3

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ 2
MỤC LỤC.............................................................................................................. 3
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. 5
DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... 7
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 9
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 11
1.1. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VL&LXL TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM .. 11
1.1.1. Thế giới ............................................................................................... 11
1.1.2. Việt Nam ............................................................................................. 12
1.2. TRIỆU CHỨNG LÖA NHIỄM BỆNH VL&LXL ...................................... 13
1.3. ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC LOẠI VIRUT GÂY BỆNH VL&LXL Ở LÖA ..... 14
1.3.1. Virut vàng lùn lúa (RGSV) ............................................................... 14
1.3.2. Các loại virut khác ............................................................................. 16
1.3.2.1. Virut lùn xoắn lá lúa (RRSV)....................................................... 16
1.3.2.2. Virut tungro hình cầu (RTSV) ..................................................... 17
1.3.2.3. Virut tungro hình nhộng (RTBV) ................................................ 18
1.4. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA RẦY NÂU – MÔI GIỚI CHỦ YẾU
TRUYỀN BỆNH VL&LXL .............................................................................. 19
1.4.1. Đặc điểm hình thái ............................................................................ 19
1.4.2. Đặc điểm sinh học, sinh thái và gây hại ............................................ 19
1.5. PHÕNG TRỪ BỆNH VL&LXL ................................................................. 20
1.6. MỘT SỐ ENZYM VÀ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG
NGHIÊN CỨU BỆNH VIRUT .......................................................................... 21
1.6.1. Một số enzym sử dụng trong sinh học phân tử ................................. 21
1.6.2. Kỹ thuật RT-PCR .............................................................................. 22
1.6.3. Kỹ thuật PCR ..................................................................................... 23
1.6.4. Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E.coli ................................................ 24
1.6.5. Kỹ thuật tách dòng gen ...................................................................... 24
1.6.6. Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR) ...................... 25
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 26
2.1. VẬT LIỆU .................................................................................................. 26
2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM .......................................................... 27
2.2.1. Hóa chất .............................................................................................. 27

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
 4

2.2.2. Thiết bị ................................................................................................ 27

2.2.3. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 27
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 27
2.3.1. Thu mẫu thí nghiệm ........................................................................... 27
2.3.2. Thiết kế mồi đặc hiệu ......................................................................... 28
2.3.3. Tách chiết RNA tổng số của virut ở lúa ............................................ 28
2.3.4. Phản ứng RT-PCR ............................................................................. 29
2.3.5. Tạo plasmit tái tổ hợp mang gen mong muốn (Ligation) ................. 29
2.3.6. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng
phƣơng pháp sốc nhiệt................................................................................. 30
2.3.7. Colony-PCR........................................................................................ 31
2.3.8. Tách chiết plasmit .............................................................................. 32
2.3.9. Cắt gen bằng enzym giới hạn............................................................. 32
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................. 34
3.1. THIẾT KẾ MỒI.......................................................................................... 34
3.2. TÁCH DÕNG CÁC ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV ................... 34
3.2.1. RT-PCR .............................................................................................. 34
3.2.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α ............. 37
3.2.3. Chọn lọc plasmit tái tổ hợp bằng colony-PCR .................................. 37
3.2.4. Tách plasmit và cắt kiểm tra sự có mặt của gen ............................... 39
3.3. XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA MỘT SỐ ĐOẠN TRONG
GENOME CỦA RGSV ..................................................................................... 40
3.4. SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN CP-RGSV CỦA HAI TỈNH NINH THUẬN
VÀ BÌNH THUẬN VỚI CÁC TRÌNH TỰ TƢƠNG ỨNG TRÊN GENBANK. 41
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................. 46
CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ ................................................. 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 48
PHỤ LỤC ............................................................................................................. 53

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
 5

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

µg microgram
µl microlitre
µm micrometer
bp base pair
cDNA Complementary DNA (DNA bổ sung đƣợc tổng hợp nhờ enzym phiên
mã ngƣợc từ RNA thông tin)
CS Cộng sự
CLRRI Cuulong Delta Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa đồng
bằng sông Cửu Long), http://www.clrri.org
CP/NCP Coat protein/Nucleocapsid Protein (Protein vỏ)
Đ/c Đối chứng
ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long
DEPC Diethyl pyroCarbonate
DNA Deoxyribonucleic acid
DPV Description of Plant Viruses (Miêu tả các virus thực vật),
http://www.dpvweb.net
EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid
ELISA Enzyme linked immunsorbent assay (kỹ thuật hấp thụ miễm dịch liên
kết với enzym)
g gram
ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses (Ủy ban quốc tế về
phân loại virus).
ICTVdB The Universal Virus Database of the International Committee on
Taxonomy of Viruses (Ngân hàng dữ liệu về virus của ICTV),
http://www.ictvdb.rothamsted.ac.uk
IPTG Isopropylthio-β-D-galactoside
IRRI International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu Lúa quốc tế),
http://www.irri.org

