Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản, số 4/2009

THÔNG BÁO KHOA HỌC

THU NHẬN PROTEASE TỪ CANH CẤY CHỦNG VI KHUẨN Pseudomonas

AERUGINOSA CB07- XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA ENZYME PROTEASE
THU ĐƯỢC

PARTIAL PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF PROTEASE OF Pseudomonas

Aaeruginosa CB07

Nguyễn Minh Trí, Ngô Thị Hoài Dương

Phạm Thị Mai, Đỗ Thị Ánh Hoà
Khoa Chế biến, Trường Đại học Nha Trang

Tóm tắt
Chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa CB07 sinh protease tuyển chọn được từ nguyên liệu
thuỷ sản. Để có thể sử dụng protease này, cần tìm phương pháp thu nhận, cũng như một số yếu tố tác
động đến hoạt tính của enzyme thu được.
Qua số liệu thực nghiệm cho thấy từ dịch ly tâm cấy vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa CB07,
tủa enzyme protease bằng pH 4,25 có hiệu suất thu hồi cao nhất, nhưng tính đặc hiệu còn thấp chỉ
tăng được 3,4 lần so với trước khi tủa, nhưng thuận lợi cho việc thu được enzyme từ lượng canh cấy
lớn, tiết kiệm được hoá chất sử dụng. Enzyme thu được có hoạt tính cao nhất ở 65°C, ở nhiệt độ này,
pH ít ảnh hưởng, trong khoảng pH khảo sát từ 7 đến 8,5, ở khoảng pH 8 cho hoạt tính cao nhất.
Từ khoá: Protease, Pseudomonas aeruginosa, tinh chế, nhiệt độ, pH.

Abstract
The protease-production strain Pseudomonas aeruginosa CB07 was isolated from fishery
material. For application, an effective method for extraction from culture was determinated; some
factors that effect enzymes activity were also tested.
The experience results showed that the protease was purified preliminarily from the centrifuged
culture by adjusting pH to 4.25 with the highest recovery yield, but its specific activity only increased
3.4 times. The method is advantage of quantity of chemicals used. Enzyme had the highest activity at
65°C, at this temperature; influence of pH was not much, in the tested pH of 7-8.5, and the highest
activity was at pH 8.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Pseudomonas là trực khuẩn Gram âm có
khả năng phân giải các chất khác nhau, thường
gặp trong thực phẩm nhất là thuỷ sản, là tác
nhân gây hư hỏng thường gặp. Một trong
những enzyme quan trọng nhất do
Pseudomonas sinh ra là Protease [5]. Một số đề
tài nghiên cứu về Protease của loại vi khuẩn
này, kết quả cho thấy sinh enzyme Protease có
hoạt tính cao trong canh cấy, và có các đặc tính
khác nhau, áp dụng có hiệu quả trong thực tế
như đặc tính bền trong dung môi [7, 12], không
bị tác động bởi các ion kim loại, bền với chất tẩy
rửa [11, 12]
Để thu nhận enzyme từ canh cấy, người ta
sử dụng phương pháp tủa protease bằng muối
ammonium sulfate [2], cồn [1, 2, 3], acetone [2,
6]. Kết quả nghiên cứu cho thấy tủa bằng
acetone đạt được hiệu quả cao. Các phương
pháp này đều sử dụng khá nhiều hoá chất, cần
phải có kế hoạch thu hồi các chất này.
Chúng ta cũng có thể tủa protein enzyme
bằng pH, điều này cũng được nói đến [4]. Tuy
vậy, trong nhiều bài báo không thấy đề cập đến.

39
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản, số 4/2009
Trong điều kiện nghiên cứu của phòng thí
nghiệm của chúng tôi, và đây là phương pháp
phù hợp, dễ áp dụng trong thực tế của nước ta,
do vậy chúng tôi đã tiền hành đề tài này nhằm
đánh giá khả năng thu hồi enzyme protease từ
canh cấy vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
CB07 bằng phương pháp tủa protein enzyme
bằng điều chỉnh pH. Đồng thời tiến hành xác
định một số tính chất của enzyme thu nhận được.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Hoá chất
Tất cả các hoá chất sử dụng ở mức độ
phân tích.
2.2. Xác định hoạt tính protease
Hoạt tính của protease được xác định theo
phương pháp Anson cải tiến. Đơn vị hoạt tính
của enzyme (U) được xác định theo lượng
enzyme cần để thuỷ phân casein tạo sản phẩm
tương đương 1mol tyrosine ở điều kiện thí
nghiệm.
2.3. Xác định hàm lượng protein
Hàm lượng protein được xác định bằng
phương pháp Lowry cải tiến [8, 9]
2.4. Vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy
Vi khuẩn sinh protease được phân lập trên
thạch dinh dưỡng bổ sung sữa tách kem từ các
mẫu tôm. Tuyển chọn các chủng tạo vòng ly giải
protein lớn. Định danh vi sinh vật dựa theo
phương pháp được mô tả trong cuốn ‘Sổ tay
phân loại vi khuẩn của Bergey’ [13]. Chủng đem
thí nghiệm được đánh số CB07 theo thứ tự các
chủng phân lập được. P. aeruginosa CB07
được duy trì trên ống thạch nghiêng CYKN (1%
(w/v) casein, 0,5% (w/v) yeast extract, 0,2%
(w/v) K2HPO4, 0,5% (w/v) NaCl, pH 7,5).
Môi trường nuôi cấy sinh protease chứa
a.
0,5% (w/v) yeast extract, 0,2% (w/v) K2HPO4,
0,5% (w/v) NaCl, và 1% protein tôm, pH 7,5.
2.4. Thu nhận protease từ canh cấy
a. Ly tâm tách tế bào
40
Tế bào vi khuẩn và các chất không tan
được tách khỏi dịch cấy bằng ly tâm ở 10000xg
trong điều kiện lạnh (canh cấy ly tâm)
b. Tủa enzyme bằng pH
Điều chỉnh canh cấy ly tâm bằng HCl 0,1N
về các pH từ 2,5 đến 5,0, bước nhảy 0,25.
Ly tâm 15000xg lấy tủa.
Hoàn nguyên bằng dung dịch đệm
phosphate 8,0.
c. Tủa enzyme bằng (NH4)2SO4
Bổ sung (NH4)2SO4 để đạt được nồng độ
cuối trong dịch ly tâm từ 10% đến 80%,
Ly tâm 15000xg lấy tủa.
Hoàn nguyên bằng dung dịch đệm
phosphate 9,0.
2.5. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH
đến hoạt động của enzyme
Tiến hành thuỷ phân dịch casein ở các pH
khác nhau (7 đến 8,5), nhiệt độ khác nhau (từ
45 đến 75°C). Xác định hoạt độ enzyme.
2.6. Xử lý thống kê
Số liệu trong báo cáo là trung bình của 3
lần phân tích. Kết quả được phân tích thống kê
và vẽ đồ thị bằng phần mền Excel. Giá trị của p
< 0,05 được xem là có ý nghĩa về mặt thống kê.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thu nhận enzyme protease từ canh cấy
vi khuẩn P. aeruginosa CB07
Để thu nhận được protease từ canh cấy vi
sinh vật, enzyme được tủa trong điều kiện thích
hợp, một số cách thường được áp dụng: tủa
bằng (NH4)2SO4, cồn, acetone, phương pháp
tủa bằng pH cũng được nhắc đến [4], tuy vậy,
không thấy các tác giả quan tâm đăng tải các
kết quả nghiên cứu trên các tạp chí. Trong
nghiên cứu này có khảo sát khả năng tủa bằng
pH, cồn, ammonium sulfate.
a. Thu nhận enzyme bằng cách sử dụng cồn
Tủa enzyme bằng cách sử dụng cồn ở các
tỷ lệ cồn khác nhau, kết quả cho thấy hiệu suất
thu hồi và hoạt tính đặc hiệu (U/mg protein)
khác nhau. Kết quả được trình bày trong Hình 1.
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản, số 4/2009

80 10 Hiệu suất
9 thu hồi
70
Hoạt tính
8
60 đặc hiệu
7

Hiệu suất thu hôi (%)

Hoạt tính đặc hiệu

50

(U/ mg protein)
6
40 5

30 4
3
20
2
10 1
0 0
20 35 50 65 80
Tỷ lệ cồn (%)

Hình 1. Hiệu suất thu hồi và hoạt tính đặc hiệu của enzyme
thu được theo tỷ lệ cồn (%) khác nhau

Qua đồ thị thu được, với tỷ lệ cồn 80% cho của Serratia sp. bằng cồn 80% cho thấy hiệu
kết quả cao nhất cả về hiệu suất thu hồi và hoạt suất thu hồi 77% [2].
tính đặc hiệu. Kết quả này cũng phù hợp với kết b. Thu nhận enzyme bằng cách sử dụng
quả nghiên cứu của một số tác giả khác như ammonium sulfate
trên chủng Acinetobacter QN6, tủa bằng cồn 80- Tủa enzyme bằng cách sử dụng dung dịch
90% cho hiệu suất thu hồi 65-85%[1], tủa ammonium sulfate bão hoà ở các tỷ lệ khác
Protease của chủng Bacillus subtilis cho thấy nhau so với dịch ly tâm, kết quả cho thấy hiệu
hiệu suất thu nhận enzyme cao ở tỷ lệ 65-75% suất thu hồi và hoạt tính đặc hiệu (U/mg protein)
[3]. Kết quả này cũng tương tự khi tủa protease khác nhau. Kết quả được trình bày trong Hình 2.

70 4
Hiệu suất thu đồi
60 3,5
Hoạt tính đặc hiệu
3
50
Hiệu suất thu hồi (%)

Hoạt tính đặc hiệu

2,5
(U/mg protein)

40
2
30
1,5
20
1

10 0,5

0 0
20 30 40 50 60 70 80
Tỷ lệ thể tích ammonium sulfate bão hoà sử dụng (%)

Hình 2. Hiệu suất thu hồi và hoạt tính đặc hiệu của enzyme
thu được theo tỷ lệ dung dịch ammonium sulfate bão hoà

Qua đồ thị thu được, với tỷ lệ dung dịch Kết quả này khác với kết quả của nghiên
ammonium sulfate bão hoà 30% cho kết quả cứu thu nhận protease từ Bacillus subtilis của
cao nhất cả về hiệu suất thu hồi và hoạt tính Đỗ Thị Bích Thuỷ cho kết quả ngược lại, cao ở
đặc hiệu. tỷ lệ ammonium sulfate bão hoà 50-70%, Thấp

41
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản, số 4/2009

ở tỷ lệ ammonium sulfate bão hoà 30%. Một
nghiên cứu khác sử dụng tỷ lệ ammonium
sulfate bão hoà 80%, cũng đạt được hiệu suất
thu hồi cao đến 95,5% protease vi khuẩn V.
vuinificus VM10 [10]. Sự khác biệt này có thể
giải thích do loại protease khác nhau có nồng độ
ammonium sulfate cần thiết để tủa khác nhau,
cũng như bị bất hoạt ở các nồng độ muối khác
nhau. Ngoài ra, cũng phải đề cập đến khả năng
khi sử dụng ammonium sulfate ở nồng độ cao,
độ nhớt lớn cần ly tâm ở tốc độ cao, trong thí
nghiệm này chúng tôi chỉ sử dụng ly tâm 15000
xg trong 15 phút để tách tủa.
c. Thu nhận enzyme bằng cách điều
chỉnh pH dịch ly tâm
Bản chất của enzyme là protein, trên bề
mặt có các nhóm phân cực, các phân tử nước
lưỡng cực được hấp phụ bởi các nhóm này, tạo
thành màng nước bao quanh phân tử protein
gọi là các lớp vỏ hydrate, làm dung dịch keo
protein bền. Khi ở pH đẳng điện, trung hoà điện
của phân tử protein, enzyme kết tủa [4]. Trên cơ
sở này, tiến hành tủa enzyme bằng cách điều
chỉnh dịch ly tâm ở các pH khác nhau, kết quả
cho thấy hiệu suất thu hồi và hoạt tính đặc hiệu
(U/mg protein) khác nhau. Kết quả được trình
bày trong Hình 3.

120 4
Hiệu suất thu hồi
3,5
100 Hoạt tính đặc hiệu
3
80
2,5
Hiệu suất thu hồi (%)

Hoạt tính đặc hiệu

(U/mg protein)
60 2

1,5
40
1
20
0,5

0 0
2,75 3 3,25 3,5 3,75 4 4,25 4,5
pH tủa

Hình 3. Hiệu suất thu hồi và hoạt tính đặc hiệu của enzyme thu được tủa ở các pH khác nhau

Bảng 1. Hoạt tính đặc hiệu và hiệu suất thu hồi của các phương pháp tủa

Phương pháp tủa

Dịch trước tủa Tỷ lệ ammonium
Cồn 80% pH 4.25
sulfate bão hoà 30%
Hoạt tính protease (U/ml) 0,56  0,01 0,39  0,01 0,28 0,01 0,55  0,01
Hoạt tính đặc hiệu
0,79  0,01 7,71  0,2 2,90  0,05 2,71  0,02
(U/mg protein)
Hiệu suất thu hồi (%) 68,9  1,05 49,6  1,07 97,5  1,74

42
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản, số 4/2009

120 10
Hiệu suất thu hồi
9
100 Hoạt tính đặc hiệu
8

Hiệu suất thu hồi (%)

7
80
6

Hoạt tính đặc hiệu

(U/mg protein)
60 5
4
40
3
2
20
1
0 0
Cồn 80% Ammonium sulfate pH 4.25
BH 30%

Hình 4. So sánh giữa các phương pháp tủa pH, cồn, ammonium sulfate

Qua Bảng 1- Hình 4, phương pháp tủa
enzyme bằng pH 4,25 cho thấy có hiệu suất thu
hồi cao tuy hoạt tính đặc hiệu không cao nhưng
phương pháp này không sử dụng nhiều hoá
chất, dễ thực hiện phù hợp với điều kiện của
phòng thí nghiệm của chúng tôi. Phương pháp
tủa bằng cồn ở 80% cho thấy hiệu suất thu hồi
chấp nhận được (68,9%), hoạt tính đặc hiệu của
enzyme cao hơn, tuy lượng hoá chất sử dụng
nhiều nhưng nếu có điều kiện chưng cất thu
hồi cồn sử dụng thì đây là phương pháp ưu
tiên lựa chọn.
3.2. Một số tính chất của chế phẩm enzyme
thu được
Phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc
vào nhiều yếu tố như nồng độ enzyme, bản chất
và nồng độ cơ chất, nhiệt độ và pH của môi
trường, các ion kim loại và các chất khác...
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành xác
định pH và nhiệt độ thích hợp chế phẩm
enzyme thu được khi thuỷ phân casein. Kết quả
nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.

Bảng 2. Hoạt tính của enzyme đo được ở các điều kiện nhiệt độ, pH khác nhau

Nhiệt độ pH
(°C) 7 7,5 8 8,5
45 1,23 1,23 0,6 0,4
55 1,8 1,97 1,93 1,89
65 4,39 4,6 4,97 4,44
75 1,2 2,49 1,44 0,87

Xử lý thống kê Phân tích phương sai 2 yếu tố, kết quả như sau:
FNĐ = 73,74 > F 0,05 = 3,86
FpH = 2,10 < F 0,05 = 3,86
Vậy trong khoảng khảo sát (nhiệt độ : 45- 65°C, pH : 7- 8,5) chỉ có nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt
độ của enzyme một cách có ý nghĩa.
Minh hoạ số liệu trên biểu đồ ở Hình 5.

43
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản, số 4/2009
Hoạt tính
Protease (U/ml)
4-5
3-4
2-3
1-2
0-1
7 7,5
Hình 5. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến chế độ thuỷ phân của enzyme protease thu được
Qua đồ thị biểu diễn chúng ta thấy rõ hơn
các vùng biểu diễn hoạt tính enzyme kéo dài
theo trục pH, chứng tỏ pH ít ảnh hưởng đến
hoạt tính của enzyme trong khoảng khảo sát (7-
8,5). Điều này cho thấy khả năng ứng dụng cao
trong thực tế, do vấn đề điều chỉnh pH trong
thực tế là không dễ dàng như trong phòng thí
nghiệm, khó tạo được độ đồng đều của dịch cơ
chất đem thuỷ phân.
Nhiệt độ ảnh hưởng nhiều đến hoạt động
xúc tác của enzyme (p>0,05). Nhiệt độ 65°C
cho thấy có hoạt tính cao nhất (dao động trong
khoảng 4,39- 4,97 U/ml). Đây là nhiệt độ khá
cao khi áp dụng trong thực tế, việc gia nhiệt cho
cơ chất trong khi phản ứng phải có trang thiết bị
thích hợp để duy trì nhiệt độ tối ưu cho enzyme,
nhưng đây cũng là ưu điểm của chế phẩm
enzyme thu được, vì ở nhiệt độ cao này, dịch
thuỷ phân không cần bổ sung chất bảo quản
tránh hư hỏng gây ra do vi sinh vật.
Ở nhiệt độ thấp (45°C) hoạt tính giảm ở pH
cao (≥ 8). Ở nhiệt độ cao cũng vậy nhưng ít rõ
hơn. Ở nhiệt độ 65°C, hoạt tính của enzyme
mạnh nhất, yếu tố pH ít tác động, tuy vậy ở pH
8, hoạt tính của enzyme là cao nhất. Do vậy,
chế độ này (65°C, pH 8) được chọn là chế độ
44
75
Nhiệt độ
(°C)
65
55
45
8 8,5
pH
thuỷ phân casein đối với chế phẩm enzyme
protease thu được canh cấy chủng vi khuẩn
Pseudomonas aeruginose CB07.
IV. KẾT LUẬN
Qua số liệu thu được, tủa enzyme protease
từ dịch ly tâm canh cấy vi khuẩn Pseudomonas
aeruginosa CB07 bằng pH 4,25 có hiệu suất thu
hồi cao hơn (97%) so với tủa bằng cồn tỷ lệ
80%, tủa bằng ammonium sulfate bão hoà tỷ lệ
30%, hiệu suất thu hồi chỉ được 68,9% và
49,6% (theo thứ tự). Mặc dù hoạt tính đặc hiệu
còn thấp, nhưng nhờ hiệu suất thu hồi cao trong
khi lượng hoá chất sử dụng nhỏ, phương pháp
tủa enzyme bằng pH tỏ ra thuận lợi cho việc thu
được enzyme từ lượng canh cấy lớn.
Enzyme thu được có hoạt tính cao nhất ở
65°C, ở nhiệt độ này, pH ít ảnh hưởng, trong
khoảng pH khảo sát từ 7 đến 8,5; ở khoảng pH
8 cho hoạt tính cao nhất.
Lời cảm ơn
Bài báo này được hoàn thành với sự hỗ trợ
kinh phí từ Dự án SRV2701, trong phạm vi
nghiên cứu của Hợp phần 3 và sự phối hợp của
các cộng tác viên từ Bộ môn CNCB-Khoa Chế
biến, đặc biệt là kỹ sư Nguyễn Thị Ngọc Hoài.
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản, số 4/2009

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Quyền Đình Thi, Trần Thị Quỳnh Anh (2007). Một số tính chất hoá lý của protease ngoại bào
chủng vi sinh vật biển Acinetobacter sp. QN6. Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(2): 197-203.
2. Quyền Đình Thi, Trần Thị Quỳnh Anh, Lê Thị Thu Hương (2006). Xác định một số tính chất lý hoá
của protease chủng Serratia sp. DT3. Tạp chí Công nghệ Sinh học 4(2): 195-204.
3. Đỗ Thị Bích Thuỷ, Trần Thị Xô (2006). Nghiên cứu quy trình thu nhận và khảo sát một số tính chất
của chế phẩm protease Bacilius subtilis. Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 1: 41-43.
4. Lê Ngọc Tú (2000). Hoá sinh công nghiệp, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà nội.
5. Folders J, Tommassen J, Loon LC, Bitter W. (2000). Identification of a chitin-binding protein
secreted by Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol, 182:1257–63.
6. Anissa Haddar, Ali Bougatef, Rym Agrebi, Alya Sellami-Kamoun, Moncef Nasri (2009). A novel
surfactant-stable alkaline serine-protease from a newly isolated Bacillus mojavensis A21:
Purification and characterization. Process Biochemistry 44 29–35.
7. Gupta A.,Roy I.,Khare S.K.,Gupta M.N. (2005). Purification and characterization of a solvent
stable protease from Pseudomonas aeruginosa PseA. J Chromato A; 1069:155–61.
8. Hartree, E.E. (1972). Determination of protein; A modification of the Lowry method that gives a
linear photometric response. Anal. Biochem. 48, 422-427.
9. Lowry O.H., N.J. Rosbrough, A.L. Farr, and R.J. Randall (1951). Protein measurement with the
Folin phenol reagent, J. Biol. Chem. 193 265.
10. Meera Venugopal, A.V. Saramma (2006). Characterization of alkaline protease from Vibrio
fluvialis strain VM10 isolated from a mangrove sediment sample and its application as a laundry
detergent additive. Process Biochemistry, 41, 1239–1243.
11. Mohsen Fathi Najafia, Dileep N. Deobagkar, Mohsen Mehrvarz, Deepti D. Deobagkar. (2006).
Enzymatic properties of a novel highly active and chelator resistant protease from a Pseudomonas
aeruginosa PD100. Enzyme and Microbial Technology 39 1433–1440.
12. Najafi M.F., Deobagkar D., Deobagkar D., Potential application of protease isolated from
Pseudomonas aeruginosa PD100 (2005). Electron J Biotechnol; 8(2) [online].
13. Sneath P.H.A., Mair N.S., Sharpe E.M.,Holt J.G. (1986). Bergey’smanual of systematic
bacteriology. Baltimore: Williams & Wilkins.

45