểu gen kháng nhiễm (kháng
đồng hợp, nhiễm đồng hợp và dị hợp) rồi đưa vào chương trình MapMaker trên máy tính
để phân tích. Với LOD = 3 và Max. distance = 50, các chỉ thị RM185, RM119, RM317
và RM349 đều liên kết với lôcut Bph6. Như vậy nhóm liên kết của gen kháng rầy nâu
Bph6 bao gồm 4 chỉ thị SSR (RM185, RM119, RM317, RM349) với tổng chiều dài là
125,2 cM trên nhiễm sắc thể số 4. Lôcut Bph6 nằm giữa 2 chỉ thị RM119 và RM317. Vị
trí lôcut gen Bph6 cách chỉ thị RM119 là 24,4 cM, và cách chỉ thị RM 317 là 21,1 cM.
(Chú ý: chỉ thị RM119 nằm không xa tâm động của NST số 4). Từ các kết quả trên chúng
tôi xác định được vị trí của gen kháng rầy nâu Bph6 trên nhiễm sắc thể số 4 của lúa (xem
hình 4).
Kết luận

Như vậy, theo kết quả nêu trên, cả 2 gen kháng rầy nâu bph4 và Bph6 đều được định vị
trên nhiễm sắc thể số 4. Trong trường hợp gen bph4, kết quả này phù hợp với kết luận
của Sidhu và Khush (1978), nhưng mâu thuẫn với kết luận của Kawaguchi và cộng sự
(2001) vốn cho rằng bph4 nằm trên nhiễm sắc thể số 6. Còn đối với gen Bph6, công trình
này là công trình đầu tiên định vị nhiễm sắc thể cho gen này.

http://svdanang.com/@f/archive/index.php?t-935.html

NGHIÊN CỨU THU NHẬN, TINH SẠCH UREASE TỪ ĐẬU NÀNH

Lê Thị Phú, Nguyễn Thị Cẩm Vi, Nguyễn Tấn Đạt
Trường Đại học Bán công Tôn Đức Thắng
(Bài nhận ngày 28 tháng 02 năm 2006, hoàn chỉnh sửa chữa ngày 14 tháng 08 năm 2006)
TÓM TẮT: Trong nghiên cứu này chúng tôi đã so sánh các phương pháp tinh sạch sơ bộ
enzym urease: tủa phân đoạn sunfat amon, tủa bằng aceton, sắc ký rây phân tử và siêu lọc.
Dựa vào kết quả xác định độ tinh sạch, hiệu suất tinh sạch enzym và kết quả kiểm tra độ tinh
sạch bằng điện di trên gel acrylamid chúng tôi nhận thấy phương pháp tủa phân đoạn sunfat
amon nồng độ 65% và 55% bão hoà hiệu quả nhất. Tiếp tục thực hiện tinh sạch qua sắc ký trao
đổi ion DEAE – cellulose, sắc ký đồ cho thấy có 3 peak protein và chỉ có một peak enzym
urease ứng với nồng độ muối 0,3 M. Thu nhận peak enzym, kiểm tra trên điện di gel acrylamid
đã xác định được urease đậu nành là một loại homogeneous. Kết quả điện di cũng đã chứng
minh quy trình tinh sạch do chúng tôi xây dựng đã tinh sạch được enzym urease.
1.MỞ ĐẦU
Urease là một loại enzym thuỷ phân ure hình thành NH3 và CO2, được ứng dụng rất nhiều
trong Y học và Công nghiệp thực phẩm để định lượng ure trong các mẫu bệnh phẩm và nước
chấm. Trước đây, đã có rất nhiều nghiên cứu về enzym urease và đã đưa ra nhiều phương pháp
tinh sạch urease, tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào so sánh giữa các phương pháp tinh sạch
khác nhau. Ở nước ta, cũng đã có một số nghiên cứu tinh sạch enzym urease từ đậu nành nhưng
cũng chưa đưa được quy trình tinh sạch hiệu quả và chưa được ứng dụng trong sản xuất chế
phẩm urease. Ngành Y học và Thực Phẩm ở nước ta hiện nay vẫn phải nhập chế phẩm urease
và kit urease từ nước ngoài với giá thành rất cao.
Do đó chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm tìm ra một quy trình tinh sạch urease hiệu quả
nhất từ đậu nành, một nguồn nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm. Đồng thời sử dụng phương pháp
điện di trên gel acrylamid để nghiên cứu thành phần enzym urease từ đậu nành.
2.NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.Nguyên liệu
- Đậu nành loại bỏ các hạt xấu, bỏ sâu mọt, xay mịn, loại lipid, bảo quản lạnh.
- Hoá chất: Urease chuẩn (urease Jack bean), Albumin bovine, Ether petrolium, acetone,
glycine, Tris(base), Coomassie Brilliant Blue – G250 (Merck), Nessler, EDTA, L-Cystein.HCl,
Acrylamide và bisacrylamide, SDS, TEMED, Amonium persulfate, Sephadex G 50, DEAE –
Cellulose (Merck), …
2.2 Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp tủa sunfat amon: phương pháp 1 tủa phân đoạn ở 2 nồng độ 65% và 55%
bão hoà, phương pháp 2 tủa phân đoạn ở 2 nồng độ 20% và 55% bão hoà.
- Phương pháp sắc ký: tách liên tục từng vi phân của hỗn hơp chất [6]
�Sắc ký rây phân tử trên gel Cephadex G-50 (6×12cm)
� Sắc ký trao đổi ion trên gel DEAE-Cellullose
- Phương pháp Bradford: xác định hàm lượng protein [4]
- Phương pháp Nessler: xác định hoạt tính urease [4]
- Phương pháp điện di: kiểm tra hiệu quả tinh sạch, điện di trên gel 10% polyacrylamid với
tốc độ dòng 20mA, gel được nhuộm với Coomassie Blue R-250. [1]
- Phương pháp siêu lọc: sử dụng thiết bị lọc membrane Vivaflow.
3.KẾT QUẢ
3.1 Khảo sát các phương pháp tinh sạch urease từ đậu nành
3.1.1. Khảo sát nồng độ aceton để tủa enzym
Kết quả so sánh độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi enzym urease khi tủa với các nồng độ
aceton từ 30% - 60% được trình bày ở bảng 1.
Bảng 1.Kết quả so sánh hiệu quả tủa enzym ở các nồng độ aceton khác nhau
Giai đoạn Vdịch , ml
mbột , mg
P, mg/ml
(mg/mg) Pt , mg A, UI/ml
(UI/mg) At , UI
Ap,
UI/mg
pr
Độ tinh
sạch H, %
Trích ly 150.00 19.69 2953.50 104.40 15660.00 5.30 1.00 100
Aceton 30 % 882.75 0.21 185.38 1.36 1200.54 6.48 1.22 7.67
Aceton 40 % 2976.00 0.46 1368.96 1.79 5327.04 3.89 0.73 34.02
Aceton 50 % 3313.24 0.45 1490.96 1.87 6.95.76 4.16 0.78 39.55
Aceton 60 % 3788.25 0.44 1666.83 2.91 11023.81 6.61 1.25 70.39
Kết quả ở bảng 1 cho thấy độ tinh sạch của mẫu tủa 30% và 60% aceton gần bằng nhau và
lớn hơn 1, nhưng hiệu suất thu hồi ở nồng độ aceton 60% nhiều gấp 10 lần so với nồng độ
aceton 30%. Ở mẫu tủa 40% và %0% aceton có độ tinh sạch thấp nhỏ hơn 1 và hiệu suất thu
hồi enzym cũng không cao.
Kiểm tra 5 mẫu qua điện di trên gel acrylamid 10%, kết quả được trình bày ở hình 1.
Điện di đồ trên hình 1 cho thấy: urease đậu rựa dù đã ở dạng rất tinh khiết vẫn xuất hiện 3
vạch rõ ràng, điều đó chứng tỏ urease của đậu rựa là một loại enzym heterogeneous.
Điện di đồ đậu nành chứa đủ các vệt có trong điện di đồ đậu rựa. Ngoài ra điện di đồ đậu
nành còn chứa một số vạch khác cũng rất rõ ràng, đặc biệt vạch thứ 6 với độ đậm tăng dần từ
nồng độ aceton 30% - 60%. Kết quả chạy điện di cho thấy phương pháp tủa bằng aceton có
hiệu quả tinh sạch chưa cao, còn lẫn nhiều protein tạp nên các mẫu điện di chưa có sự phân
tách rõ ràng.
Như vậy từ kết quả kiểm tra hiệu quả tinh sạch trên cho thấy nồng độ aceton 60% là nồng
độ dung môi làm tủa enzym urease có hiệu quả nhất về độ tinh sạch cũng như hiệu suất thu hồi
enzym.
Hình 1. Kết quả điện di urease tủa ở các nồng độ aceton khác nhau
Urease
Jackbean
Aceton
30%
Aceton
40%
Aceton
50%
Aceton
60%
Vạch 6
TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 9, SỐ 7 -2006
Trang 59
3.1.2 Khảo sát tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4 (theo phương pháp ở mục 2,2)
Kết quả xác định độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi của hai phương pháp tủa phân đoạn
sunfat amon được trình bày ở bảng 2.
Bảng 2. So sánh hiệu quả tinh sạch của 2 phương pháp tủa phân đoạn (NH4)2SO4
Giai đoạn Vdịch ,ml
mbột ,mg
P, mg/ml
(mg/mg) Pt , mg
A,
UI/ml
(UI/mg)
At ,UI Ap UI/mg pr Tinh
sạch H,%
Trích ly 150.00 19.69 2953.50 104.40 15660.00 5.30 1.00 100
P.Pháp 1 1896.72 0.19 360.38 1.60 3034.75 8.42 1.59 19.38
P.Pháp 2 1214.25 0.19 230.71 1.36 1651.38 7.16 1.35 10.55
Các số liệu thực nghiệm cho thấy ở phương pháp có độ tinh sạch enzym và hiệu suất thu
hồi enzym đều cao hơn so với phương pháp 2. Tuy nhiên hiệu suất thu hồi enzym của cả 2
phương pháp này đều thấp, chỉ 10 – 20%.
Kiểm tra 4 mẫu qua điện di trên gel acrylamid 10%, kết quả được trình bày ở hình 5.
Kết quả điện di cho thấy, cả hai mẫu tủa Sunfate amonium đều xuất hiện các vạch tương
đồng với mẫu chuẩn và chứa ít vạch hơn so với mẫu trích ly. Ở mẫu tủa theo phương pháp 2
tuy đã loại bớt protein tạp ở vạch số 2 và số 4, tuy nhiên vẫn còn sót một ít và thể hiện thành
các vạch mờ. Ở mẫu tủa sunfat amon theo phương pháp 1 đã loại được hoàn toàn các protein
tạp ở các vạch 2, 4 và 7 so với mẫu trích ly. Điện di đồ của mẫu tủa theo phương pháp 1 chỉ
còn lại 4 vạch.
Như vậy, phương pháp tủa phân đoạn Sunfate amonium theo phương pháp 1 đem lại hiệu
quả tinh sạch tốt hơn phương pháp 2. Do đó chúng tôi chọn tủa bằng Sunfate amonium theo
phương pháp 1 để tiếp tục các bước nghiên cứu sau.
3.1.3 Khảo sát quá trình tinh sạch urease bằng phương pháp sắc ký trên cột Sephadex G-
50
Lấy 0,5ml dịch trích ly đã điều chỉnh về pH 7 cho lên cột Sephadex G-50). Rửa cột bằng
đệm phosphate pH7; 1/15M. Kiểm tra hàm lượng protein và hoạt tính enzym ở mỗi phân đoạn.
Urease
Jackbean
Trích ly Tủa PP1 Tủa PP2
Hình 2. Kết quả chạy điện di các mẫu urease thu từ hai phương pháp tủa phân đoạn sunfat amon
Hình 3. Sắc ký đồ của dịch trích ly từ đậu nành
khi qua cột SephadexG-50
Hình 4.Kết quả điên di mẫu đã qua cột
Sephadex, ở phân đoạn 4
Từ sắc ký đồ cho thấu vị trí cực đại của peak protein cũng chính là vị trí cực đại của peak
enzym ở phân đoạn 4. Để kiểm tra hiệu quả tinh sạch, chúng tôi tiến hành chạy điện di trên gel
acrylamide 10% với chất chuẩn là urease từ đậu rựa. Kết quả trình bày ở hình 4.
Sắc ký đồ trên gel acrylamide cho thấy hầu như tất cả các vạch trên mẫu trích ly đều xuất
hiện ở mẫu đã qua tinh sạch trên cephadex. Điều đó có nghĩa trước và sau khi chạy sắc ký lọc
gel trên cột Sephadex G-50 chưa có hiệu quả lắm về mặt tinh sạch, có thể do Sephadex G-50
không phù hợp nên chưa thể loại bỏ một số tạp chất.
3.1.4 Siêu lọc
Dịch trích ly được cho qua thiết bị lọc màng membrane có kích cỡ lỗ 10 000 Da, áp suất lọc
2.5 bar, lọc trong 2h. Sau khi qua siêu lọc, nồng độ enzym trong mẫu rất cao.
Bảng 3. Kết quả đánh giá hiệu quả tinh sạch của phương pháp siêu lọc
Giai đoạn Vdịch,ml
mbột ,mg
P, mg/ml
(mg/mg) Pt , mg
A,
UI/ml
(UI/mg)
At ,UI
Ap,
UI/mg pr
Độ
tinh
sạch
H,%
Trích ly 150.00 27.28 4092.00 68.40 10260.00 2.51 1.00 100
Dung dịch siêu lọc 90.00 29.34 2640.60 78.14 7032.60 2.66 1.06 68.54
Siêu lọc đk 6876.40 0.43 2956.85 0.76 5226.06 1.77 0.71 50.94
Khi sử dụng màng lọc 10 000 Da là quá nhỏ so với phân tử Urease nên hiệu quả tinh sạch
không cao, chỉ làm dịch enzym đậm đặc hơn. Dịch siêu lọc sau đông khô bị giảm hoạt tính, có
thể do một số chất ổn định hoạt tính urease như L-Cystein, EDTA-Na2 đã bị loại khi siêu lọc.
3.2 So sánh các phương pháp tinh sạch
Kết quả so sánh các phương pháp tinh sạch sơ bộ enzym urease trình bày ở bảng 4.
Bảng 4. So sánh hiệu quả tinh sạch của các phương pháp
Giai đoạn VTr.ly ,ml
mbột , mg
P, mg/ml
(mg/mg) Pt , mg A, UI/ml
(UI/mg) At ,UI
Ap,
UI/mg pr
Tinh
sạch H,%
Trích ly 150.00 27.28 4092.00 68.40 10260.00 2.51 1.00 100
Dung dịch siêu lọc 90.00 29.34 2640.60 78.14 7032.60 2.66 1.06 68.54
SK.Cephadex 300.00 7.88 2362.50 23.08 6924.00 2.93 1.17 57.88
TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 9, SỐ 7 -2006
Trang 61
(NH)4SO4 65% 1906.00 0.39 743.34 1.48 2820.88 3.79 1.51 27.49
Aceton 60% 4837.13 0.46 2225.08 1.47 7110.58 3.19 1.27 69.30
Kết quả cho thấy tủa phân đoạn (NH4)2SO4 theo phương pháp 1 cho độ tinh sạch cao nhất
(1,51), nhưng hiệu suất thu hồi lại tương đối thấp (18,01%). Ở phương pháp siêu lọc và sắc ký
trên Cephadex hiệu suất thu hồi rất cao, nhưng hiệu quả tinh sạch lại không cao.
Phương pháp tủa aceton 69% thực hiện rất đơn giản, thời gian tủa ngắn và rất dễ thu hồi,
nhưng quá trình này không ổn định, enzym rất dễ biến tính. Hơn nữa, bột sau khi đông khô độ
hoà tan rất kém. Bột đông khô thu được từ mẫu tủa sun fat amon có độ tan rất tốt.
Kiểm tra 4 mẫu qua điện di trên gel acrylamid 10%, kết quả được trình bày ở hình 5.
Kết quả điện di hoàn toàn phù hợp với số liệu thực nghiệm ở bảng 4. Các phương pháp sắc
ký rây phân tử, siêu lọc, tủa aceton không đem lại hiệu quả tinh sạch cao, điều đó thể hiện qua
điện di đồ còn rất nhiều vạch tạp chất. Ở mẫu tủa sunfat amon theo phương pháp 1 có hiệu quả
tinh sạch cao nhất, điện di đồ chỉ còn 4 vạch rất rõ ràng, ngoài 3 vạch tương ứng với các vạch
trên điện di đồ của urease đậu rựa còn một vạch thứ 4 rất đậm. Từ những nhận xét trên, chúng
tôi quyết định chọn phương pháp tủa phân đoạn sunfat amon theo phương pháp 1 để tiếp tục
qua sắc ký trao đổi ion.

http://vea.gov.vn/VN/khoahoccongnghe/congnghemt/xulychatthainguyhai/Pages
Một số kết quả nghiên cứu mới về công nghệ xử lý khử độc cho môi
trường bị nhiễm các hóa chất độc hại đặc thù nghành quốc phòng

Đỗ Ngọc Khuê1, Phan Nguyễn Khánh1, Tô Văn Thiệp1,Trần Văn Chung1, Đỗ Bình Minh1,
Nguyễn Văn Hoàng1, Nguyễn Hải Bằng, Vũ Quang Bách2, Nguyễn Văn Chất3, Phạm Ngọc Lân3
1. Viện Khoa học và Công nghệ Quân sự / BQP
2. Viện Công nghệ, Tổng cục CNQP/ BQP
3. Viện Kỹ thuật Hoá-sinh & TLNV/Tổng cục HC-KT/BCA

TÓM TẮT
Bài báo giới thiệu một số kết quả mới trong nghiên cứu, ứng dụng các giải pháp công nghệ hóa
học, hóa lý, điện hóa và đặc biệt là các giải pháp công nghệ sinh học (sử dụng mùn trồng nấm,
sử dụng thực vật bậc cao) để xử lý khử độc cho môi trường bị nhiễm các hóa chất độc hại đặc
thù quốc phòng và các chất độc hóa học tồn lưu sau chiến tranh (chất độc da cam /dioxin và
Cesium (CS)).
Từ khóa: công nghệ môi trường, công nghệ xử lý khử độc, hóa chất độc hại, chất độc da
cam/dioxin và CS.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Các tác nhân gây ô nhiễm môi trường đặc thù ngành quốc phòng là các hoá chất hoặc loại chất
thải đặc biệt thường chỉ được tạo ra từ các hoạt động quân sự, trong đó chủ yếu từ các hoạt
động của các cơ sở sản xuất, sửa chữa quốc phòng và đảm bảo kỹ thuật của quân đội [24, 25,
37]. Có thể liệt kê một số nhóm các tác nhân gây ô nhiễm môi trường đặc thù ngành quốc phòng
như:
1- Nhóm các hóa chất có tính nổ bị nhiễm trong các chất thải (chủ yếu là nước thải, chất thải rắn)
của các cơ sở sản xuất vật liệu nổ; gồm các loại thuốc nổ sơ cấp (chất mồi nổ hay chất gợi nổ)
như thủy ngân phulminat (C2N2O2Hg), chì azotua (N6Pb), chì stypnat (C6HN3O8Pb), axit stypnic
(C6H3N3O8), tetrazen, diazodinitrophenol (DDNP) và các hoá chất là nguyên liệu để sản xuất
chúng trong đó có chì nitrat, axit picric (trinitrophenol, TNP); các loại thuốc nổ thứ cấp bao gồm
các thuốc nổ đơn chất như 2,4,6-trinitrotoluen (TNT, Tolit), dinitrotoluen (DNT), các hợp chất
nitramin mạch vòng (Tetryl), nitramin mạch thẳng như hexogen (RDX), octogen (HMX),
nitroglyxerin (NG), Pentrit và các loại thuốc nổ dạng hỗn hợp và các hoá chất là nguyên liệu để
chế tạo chúng, thí dụ như mononitrotoluen (MNP), nitroxenlulo, axit nitric, axit sunfuric,… Các
loại thuốc nổ hỗn hợp dùng trong quân sự phần lớn dựa trên cơ sở các loại thuốc nổ như TNT,
RDX, HMX, Pentrit, một số loại thuốc nổ công nghiệp dựa trên nền amoni nitrat. Các chất thải là
dung môi hữu cơ dễ bay hơi dùng trong công nghệ sản xuất thuốc nổ thuốc phóng như etanol,
axeton, etylaxetat, xylen, toluen v.v…
2- Nhóm các chất độc quân sự tồn lưu sau chiến tranh bao gồm chất độc da cam (thành phần
chủ yếu là các chất diệt cỏ như axit 2,4-diclophenoxyaxetic (2,4-D); axit 2,4,5-triclophenoxyaxetic
(2,4,5-T) có chứa tạp chất là dioxin (PCDD) nhiễm trong đất, bùn đáy và nước ở một số khu vực
Miền Nam Việt Nam và chất độc CS.
Đặc điểm chung của các hoá chất này là chúng vừa nguy hiểm (thí dụ như dễ cháy nổ), vừa có
độc tính cao với môi trường và sức khỏe con người. Chính vì vậy nghiên cứu ứng dụng và phát
triển các giải pháp công nghệ mới để xử lý khử độc cho môi trường bị nhiễm các chất ô nhiễm
đặc thù quân sự đã sớm trở thành một trong các hướng hoạt động quan trọng của các cơ sở
nghiên cứu chuyên ngành môi trường của quân đội. Được sự quan tâm chỉ đạo của Thủ trưởng
Bộ Quốc phòng và các cơ quan chức năng, với sự nỗ lực cố gắng của các cơ quan, đơn vị trong
toàn quân, trong thời gian qua công tác nghiên cứu, ứng dụng công nghệ môi trường trong quân
đội đã đạt được nhiều kết quả trong đó có kết quả nghiên cứu, ứng dụng các giải pháp công
nghệ mới để xử lý các chất thải gây ô nhiễm môi trường đặc thù ngành quốc phòng.
Một số kết quả theo hướng nghiên cứu này của giai đoạn từ năm 2004 trở về trước đó được giới
thiệu trong các tài liệu [7,24,36]. Trong giai đoạn từ 2005 đến nay đây là hướng nghiên cứu vẫn
tiếp tục được các cơ sở nghiên cứu chuyên ngành của quân đội chú trọng phát triển. Trong báo
cáo này sẽ trình bày một số kết quả mới đó đạt được trong giai đoạn từ 2005 đến nay trong
nghiên cứu công nghệ khử độc cho môi trường bị nhiễm các hoá chất độc hại đặc thù ngành
quốc phòng.

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu
Các đối tượng môi trường đó được nghiên cứu là đất bị nhiễm các chất độc hoá học tồn lưu sau
chiến tranh là các hợp chất clo hữu cơ: như 2,4-D; 2,4,5-T; 2,3,7,8-tetraclodibenzo-p-dioxin
(TCDD), 2-clobenzalmalononitril (CS), các hợp chất clophenol); nước thải và đất ở các nhà máy
sản xuất, sửa chữa quốc phòng bị nhiễm các loại thuốc nổ (TNT,DNT, TNR, DDNP, NG, RDX,
HMX, Tetryl…) hoặc nguyên liệu sản xuất chúng.
2.2. Các phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết bị, nguyên liệu, hoá chất
Thiết bị dùng để phân tích, xác định các chất ô nhiễm trong các đối tượng môi trường và đánh
giá hiệu quả của các giải pháp công nghệ đó được thử nghiệm, áp dụng chủ yếu là các thiết bị
phân tích quang phổ tử ngoại- khả kiến (UV-VIS), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký
lỏng/khối phổ (HPLC/MS), sắc ký khí/khối phổ (GC/MS) hiện có tại các phòng thí nghiệm của các
cơ quan thuộc Viện KH-CNQS và Viện KTHS -TLNV. Các thiết bị công nghệ như hệ thống điện
phân sử dụng điện cự trơ trên nền TiO2, RuO2, IrO2; thiết bị chuyên dụng để nghiên cứu phản
ứng quang hoá là do các tác giả tự thiết kế chế tạo. Các mẫu đất, nước thử nghiệm được lấy
trực tiếp từ các địa điểm bị ô nhiễm. Các hóa chất sử dụng cho nghiên cứu được cung cấp từ
các háng hóa chất có uy tín (Merck), có độ tinh khiết bảo đảm cho phân tích sắc ký, quang phổ.
2.2.2. Các giải pháp công nghệ đã khảo sát
Các giải pháp công nghệ chính đã được tập trung nghiên cứu phát triển là các giải pháp thân
thiện với môi trường trong đó có: các phương pháp sinh học (sử dụng vi sinh vật, thực vật bậc
cao, phản ứng xúc tác enzym); các phương pháp điện hoá, hấp phụ, quang hoá v.v…

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả nghiên cứu công nghệ khử độc cho môi trường bị nhiễm các chất độc hoá
học thuộc nhóm các hợp chất clo hữu cơ tồn lưu sau chiến tranh
Trong giai đoạn 2006-2008 trên cơ sở thực hiện nhiệm vụ Hợp tác quốc tế theo Nghị định thư với
Nhật Bản đã triển khai thử nghiệm một giải pháp công nghệ mới: dùng mùn (hay còn gọi là bã
nấm) đã trồng một số loại nấm ăn và nấm thuốc có nguồn gốc khác nhau (như nấm sò Hiratake
Pleurotus sajor caju, nấm ngọc Bunashimeji Hipsizigus marmoreus (Nhật Bản), nấm sò trắng
Pleurotus ostreatus, nấm linh chi Ganoderma lucium và nấm hương Lentinus edodes (Việt Nam);
để phân hủy các hợp chất clo hữu cơ nhiễm trong đất trong đó có DDT, 2,4-D, 2,4,5-T, 2,3,7,8-
TCDD [6, 8, 14, 15].
Kết quả thử nghiệm cho thấy chỉ sau một khoảng thời gian khoảng 40 ngày kể từ khi mẫu đất có
hàm lượng các chất ô nhiễm nằm trong khoảng < 50 ppm (đối với DDT, 2,4-D, 2,4,5-T ) hoặc
21.000 ppt (đối với 2,3,7,8-TCDD) được trộn với một lượng nhất định mùn trồng nấm; thì hàm
lượng các hợp chất clo hữu cơ nhiễm trong đó đã giảm đi đáng kể (trên 90% đối với 2,4-D; 2,4,5-
T, trên 67% đối với DDT và trên 60% đối với TCDD)

http://www.sinhhocvietnam.com/vn/modules.php?go=page&name=Pages1&pid=101

TÌM HIỂU CÁC ENZYM BẢO VỆ ÔXI HOÁ CỦA NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM

Tạ Bích Thuận, Phạm Kiên Cường, Đặng Quang Hưng

Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN

MỞ ĐẦU
Nấm Linh Chi (Ganoderma lucidum) từ lâu đã được coi như là một loại "thần dược” với
những tác dụng giá trị dược liệu như bổ gan, thận, phổi, điều hoà huyết áp, làm giảm
lượng đường và colesteron trong máu... Gần đây nấm Linh Chi còn được dùng để điều trị
các bệnh ung thư và được xem là nguyên liệu chứa nhiều chất chống oxy hoá.

Nhằm đóng góp thêm các dẫn liệu về loại nấm có nhiều giá trị dược liệu này, chúng tôi
đã tiến hành tìm hiểu các enzyme bảo vệ oxi hoá của nấm Linh Chi, trong đó trước hết
tập trung vào 3 enzym chính đó là catalase, superoxid dismutase và NADH oxidase. Bài
báo này giới thiệu một số kết quả mà chúng tôi đã thu được.

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Nguyên liệu

Nấm Linh Chi Ganoderma lucidum - ký hiệu GAL được lấy từ phòng Giống nấm gốc của
Trung tâm Công nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội, được GS. Trịnh Tam Kiệt
định tên khoa học.

Phương pháp nghiên cứu

- Nuôi cấy nấm Ganoderma lucidum được trình bày trong [1,2]

- Protein được xác định theo phương pháp của Lowry, dùng casein làm chất chuẩn [7]

- Hoạt độ SOD được xác định theo phương pháp McCord và Fredovich [3,9]

- Hoạt độ catalase được xác định theo phương pháp của Thibodeau và cộng sự [8] và
lượng H2O2 còn lại được xác định theo phương pháp của Mottola và cộng sự [10]

- Hoạt độ của NOX được xác định theo phương pháp của Poole và Clairborne [11]

- Điện di trên gel polyacrylamide được tiến hành theo phương pháp của Laemmli [6]

-Tinh sạch enzyme bằng cột sắc ký trao đổi ion qua cột DE-52, sắc ký lọc gel qua cột
Sephadex G100 [4,5].

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Sự sinh trưởng và phát triển của nấm GAL

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy hệ sợi của nấm GAL phát triển thích hợp ở
26-28oC. Sau 18-24 giờ cấy, hệ sợi bắt đầu phát triển mạnh trên môi trường nuôi cấy
lỏng. Chủng Ganoderma lucidum có tốc độ sợi mọc từ 150 - 200 ml/giờ. Còn trong điều
kiện nuôi cấy sinh quả thể, kết quả cho thấy sau khoảng 25-30 ngày nuôi cấy, hệ sợi nấm
bắt đầu bện kết. Sau khoảng 2-3 tháng kể từ khi cấy giống, tán nấm phát triển thành thục,
mỗi bịch chỉ cho 1-2 tán nấm lớn, năng suất thu hái tương đối thấp từ 2,5 - 4%.
Hoạt độ các enzym NADH, CAT, SOD của nấm GAL

Hoạt độ enzym NADH oxidase (NOX) của nấm GAL

Kết quả xác định hoạt độ của enzym NADH oxidase được trình bày ở hình 1.

Hình 1. Hoạt độ NADH oxidase (NOX) của nấm GAL

Qua đây chúng tôi thấy rằng hoạt độ NOX của nấm GAL nhìn chung là tương đối thấp,
chỉ đạt 0,049 đơn vị/ g nguyên liệu tươi. Hoạt độ NOX của nấm GAL ở dạng sinh khối
cao hơn so với hoạt độ NOX ở dạng quả thể đạt 0,029 đơn vị/g nguyên liệu tươi

Hoạt độ enzym catalase (CAT) của nấm GAL

Catalase (CAT) là enzym chủ yếu giữ vai trò quan trọng phân huỷ các H2O2 trong hầu hết
các cơ thể sinh vật. Kết quả xác định hoạt độ CAT của mẫu GAL ( hình 4) cho thấy hoạt
độ CAT của nấm GAL nhìn chung là tương đối cao, đạt tương ứng là 2,331 đv/mg
protein và 2,319 đv/mg protein ở dạng quả thể và dạng sinh khối.

Hình 2. Hoạt độ catalase (CAT) của nấm GAL

Hoạt độ enzym superoxit dismutase (SOD) của nấm GAL

Kết quả phân tích hoạt độ enzym SOD của nấm GAL được biểu hiện ở hình 5, nhìn vào
đồ thị cho ta thấy hoạt độ riêng enzym SOD của quả thể là 1,517 đv/mgPr, còn ở dạng
sinh khối hoạt độ riêng tương ứng với 10,279 đv/mgPr

Hình 3. Hoạt độ superoxit dismuatse (SOD) của nấm GAL

Trên cơ sở xác định hoạt độ của các enzym CAT, SOD, NADH chúng tôi đã chọn enzym
NADH oxidase để tách, tinh sạch và nghiên cứu một số tính chất.

Bước đầu tinh sạch và nghiên cứu một số tính chất của NOX từ sinh khối nấm GAL.

Trên cơ sở xác định hoạt độ của các enzym CAT, SOD, NOX chúng tôi đã chọn enzym
NOX để tách, tinh sạch và nghiên cứu một số tính chất.

Tinh sạch một phần enzym NOX từ sinh khối nấm GAL

Để tinh sạch NOX từ sinh khối của nấm GAL, chúng tôi tiến hành thu dịch chiết, bổ sung
thêm 0,1 thể tích đệm Tris-HCL 100mM, pH 8,0 để nồng độ cuối cùng của đệm là
100mM, pH đảm bảo đạt 8,0 và cho sắc ký qua cột gel DEAEcellulose DE-52, cột Sigma
có kích thước 3x14 cm, được cân bằng với cùng đệm trên. Phần protein gắn trên cột được
rửa chiết bằng gradient NaCl từ 50 mM- 1000 mM pha trong đệm Tris- HCl 100mM, pH
8,0.

Kết quả phân tích protein và hoạt độ NOX của các phân đoạn sắc ký qua cột cho thấy
phần dịch không hấp thụ không có hoạt độ NOX. Phần hấp thụ được đẩy ra dưới dạng 3
đỉnh protein chính, trong đó chỉ có đỉnh đầu tiên được đẩy ra ở nồng độ khoảng 370mM
là có hoạt độ NOX. Sử dụng SDS-PAGE để đánh giá độ sạch của chế phẩm NOX sau khi
qua cột DE-52 (hình 4) cho thấy chế phẩm có một băng protein rõ nét với kích thước
khoảng 40 kDa và một số băng protein khác nhưng ít rõ nét hơn ( H4.cột 2)
Để tiếp tục tinh sạch NOX của GAL, chúng tôi đã tiến hành tập trung các phân đoạn có
hoạt độ NOX qua cột DE-52, cô đặc mẫu bằng centricon và cho sắc ký qua cột lọc gel
Sephadex G-100. Cột có kích thước 1x70cm, được cân bằng với đệm. Kết quả rửa chiết
và phân tích protein và hoạt độ NOX của các phân đoạn qua cột Sephadex G100 cho thấy
có 2 đỉnh protein chính, trong đó đỉnh thứ nhất có hoạt độ NOX.

Kết quả kiểm tra độ sạch của chế phẩm sau khi qua bước lọc gel cho thấy ngoài băng
protein 40 kDa vẫn còn một số băng khác có mặt trong chế phẩm, cho thấy chế phẩm
chưa được tinh sạch hoàn toàn và cần tiếp tục tinh sạch.

Hình 4: Kết quả điện di phổ băng protein của nấm GAL
Cột M: Thang chuẩn protein; Cột 1: Dịch mẫu thô nấm GAL;
Cột 2: Mẫu chạy qua cột DE-52 ; Cột 3: Mẫu chạy cột lọc gel G-100

Nghiên cứu một số tính chất của enzym NOX

Sau khi thu được chế phẩm NOX tinh sạch một phần qua bước sắc ký trao đổi ion và sắc
ký lọc gel chúng tôi đã tiến hành tìm hiểu một số tính chất của enzym.

Độ bền nhiệt

Kết quả phân tích độ bền của enzym NOX bằng cách ủ enzym ở các nhịêt độ khác nhau
và sau đó xác định hoạt độ còn lại (hình 5) cho thấy NOX của nấm GAL là tương đối bền
với nhiệt, ở nhiệt độ 30-60oC sau 15 phút xử lý enzym vẫn giữ nguyên hoạt độ ban đầu.
Tuy vậy khi xử lý ở 80oC, trong 15 phút thì enzym chỉ còn 10% hoạt độ ban đầu.
 Ảnh hưởng của một số ion kim loại

Kết quả phân tích ảnh hưởng của 5 ion kim loại (Ca2+, Cu2+, Fe2+, Mg2+ , Zn2+) và anion F-
lên hoạt độ của NOX (hình 6) cho thấy chỉ có Fe2+ ở nồng độ 3-4mM có khả năng làm
tăng một phần hoạt độ của NOX. Các ion Ca2+, Mg2+ và Zn2+ và anion F- không ảnh
hưởng đến hoạt độ của enzym. Còn ion Cu2+ ở nồng độ 4mM ức chế hoạt độ của NOX.

Hình 6: Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt độ của NOX
Xác định NOX của nấm GAL là thuộc loại sinh H2O hay sinh H2O2.

Theo các nghiên cứu khác nhau [10], NADH oxidase của các sinh vật được phân thành
hai nhóm: nhóm thứ nhất xúc tác cho phản ứng oxi hoá một phân tử NADH đến oxi và
hình thành nên một phân tử H2O2, vì vậy được gọi là NOX sinh H2O2. Nhóm thứ hai oxi
hoá 2 phân tử NADH và tạo H2O, nên có tên là NOX sinh H2O. Kết quả xác định lượng
H2O2 sau phản ứng giữa NADH và enzym cho thấy H2O2 không hình thành sau phản ứng,
chứng tỏ NADH oxidase của nấm GAL thuộc nhóm sinh H2O.

Tóm lại, qua nghiên cứu này chúng tôi đã điều tra được hoạt độ ba enzym bảo vệ oxi hoá
là SOD, CAT và NOX của nấm GAL ở dạng quả thể cũng như dạng sinh khối. Có sự
khác nhau về hoạt độ enzym giữa hai loại mẫu này. Chúng tôi cũng đã bước đầu thu được
chế phẩm NOX ở dạng tinh sạch một phần bằng phương pháp sắc ký qua cột trao đổi ion
DE-52 và cột lọc gel Sephadex G-100. Các kết quả xác định tính chất chứng tỏ NOX của
nấm GAL là thuộc nhóm sinh H20, khá bền với nhiệt, được hoạt hoá bởi Fe2+ và bị ức chế
bởi Cu2+.
Hình 1. Sắc đồ HPLC của mẫu đất nhiễm chất độc da cam (50 ppm 2,4-D, 2,4,5-T) trước (a)
và sau 10 ngày trộn với mùn trồng nấm Pleurotus ostreatus (b)
Các kết quả khảo sát đó cho phép xác định được vai trò của các enzym hệ phân hủy lignin như
Lignin peroxydas (LiP), Mangan peroxidas (MnP) v.v…có trong mùn trồng các loại nấm trên
trong phản ứng xúc tác oxi hoá phân hủy các chất độc clo hữu cơ nhiễm trong đất. Hiệu quả
phân hủy các chất ô nhiễm phụ thuộc vào nhiều yếu tố như hoạt độ các enzym, bản chất giống
nấm, cơ chất dùng để trồng nấm, thời điểm lấy mùn để trộn với đất và một số yếu tố môi trường
khác [6,8,14,15].
Những ưu điểm nổi bật của giải pháp công nghệ xử lý đất ô nhiễm bằng mùn trồng nấm ở điều
kiện phũng thí nghiệm đã được xác định bước đầu là [8, 37]:
- Đây là giải pháp có hiệu suất khử độc cao và tốc độ khử độc nhanh. Đối với các mẫu đất nhiễm
2,3,7,8-TCDD với hàm lượng < 6.000ppt thì ở điều kiện phòng thí nghiệm thời gian khử độc là
khoảng 40 - 60 ngày.
- Đây là giải pháp lưỡng dụng thân thiện với môi trường vì vừa có thể khử độc vừa cải tạo được
đất; đồng thời tận dụng được phế thải nông nghiệp là mùn trồng nấm.
- Giải pháp công nghệ có tính khả thi và có đủ điều kiện thực hiện ở trong nước. Chúng ta có thể
tự đảm bảo được nguồn giống nấm, có thể thay thế giống ngoại nhập bằng giống nấm trong
nước đồng thời đã làm chủ được công nghệ nhân giống nuôi trồng nấm để đảm bảo lượng mùn
trồng nấm cần thiết cho mục đích xử lý môi trường. Chi phí cho việc nuôi trồng nấm để tạo các
loại mùn này không cao. Quy trình xử lý đất bị nhiễm các hợp chất clo hữu cơ độc hại bằng mùn
trồng nấm thực hiện không phức tạp, có thể huấn luyện nhanh cán bộ nắm quy trình để triển khai
trong thực tế.
Tuy nhiên, giải pháp này cũng còn có hạn chế là mới chỉ được thử nghiệm ở điều kiện phòng thí
nghiệm với khối lượng mẫu đất lấy từ thực địa không lớn. Do đó, để có được quy trình công
nghệ có thể áp dụng thành công trong việc góp phần khắc phục sự tồn lưu chất độc hoá học ở
Miền Nam Việt Nam cần phải có thêm giai đoạn áp dụng thử trực tiếp ở điều kiện hiện trường
tức là ở các khu vực bị ô nhiễm chất độc da cam/dioxin.
Ngoài khả năng sử dụng trực tiếp mùn trồng nấm; các nghiên cứu thử nghiệm cũng cho thấy có
thể sử dụng cả dịch chiết bằng nước của mùn trồng các giống nấm kể trên để phân hủy nhanh
TCDD và các hợp chất clophenol thường cũng có mặt trong thành phần các mẫu đất bị nhiễm
chất độc da cam/dioxin [27]. Tốc độ phân hủy các hợp chất mono- hoặc diclophenol bằng dịch
chiết mùn trồng nấm thường cao hơn so với các hợp chất triclophenol [27]. Đây là một trong các
kết quả nghiên cứu lần đầu tiên được công bố ở trong nước liên quan đến vấn đề này.
Khả năng phân hủy các chất ô nhiễm dạng clo hữu cơ của dịch chiết mùn trồng nấm còn
được thể hiện qua kết quả nghiên cứu về tác động của nó tới các sản phẩm thủy phân bằng
kiềm của chất độc CS [13]. Bằng cách sử dụng các phương pháp phân tích công cụ hiện đại như
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí- khối phổ (GC/MS) các tác giả công trình [13] đó
nhận diện được các sản phẩm chính của phản ứng phân hủy CS trong dung dịch kiềm. Theo kết
quả phân tích GC/MS có thể đi tới kết luận là 2 sản phẩm chính của phản ứng thủy phân trong
kiềm của chất độc CS là 2-clobenzaldehit (CBA) và 2-clobenzylmetanol (CBM). Trong dung dịch
sau thủy phân đã không phát hiện được sự cú mặt của malononitril.
 (a) S¾c ký ®å GC (b) Phæ khèi øng víi tR= 8.5 (c) Phæ khèi øng víi tR= 9.9
min min

Hình 2. Sắc đồ GC và phổ khối (MS) mẫu đất nhiễm các sản phẩm thủy phân CS, 2-
clobenzaldehit (tR= 8,54), 2-clobenzylmetanol (tR=9,9)
Điều đó có nghĩa là bằng phản ứng thủy phân CS trong dung dịch kiềm chúng ta chỉ có thể loại
bỏ được tính kích thích của chất độc này, nhưng vẫn chưa khử được triệt để độc tính của nó với
môi trường bởi các sản phẩm thủy phân của CS vẫn là các hợp chất clo hữu cơ. Do đó để khử
độc triệt để cho môi trường bị nhiễm chất độc CS cần thiết phải bổ sung công đoạn xử lý tiếp các
sản phẩm thủy phân của nó là các hợp chất clo chứa nhân thơm.
Các nghiên cứu mới đây của chúng tôi đó cho thấy sử dụng mùn trồng nấm, hoặc dịch chiết
trong nước của chúng là một trong các phương án cụ thể lựa chọn để góp phần giải quyết vấn
đề trên. Kết quả thử nghiệm đó cho thấy hàm lượng 2-clobenzaldehit - một trong 2 sản phẩm
thủy phân chính của CS, đã giảm đáng kể (>80 %) sau 15 phút cho tác dụng với dịch chiết mùn
trồng giống nấm Pleurotus ostreatus hoặc Pleurotus sajor caju [13].
3.2. Kết quả nghiên cứu công nghệ khử độc cho môi trường bị nhiễm các hoá chất có tính
nổ
Nghiên cứu ứng dụng và phát triển các giải pháp công nghệ mới để xử lý khử độc cho nước thải
và đất ở các cơ sở sản xuất, sửa chữa quốc phòng bị nhiễm các loại hoá chất có tính nổ hoặc
các hoá chất là nguyên liệu dùng để sản xuất vật liệu nổ vẫn là hướng nghiên cứu được các cán
bộ khoa học của quân đội giành cho sự quan tâm đặc biệt trong giai đoạn vừa qua. Sự phát triển
của hướng nghiên cứu này được thể hiện qua các công trình đó công bố về kết quả nghiên cứu,
phát triển các giải pháp công nghệ hoá lý, điện hoá, quang hoá và sinh học để xử lý nước thải và
đất bị nhiễm các loại thuốc nổ khác nhau [37].
Để góp phần hoàn thiện và nâng cao hiệu quả giải pháp công nghệ xử lý nước thải nhiễm thuốc
nổ bằng phương pháp hấp phụ trên than hoạt tính trong giai đoạn vừa qua đã tập trung nghiên
cứu giải quyết một số nội dung có tính chất cơ bản liên quan đến công nghệ này. Đó nghiên cứu
và làm sáng tỏ được quy luật ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ trong đó có bản chất, cấu
trúc của vật liệu hấp phụ (than hoạt tính) đến hiệu suất hấp phụ các chất nổ như TNT; các dẫn
xuất nitro khác của toluen như: dinitrotoluen (DNT), mononitrotoluen (MNT), các dẫn xuất nitro
của phenol như: trinitrophenol (TNP), dinitrophenol (DNP), mononitrophenol (MNP),
trinitrorezocxin (TNR); các thuốc nổ thuộc nhóm nitrat ancol (nitroglyxerin (NG)); nitramin
(hexogen (RDX), octogen (HMX), tetryl); trên cơ sở đó đã lưạ chọn đựợc loại than hoạt tính sản
xuất trong nước và mô hình công nghệ thích hợp cho mục đích xử lý nước thải bị nhiễm các loại
hoá chất độc hại kể trên [2,17,18,33,34].
Phương pháp điện phân sử dụng điện cực trơ có độ bền cao trên nền các oxit kim loại quý hiếm
như TiO2, RuO2, IrO2 là phương pháp đã được thử nghiệm áp dụng để xử lý các nguồn nước bị
nhiễm một số loại thuốc nổ như TNT, NG, TNR [35], Tetryl [11,12], TNP [29] và RDX [9]. Kết quả
cho thấy hiệu quả xử lý nguồn nước bị nhiễm TNR, Tetryl và TNP bằng phương pháp điện phân
sử dụng điện cực có độ bền cao là cao nhất; hiệu quả thấp hơn là trường hợp điện phân TNT và
DDNP. Trong số các chất ô nhiễm đã được thử nghiệm thì NG và RDX là hai chất rất khó xử lý
bằng phương pháp điện phân với hiệu suất xử lý rất thấp [9,35]. Trên cơ sở các kết quả thử
nghiệm đã lựa chọn được điều kiện tối ưu và thiết lập được quy trình công nghệ mới cụ thể áp
dụng để xử lý nguồn nước thải bị nhiễm thuốc nổ Tetryl, TNP và chất mồi nổ TNR. Các kết quả
nghiên cứu còn cho thấy việc sử dụng điện cực trơ có độ bền cao trên nền các oxit kim loại như
TiO2, RuO2, IrO2 sẽ cho hiệu quả xử lý các hợp chất nitrophenol cao hơn đáng kể so với trường
hợp sử dụng các điện cực trơ khác thí dụ như grafit [29,35].
Phương pháp quang hoá trong điều kiện không có hoặc có mặt chất xúc tác nano TiO 2 và các
chất oxi hoá như H2O2, O3 cũng đã được áp dụng thử nghiệm để xử lý nguồn nước bị nhiễm TNT
và TNR [3-5]. Trên cơ sở các kết quả phân tích, xác định các sản phẩm và cơ chế quá trình quá
trình quang hoá, quang hoá xúc tác phân hủy TNT và TNR bằng các kỹ thuật phân tích HPLC và
HPLC/MS đó lựa chọn được mô hình và quy trình công nghệ thích hợp để xử lý nguồn nước bị
nhiễm hai loại thuốc nổ này.
Ngoài các giải pháp công nghệ hoá lý, điện hoá, trong thời gian qua các giải pháp công nghệ
sinh học môi trường mới cũng đó được triển khai nghiên cứu và áp dụng thử nghiệm để xử lý
nguồn nước thải và đất bị nhiễm các hoá chất có tính nổ. Các tác nhân sinh học chính đã được
thử nghiệm là: các chế phẩm vi sinh chế tạo ở trong nước, các loại thực vật bậc cao và mùn
trồng một số loại nấm ăn và dược liệu nguồn gốc trong và ngoài nước. Các đối tượng môi trường
được thử nghiệm xử lý là các nguồn nước và khu đất ở các cơ sở sản xuất, sửa chữa quốc
phòng bị nhiễm các loại thuốc nổ TNT, DNT, TNR, TNP, DDNP, NG, Tetryl , RDX và HMX.
Các thử nghiệm cho thấy việc sử dụng một số chế phẩm sinh học có chứa các chủng vi sinh đã
được phân lập và tuyển chọn từ các mẫu đất, nước lấy từ các khu vực đã bị ô nhiễm lâu năm
các loại thuốc nổ để bổ sung vào đất hoặc nước bị nhiễm TNT sẽ có tác dụng làm chuyển hoá
TNT thành các sản phẩm khác [21, 22]. Tuy nhiên khả năng khoáng hoá TNT bằng các chế
phẩm vi sinh không cao. Sau khoảng thời gian 60 - 70 ngày (đối với các mẫu đất) và 30 ngày (đối
với các mẫu nước) trong các mẫu thử nghiệm vẫn phát hiện được nhiều sản phẩm chuyển hoá
của TNT là các hợp chất chứa vòng thơm. Tốc độ và hiệu quả xử lý và khoáng hoá TNT nhiễm
trong đất được nâng cao đáng kể khi sử dụng giải pháp công nghệ tổng hợp: bổ sung chế phẩm
vi sinh hoặc mùn trồng nấm kết hợp với trồng một số loại cây bản địa hoặc cây họ đậu [19, 23,
32].
Ngoài đối tượng đất bị ô nhiễm các phương pháp sinh học (sử dụng chế phẩm vi sinh; thực vật
thủy sinh; mùn hoặc dịch chiết mùn trồng nấm) cũng đã được áp dụng thử nghiệm để xử lý
nguồn nước bị nhiễm các loại chất nổ khác nhau. Kết quả thử nghiệm cho thấy một số loại thực
vật thủy sinh, đặc biệt là các loại cây họ cói như thủy trúc, cói có khả năng làm giảm nhanh hàm
lượng các loại thuốc nổ như TNT [30], NG [20], hỗn hợp TNT, NG, NH 4NO3 [16], TNR [31], TNP
[28], DDNP [10], RDX, HMX [26], Tetryl [1].

IV. KẾT LUẬN

Từ các kết quả đã giới thiệu ở trên có thể rút ra kết luận là trong giai đoạn từ 2005 đến nay
hướng nghiên cứu về công nghệ xử lý khử độc cho môi trường bị nhiễm các hoá chất độc hại
đặc thù ngành quốc phòng vẫn tiếp tục được các cơ sở nghiên cứu chuyên ngành của quân đội
duy trì và phát triển có hiệu quả.
Tuy nhiên, trong giai đoạn này ngoài đối tượng môi trường nước, các tác giả đã tập trung nghiên
cứu sâu hơn về khả năng ứng dụng các giải pháp công nghệ sinh học (đặc biệt là phương pháp
sử dụng mùn trồng nấm) để xử lý khử độc cho môi trường đất bị nhiễm các chất độc hoá học tồn
lưu sau chiến tranh.
Một hướng công nghệ sinh học môi trường khác cũng đã được chú ý phát triển có hiệu quả là
hướng nghiên cứu về các giải pháp công nghệ sử dụng thực vật bậc cao để khử độc và cải tạo
môi trường đất và nước bị nhiễm các chất hữu cơ độc hại khó phân hủy. Đây thật sự là những
đóng góp thiết thực của các cơ sở nghiên cứu chuyên ngành của quân đội trong việc phát triển
các giải pháp công nghệ thân thiện với môi trường để tham gia giải quyết các vấn đề môi trường
cấp bách của quân đội và đất nước.
Các tác giả chân thành cảm ơn Bộ Quốc phòng, Bộ KH-CN và Quỹ NAFOSTED đã tài trợ kinh
phí để thực hiện công trình này.

http://www.hus.edu.vn/Dmthietbi/?f=noidung/hoa20.htm

Máy UV-VIS SPECTRO UVS 2700

1. Tên thiết bị: Máy UV-Vis UVS2700 (Spectro UVS2700 Dual Beam
PC)

2. Kí mã hiệu: UVS 2700

3. Hãng sản xuất: LABOMED – Mỹ

4. ảnh chụp toàn cảnh thiết bị:

Mô tả thiết bị:

Máy UV-Vis UVS2700 do hãng LABOMED-Mỹ chế tạo được điều

khiển trực tiếp bằng hệ thống điều khiển nằm trên thân máy (kèm theo màn
hình hiển thị) hoặc điều khiển hoàn toàn tự động bằng máy tính PC sử dụng
hệ điều hành Windows NT giúp người vận hành dễ dàng sử dụng với giao
diện thân thiện.

Hệ thống chứa cuvet gồm 8 vị trí được bố trí thành 2 dãy được điều
khiển hoàn toàn tự động bằng phần mềm. Phần mềm đi kèm UV-Win bao
gồm các chương trình đo điểm, quét phổ, phân tích định lượng và nghiên
cứu động học.

5. Các thông số kỹ thuật chủ yếu:

Hệ thống quang học

Dải phổ: 190nm – 1100nm

 Độ chính xác: ± 0.3nm

Độ lặp lại: 0.2nm

Thông số đo phổ:

Phương pháp đo: Truyền qua, hấp thụ, nồng độ và năng lượng

Thang đo hấp thụ: -3.0 – 3.0Abs, độ chính xác phép đo 0.002Abs

Độ lặp lại: 0.001Abs

Độ cao đường nền: 0.001Abs

Độ ổn định đường nền: 0.002Abs/giờ

Tốc độ quét phổ: 1400nm/phút

Phần mềm: UV-Win có thể: đo điểm, ghi phổ, phân tích định lượng, nghiên
cứu động học, phân tích protein, ADN/ARN và xử lý phổ. Ngôn ngữ hiển thị
- tiếng Anh.

Điều kiện làm việc:

Nhiệt độ phòng: 15-300C

Độ ẩm: dưới 70%

Nguồn điện: một pha AC 220V 50/60Hz 5kVA

6. Nguyên lý làm việc:

Máy làm việc dựa trên định luật Lambert – Beer: A = -lg(I/I0) =
ε lC

A: độ hấp thụ quang

I0 và I: cường độ chùm tia tới và chùm tia truyền qua

 ε : hệ số hấp thụ mol phân tử

l: Chiều dày cuvet

C: Nồng độ dung dịch

Với các giá trị ε và l là hằng số thì độ hấp thụ quang A phụ thuộc
vào nồng độ dung dịch. Vì vậy xác định được A thì có thể suy ra được nồng
độ C tương ứng.

7. Các thông số mẫu mà máy có thể đo đựơc:

- Đo độ hấp thụ quang của dung dịch.

- Ghi phổ xác định các cực đại hấp thụ hoặc sử dụng để xác định cấu
trúc.

- Phân tích định lượng bằng phương pháp lập đường chuẩn.

- Nghiên cứu động học của phản ứng trong dung dịch.

8. Các kết quả chính:

Giao diện làm việc và một số kết quả điển hình

9. Yêu cầu cơ bản đối với mẫu đo:

Mẫu sạch được hoà tan trong dung môi không bay hơi.

10. Lĩnh vực áp dụng và giới hạn của thiết bị:

Sử dụng cho các nghiên cứu về hoá học, sinh học, y học...

11. Địa điểm lắp đặt:

Bộ môn Hoá vô cơ, Khoa Hoá học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên

12. Năm đưa vào sử dụng: 2007

13. Cán bộ vận hành: Bộ môn Hoá vô cơ (04.38241169