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
 6

Kb Kilobase
LB Luria và Bertani
M Nồng độ mol/lit
ml mililitre
mm milimeter
NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Quốc gia
về thông tin Công nghệ Sinh học), http://www.ncbi.nlm.nih.gov
ng Nanogram
nm Nanometer
PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)
PEG Polyethylene glycon
RdRp RNA dependent RNA polymerase (Enzym nhân bản RNA và tạo ra
phân tử RNA)
RGSV Rice grassy stunt virus (Virut vàng lùn lúa)
RNA Ribonucleic acid
RNase Ribonuclease
RRSV Rice ragged stunt virus (Virut lùn xoắn lá lúa)
RSV Rice stripe virus
RT- PCR Reverse transcription polymerase chain reaction (phản ứng PCR phiên
mã ngƣợc)
RTBV Rice tungro bacilliform virus (Virut tungro hình nhộng)
RTSV Rice tungro spherical virus (Virut tungro hình cầu)
RWSV Rice wilted stunt virus (Virut héo lùn lúa)
TAE Tris - Acetate – EDTA
Taq Thermus aquaticus
v/p vòng/phút
vcRNA viral complementary RNA (đoạn RNA bổ sung của virus)
VL&LXL Vàng lùn, lùn xoắn lá
vRNA viral RNA (đoạn RNA của virus)
X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
 7

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1. Trình tự mồi sử dụng để nhân một số đoạn trong genome RGSV… 34
Bảng 3.2. Mã số đăng ký trên GenBank của các trình tự đã thu đƣợc............... 41
Bảng 3.3. Hệ số tƣơng đồng và sai khác giữa trình tự nucleotit của gen CP-
RGSV tại Bình Thuận, Ninh Thuận với các trình tự tƣơng ứng của các tỉnh
ĐBSCL và thế giới (GenBank).......................................................................... 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1. Cây lúa bị bệnh vàng lùn, bụi lúa giảm chồi........................................ 13
Hình 1.2. RGSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử............................................ 15
Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc bộ gen của RGSV......................................................... 16
Hình 1.4. RRSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử............................................. 17
Hình 1.5. RTSV và RTBV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử............................ 18
Hình 1.6. Các giai đoạn phát triển của rầy nâu..................................................... 19
Hình 2.1. Các điểm thu mẫu lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL tại Nam Trung Bộ.... 26
Hình 2.2. Sơ đồ vectơ pBT ................................................................................. 30
Hình 3.1. Điện di sản phẩm RT-PCR phân đoạn 1 và 4 của RGSV từ mẫu của
tỉnh Bình Thuận bằng 2 cặp mồi RNA1-RGSV và RNA4-RGSV....................... 35
Hình 3.2. Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP của RGSV bằng cặp mồi CP-RGSV 36
Hình 3.3. Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP của RGSV bằng cặp mồi CP-RGSV 36

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
 8

Hình 3.4. Khuẩn lạc E.coli DH5α mang vectơ tái tổ hợp của các dòng CP của
RGSV tỉnh Bình Thuận trên môi trƣờng LB đặc................................................. 37
Hình 3.5. Điện di sản phẩm colony-PCR các dòng RGSV bằng cặp mồi pUC 18.. 38
Hình 3.6. Điện di sản phẩm colony-PCR từ các dòng của phân đoạn 1 và 4
RGSV bằng cặp mồi pUC 18............................................................................... 38
Hình 3.7. Điện di sản phẩm cắt plasmit mang gen CP của RGSV bằng
BamHI.................................................................................................................. 39
Hình 3.8: Điện di sản phẩm cắt plasmit mang phân đoạn 1 và 4 của RGSV tại
Bình Thuận bằng BamHI..................................................................................... 40
Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên việc so sánh trình tự 02 gen
CP- RGSV Nam Trung Bộ (NT, BT) với các trình tự tƣơng ứng của ĐBSCL
và thế giới đã đƣợc đăng ký vào GenBank........................................................... 43

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
 9

MỞ ĐẦU

1. Lí do chọn đề tài
Lúa gạo là nguồn lƣơng thực giàu chất dinh dƣỡng chủ yếu trên thế giới,
đứng thứ ba sau ngô và lúa mì về sản lƣợng, cung cấp trên 20% calo, 15% protein,
các chất khoáng và chất xơ cho con ngƣời. Năm 2009, Việt Nam dự kiến sẽ tiếp tục
đứng thứ hai thế giới về xuất khẩu gạo (khoảng 5,3 triệu tấn/năm) và tổng sản lƣợng
đạt khoảng 36 triệu tấn/năm [62]. Khoảng 52% diện tích lúa đƣợc trồng ở ĐBSCL.
Khi đánh giá về những thành tựu đạt đƣợc trong sự nghiệp đổi mới kinh tế ở Việt
Nam, các nhà kinh tế thế giới đều thống nhất nhận định: Thành công lớn nhất là
nông nghiệp và cây lúa vẫn luôn là cây lƣơng thực quan trọng bậc nhất của Việt
Nam.
Tuy nhiên, sản lƣợng lúa bị giảm sút nghiêm trọng bởi các bệnh virut do rầy
nâu (Nilaparvata lugens Stal) lây truyền, đặc biệt là bệnh VL&LXL xảy ra trong
thời gian gần đây. Bệnh này do sự tổ hợp từ một đến bốn loại virut gây ra, gồm
virut vàng lùn lúa (Rice Grassy Stunt Virus- RGSV), virut lùn xoắn lá lúa (Rice
Ragged Stunt Virus- RRSV), virut tungro hình cầu (Rice Tungro Spherical Virus-
RTSV) và virut tungro hình nhộng (Rice tungro bacilliform virus- RTBV) [8], [43],
[48], [59]. Trong một số trƣờng hợp, cây lúa bị nhiễm cùng một lúc 2 đến 4 loại
virut này. Trong đó, RGSV thƣờng chiếm tỷ lệ cao nhất. Từ năm 2006 đến nay dịch
bệnh lại phát triển rộng ở các tỉnh ĐBSCL với diện tích nhiễm rất lớn. Do ảnh
hƣởng của dịch bệnh này trên cây lúa, năm 2009 Việt Nam có nguy cơ tiếp tục bị
giảm sản lƣợng gạo xuống 1 triệu tấn so với năm 2008 [12].
Rất nhiều thành tựu đã đạt đƣợc trong nghiên cứu các biện pháp phòng
chống rầy nâu- môi giới chủ yếu truyền bệnh VL&LXL nhƣ: nghiên cứu đặc tính
sinh học, sinh thái học của rầy nâu, các biện pháp phòng trừ bằng thuốc hóa học,
sinh vật học, kỹ thuật canh tác, giống kháng... Tuy nhiên, hiệu quả của các phƣơng
pháp này vẫn chƣa cao.
Do dịch bệnh VL&LXL đang gây hại nặng nề về sản lƣợng lúa gạo cho các
tỉnh ĐBSCL [7] và có nguy cơ lây lan ra các khu vực lân cận, nên nhiệm vụ cấp
bách là phải kiểm tra sự có mặt của các chủng virus gây bệnh tại khu vực Nam
Trung Bộ, nơi có diện tích trồng lúa khá lớn và tiếp giáp với ĐBSCL. Đồng thời,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
 10

đánh giá độ tƣơng đồng di truyền của các chủng virut gây bệnh, góp phần vào việc
đề ra những biện pháp đối phó kịp thời với dịch bệnh tại khu vực miền Trung.
Với những lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài : “Tách dòng và xác định
trình tự nucleotit một số đoạn trong genome của virut vàng lùn lúa (RGSV) tại
Việt Nam”.
2. Mục tiêu
Phân lập và so sánh trình tự nucleotit của một số đoạn trong genome của
virut vàng lùn lúa (RGSV).
3. Nội dung nghiên cứu
1> Tách dòng, xác định trình tự một số đoạn trong genome của chủng
RGSV.
2> So sánh các trình tự nucleotit của gen CP- RGSV thu đƣợc với các trình
tự tƣơng ứng trên GenBank để đánh giá độ tƣơng đồng về mặt di truyền giữa các
chủng virut.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn