CHƯƠNG 1: TÁCH CHIẾT VÀ LÀM SẠCH ENZYME

1 Các phương pháp phá vỡ tế bào

1.1 Phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học
Mục đích của phá vỡ tế bào là giải phóng các chất có trong tế bào và đảm bảo được
hoạt tính enzyme nội bào. Việc phá vỡ tế bào sinh vật bao gồm cả phá vỡ tế bào động vật,
thực vật và VSV. Đối với tế bào động vật, người ta thường sử dụng toàn bộ cơ quan (hay
mô bào) của động vật có chứa enzyme và cần phải loại bỏ mỡ hoặc các thành phần khác
bám theo mô bào đó, các mẫu cần được xử lý nhanh và phải được thu nhận enzyme trong
thời gian không quá 4 giờ kể từ khi giết mỗ. Đối với tế bào và mô bào thực vật, cần phải
được làm sạch và phải được trữ lạnh nếu chưa tiến hành thu nhận enzyme ngay.
Tế bào động vật và thực vật thường rất dễ phá vỡ bằng các phương pháp cơ học. Riêng
tế bào vi sinh vật, việc phá vỡ tế bào có những khó khăn nhất định.
- Tế bào vi sinh vật có kích thước quá nhỏ, việc phá vỡ tế bào bằng phương pháp
nghiền nếu không có chất trợ nghiền sẽ không có hiệu quả.
- Vi sinh vật là cơ thể đơn bào, khi phát triển trong môi trường, đặc biệt là môi trường
lỏng có nhiều cơ chất thủy phân, chúng sẽ tạo ra nhiều enzyme ngoại bào tương ứng.
Các enzyme ngoại bào này được hòa tan trong môi trường và dễ dàng tách chúng ra
khỏi dung dịch nuôi cấy, do đó trong công nghiệp người ta ít khi tiến hành nghiền tế
bào (trừ trường hợp phải thu nhận enzyme nội bào). Tuy nhiên, trong thời gian gần
đây, việc nghiên cứu enzyme nội bào ở VSV ngày càng nhiều, do đó phương pháp cơ
học được ứng dụng để phá vỡ tế bào VSV ngày càng nhiều.
* Phương pháp đồng hóa áp lực cao:
Đây là phương pháp được ứng dụng rộng rãi nhất để phá vỡ tế bào quy mô công
nghiệp. Theo phương pháp này, huyền phù tế bào sẽ được nén với một áp suất cao, chúng
va chạm rất mạnh vào vành ống (máy đồng hóa maton-gaulin). Tế bào bị phá vỡ bởi lực
cắt và sức nén. Tùy thuộc vào loại máy, công suất từ 50 – 5000 lít/giờ mà áp lực cần có
khác nhau. Mặt khác, tính chất, cấu tạo của tế bào khác nhau đòi hỏi áp lực khác nhau. Ví
dụ đối với tế bào vi khuẩn người ta cần áp lực khoảng 550 bar. Phương pháp đồng hóa áp
lực cao thường được áp dụng cho việc phá vỡ tế bào vi khuẩn. Tế bào động vật và tế bào
thực vật ít khi phải dùng phương pháp này.
* Phương pháp nghiền ẩm: Đây cũng là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong công
nghiệp sản xuất enzyme. Trong quá trình nghiền, người ta thường sử dụng những viên bi
thủy tinh có kích thước 0.2 – 1mm để tăng quá trình phá vỡ tế bào. Trong nhiều trường
hợp, người ta không dùng viên bi thủy tinh mà người ta dùng hạt thủy tinh, vì hạt thủy
tinh có độ ma sát cao hơn viên bi thủy tinh nên hiệu suất nghiền tốt hơn.
1.2 Phá vỡ tế bào không phải bằng phương pháp cơ học
Ngoài hai phương pháp cơ học trên, người ta còn phá vỡ tế bào bằng phương pháp
không phải là phương pháp cơ học. Các phương pháp bao gồm phương pháp hóa học,
phương pháp nhiệt và phương pháp enzyme (ở một số tài liệu người ta còn gọi là phương
pháp hóa học, phương pháp vật lý và phương pháp sinh học).

Phương pháp hóa học: Là phương pháp dựa trên khả năng tạo ra áp suất thẩm thấu mạnh,
hoặc khả năng oxy hóa mạnh của các chất hóa học để phá vỡ thành tế bào. Phương pháp
này không đòi hỏi áp suất cao, nên ít chi phí và dễ thực hiện. Tuy nhiên vì trong quá trình
thực hiện, người ta sử dụng các hóa chất nên các hóa chất này thường lẫn vào trong hỗn
hợp, đòi hỏi quá trình tách rất phức tạp. Một trong những hóa chất sử dụng nhiều là
acetone.
Phương pháp vật lý: Là phương pháp sử dụng siêu âm, phương pháp này thường được sử
dụng trong các phòng thí nghiệm, chưa thấy sử dụng trong quy mô công nghiệp. Một
phương pháp vật lý khác cũng được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu và trong sản xuất ở
dạng thử nghiệm là tạo shock nhiệt hay shock thẩm thấu. Nguyên tắc của phương pháp
này là, khi đưa nhiệt độ của tế bào huyền phù xuống nhiệt độ rất thấp, ngay lập tức nâng
nhiệt đến 400C (thao tác nâng nhiệt rất nhanh), khi đó thành tế bào sẽ bị phá vỡ và người
ta thu được huyền phù tế bào vỡ. Phương pháp này thường dễ thực hiện, đảm bảo được
hoạt tính của enzyme nhưng hiệu suất phá vỡ tế bào không cao.
Phương pháp sinh học (phương pháp enzyme). Có hai phương pháp hiện đang được sử
dụng rộng rãi là phương pháp tự phân và phương pháp thủy phân bằng enzyme đưa từ
bên ngoài vào.
Phương pháp tự phân là phương pháp tạo điều kiện tối ưu cho một số enzyme có khả
năng phân giải cho một số thành phần của thành tế bào, các enzyme này phải là những
enzyme có trong tế bào và là của tế bào đó. Bình thường các enzyme này không hoạt
động mạnh, nhưng nếu điều kiện nhiệt độ, pH, nước ở bên ngoài tế bào mà trùng với mức
hoạt động tối ưu của chúng, thì chúng sẽ hoạt động mạnh và thủy phân thành tế bào, làm
chết tế bào. Tự phân là quá trình được áp dụng nhiều trong quá trình phá vỡ thành tế bào
các loại nấm men. Người ta thường tiến hành quá trình tự phân huyền phù tế bào nấm
men ở nhiệt độ 48 – 520C, trong khoảng thời gian 6 – 24 giờ. Phương pháp này có nhiều
nhược điểm vì trong quá trình thủy phân, các enzyme có trong tế bào không chỉ thủy
phân các chất ở thành tế bào mà cả những chất có trong tế bào, thậm chí các enzyme cũng
bị phá hủy. Phương pháp này hiện nay không được sử dụng nhiều trong công nghiệp.
Một phương pháp khác đang được nghiên cứu nhiều là phương pháp sử dụng enzyme
từ ngoài tế bào. Các enzyme này được đưa vào huyền phù tế bào để tiến hành các quá
trình thủy phân có định hướng các chất nhất định trong thành tế bào. Người ta thường sử
dụng hệ enzyme cellulase để phá vỡ thành tế bào nấm men và thành tế bào thực vật.
Phương pháp này không gây hư hỏng các chất có trong tế bào và thực hiện dễ dàng trong
mọi điều kiện (phòng thí nghiệm, sản xuất thử nghiệm, và sản xuất công nghiệp). Ngoài
ra, người ta còn sử dụng lysozym trong các loại tế bào khác.
2.2 Các Phương pháp cơ học tách enzyme
Các phương pháp cơ học được ứng dụng nhiều để tách enzyme khỏi tế bào và các
thành phần khác gồm hai phương pháp:
- Phương pháp ly tâm
- Phương pháp lọc
2.2.1 Phương pháp ly tâm
 Ly tâm là quá trình tách vật chất rắn ra khỏi dung dịch. Trong công nghệ enzyme,
phương pháp ly tâm thường được ứng dụng khá rộng rãi để thu nhận dung dịch enzyme,
dung dịch này chứa các enzyme ngoại bào. Enzyme nội bào nằm trong tế bào sinh vật,
muốn thu nhân enzyme nội bào ta phải tiến hành một giai đoạn phá vỡ tế bào.

Phần lớn các enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme hòa tan. Như vậy khi
tiến hành ly tâm, dung dịch được tách khỏi các thành phần rắn là dung dịch enzyme thô,
dung dịch enzyme thô này còn chứa các thành phần sau:
- Protein có hoạt tính sinh học
- Các chất hòa tan khác
- Nước

Phương pháp ly tâm chỉ tách được thành phần rắn có tỷ trọng lớn hơn dung dịch.
Dịch thu được chưa phải là chế phẩm enzyme tinh khiết mà là chế phẩm enzyme thô, vì
còn chứa protein không hoạt động, nước và các chất hòa tan khác.

Đối với sinh khối động vật và thực vật, sau khi nghiền ta thu được hỗn hợp nhiều
thành phần. Ly tâm hỗn hợp này ta thu được dung dịch enzyme thô tương tự như ở VSV.
Để tránh hiện tượng biến tính của enzyme, trong những mẫu nghiên cứu, người ta thường
tiến hành ly tâm lạnh, còn trong sản xuất theo quy mô công nghiệp, người ta thường tiến
hành trong điều kiện nhiệt độ thấp.

Trong quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành ly tâm thu nhận dung dịch
enzyme bằng máy ly tâm liên tục. Phương pháp ly tâm liên tục có những ưu điểm là thời
gian thu nhận sản phẩm nhanh, liên tục, và không gây ảnh lớn đến hoạt tính của enzyme.
Hiện nay, trong công nghệ enzyme, người ta đang sử dụng rông rãi ba kiểu ly tâm: ly tâm
hình trụ thẳng đứng, ly tâm liên tục nằm ngang, ly tâm liên tục nhiều đĩa.
Ngoài ba kiểu ly tâm điển hình trên, ở một số nhà máy sản xuất enzyme có sử dụng một
số kiểu ly tâm khác. Việc chọn kiểu ly tâm này hay ly tâm khác phải xem xét đến hai yếu
tố rất quan trọng: nồng độ chất rắn (%), kích thước vật lắng.

2.2.2 Phương pháp lọc

Trong công nghệ enzyme, sau khi phá vỡ thành tế bào sinh vật hay sau khi lên men,
người ta thường sử dụng quá trình lọc để thu nhận dung dịch enzyme nội bào, enzyme
ngoại bào hòa tan.
Lọc cũng là phương pháp tách thành phần rắn ra khỏi dung dịch. Lọc là một phương
pháp khi thực hiện thường gặp nhiều khó khăn như kích thước vật chất dưới tế bào
thường rất nhỏ, và độ nhớt của dung dịch thường rất cao. Cả hai yếu tố này đều làm cản
trở quá trình lọc. Tốc độ lọc phụ thuộc rất lớn vào: diện tích bề mặt vật liệu lọc; độ nhớt
dịch lọc; sức đề kháng.

Trong công nghiệp sản xuất enzyme người ta thường sử dụng các kiểu sau:
- Lọc ép: Lọc ép (lọc đĩa, buồng lọc) thường được sử dụng trong trường hợp dung
dịch cần lọc có khối lượng nhỏ. Phương pháp này sử dụng để lọc enzyme rất có hiệu
quả.
- Lọc chân không: Là phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong nghiên cứu và
trong sản xuất các sản phẩm sinh học có hoạt tính. Trong đó, lọc chân không quay
được sử dụng nhiều hơn cả.
- Lọc theo dòng chảy cắt ngang. Trong những năm gần đây, nhiều nhà máy sản xuất
enzyme sử dụng phương pháp lọc theo dòng chảy cắt ngang. Theo đó, dòng dung
dịch lọc sẽ chảy song song bề mặt nguyên liệu lọc. Phần lọc sẽ được thoát qua vật
liệu lọc và đi xuống phía dưới. Phương pháp này có ưu điểm là giảm sức đề kháng
quá trình lọc của vật liệu chất rắn.
 - Lọc thông thường. Phương pháp lọc thông thường đã có từ rất lâu, hiện nay ở một
số nhà máy vẫn còn sử dụng. Phương pháp lọc này đang được thay thế dần bằng
những phương pháp khác nhanh hơn, có hiệu quả hơn.

2.3 Phương pháp cô đặc

Dung dịch enzyme thô thường chứa lượng enzyme không nhiều. Để xử lý một khối
lớn dung dịch enzyme phải tốn rất nhiều công sức và chi phí cho xử lý này rất cao. Mặt
khác lượng enzyme có trong dịch enzyme thô quá ít, hoạt tính enzyme không cao. Chính
vì thế, người ta phải cô đặc dung dịch enzyme nhằm một số mục đích sau:
- Làm tăng hoạt tính của enzyme trong một khối lượng dung dịch enzyme
- Làm giảm chi phí và công sức cho việc xử lý sau này
- Tăng khả năng bảo quản enzyme
- Giảm chi phí vận chuyển, bảo quản
- Tăng hiệu suất tác động của enzyme đối với cơ chất
Để đạt được mục đích đó, người ta tiến hành cô đặc enzyme bằng một trong những
phương pháp sau:

2.3.1 Phương pháp nhiệt

Chúng ta có thể tiến hành cô đặc enzyme bằng phương pháp nhiệt, nhưng sử dụng
nhiệt để cô đặc enzyme thường gặp rất nhiều khó khăn vì enzyme là protein rất nhạy cảm
với nhiệt độ, nguyên nhân là hầu hết enzyme đều được tổng hợp trong tế bào (trừ enzyme
nhân tạo). Trong cơ thể, enzyme thường hoạt động trong điều kiện nhiệt hoạt động của tế
bào sống. Trường hợp nhiệt độ vượt quá nhiệt độ hoạt động của tế bào sống, thì tế bào sẽ
chết. Enzyme mất hoạt tính là một trong những nguyên nhân làm tế bào chết, là vì khi đó
các phản ứng trao đổi chất của tế bào sẽ không còn xảy ra nữa, sự trao đổi chất của tế bào
bị ngưng trệ, tế bào không thể tồn tại.
 Khi enzyme được tách ra khỏi tế bào thường hoạt động ở nhiệt tối ưu cao hơn nhiệt độ
sinh lý của tế bào, hiện tượng này thấy ở hầu hết các loại enzyme. Tùy theo nguồn thu
nhận enzyme và tính chất của từng loại enzyme mà quyết định chế độ gia nhiệt trong quá
trình cô đặc.

Quá trình cô đặc là quá trình làm bốc hơi nước, làm cho lượng nước trong dung dịch
giảm đi, hàm lượng enzyme trong dung dịch sẽ tăng lên, hoạt tính enzyme cũng tăng cao.
Tuy nhiên nếu không chú ý đến điều kiện nhiệt độ để khống chế nó trong một khoảng cho
phép thì hoạt tính của enzyme có thể sẽ bị mất nhiều, thậm chí có thể dẫn đến triệt tiêu
hoạt tính. Do đó, việc khống chế nhiệt độ cùng với thời gian cần thiết trong quá trình cô
đặc là điều rất cần thiết.

Trong công nghiệp, người ta thường sử dụng những phương pháp sau:
- Bốc hơi lớp mỏng
- Bốc hơi ly tâm lớp mỏng
- Bốc hơi ống dài

2.3.2 Phương pháp kết tủa

Kết tủa là phương pháp được sử dụng rất rộng rãi trong các nghiên cứu enzyme trong
phòng thí nghiệm và sản xuất enzyme trong quy mô sản xuất công nghiệp. Phương pháp
kết tủa dựa trên nguyên tắc, enzyme là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa với
một số dung môi. Trong quá trình kết tủa, người ta phân biệt hai thuật ngữ: kết tủa âm và
kết tủa dương.
- Kết tủa âm: là sự kết tủa protein tạp. Phần protein cần thiết nằm trong dung dịch chứ
không nằm trong phần tủa.
- Kết tủa dương thì hoàn toàn ngược lại, các protein cần thiết lại nằm trong phần kết
tủa còn protein tạp nằm trong phần dung dịch.
* Phương pháp kết tủa bằng muối: Muối nồng độ cao có tác dụng với phân tử nước bao
quanh protein enzyme và làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hòa tan của
enzyme.
Trong công nghiệp enzyme người ta thường sử dụng muối ammonium sulfate. Các thiết
bị dùng trong quá trình kết tủa bằng muối ammonium sulfate thường được chế tạo bằng
thép không rỉ. Tuy nhiên, thép không rỉ có nhiều loại, do đó nhiều trường hợp thiết bị chế
tạo từ thép không rỉ cũng bị ăn mòn bởi ammonium sulfate. Sau này người ta thay
ammonium sulfate bằng sodium sulfate, muối này tuy không gây hư hỏng thiết bị, song
chúng lại không có tính hòa tan tốt. Nhiệt độ tiến hành kết tủa có thể ở 35 – 400C, nhưng
để tránh khả năng làm mất hoạt tính enzyme, người ta thường phải làm lạnh dung dịch
muối và dung dịch enzyme trước khi trộn hai loại dung dịch này với nhau. Khoảng tối ưu
của nồng độ muối dùng trong kết tủa enzyme rất rộng, khoảng 20 – 80%.
* Phương pháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ: Dung môi hữu cơ có ảnh hưỡng
rất lớn đến khả năng hòa tan của enzyme, ảnh hưởng solvate hóa của phân tử nước xung
quanh phân tử enzyme bị thay đổi, tương tác giữa các phân tử enzyme sẽ bị tăng lên.
Trong công nghiệp sản xuất enzyme, người ta thường sử dụng ethanol và acetone để kết
tủa enzyme. Khi tiến hành kết tủa enzyme bằng những dung môi hữu cơ cần hết sức lưu ý
đến nhiệt độ. Do enzyme rất nhạy cảm với nhiệt độ khi có mặt của các chất như ethanol
hoặc acetone, nên bắt buộc ta khi tiến hành kết tủa enzyme phải làm lạnh cả dung môi
hữu cơ và dung dịch enzyme. Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi có mặt các
dung môi hữu cơ thường mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có
mặt của muối vô cơ. Người ta thường kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ
3 – 100C. Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định
bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch
enzyme.

* Kết tủa enzyme bằng polymer: Polyethylene glycol là một polymer cao phân tử được
ứng dụng rộng rãi trong kết tủa protein, enzyme. Nhiều tác giả cho rằng cơ chế lắng của
chúng gần giống dung môi hữu cơ. Phương pháp này có ưu điểm là ta có thể thực hiện
quá trình kết tủa enzyme ở nhiệt độ bình thường (nhiệt độ phòng thí nghiệm) và lượng
polyethylene glycol cần sử dụng để kết tủa không nhiều (khoảng 5 – 15 %). Nếu sử dụng
nồng độ cao sẽ làm độ nhớt của dung dịch rất cao và như thế sẽ tạo ra nhiều khó khăn cho
kỹ thuật làm sạch sau này. Polymer được sử dụng rất rộng rãi để kết tủa enzyme cả trong
nghiên cứu và trong sản xuất theo quy mô công nghiệp. Các polymer được sử dụng nhiều
là polyethylenamin và polyethylene glycol với những khối lượng phân tử khác nhau.
Trong công nghiệp, người ta thường sử dụng nồng độ polymer khoảng 15 – 20% để kết
tủa enzyme.

* Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện của protein-enzyme: Protein là chất lưỡng cực, chúng
có cả nhóm acid và nhóm base. Mức độ hòa tan của enzyme phụ thuộc vào pH, mức độ
này là tối thiểu khi chúng ở điểm đẳng điện, phần lớn protein có điểm đẳng điện ở
khoảng acid, vì thế quá trình này gọi là kết tủa acid. Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện
thường được thực hiện ở quy mô nhỏ, chứ không thực hiện ở quy mô công nghiệp. Thời
gian tạo điểm đẳng điện và thời gian lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm thay đổi
hoạt tính enzyme. Như vậy thiết bị phản ứng càng lớn. Khi đó, thời gian khuấy trộn và
thời gian lắng kết tủa càng dài, enzyme càng dễ bị biến tính.
2.3.3 Phương pháp siêu lọc
Phương pháp siêu lọc là phương pháp sử dụng những màng lọc có lỗ lọc siêu nhỏ.
Phương pháp này được ứng dụng rất nhiều trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Phương pháp
tách vật chất bằng màng siêu lọc hiện nay có ba loại là: lọc dòng chảy cắt ngang, siêu lọc,
thẩm thấu ngược.

Trong những phương pháp trên, phương pháp lọc dòng chảy cắt ngang để thu nhận sinh
khối vi khuẩn, tách vi khuẩn khỏi dung dịch enzyme. Phương pháp thẩm thấu ngược
dùng để thu nhận các chất có khối lượng phân tử thấp và có khả năng hòa tan. Trong khi
đó, siêu lọc lại được sử dụng rất rộng rãi để thu nhận enzyme, siêu lọc có thể giúp ta thu
nhận các chất có khối lượng phân tử trong khoảng1.000 – 300.000 dalton. Người ta sử
dụng cellulose acetate và các loại polymer hữu cơ như poly sulfone, poly-vinylidene và
poly propylene làm nguyên liệu màng lọc. Trừ cellulose acetate ra, các loại nguyên liệu
màng lọc khác kể trên có thể rửa bằng kiềm, acid hoặc bằng hơi nóng. Ngoài ra, người ta
còn tách muối trong dung dịch enzyme bằng lọc thẩm tích.
2.4 Phương pháp tinh sạch enzyme
2.4.1 Phương pháp kết tinh
Trong nghiên cứu và trong sản xuất, người ta dùng dung dịch ammonium sulfate để
kết tinh enzyme, dung dịch ammonium sulfate để kết tinh enzyme đòi hỏi độ tinh sạch
phải rất cao là rất khó, vì vậy phương pháp này ít được phổ biến

2.4.2 Phương pháp điện di

Phương pháp điện di chỉ được ứng dụng nhiều trong phòng thí nghiệm. Người ta cũng
đã tiến hành áp dụng thử phương pháp này theo quy mô công nghiệp nhưng cho đến nay
vẫn chưa được phát triển rộng rãi.

2.4.3 Phương pháp sắc ký

* Phương pháp sắc ký lọc gel. Theo phương pháp này, các loại gel được nạp vào trong
cột dùng để tách enzyme. Các loại gel được sử dụng rộng rãi trong phương pháp sắc ký
cột là: polycryamide, ararose, vinyl polymer, dextran …Trong lọc gel, các phân tử được
tách ra dựa theo kích thước và hình dáng của chúng.

* Sắc ký trao đổi ion. Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa trên sự tích điện của phân tử
protein. Phương pháp trao đỏi ion được sử dụng rộng rãi trong sản xuất enzyme theo quy
mô công nghiệp. Tính chất tích điện của protein chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi giá trị pH.
Từ đó, người ta chọn chất trao đổi là anion hay cation.

* Sắc ký kỵ nước. Phương pháp này dựa trên sự tương tác của vùng kỵ nước của phân tử
protein với nhóm kỵ nước trên chất nền, sự hấp thụ xảy ra ở nồng độ muối cao và quá
trình phân đoạn với muối. Phương pháp này đặc biệt thích hợp đối với những enzyme đã
được làm cô đặc trước đó bằng phương pháp kết tủa với muối ammonium sulfate.

* Sắc ký đồng hóa trị. Liên kết đồng hóa trị được tạo thành giữa các protein ở trạng thái
tĩnh.

* Sắc ký ái lực. Phương pháp này dựa trên khả năng giữ enzyme bằng những chất nền
không hòa
tan, được nhồi vào trong các cột sắc ký.

2.5 Thu nhận enzyme từ nguồn thực vật

2.5.1 Thu nhận enzyme amylase

Hiện nay, người ta biết có sáu loại amylase, trong đó α-amylase, β-amylase, γ-
amylase (hay glucose) thủy phân các liên kết α-1,4-glucoside của tinh bột, glycogen và
các polysaccharide đồng loại. Các amylase còn lại: dextrin-6-glucanhydrolase (hay
dextrinase) thủy phân các liên kết α-1,6-glucoside. Sáu loại amylase này được xếp thành
hai nhóm: endoamylase (enzyme nội bào), và exoamylase (enzyme ngoại bào). Enzyme
amylase được thu nhận chủ yếu từ các hạt nảy mầm như: malt đại mạch, malt thóc và
ngô. Có hai phương pháp tinh sạch enzyme amylase là phương pháp sắc ký và phương
pháp điện di trên gel polyacrylamide
* Tinh sạch enzyme amylase bằng phương pháp sắc ký
Hạt lúa được cho hút ẩm và ủ trong tối ở 300C trong 8 ngày. Hạt nảy mầm được đồng hóa
trong một máy trộn và một polytron với 800ml dung dịch đệm TRIS/HCl 50mM (pH 8,5)
(dung dịch đệm A). Sản phẩm đồng hóa được ép qua hai lớp lưới nylon và dịch lọc thô
được đưa vào ly tâm với tốc độ 15.000 vòng trong 20 phút. Phần ở trên được xem như
dịch enzyme thô. Dịch enzyme thô được cho kết tủa với (NH4)2SO4 (25 – 60%). Phần kết
tủa thu được đem hòa tan trong 10ml dung dịch đệm A và ly tâm với tốc độ 15.000 vòng
trong 20 phút.
 Sau khi sử dụng phương pháp thẩm tích thì phần nổi ở trên trong dung dịch đệm A thì
sẽ được cho qua cột DEAE cellulose, DE 52 và được cân bằng với dung dịch đệm A;
enzyme được tách rửa bằng NaCl nồng độ 0 – 0,5M. Dung dịch được thẩm tích và được
lôi cuốn qua cột CHA (ancyclodextrin), cột này đặc biệt được sử dụng để lôi cuốn
amylase. Các phân đoạn qua cột thu được sẽ được chuyển qua 12 sắc ký cột superpose.
Những phân đoạn này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

* Thu nhận enzyme amylase bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (PAGE)

Hạt lúa được ngâm nước và ủ cho nảy mầm. Sau 14 ngày, cây mầm được xay nhuyễn
với đệm Tris-HCl 0,05M (pH 8,0). Tỷ lệ mô đệm là 1:2 (trọng lượng/thể tích). Hỗn hợp
sau khi đồng hóa được ly tâm với tốc độ 10.000rpm trong 15 phút ở nhiệt độ 40C. Phần
nổi ở trên được chuyển sang một ống ly tâm khác và được xem là dịch enzyme.

Gel được chuẩn bị sẵn sàng và được đưa vào điện di với cường độ dòng điện 70V. Sau
khi hoàn tất việc chạy điện di, gel được đưa ra nhuộm với dung dịch nhuộm màu để xác
định sự hiện diện của amylase.
2.5.2 Thu nhận enzyme bromelin từ dứa
Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả năng
phân giải protein, được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt ở cây dứa (thân và trái).
 Phương pháp thu nhận
 Quy trình tổng quát thu nhận và tinh sạch enzyme bromelin

 Thu dịch enzyme thô

Quả dứa hoặc thân được xay nhuyễn, vắt kỹ, lọc bỏ bã và thu dịch lọc, ly tâm dịch lọc với
tốc độ 6.000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ chất xơ sẽ thu được dịch chiết có chứa
bromelin.

 Các phương pháp tách bromelin

Phương pháp kết tủa enzyme

Nguyên tắc: điểm đẳng điện của đa số protein thấp hơn pH 7, do đó trong điều kiện sinh
lý, các phân tử protein có tích điện âm thừa và chính những điện tích âm thừa này đã kết
hợp với các đầu mang điện tích dương của phân tử nước hữu cực (ở trong dung dịch,
protein liên kết với một lượng nước khá lớn) cũng như các ion dương. Sự kết hợp với
nước tạo ra một lớp nước bao xung quanh phân tử protein và cản trở sự kết tủa của
chúng. Đối với enzyme protein cũng như các protein enzyme khác, để có thể kết tủa được
enzyme, điều cần thiết là phải phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh phân tử này bằng
cách bổ sung vào dung dịch protein enzyme các dung môi hoặc các chất ưa nước có ái
lực với nước mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein đó, giúp cho
protein tủa xuống.
Cách thực hiện:

- Tủa bằng muối ammonium sulfate: chuẩn bị một lít dung dịch nước dứa sau ly tâm,
cho từ từ 532g ammonium sulfate vào và khuấy đều (dung dịch đạt được độ bão hòa
ammonium sulfate là 70%). Để yên ở nhiệt độ phòng 10 – 15 phút, sau đó ly tâm
với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 5 phút để thu nhận tủa.
- Tủa bằng ethanol: làm lạnh dung dịch nước dứa sau ly tâm, cho ethanol 96% (cũng
đã được làm lạnh) vào theo tỷ lệ 4:1 (4 nước dứa, 1 cồn), trộn đều, để ở nhiệt độ 00C
trong 3-4 giờ. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút. Rửa tủa
bằng acetone và thu nhận tủa.
- Tủa bằng acetone: thêm một thể tích acetone lạnh hoặc 20% acetone lạnh vào 1 thể
tích dung dịch nước dứa sau ly tâm. Để yên trong 1 giờ ở nhiệt độ 0-40C. Ly tâm
hốn hợp với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ tủa. Thêm 2 thể tích
acetone lạnh vào, để 1 giờ ở 0-40C, ly tâm thu tủa và rửa tủa bằng acetone lạnh.

Phương pháp hấp phụ

Có nhiều chất được sử dụng để làm chất hấp phụ enzyme. Có thể sử dụng kaolin hay
betonite để hấp phụ bromelin. Trình tự thực hiện tương tự nhau. Cách làm: cho kaolin
khô (hoặc đã ngâm cho trương nở) vào dung dịch nước dứa sau ly tâm với tỷ lệ 25mg
kaolin/ml dung dịch nước dứa. Khuấy đều bằng máy khuấy từ, sau đó ly tâm để thu tủa.
Tủa được gọi là bromelin-kaolin.

Phương pháp siêu lọc

- Siêu lọc là quá trình dung dịch lỏng chảy qua một màng lọc dưới một áp suất để
tách các thành phần trong chất lỏng đó. Sự phân chia các phân đoạn phụ thuộc vào
kích thước lỗ trên màng và tùy theo trọng lượng phân tử của chất thấm qua. Tùy
 theo kích thước của lỗ trên màng mà sau khi thực hiện quá trình siêu lọc sẽ thu được
nước và những chất có phân tử nhỏ còn những các phân tử lớn sẽ bị giữ trên màng.
- Cách thực hiện: Sử dụng màng FS 50PP có giá trị loại trừ 30.000, diện tích màng
336cm2. Dịch nước sau khi ly tâm được cho qua siêu lọc, trong quá trình này thêm
nước cất vào để tinh sạch và thu được dung dịch cô đặc. Thu nhận tủa bằng cách sử
dụng acetone hoặc sấy thăng hoa dung dịch cô đặc.
- Tách chiết protein từ dịch chứa bằng CMC: CMC vải màng được tẩm ướt bằng dung
dịch đệm phosphate 0,005M, pH 6,1, sau đó cho dịch chiết dứa vào thỉnh thoảng
khuấy trộn. Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt, vẩy sạch chất bẩn bám vào CMC. Rửa protein
bằng đệm phosphate 0,05M, pH5,6. Sau đó, tiến hành phản ứng hấp phụ lần thứ
nhất, cho dung dịch phản ứng hấp phụ là đệm phosphate 0,05M, pH 7,1 và NaCl
0,5M khuấy trộn 3-4 lần. Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt thì thu được dung dịch đậm đặc
chứa bromelin. Tiếp tục phản ứng hấp phụ lần thứ hai như lần thứ nhất. Sau đó, góp
các dịch chiết lại và tủa bằng acetone hay cồn lạnh để tách lấy enzyme.

 Phương pháp tinh sạch enzyme bromelin

 Tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích

Cân 1g enzyme thô, pha trong 10ml dung dịch đệm sodium phosphate 0,03M có pH
7,2. Sau khi tất cả enzyme hòa tan thì cho hỗn hợp vào túi cellophane rồi đặt túi vào cốc
có chứa 1 lít dung dịch đệm sodium phosphate 0,03M, pH 7,2. Túi cellophane được
chuẩn bị bằng cách trước khi dùng được tráng đầy bằng dung dịch đệm tương tự như
trên. Tiến hành thẩm tích trong 6 giờ và cứ sau hai giờ thay dung dịch đệm bên ngoài 1
lần. Dung dịch đệm phía ngoài túi được khuấy liên tục bằng một máy khuấy từ.

 Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-50

Sephadex G-50 được đun cách thủy ở 1000C trong một giờ rồi nhồi vào cột (kích
thước cột 23,5x0,9cm). Đặt 1 cái phễu thủy tinh phía trên cột, cho sephadex từ từ vào
phễu và khuấy liên tục. Các hạt sẽ lắng từ từ xuống cột, chú ý phải khuấy liên tục cho đến
khi nhồi xong cột. Khi nhồi cột phải cố gắng nhồi sao cho mật độ hạt đồng nhất và không
có bọt khí. Trong quá trình nhồi cột vẫn phải xả cột trong một giờ, với vận tốc khoảng
1ml/7 phút.

Cân 100mg enzyme thô hòa vào trong một ml dung dịch đệm sodium phosphate
0,02M, pH 7,2. Khi enzyme đã hòa tan hoàn toàn thì cho hỗn hợp enzyme từ từ vào cột.
Cho dung môi enzyme phân ly qua cột và điều chỉnh tốc độ chảy khoảng 2ml/7 phút.
Loại bỏ 5ml đầu tiên rồi mới bắt đầu thu dịch enzyme. Dịch enzyme được thu đến khi
dùng Ba(NO3)2 để thử (NH4)2SO4 và thấy có xuất hiện kết tủa trắng thì ngừng quá trình
thu dịch enzyme. Dịch enzyme thu nhận được làm đông khô. Quá trình lọc enzyme qua
sephadex G-50 nên được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp do nhiệt độ thấp có khả
năng giảm thiểu sự biến tính của enzyme. Quá trình lọc enzyme qua sephadex diễn ra
trong khoảng thời gian 1 giờ.

 Tinh sạch bromelin bằng phương pháp sắc ký

Bromelin thân được cho chạy sắc ký trên Duolite CS101 ở pH 6,05 cho hai phân đoạn
khác nhau về điện tích với hoạt tính xúc tác phân giải BAEE, casein và glucagons.
Sắc ký bromelin thân trên Bio Rex ở pH 6,1 sẽ thu được 5 phân đoạn khác nhau về thành
phần amino acid. Khi sắc ký trên sephadex G-75 ở pH 7 cũng nhận được 5 thành phần có
hoạt tính enzyme. Trọng lượng phân tử của 5 thành phần này ở trong khoảng từ 17.800 –
20.000 Dalton.

2.5.3 Thu nhận enzyme papain

Papain là một endoprotease có chứa 16,1%N và 1,2%S. Papain là một protease thiol,
là một chuỗi popeptit gồm 185 amino acid, trọng lượng phân tử là 20.900 dalton. Quá
trình thu nhận papain tinh khiêt gồm các bước sau:
- Chuẩn bị: thành phần nhựa đu đủ tươi ngoài enzyme papain, chymopapain còn chứa
một số loại enzyme, protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo,… và các chất tạp
khác. Để có được quy trình tách và tinh sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả thì
phải có quy trình hòa tan nhựa đu đủ, mục đích là để loại bỏ các chất nhựa, cặn tạp
lớn… Trộn 180g nhựa đu đủ khô với 100g celite và 150 cát sạch, nghiền kỹ trong
cối ở nhiệt độ phòng 200-300ml dung dịch cysteine 0,04M (hòa tan 6,3g cystein
hydrochloride trong 1.000 ml dung dịch NaOH 0,054M, kiềm được sử dụng để đưa
pH dịch chiết tới pH 5,7). Khi dịch nhựa tạo thành thể huyền phù, gạn bỏ lớp nổi ở
trên. Quá trình nghiền và trích được lặp lại với 300ml dung dịch cysteine Sau đó rửa
cối với dung dịch cystein để điều chỉnh thể tích dịch chiết lên 1 lít. Dịch huyền phù
sau cùng được lọc lạnh trên giấy lọc Whatman số 1. Thời gian lọc phụ thuộc vào
nhựa khô được sử dụng và quá trình này có thể rất chậm. Nước lọc có màu trắng sữa
hoặc màu xanh, pH gần 5,7. Các bước còn lại của quá trình làm tinh sạch được tiến
hành trong điều kiện lạnh.
- Loại bỏ các chất không tan ở pH 9: Dịch chiết thu được ở bước 1 được điều chỉnh
lên pH 9 bằng cách thêm từ từ và khuấy đều một lượng khoảng 110ml dung dịch
NaOH 1M. Tủa xám tạo thành có thể được loại ra bằng lọc hoặc ly tâm ở 2.600rpm
trong 1 giờ. Dịch chiết phải trong do các tủa gây biến tính protein đã được loại bỏ.
- Quá trình phân đoạn bằng ammonium sulfate: Cho ammonium sulfate vào dịch
enzyme đến 40% độ bão hòa, sau 1-2 giờ, ly tâm ở 2500rpm thu nhận tủa, bỏ dịch
lỏng hoặc có thể giử lại để lấy chymopapain. Tủa được rửa một lần với 400-500ml
dung dịch ammonium sulfate 40% độ bão hòa.
- Quá trình phân đoạn bằng NaCl: hòa tan tủa trong 600ml dung dịch cystein 0,02M
(pH7-7,5), tủa papain tạo thành khi thêm từ từ 60g NaCl rắn. Sau một giờ ly tâm ở
2.500rpm trong một giờ để thu tủa, bỏ dịch lỏng.
- Kết tinh: tủa được thành dịch huyền huyền phù với 400ml dung dịch cytein 0,002M,
pH 6,5 ở nhiệt độ phòng. pH của dung dịch huyền phù được điều chỉnh lại pH 6,5
sau khi cho protein vào. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tinh thể tạo thành,
 sau đó duy trì ở 40C qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 2.500rpm trong 4-5 giờ để thu
nhận tinh thể.
- Tái kết tinh: Hòa tan tinh thể thu được ở bước 5 trong nước cất (tạo dung dịch
protein có nồng độ khoảng 1%) ở nhiệt độ phòng. Sau đó cho vào từ từ (đồng thời
khuấy đều) dung dịch NaCl bão hòa (10ml/300ml dung dịch protein). Khi 75% thể
tích dung dịch NaCl đã cho vào papain đã bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phòng. Dịch
huyền phù được giữ ở 40C qua đêm, sau đó ly tâm thu tủa như ở bước 5. Hoạt độ
riêng của enzyme có thể tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm một lần nữa như
trên.
- Sấy chân không: Sấy chân không ở nhiệt độ khoảng 400C, thu nhận papain tinh chế.
Để tăng hoạt tính enzyme, trước khi tái kết tinh có thể hòa tan tinh thể enzyme trong
dung dịch đệm phosphate chứa cystein, sau đó tiến hành siêu lọc với màng lọc
4000A0. Đem kết tinh dịch lỏng thu được sau siêu lọc.

2.5.4 Thu nhận enzyme ficin

Ficin là một loại protease thực vật trong cấu trúc bậc I có chứa nhóm sulfhydryl (-
SH). Trình tự các amino acid ở gần trung tâm phản ứng gần giống với papain và
bromelin. Enzyme ficin dược thu nhận từ dịch nhựa tươi từ cây sung. Quá trình sơ chế
dịch nhựa tươi từ cây sung thành chế phẩm enzyme ficin gồm các bước sau:
- Dịch nhựa sung sau khi thu được pha theo tỷ lệ 1g dịch nhựa trong 2ml nước cất.
- Khuấy đều dung dịch bằng máy khuấy từ trong 5 phút để enzyme ficin hòa tan hoàn
toàn trong nước.
- Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 3.000 vòng/phút trong thời gian 10 phút để cao su đông
đặc lại và lắng xuống. Loại bỏ phần lắng ở phía dưới, thu dịch nổi bên trên.
- Dùng phương pháp tủa phân đoạn enzyme bằng ethanol 96% để thu lấy các phân đoạn
và xác định hoạt tính enzyme trong các phân đoạn.
- Nhũng phân đoạn có hoạt tính enzyme được đưa qua lọc gel để loại bỏ các tạp chất
trong các phân đoạn enzyme.
 - Các phân đoạn sau khi qua cột gel sẽ được xác định lại hoạt tính, trộn với tinh bột với
tỷ lệ 1:1 rồi sấy khô ở nhiệt độ 400C. Chế phẩm enzyme thu được ở dạng bột sẽ
được bảo quản ở nhiệt độ 0– 40C.
2.6. Chiết và tinh chế enzyme từ vi sinh vật
Tùy theo yêu cầu của ứng dụng enzym mà ta cần enzym sạch và enzym không
sạch(chế phẩm thô, chế phẩm tinh).
Chế phẩm enzym thô thường chứa nhiều loại enzym khác nhau, chứa thành phần
môi trường chưa được đồng hóa và vi sinh khối tế bào vi sinh vật.
Chế phẩm enzym tinh là sản phẩm được tách khỏi dung dịch môi trường và tách
khỏi tế bào vi sinh vật, sau đó được tinh sạch bằng cách kết tinh, làm khô. Các chế phẩm
enzym tinh khiết được ứng dụng sản xuất các sản phẩm tinh khiết, vô trùng. Thông
thường chế phẩm enzym tinh chứa một loại enzym, cũng có một số trường hợp enzym
tinh chứa một số enzym cùng loại. Các enzym tinh thưòng sử ụng trong công nghiệp nhẹ,
mỹ phẩm, y học và trong một số công nghệ thực phẩm.
Quá trình thu nhận enzym sạch được trình bày như sau:
2.6.1 .Thu nhận enzym sạch từ nuôi cấy bề mặt:
Việc thu nhận enzym sạch từ nuôi cấy bề mặt bao gồm 2 giai đoạn:
2.6.1.1.Chiết rút enzym từ môi trường nuôi cấy bề mặt:
Công đoạn chiết rút enzym từ môi trường nuôi cấy bề mặt rất phức tạp.
Giai đoạn tinh chế dễ hay khó phụ thuộc rất nhiều vào công đoạn này. Khi tiến
hành chiết rút enzym từ canh trường ta thu được không chỉ có enzym hòa tan trong nước
mà còn thu được rất nhiều sản phẩm thủy phân từ cơ ché của môi trường và cà chất màu
của chính nấm mốc tạo ra. Hiện nay có hai phương pháp chiết rút enzym từ canh trường
nuôi cấy bề mặt:
a. Phương pháp thủ công:
Trong phương pháp thủ công chế phẩm enzym thô được nghiền nhỏ( nghiền bằng
cối với các thạch anh hoặc với bột thủy tinh sau khi được xử lí sạch hoặc máy nghiền.
Mục đích của quá trình này là làm tăng khả năng thu nhận enzym trong dịch chiết từ tế
bào vi sinh vật. Dịch chiết thu nhận được từ phương pháp này rất đục do trong đó chứa
rất nhiều chầt khác nhau.
b. Phương pháp chiết rút enzym bằng các thiết bị khuếch tán.
Trong phương pháp chiết rút bằng các thiết bị khuếch tán, các enzym được chuyển
từ tế bào vào nước do sự chêch lệch nồng độ enzym từ tế bào vào nước. Thiết bị dùng
cho quá trình này bao gồm nhiều thiết bị khuếch tán được lắp đặt nối tiếp nhau. Quá trình
khuếch tán được thực hiện như sau:
Nước (dung môi) được đưa từ bể khuếch tán chứa chế phẩm nấm mốc có hàm
lượng enzym và các chất tan khác thấp nhất. Dung dịch sau khi khuếch tán chứa nồng độ
enzym cao hơn sẽ đi từ bể khuếch tán có chế phẩm nấm mốc mới nạp vào. Như vậy, vấn
đề trở nên phức tạp trong điều hành. Để dễ hiểu ta xem cách vận hành cụ thể như sau:
Chế phẩm nấm mốc được đưa vào bể khuếch tán thứ nhất, đồng thời ta đưa nước
vào, giữ chế phẩm nấm mốc trong nước một thời gian. Tuần tự như vậy ta tiến hành với
tất cả các bể còn lại. Dòng chảy của dịch khuếch tán từ bể này sang bể khác sẽ làm giàu
hơn lượng khuếch tán vào. Dịch khuếch tán cuối cùng sẽ được bơm vào bể thu nhận và từ
bể khuếch tán thứ nhất, sau khi tháo bã nấm mốc được nối vào vị trí cuối cùng của dãy
khuếch tán. Khi đó bể khuếch tán thứ hai trong lúc này của bể thứ nhất. Trong quá trình
khuếch tán, nhiệt độ được duy trì là 25-280 C và cho thêm focmalin để tránh nhiễm trùng.
Dịch khuếch tán hay dịch chiết enzym được cô đặc dưới áp suất thấp trong chân không để
hàm lượng chất khô ít hơn 50-55%.
2.6.2 Thu nhận enzym từ phương pháp bề sâu:
Dung dịch lên men từ phương pháp nuôi cấy bề sâu, sau khi tách khối vi sinh vật
chứa hàm lượng chất khô rất thấp (khoảng 1 – 3 %). Do đó, để giảm chi phí dung môi
hoặc muối trung tính trong quá trình kết tủa ta phải cô đặc dung dịch này.
Phương pháp cô đặc phải sao cho hoạt tính dung môi không thay đổi. Muốn vậy
dung dịch phải được cô chân không ở nhiệt độ thấp, khoảng 25 – 300C. Lượng dịch sau
cô đặc sẽ giảm 4 – 10 lần. Phương pháp tốt nhất là cho dịch qua cột nhựa trao đổi ion
hoặc các chất hoạt động bề mặt. Hiện nay, người ta áp dụng một số phương pháp thu
nhận enzym từ dịch lọc của phương pháp bề mặt sâu như sau:
 a.Phưong pháp thu nhận enzym bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ
hoặc bằng muối trung tính từ dịch chiết của canh trường nuôi bề mặt. Dịch nuôi cấy từ
phưong pháp bề sâu phải làm cô đặc lại. Thao tác và các yêu cầu kỳ thuật tương tự như
phương pháp thu nhận kết tủa enzym từ môi trường nuôi cấy bề mặt.
b.Phương pháp hấp thụ hoàn toàn bởi silicagen. Được thực hiện ở pH 4,7 – 4,9.
Cách tiến hành được thực hiên như sau: cho dịch enzym chảy qua cột nạp đầy silicagen.
Sau đó tách silicagen ra. Để tăng quá trình hấp phụ, người ta cho thêm 6 – 20% NaCl.
Sau đó silicagen được rửa bằng photphat natri ở pH= 8 – 8,4 hoặc bằng cacbonat natri
2%. Bằng cách này ta có thể thu được nước lọc từ canh trường nuôi cấy bề sâu xuống 8 –
10 lần. Sau đó rút enzym ra, silicagel được tái sinh lại bằng cách nung ở nhiệt độ 160 –
1700C hoặc cũng có thể xử lí bằng HCl 1N và rửa cẩn thận bằng nước cất.
Dung lượng hấp thụ của 1 gam silicagel là 60 – 120 - amilaza.
2.6.3 Tinh chế enzym
Để tinh chế enzym người ta dùng các dung môi hữu cơ để kết tủa, hoặc dùng một
số trung tính kết tủa.
a. Phương pháp kết tủa bằng dung môi hữu cơ
Dung môi hữu cơ được dùng để kết tủa enzym bao gồm: etanol, izopropanol,
axeton. Các loại dung môi này làm giảm hằng số điện môi của môi trường. Khi đó lực hút
và lực đẩy tỷ lệ thuận với hằng số điện môi. Do đó, trong dung dịch toàn bộ các protein
enzym và toàn bộ các protein khác cũng như các tạp chất phân tử khác đều bị kết tủa. Do
sự giảm hằng số điện môi nên các phân tử tương tác với nhau tạo thành một tập hợp và
đợt và sẽ lắng xuống.
Các yếu tố có ảnh hưởng đến hiện tượng này bao gồm nồng độ dung môi, nhiệt độ,
phản ứng môi trường, lực ion của dung dịch và tính chất của enzym. Kết tủa enzym bằng
etanol người ta thực hiện trong các điều kiện kỹ thuật sau:
- Kết tủa trong điều kiện nhiệt độ từ 3 – 50 C. Thông thường, người ta phải làm lạnh
dung dịch chiết enzym và dung môi để tránh biến tính enzym.
- Khối lượng etanol cho vào gấp 3 – 4 lần thể tích dịch chiết enzym.
- Khuấy đều để phân phối etanol trong dung dịch.
 - Sau khi có kết tủa đem lọc hoặc đem ly tâm để thu nhận kết tủa.
- Rửa kết tủa bằng rượu đậm đặc 2 – 3 lần để tách bớt lượng nước trong kết tủa và
đem sấy chân không.
- Kết tủa enzym bằng izopropanol ta thực hiện các điều kiện kỹ thuật như sau:
+ Khối lượng izopropanol gấp 1,5 – 2 lần khối lượng dịch chiết enzym.
+ Các điều kiên khác thực hiện như thực hiện đối với etanol. Kểt tủa thu được từ
việc sử dụng etanol là một kết tủa dạng bột nhão và dính, do đo khi tiến hành sấy sễ
gặp rất nhiều khó khăn.
Kết tủa enzym bằng axetol ta cần lượng axetol nhiều hơn 1,5 – 2 lần dịch chiết
enzym. Điều lưu ý là axetol là một chất rất dễ gây cháy nổ, do đó việc thực hiện phải
rất cẩn thận.
Trong tất cả các phương pháp trên người ta cho thêm 0,2% CaCl2 để làm tăng
khả năng kết tủa của enzym và làm bền cấu trúc của chúng.
Khi cần tách riêng biệt một enzym nào đó ra khỏi hỗn hợp enzym kết tủa trên,
ta sẽ dựa trên độ hòa tan khác nhau trong hỗn hợp etanol và các enzym đó để tách.
b. Phương pháp kết tủa enzym bằng một số muối trung tính.
Muối trung tính dùng để kết tủa enzym là: sulfat amon, sulfat natri, sulfat
magie.Trong đó người ta cho biết loại tốt nhất là sulfat amon vì độ hòa tan của chúng
cao, phản ứng kết tủa không phụ thuộc vào nhiệt độ và chúng không làm biến tính các
enzym. Kết tủa bằng sulfat amon thường thu được các kết tủa enzym có hoạt tính cao hơn
các kết tủa enzym từ phương pháp dùng dung môi hữu cơ.
Nhược điểm lớn nhất của phương pháp kết tủa enzym bằng phương pháp trung
tính là lượng muối trung tính dùng quá nhiều, thường tới 50 – 60% so với dung dịch chiết
enzym. Mặt khác, nếu trong phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ để kết tủa, thì ngoài
việc thu được kết tủa ta còn có thể tái thu hồi dung môi hữu cơ. Nhưng trong phương
pháp kết tủa bằng muối trung tính ta lại không thể tái thu hồi muối trung tính. Do đó, để
giảm giá thành ta có thể thực hiện bằng cách là làm cô đặc dịch chiết enzym trước khi
cho kết tủa enzym.
2.6.4 Phương pháp thu nhận một số enzym quan trọng từ vi sinh vật(VSV):
2.6.4.1. Thu nhận enzym protease từ VSV:
• Nguồn thu nhận enzym protease:
Nhiều VSV cố khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzym này có trong tế bào
hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy. Một số protease ngoại bào đã được sản xuất theo
quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong quy mô công nghiệp, trong nông
nghiệp và trong y học.
Một số VSV có khả năng tổng hợp mạnh protease:
Vi khuẩn: Bac.subtilispha, Bac.cireulans, Bac.sphaericus, Bac.brevis, Bac.cerus…
Xạ khuẩn: Str.griseus, Str.rimous, Str.fradiae,…
Nấm mốc: Asp.oryzae, Asp.satoi, Asp.niegr, Pen.chrysogenum, Pen.cyaneo
fulvum, Mucor.pusillus
• Các phương pháp thu nhận enzym protease
a. Nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt
Là phương pháp kinh tế nên được sử dụng rộng rãi.
Môi trường thường dùng là cám, có pH từ 5,6-6,2( đối với nấm sợi) hoặc từ 6,2-
7,2 ( đối với vi khuẩn). Cho môi trường vào những khay lớn để nuôi cấy. Thời gian nuôi
cấy thay đổi tùy vào vi sinh vật, do đó với mỗi VSV cần lựa chọn thời gian thích hợp
nhất ( thời gian mà luợng enzym trong môi trường là lớn nhất). Nói chung, đối với đa số
nấm sợi mesofil có thể nuôi từ 32-42 giờ. Sau đó dùng nước hoặc dung dịch nuôi để chiết
rút enzym khỏi môi trường, loại bỏ nhũng phần không hòa tan, kết tủa enzym bằng muối
vô cơ hay dung môi hữu cơ.
b. Nuôi cấy bằng phương pháp bề sâu
Chuẩn bị môi truờng thích hợp ngay trong thùng lên men và khử trùng. Sau khi
làm lạnh, cấy VSV vào với tỷ lệ 1-10%. Sau một thời gian nuôi cấy, tiến hành kiểm tra
hoạt độ enzym của dịch môi trong trường cấy. Khi hoạt động đã đạt đến cực đại cần
nhanh chóng tách enzym ra khỏi tế bào VSV bằng cách ly tâm hay lọc.
Khi dùng phương pháp bề sâu, muốn có kết quả tốt cần xác định cho được lượng
oxy cần thiết trong thời gian sinh trưởng mỗi loài VSV. Thể tích thùng lên men càng lớn
càng khó khống chế yếu tố này. Ở Nhật thường dùng các thùng lên men 20-30m3.Theo
các tác giả Nhật nên cấy vào các thùng lên men(chứ không qua giai đoạn nuôi cấy trung
gian) sẽ bảo đảm môi trường khỏi bị nhiễm.
c. Thu nhận enzym protease:
Tách enzym: Như trên đã nói, để tách enzym từ môi trường nuôi cấy theo VSV
theo phương pháp bề mặt, có thể dùng dung dịch đệm thích hợp, dung dịch muối loãng
hoặc nước để chiết rút enzym. Cho canh trường sau khi nuôi cấy vào dung dịch đã nói
trên theo một tỷ lệ thích hợp, khuấy lắc đều trên máy lắc trong một thời gian xác định, lọc
hoặc li tâm, thu lấy dung dịch trong. Trong sản xuất thường dùng máy để chiết rút enzym
trong một giờ. Tiến hành theo phương pháp này cho kết quả rất tốt.
Trong trường hợp nuôi cấy theo phương pháp bề sâu, trước hết cần làm lắng tế bào
VSV hoặc ly tâm để tách sinh khối khỏi dung dịch enzym. Quá trình này là một giai
đoạn quan trọng nhất và khó khăn nhất trong kỹ thuật sản xuất chế phẩm enzym. Ở Nhật
bản đã tìm đựoc phương hướng thích hợp để làm trong nước chiết và dịch môi trường
nuôi cấy. Theo các tác giản Nhật thì nên lọc chứ không nên ly tâm vì khi ly tâm thường
làm giảm đáng kể hoạt động enzym.
2.6.4.2. Thu nhận enzym amylase từ VSV
Hệ enzym amylase là một trong số các hệ enzym đựoc sử dụng rộng rãi trong nhất
trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực kinh tế quốc dân khác.
Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzym nói chung và về amylase nói
riêng được bắt đầu vào những năm 1811-1814.
Các enzym amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong
hạt nảy mầm, nấm sợi, vi khuẩn, nấm men và vi khuẩn.
• Nguồn enzym amylase từ VSV
Trong thiên nhiên enzym có nhiều ở hầu hết ở thực vật, động vật và vi sinh vật.
Song chỉ có một số hạt thực vật và một số loài VSV mới là những đối tượng có thể dùng
làm nguồn thu các chế phẩm enzym do chúng có khả năng tích lũy một lượng lớn các
enzym này trong những điều kiện xác định.
Ngày nay, do có ưu thế về nhiều mặt, VSV đã trở thành nguồn thu enzym chỉ đạo.
Người ta biết nhiều loại VSV có thể năng tổng hợp các enzym amylase. Những chủng
VSV tạo nhiều amylase thương được phân lập từ nguồn tự nhiên, bởi vì các loài khác và
thậm chí các chủng VSV khác nhau cũng thường sản sinh ra nhiều hệ enzym khác nhau.
VSV tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi, giá nấm men và vi khuẩn,
còn xạ khuẩn thì ít hơn.
• . Thu nhận enzym amylase từ VSV
Muốn thu được các enzym amylase với hiệu suất cao cần phải tiến hành phân lập,
và chọn giống VSV để tuyên truyền lấy nhưng chủng hoạt động mạnh, đồng thời phải
tiến hành lựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trường tối thích cũng như tiêu
chuẩn hóa các điều kiện nuôi. Như vậy là sự tổng hợp enzym amylase không những chỉ
phụ thuộc vào các tính chất di truyền của VSV mà còn phụ thuộc vào việc tuyển chọn các
điều kiện nuôi đặc hiệu.
Ngoài các yếu tố hóa học ( thành phần môi trường) ra, cá điều kiện lý hóa của quá
trình nuôi cũng có một ý nghĩa rất lớn đối với sinh tổng hợp các enzym amylase. Người
ta đã chứng minh rằng có thể dùng điều kiện nuôi khác nhau ở quy mô công nghiệp. Ví
dụ, có thể dùng Bac.sublilis để thu chủ yếu là phức hệ amylase hạơc chủ yếu là phức hệ
protease.
Trong số những yếu tố có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp các enzym amylase
trong quá trình nuôi VSV, thì thành phần môi trường tính chất cơ lý của môi trường, độ
tiệt trùng, độ ẩm ban đầu, độ thoáng khí, nhiệt độ nuôi và pH môi trường… là những yếu
tố cơ bản tối quan trọng. Có hai phương pháp nuôi VSV là phương pháp bề mặt và
phương pháp bề sâu.
a.Nuôi VSV tạo amylase bằng phương pháp bề mặt
Hầu hết VSV tạo amylase đều hấp carbon chủ yếu ở dạng các hợp chất hữu cơ
( tinh bột, dextrin), hydro ở dạng H2O và của các hợp chất hữu cơ, oxy ở trong thành
phần cấu tử cơ bản của môi trường và ở dạng oxy phân tử.
Cấu tử chính của môi trường VSV tạo amylase bằng phương pháp bề mặt là cám
mì, cám gạo. Cám mì, cám gạo là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy nhất
của môi trường để nuôi VSV không cần bổ sung thêm các chất khác nữa. Chất lượng của
cám mì, cám gạo có ảnh hưởng lứon tới hoạt lực của các emzym amylase.
 Yêu câu: hàm lượng tinh bột trong cám >= 20-30%, độ ẩm không quá 15%, tạp
chất độc không quá 0.05%, nên dùng cám tốt, cám mới không có dư vị chua hay đắng,
không hôi mùi mốc.
Có thể thay thể cám bằng một số cấu tử rẻ tiền hơn. Các cấu tử được đưa vào có
thể là chất làm xốp môi trường mà cám không có đủ. Các cấu tử này thường là mầm
mạch (15-20%) , trấu( 2-25%) mùn cưa(5-10%), có thể dùng cặn bỏ môi trường rắn( sau
khi tách lyenzym) làm cấu tử chính của môi trường.
Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử VSV khác nên cần phải thanh trùng để
đảm bảo nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa VSV ngoại lai.
Cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1-1.5 atm trong vòng 4-6h, có thể thanh trùng loãng hơn
nóng ở nhiệt độ 120 độ C trong 90 phút. Khi thanh trùng cho vào 0,2% formalin(40%) và
0,8% HCl kỹ thuật theo khối lương.
Độ ẩm tối thích của môi trường: độ ẩm ban đầu 58-60%, và giữ độ ẩm này trong
suốt quá trình nuôi. Độ ẩm tăng quá 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 55-
50% thì kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV cũng như tạo enzym amylase.
Trong quá trình sinh trưởng của mình VSV tiêu thụ 25-35% chất dinh dưỡng của
môi trường và thải ra một lượng lớn nhiệt sinh lý và CO2. Vì vậy cần phải thải nhiệt này
bằng cách thông gió với không khí vô trùng có độ ẩm tương đối khoảng 100%. Chế độ
thông khí có thể liên tiếp, gián đoạn (hoặc không khí tự nhiên) tùy thuộc vào chiều dày
của lớp môi trường nuôi, vào khoảng cách giữa các tầng khay và dây khay thường là giai
đoạn sinh truởng thứ nhất phải thông khí vào phòng nuôi khoảng 4-5 lần thể tích không
khí trên một thể tích phòng trong một giờ, còn giai đoạn thứ hai là 30-60 thể tích không
khí trên thể tích phòng nuôi/1 giờ, còn giai đoạn thứ ba giảm đi còn 10-12 thể tích không
khí.
Nhiệt độ nuôi: tòan bộ chu kỳ sinh trưởng của nấm mốc trên cám có thể chia làm 3
thời kỳ:
+ Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử (đối với nấm mốc 10-11 giờ đầu
tiên), đối với vi khuẩn 3-4 giờ thời kỳ này phải đốt nóng không khí phòng nuôi và giữ
cho nhiệt độ phòng nuôi không thấp hơn 23-30 độ C đối với nấm mốc và duy trì nhiệt độ
32-38 độ C cho vi khuẩn. Độ ẩm tương đối của không khí 96-100%
+ Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi ( kéo dài trong vòng 4-18 giờ). Thời kỳ
này cần hạ nhiệt độ phòng giúp sợi nấm mọc đều và đẹp. Ở nhà máy ngưòi ta thổi không
khí vô trùng có nhiệt độ 28-29 độ C và độ ẩm cao vào phòng nuôi.
Để tăng cường khả năng sinh trưởng của VSV và khả năng tạo enzym có thể thêm
nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô, nước cám nấu nước chiết bột đậu nành.
Một trong các điều kiện quan trọng có ảnh hưởng lớn tới sinh tổng hợp các enzym
amylase ở các chủng VSV nuôi chìm là nông độ ionhydro trong môi trường và sự biến
đổi của nó trong quá trình sinh trưởng của chủng nuôi.
Độ acid của canh trưởng đựoc xác định bởi thành phần và tính chất của các muối
vô cơ thêm vào môi trường cũng như sự tiêu thụ các muối này bởi VSV. Trước hết, pH
của canh trường phụ thuộc vào tính chất của nguồn nitơ vô cơ. Nếu như thêm vào môi
trường các muối ammonium, thì khi VSV tiêu thụ ion ammonium, các anion được giải
phóng ra sẽ acid hóa môi trường. Vì thế cần phải cho thêm CaCO3 vào để trung hòa môi
trường hoặc duy trì tự động giá trị pH thích hợp cho việc tổng hợp các enzym amylase.
Khi nguồn nitơ vô cơ được dùng là các muối nitrate, thì trong quá trình VSV tiêu
thụ anion (NO3) sẽ giải phóng ra các ion kim loại và môi trường bị kiềm hóa pH tăng
lên. pH ban đầu của môi trường để nuôi Asp.oryzae 3-9-15 nhằm thu -amylase là 5.5-
5.7 (môi trường sapeck cải tiến có 6% tinh bột, nước chiết mầm mạch và NaNO3 ). Trong
quá trình nuôi môi trường bị kiềm hóa dần dần và tới cuối ký sinh trưởng canh trưởng có
pH 7.8-8.2. Trong trường hợp này, sự kiềm hóa tự nhiên môi trường khi VSV sử dụng
NaNO3 làm nguồn nitơ vô cơ có ảnh hưởng tốt tới sinh tổng hợp -amylase (là 7-8) khác
hẳn giá trị pH tối thích đối với hoạt động của enzym (pH 4,7-4,9). Khi điều chỉnh pH tới
giá trị ban đầu hoặc chỉ acid hóa một chút thôi (pH=6) thì họat lực -amylase cũng giảm
đi nhiều (gần bằng 23%). Khi dùng các muối ammonium phosphate làm nguồn nitơ để
nuôi chủng mốc này thì pH tối thích của môi trường phải nằm trong vùng 6-7. Để thu
glucoamylase ngưòi ta nuôi Asp.awamori 22 trong môi trường Sapeck có 6% tinh bột.
Glucoamylase tích lũy cực đại trong canh trường ở ngày thứ 3 tại pH = 8.pH tối thích ban
đầu cho chủng này sinh trường là 7,0-7,2. Khi kết thúc pH canh trường là 7,6-8,0
(Fenikxova. Silova,1960). pH môi trường để nuôi vi khuẩn Bac. Subtilis nhằm thu hút -
amylase thích hợp nhất là 6,3-7,9. Nên pH ban đầu cao hơn 7,5 hay thấp hơn 7,0 đều
giảm vận tốc sinh tổng hợp enzym, còn nếu pH bằng 8,8-9,0 thì vi khuẩn hầu như không
phát triển.
Nhiệt độ nuôi: Nhiệt độ nuôi cũng là một yếu tố quan trọng đối với sinh truởng
của VSV và sự tạo thành các enzym amylase. Không tuân thủ đầy đủ chế độ nhiệt độ sẽ
dẫn đến làm giảm hoạt lục các enzym amylase. Nhiệt độ nuôi tối thích đối với nấm sợi
thuộc giống Aspergillus là 30-320C ( trong đó có Asp.oryzae 3-9-15 và Asp.awarmoni
22). Đối với -amylase, môi trường thích hợp nhất và tạo nhiều amylase ở nhiệt độ 37 0C.
Một số vi khuẩn khác laị có nhiệt độ sinh trưởng tối thích cao hơn. .diataticus sinh
trưởng tốt ở nhiệt độ 65-700C song lại tạo nhiều amylase hoạt động ở 500C vì vậy người
ta thường cấy giống ở nhiệt độ 700C còn tiến hành cho tích lũy amylase ở 50 0C nuôi
chủng loại này bằng môi trường lỏng có nước nấu khoai tây, pepton và phấn. Nhiệt độ
nuôi có ảnh hưởng rất lớn tới độ bền nhiệt của enzym tạo thành amylase của
Bac.coagulans và Bac.slerothermophilus đuợc nuôi ở 350C và 550C có độ bền nhiệt khác
xa nhau. Khi giữ ở 900C trong 1 giờ thì amylase của chủng sinh trưởng ở nhiệt độ 350C bị
mất 90-94% hoạt độ ban đầu; trong lúc đó amylase của chủng được nuôi ở nhiệt độ 55 0C
chỉ bị vô hoạt có 10-12% (Campell,1955). Các VSV ưa nhiệt(vi khuẩn) sinh tổng hợp nên
các amylase bền nhiệt. Enzym với độ bền nhiệt cao có ưu thế lớn trong nhiều lĩnh vực
sản xuất. Ngoài ra nuôi vi khuẩn ưa nhiệt lại rất tiện lợi cho sản xuất công nghiệp. Vì
nuôi ở nhiệt độ cao tạo ta điều kiện chọn lọc và cho phép giảm bớt yêu cầu khắt khe về
độ tiệt trùng, đồng thời khi nuôi đỡ bị nhiễm.
Sục khí và khuấy trộn: Phần lớn VSV tạo amylase là những VSV hiếu khí. Vì vậy
sinh trưởng của chúng phụ thuộc vào lượng oxy phân tử hòa tan trong dịch nuôi cấy.
Trong quá trình sinh trưởng của mình, VSV sử dụng oxy phân tử cho hoạt động sống nên
lượng oxy hòa tan trong môi trường lỏng phải luôn luôn được bổ sung. Chính vì lẽ đó,
việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới sinh trưởng và tích lũy sinh khối
cũng như sinh tổng hợp các enzym của VSV.
 Việc khuấy đảo môi trường dinh dưỡng trong quá trình nuôi VSV có thể thực hiện
bằng nhiều cách khác nhau:
- Sục không khí vô trùng vào thiết bị nuôi
- Bằng máy các kiểu chuyên dùng
- Bằng tác dụng hiệp đồng của cả sục khí lẫn máy khuấy
- Bằng tác dụng của cả khí sinh ra khi lên men.
Nhiều công trình nghiên cứu đã xác nhận rằng muốn nuôi VSV tạo enzym (cả
nấm sợi, nấm men và vi khuẩn) có hiệu suất cao thì phải khuấy đảo môi trường bằng
sục khí hoặc bằng máy khuấy làm việc liên tục trong suốt quá trình nuôi. Việc chọn
chế độ sục khí thích hợp sẽ có tác dụng khá quyết định không chỉ đối với sự sinh
trưởng và phát triển của VSV hiếu khí trong điều kiện nuôi chìm mà còn đối với sự
sinh tổng hợp enzym amylase nữa.
Đối với nấm sợi, chế độ sục khí thích hợp là 10-12m3 không khí vô trùng (có
nhiệt độ cao không quá 400C ) trên 1m3 môi trường trong 1 giờ với thời gian nuôi
trong khoảng 68-72 giờ. Với thời gian nuôi ngắn hơn ở các thùng lên men nhân giống
(48 giờ) thì lượng không khí cần sục vào môi trường để nuôi Asp.oryzae (3-9-15) phải
là 30m3/m3 môi trường/ giờ đối với thùng nhân giống và 40m3/m3 môi trường/giờ cho
thùng sản xuất. Mức độ sục khí tối ưu để nuôi Asp.oryzae (3-9-15) tương ứng với 180
micromol O2/lít môi trường (nồng độ oxy hòa tan đo bằng máy cực phổ với điện cực
kiểu clark). Chủng này có vận tốc tiêu thụ oxy hòa tan cực lớn vào cuối pha sinh
trưởng. Vận tốc tiêu thụ O2 giảm dần từ lúc bắt đầu pha ổn định. Nuôi VSV ưa nhiệt
đòi hỏi nhiều không khí hơn là nuôi VSV ưa ẩm. Điều này cũng dễ hiểu thôi, bởi lẽ ở
nhiệt độ tương đối cao (50-650C), độ hòa tan của oxy trong môi trưòng giảm xuống,
mặc dù nhu cầu của VSV ưa nhiệt độ oxy cho các phản ứng oxy hóa có tăng lên.
Nguời ta nuôi Bac.subtilis trong thùng nhân giống (15 giờ ở 370C) có cánh
khuấy làm việc liên tục và sục không khí vô trùng vào môi trường với lượng là
40m3/m3 môi trường/giờ. Còn nuôi vi khuẩn này trong thùng lên men sản xuất (trong
48 giờ ở 370C) có cánh khuấy liên tục và sục không khí vô trùng với lượng 60m3/m3
môi trường/giờ. Thời gian nuôi VSV để có lượng amylase cực lớn trong phưong pháp
nuôi chìm phụ thuộc vào đặc tính sinh lý của chúng, vào phương pháp nuôi và một số
yếu tố liên quan. Việc xác minh thời gian nuôi tối thích cũng đựoc tiến hành bằng
thực nghiệm. Chẳng hạn ngưòi ta nuôi Asp.oryzae (3-9-15) trong thùng lên men nhân
giống 48 giờ, còn nuôi trong thùng lên men sản xuất thì khoảng 48-52 giờ. Lượng
giống đem cấy vào thùng lên men là 8-10% so với tổng thể tích môi trưòng dinh
dưỡng.
Trong công nghiệp rượu, khi nuôi nấm Aspergillus bằng phương pháp gián
đoạn thì thời gian nuôi tối thích là 68-72 giờ. Tuổi của nấm tốt nhất là 24-30 giờ và
lượng vật liệu gieo cấy là 10% so với tổng thể tích môi trường dinh dưỡng. Khi nuôi
bằng phương pháp tuần hoàn liên tục và phương pháp dòng chảy liên tục, thời gian
nuôi sez ngắn hơn rất nhiều (30-40 giờ) Asp.oryzae 22 sản sinh glucoamylase cũng
đựơc nuôi trong thùng nhân giống 48 giờ và nuôi trong thùng lên men sản xuất 52
giờ hay hơn nữa. Thời gian nuôi Bac.diastalicus ( để thu chế sản phẩm superbiolase
dùng trong công nghiệp bia và công nghiệp dệt) trong thùng nhân giống kéo dài 15
giờ, còn trong thùng sản xuất tới 48 giờ với lượng giống cho vào là 10% so với thể
tích môi trường dinh dưỡng. Đối với Endomycopsis sp. Thời gian nuôi để có lượng
amylase cực lớn phải tới 80 giờ.
2.6.4.3. Thu nhận enzym pectinase từ VSV
Enzym pectinase là enzym xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin. Sự
phân hủy pectin trong tự nhiên thườn xảy ra khi trái cây chín. Những enzym này vì
vậy có một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả.
. Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh trường bề mặt
Môi trường sử dụng để nuôi cấy VSV để thu nhận pectinase thường là cám
gạo, hay cám mì, bã củ cải hoặc thóc mầm…Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường là
các muối ammonim, phosphoric… Độ ẩm môi trường phải nằm trong khoảng 60%.
Nấm mốc A.awamori thường được nuôi cấy ở 300C trong thời gian 40h, sau đó giảm
xuống 240C và nuôi trong 48-52h. Sản phẩm sau khi lên men được sấy khô thành chế
phẩm enzym thô và đem tinh chế.
 Để thu được chế phẩm pectinase tinh khiết thì chế phẩm enzym thô phải được
trích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hay muối ammonium sulfate.
Dung môi hữu cơ sử dụng để kết tủa enym pectinase có thể là rượu ethanol (72,5-
75%) hoặc isopropanol (55-57%). Muối ammonium sulfate sử dụng có độ bão hòa
0.79. Khi kết tủa bằng rượu ethanol, chế phẩm enzym thu đựoc có độ tinh khiết
khoảng 90%, con nếu bằng muối thì độ tinh khiết đạt khoảng 75%. Nhiệt độ kết tủa
tối ưu đối với rượu là 2-50C, thời gian tiếp xúc với rượu càng ngắn càng tốt. Sau đó, ly
tâm để tách kết tủa khỏi dung dịch, sấy kết tủa trong thiết bị sấy chân không hay sấy
thăng hoa rồi nghiền nhỏ và đem bảo quản.
2.6.4.4 Thu nhận chế phẩm enzym từ canh trường bề sâu
a. Phương pháp yếm khí:
Sự tích tụ enzum trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của VSV gần
đạt đến pha ổn định, khi môi trường bị acid hóa mạnh và khi lượng phospho vô cơ
được sử dụng hoàn toàn.pH của môi trường nuôi cấy thường đạt từ 6-7.2 là thích hợp.
Đối với nấm mốc,pH kiềm hãm sự tổng hợp sinh khối và sự tích lũy enzym
pectinase.pH=4 ức chế hoàn toàn sự tích lũy enzym pectinase. Khi pH dịch về phía
acid, ngay cả khi pH nằm trong khoảng 4,5-5,0 tuy sự tạo thành sinh khối khôngbị
ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzym pectinase bị kìm hãm. Tuy nhiên, pH của các
trường nuôi cấy A.niger và A.awamori có thể dịch về 3,5-3,8 và 2,9-3,2 theo thứ tự.
Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24.32 và 48h tuổi với hàm lượng từ 2-10h.
Đối với A. niger và A. awamori, vật liệu gieo cấy là sợi nấm được ủ sơ bộ trong môi
truờng dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu nứt nanh bào tử. Thời gian ủ sơ bộ thường là
38-42h. Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2%. Trong quá trình nuôi cấy, hàm
lượng các chất hòa tan trong môi trường thường giảm từ 6% xuống còn 1,5-1,8%.
Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng. Cô đặc chân
không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi sấy khô trên thiết bị
sấy phun. Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165-180% và đi
ra đạt 60-70%. Thời gian lưu của chế phẩm enztm trong thiết bị sấy phun phải không
quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy phải không quá 400C. Chế phẩm thu
được cần phải được đóng gói kín để tránh hút ẩm. Có thể thu chế sản phẩm pectinase
tinh khiết bằng cách kết tủa enzym trong dịch lọc canh trường với ethanol theo tỷ lệ
4:1, với aceton theo tỷ lệ 2:1 và isopropanol theo tỷ lệ 1,3:1 hoặc với muối
ammonium sulfate (50-80% trong muối kết). Nếu kết tủa bằng ethanol, hoạt độ
pectinase trong kết tủa sẽ vào khoảng 88-89% so với họat độ của dịch canh trường
ban đầu. Nếu kết tủa bằng muối ammonium sulfate, cần tách muối ra khỏi enzym
bằng phươn pháp thẩm tích (với nước hoặc dung dịch đệm), sau đó sấy khô. Khi độ
bão hòa của (NH4)2SO4 bằng 0,5 thì sẽ kết tủa được đoạn có hoạt độ pectinase thấp
(đoạn này chiếm 0,25% trọng lượng khô), nhưng nếu kết tủa bằng (NH4)2SO4 có độ
bão hòa 1,0 thì sẽ kết tủa được đoạn chỉ chiếm 0,11% nhưng lại có hoạt độ pectinase
cao.
b. Phương pháp yếm khí:
Môi trường: Bã củ cải: 2%; (NH4)2HPO4: 0,75%, KH2P04:0,1%; CaCO3: 0,3%;
nước chiết ngô: 0,5%.
Clostridium pectinofermentants 15 có khả năng tổng hợp pectinase một cách
mạnh mẽ ở pha tăng đồng thời với sự tích lũy sinh khối. Sự tích lũy enzym sẽ tối đa
tương ứng với pha ổn định của sự sinh trưởng qua 55-60h. pH ban đầu cuả môi trường
dinh dưỡnglà 6,5-7,0. Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở dạng canh trường
bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích,Quá trình nuôi cấy được tiến hành ở
nhiệt độ 350C.
Cl. Felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu pectinase. Thành phần
môi trường gồm có:Lactose:20%; pectin củ cải: 1%; (NH4)2HPO4: 0,4%; K2HPO4 :
0.3%; NaCl: 0,1%; MgSO4: 0.025 %; FeSO4: dạng viết; CaCO3: 0,5%; dịch nấm men
tự phân: 0.05%; ascorbic acid: 0,5%.
Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa
enzym với dung môi hữu cơ hoặc với muối ammonium sulfate. Nếu kết tủa bằng dung
môi hữu cơ,pH của dung dịch đã xử lý là 6,5-6,8. Nếu kết tủa bằng 2-2,5 thể tích
aceton thì họat độ của enzym trong kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu.
 Khi kết tủa bằng ammonium sulfate có độ bão hòa bằng 0,2 thì sẽ thu được chế
phẩm chỉ chứa pectinesterase và pectintranseliminase; khi độ bão hòa là 0,9-1 thì sẽ
thu được chế phẩm chỉ chứa pectintranseliminase và exopolygalacturonase.
Phương pháp hiện đại trong chuẩn bị chế phẩm enzym pectinase thưòng theo
các bước cơ bản sau đây:
- Khử muối bằng phương pháp lọc gel (Biogel P100)
- Tách protein bằng phương pháp trao đổi anion (DEAE Bilogel A), hay trao đổi
cation (CM Bilogel A)
- Tách enzym pectinase bằng alginate liên kết ngang
- Tinh sạch bằng FPLC
Aliginate liên kết ngang hoạt động bằng cách kết hợp ái lực, ảnh hưởng tĩnh điện
và thay thế pectate liên kết ngang.
2.6.4.5 Thu nhận enzym cellulase từ VSV
 VSV sinh tổng hợp cellulase
Trong điều kiện tự nhiên, cellulase bị phân hủy vởi VSV cả trong điều kiện hiếu
khí và yếm khí. Các loài VSV thay phiên nhau phân hủy cellulase đến sản phẩm cuối
cùng là glucose.
Số lượng các loài VSV tham gia sinh tổng hợp các enzym cellulase có trong điều
kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số
trường hợp còn thấy cả nấm men.Một số loài VSV được nghiên cứu: Altenaria tennuis,
Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Penicillium Spp, Trichoderma reesei,
Actinomycees spp…
• . Phương pháp thu nhận enzym cellulase
VSV có khả năng sin tổng hợp cellulase thuộc ba nhóm: nấm sợi, xạ khuẩn và vi
khuẩn. Trong công nghiệp sản xuất sản xuất enzym cellulase hiện nay, người ta chủ yếu
nuôi cấy sợi nấm sợi và xạ khuẩn, còn vi khuẩn ít được ứng dụng trong sản xuất.
Để thu nhận enzym cellulase từ nấm sợi và xạ khuẩn, người ta thường nuôi cấy
theo phương pháp bề mặt bằng môi trường xốp (còn gọi là môi trường bán rắn). Cả xạ
khuẩn và nấm sợi đều phát triển rất tốt trong môi trường có độ ẩm là 60-65%, có cơ chất
là cellulase. Thành phần môi trường nuôi cấy cạ khuẩn và nấm sợi rất đa dạng, trong đó
vừa phải đủ chất dinh dưỡng, vừa phải có cơ chất là cellulase và phải có độ xốp nhất định
để không khí có thể lưu thông từ bên ngoài môi trường vào trong khối môi trường.Cả hai
nhóm xạ khuẩn và nấm sợi đều là những VSV hiếu khí nên trong quá trình nuôi thường
xuyên phải được cung cấp oxy.
Điểm khác biệt lớn nhất trong khi nuôi nấm sợi và xạ khuẩn là xạ khuẩn phát triển
mạnh trong môi trường kiềm và môi trường acid yếu, còn nấm sợi phát triển ở môi
trường acid. Do đó, khi chế tạo môi trường cần lưu ý tạo pH môi trường ban đầu cho xạ
khuẩn từ 6,2-7,6, còn pH môi trường ban đầu cho nấm sợi từ 4,5-5,5.
Thời gian phát triển và sinh tổng hợp enzym cellulase củ xạ khuẩn và nấm sợi
cũng khác nhau.Xạ khuẩn thường có thời gian phát triển và sinh tổng hợp cellulase dài
hơn nấm sợi thông thường, nấm sợi phát triển từ 36 giờ đến 48 giờ đã cho hoạt tính
enzym cellulase rất cao. Trong khi đó, xạ khuẩn phải mất ít nhất là 72 giờ mới tổng hợp
cellulase nhiều.
Điểm khác cuối cùng là khả năng chịu nhiệt của cả hai nhóm VSV này, các loài xạ
khuẩn thường chịu nhiệt tốt hơn các loài nấm sợi. Enzym cellulase của xạ khuẩn cũng
hoạt động ở nhiệt độ cao hơn enzym cellulase của nấm sợi.
Sau khi nuôi cấy trong những điều kiện kỹ thuật tối ưu, người ta thu được chế
phẩm cellulase ở dạng thô. Chế phẩm này chứa nước, sinh khối VSV, thành phần môi
trường và enzum.
Công việc tiếp theo là áp dụng các phương pháp hóa, lý tách nước, sinh khối VSV
sẽ thu được enzym dạng bán tinh khiết. Enzym bán tinh khiết còn chứa nước, protein
không hoạt động và enzym. Bằng phương pháp hóa ký, ta sẽ loại được nước, protein
không hoạt động. Khi đó ta thu được chế phẩm enzym tinh khiết.
Hiện nay, enzym cellulase được ứng dụng rất rộng rãi trong công nghiệp dệt, công
nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm gia súc. Đặc biệt các chế phẩm cellulase thô được
ứng dụng nhiều trong xử lý ô nhiễm môi trường.
Chế phẩm enzym cellulase tinh khiết được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền.
trong kỹ thuật tạo tế bào trần (protoplast), người ta thường dùng chế phẩm enzym
cellulase tinh khiết để phá vỡ thành tế bào thực vật. Ứng dụng enzym cellulase phá vỡ tế
bào thực vật không làm tổn thương các cơ quan bên trong tế bào, đảm bảo sự nguyên vẹn
các nhân tố di truyền. Do đó, phương pháp này đã nhanh chóng thay thế các phương pháp
cơ học và hóa học.
2.6.4.6. Thu nhận enzym lipase từ VSV
• VSV tổng hợp lipase
Trong thiên nhiên có nhiều loài VSV có khả năng sinh tổng hợp lipase. Chúng bao
gồm cả nấm sợi, nấm men và vi khuẩn.
Nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp lipase bao gồm: Asperrgillus spp, Muscor spp,
Rhizopus spp, Penicillium spp, Geotrichumspp.
Nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp lipase bao gồm: Trorulopsis spp, Candia spp.
Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp lipase bao gồm: Pseudomonas spp,
Achromobacter spp, Staphylococcus spp.
• Thu nhận enzym lipase
Trong công nghiệp, người ta thường sản xuất lipase chủ yếu bằng phương pháp
nuôi cấy bề mặt. Trong môi trường có bổ sung chất béo như một cơ chất cảm ứng. Tuy
nhiên, hàm lượng chất béo cho vào môi trường với số lượng rất nhỏ (khoảng<1%) vì chất
béo thường không hòa tan với nước, nếu sử dụng số lượng lớn sẽ ảnh hưởng rất lớn đến
tính chất môi trường.
Chế phẩm thô thu nhận được sẽ được xử lý để tách enzym khỏi môi trường nuôi
cấy và tiến hành loại các tạp chất, cuối cùng là làm kết tủa, tinh chế và thu nhận enzym
tinh khiết. Enzym lipase được ứng dụng nhiều trong sản xuất các chất tẩy rửa, trong sản
xuất phomai.
2.6.4.7 Thu nhận enzym glucose iso merase
Enzym glucose iso merase còn gọi là D-glucoseket toisomerase Enzym này được
ứng dụng rất nhiều trong công nghệ sản xuất dịch đường glucose.
• VSV tham gia tổng hợp glucose iso merase
Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện rất nhiều VSV có khả năng sinh tổng
hợp enzym glucose iso merase. Các loài VSV đó được liệt kê trong bảng 6.17.
 Trong đó các chủng thuộc Bacillus và Streptomyces được ứng dụng nhiều trong
sản xuất glucose isomerase theo quy mô công nghiệp. Hãng Novo của Đan Mạch sản
xuất enzym glucose iso merase cũng bằng Bacillus coagulans ở các nước châu Âu, Mỹ,
Nhật và Nam Triều Tiên.
• Thu nhận enzym glucose iso merase
Lượng siro glucose/fructose được sản xuất trên thế giới rất lớn. trong đó,
glucose/fructose được sản xuất nhiều nhất ở Mỹ, Đức, Nhật, và một số nước châu Âu,
Đức và Mỹ là những nước sản xuất glucose-fructose lớn nhất (hàng năm Đức sản xuất
khoảng 10.000-20.000 tấn glucose/fructose). Nhu cầu về glucose/fructose trên thế giới rất
lớn, vì thế người ta sản xuất enzym glucose isomerase với số lượng nhiều để áp dụng cho
nhu cầu trên.
Ở các nước châu Âu, Mỹ, Nhật và Nam Triều Tiên, người ta sản xuất enzym
glucose isomerase chủ yếu bằng vi khuẩn Bacillus coagulans. Vi khuẩn này được nuôi
bằng phương pháp chìm trong môi trường nuôi cấy thích hợp,chúng có khả năng sinh
tổng hợp enzym trong 24 giờ nuôi cấy. Trong môi trường nuôi cấy ngưòi ta thường cho
muối cobalt và magie. Hai loại muối này kích thích quá trình sinh tổng hợp glucose-
isomerase.
Ngoài bacillus coagulans, nhiều nước còn sản xuất glucose-isomerase từ
Actinoplans missouriensis. VSV này có ưu điểm là chúng có khả năng phát triển ở rất
nhiều loại môi trường khác nhau và khả năng sinh tổng hợp glucose-isomerase cũng rất
mạnh.
Để thu nhận glucose-isomerase từ loài Streptomyces, người ta thương nuôi chúng
trong những bình lên men có pH 8,5. Trong số các chủng thuộc loài Streptomyces, người
ta thường nuôi ở nhiệt độ rất cao ( nhiệt độ nuôi trong khoảng 60-70 0C). Các thiết bị lên
men thường được thiết kế và chế tạo có dung tích 22m3.
Sau 24h nuôi cấy, người ta tiến hành ly tâm, thu dịch chứa enzym ngoại bào và
sau đó là áp dụng những phương pháp tinh chế để thu nhận enzym tinh khiết.
2.1 THU NHẬN ENZIM TỪ NGUỒN ĐỘNG VẬT

Trong tất cả các nguyên liệu có nguồn gốc động vật thì tuyến tụy, màng nhày dạ dày, tim,
… những phế liệu của công nghiệp thịt dùng để tách enzym rất tiện lợi. Dịch tụy có chứa
amilase, lipase, protease, ribonuclease và một số enzym khác.

Từ ngăn thứ tư của dạ dày bê người ta thu chế phẩm rennin để làm đông sữa trong sản
xuất phomat. Người ta cũng sản xuất pepsin từ dạ dày động vật. Khác với pepsin, rennin
có khả năng đông tụ sữa cao mà không thuỷ phân sâu sắc casein. Rennin là chế phẩm
enzim có giá trị lớn trong công nghiệp.

Tuy vậy, để sử dụng rộng rãi trong công nghiệp và trong nền kinh tế quốc dân, protease
động vật ít thuận lợi do sản xuất chúng bị hạn chế và lượng nguyên liệu để thu enzim
không lớn lắm. Các nguyên liệu này có thể dùng trong nhiều lĩnh vực khác.

2.6.1 Enzim protease

Hai protease acid quan trọng trong tuyến tiêu hoá ở người và động vật, có nhiều ứng
dụng và được quan tâm là pepsin và rennin, đặc biệt về khả năng đông tụ sữa. Hai enzym
này được thu nhận chủ yếu từ dạ dày động vật (heo, bò, bê..). Ngoài ra có 3 protease
kiềm quan trọng là: Pacreatin, Trypsin [ E.C.3.4.21.4], Chymotrypsin [E.C.3.4.21.1].

 Pepsin [E.C.3.4.4.1]

 Thành phần cấu tạo

Pepsin hoạt động trong dịch vị của động vật có vú, chim, bò sát và cá. Ở heo thì pepsin
tập trung chủ yếu ở phần đáy dạ dày. Pepsin thô là một hỗn hợp của pepsin, gelatinase,
cathepsin và Brucke pepsin. Pepsin thô (heo) chứa một pepsin chính A, pepsin phụ B, C,
D và gastricsin (E.C.3.4.4.22).

Pepsin là một sợi polypeptide đơn giản có thể cuộn lại làm thành hình cầu, là một protein
vững chắc bởi các mối liên kết hydro, hydrophobic, liên kết điện tử và S-S. Pepsin chứa
đặc biệt nhiều amino acid có tính acid nên pepsin thể hiện tính acid mạnh. Số lượng các
amino acid có mạch nhánh không kỵ nước phân cực là lớn, làm cho enzim dễ tan trong
rượu etylic nồng độ cao và trong các hỗn hợp chứa nhiều dung môi phân cực. Do đặc
điểm về thành phần amino acid, pepsin tinh khiết mang điện tích âm ngay cả trong môi
trường HCl 0.1N (theo Herriot, 1940).

 Đặc tính

Chế phẩm pepsin (dược phẩm) tồn tại ở dạng bột vô định hình, trắng hay vàng nhạt hay
mảnh nhỏ, trong hay hơi đặc, mùi đặc biệt giống mùi nước thịt, vị hơi chua, nếu thêm
lactose, glucose hay saccharose thì có vị ngọt (Dược điển Việt Nam).

Điểm đẳng điện của pepsin gần pH = 1. Pepsin thuỷ phân protein trong vùng acid khá
rộng pH 1-4, pH hoạt động tối ưu của pepsin thay đổi tuỳ theo bản chất và trạng thái của
cơ chất thường pH 1.8 – 2.2. Pepsin bền nhất ở pH 4-5, nhưng trong vùng pH này hoạt
lực của enzim có phần thay đổi giảm đi. Từ pH = 5.5 trở lên pepsin không hoạt động.

 Sự hoạt hoá pepsinogen thành pepsin

Pepsin được tiết ra dưới dạng tiền pepsin, tức pesinogen bất hoạt. Khi tiếp xúc với môi
trường acid tự nhiên của bao tử hoặc chính pepsin, pepsinogen sẽ được hoạt hoá thành
pepsin. Toàn bộ quá trình tạo thành pepsin từ pepsinogen có thể biểu diễn như sau:
 pepsin
Pepsinogen phức hợp pH = 5.4 pepsin- chất ức chế +5peptide

Phức hợp pepsin- chất ức chế Pepsin + chất ức chế

pH < 5.4
Chất ức chế Pepsin + chất ức chế

 Tính đặc hiệu và khả năng thuỷ phân protein của pepsin

Pepsin là enzim quan trọng nhất của tuyến dịch vị được tiết vào dạ dày. Nhiệm vụ chủ
yếu là phân cắt sơ bộ protein thức ăn, chuyển sang dạng thích hợp để chuẩn bị cho những
quá trình tiêu hoá triệt để tiếp theo. Pepsin xúc tác sự thuỷ phân giải protein, tạo thành
chủ yếu những pepton, có ít hay không có amino acid tự do.

Tính đặc hiệu của pepsin phụ thuộc vào loai pepsin. Pepsin A và D tính đặc hiệu xảy ra
trong phạm vi rộng hơn pepsin B và C. Pepsin A, D thuỷ phân lên cả hai cơ chất Hb và
APD (acetyl –L- phenylalanin –L- diiodtyrosine) còn pepsin B chỉ có hoạt động lên APD.
Pepsin C hoạt động cơ chất Hb.

 Hoạt động xúc tác của pepsin

Pepsin là một protease thuộc nhóm hydrolase có khả năng phân cắt các liên kết peptide
của protein. Pepsin không có khả năng phân cắt triệt để protein thành các amino acid
riêng lẻ, mà chỉ cắt khoảng 15% nối liên kết peptide của protein tạo pepton có trọng
lượng phân tử nhỏ.

 Những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của pepsin

- Ảnh hưởng của pH: Pepsin là một protease, hoạt động ở vùng pH 1- 4, pH thích hợp
khoảng 1.5–2.4. Đối với mỗi cơ chất thì pH có thể thay đổi.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ: Pepsin hoạt động ở nhiệt độ tối ưu khoảng 40 – 50oC. Ở
70oC mất khả năng tiêu đạm.
 - Ảnh hưởng của các loại muối và các dung môi hữu cơ: Các chất hữu cơ kiềm hay
dung dịch muối kiềm như NaHCO3 làm chậm sự pepton hoá của pepsin. Trong đó,
HCl là acid gây ra sự thuỷ phân mạnh nhất, kế đến là HNO3, HBr, , H3PO4, các acid
lactic, formic, gây tác động kém.
- Các muối lim loại nặng như Hb, Hg, Pt ở nồng độ thấp vẫn gây kết tủa và làm biến
tính enzim.
- Các dung môi hữu cơ ít phân cực làm giảm hoạt tính của pepsin.

 Các phương pháp thu nhận pepsin

Thu nhận dung dịch pepsin

Bản chất của quá trình chiết tách pepsin từ màng nhầy dạ dày là sự phối hợp của ba quá
trình: phá vỡ tế bào, hoạt hóa và chiết tách enzyme. Sản xuất pepsin hiện nay có hai
phương pháp là phương pháp chiết và tự phân, đều dựa trên nguyên tắc: pepsin được giải
phóng từ màng nhầy dạ dày cổ động vật bằng cách chiết trong dung dịch acid loãng (theo
Konne và Muraviep, 1960; Covalines và cộng sự, 1966) hay nhờ sự tự phân trong môi
trường acid (theo Covalenco, 1966).

Khi so sánh sự thu nhận pepsin của hai phương pháp cho thấy phương pháp tự phân cho
hiệu suất thu enzym cao hơn phương pháp chiết là 5 – 7 lần (theo Teply và cộng
sự,1980). Nguyên nhân là do phương pháp tự phân có sự phá vỡ một cách triệt để cấu
trúc tế bào. Mặt khác, phương pháp tự phân còn có ưu điểm là cùng với pepsin, ta còn thu
đựơc pepton, tận dung triệt để nguồn nguyên liệu protein của dạ dày trong sản xuất.

Muốn pepsin có hoạt tính cao thì phải cách ly từ niêm mạc dạ dày lấy từ động vật mới mổ
hoặc có thể bảo quản niêm mạc ở nhiệt độ lạnh 0-240C trong thời gian ngắn.

Phương pháp 1 (Phương pháp chiết): Dạ dày rửa sạch, tách màng nhầy, nghiền, ngâm
vào nước có 5% butanol hay glyceryl, có cloroform để tránh nhiễm khuẩn sau chế hóa
bằng etanol để pepsin kết tủa. Thời gian ngâm 48 – 72 giờ, nhiệt độ thường.
Phương pháp 2 (Phương pháp tự phân): Niêm mạc dạ dày bảo quản ở nhiệt độ lạnh hay
vừa tách ra khỏi heo mới mổ, xay nhỏ, dùng HCl hay H 3PO4, H2SO4 với nồng độ thích
hợp để chiết xuất và hoạt hóa pepsinogen thành pepsin. Theo nhiều thực nghiệm, việc
dùng HCl để điều chỉnh pH môi trường sẽ cho hoạt tính cao nhất. Nguyên nhân là do HCl
là acid vô cơ quan trọng có trong thành phần dịch vị dạ dày động vật, trong cơ thể sống
pepsinogen được hoạt hóa thành pepsin nhờ HCl dịch vị. Thời gian tự phân: 48 giờ ở 40
– 420C.

Ngoài ra một số tác giả đã sử dụng nguyên lý hấp thụ enzym trên một chất kết tủa. Cho
hình thành chất kết tủa phosphattricalci từ niêm mạc dạ dày heo (ngâm nước) có mặt
H3PO4. Sau đó chất kết tủa được hòa tan bằng HCl và dung dịch thu được mang di thẩm
tích (dialyz). Dung dịch pepsin thô thu được sau khi xử lý bằng ester sẽ thu lại chất cặn
có thành phần cấu tạo là pepsin sơ lọc (phương pháp Bruché).

Các phương pháp thu pepsin thô từ dịch chiết

Phương pháp tủa.

Phương pháp tủa bằng muối (diêm tích): Các muối trung tính ở nồng độ cao có thể kết
tủa thuận nghịch các enzym mà không gây biến tính hay giảm hoạt tính enzym. Các
protein khác nhau sẽ có tính hòa tan khác nhau trong dung dịch. Do đó khi tăng dần nồng
độ muối, các protein riêng biệt sẽ kết tủa theo các trình tự khác nhau. Người ta thường
dùng các muối trung tính khác nhau như (NH4)2SO4, NaCl… ở nồng độ gần bão hòa để
làm tủa pepsin. Ly tâm lấy tủa, trộn với tá dược như lactose, glucose hay tinh bột là các
chất phụ gia có tính chất ổn định enzym, đồng thời rút ngắn thời gian sấy, hạn chế sự
giảm hoạt tính enzym trong khi sấy, thường sấy ở nhiệt độ ≤ 450C hay sấy kèm chân
không.

Phương pháp tủa bằng cồn hay dung môi hữu cơ: Với dung dịch pepsin thô được cô dưới
áp suất thấp, ở nhiệt độ ≤ 450C đến khi chỉ còn lại 1/8 so với thể tích ban đầu thì đem tủa
với cồn 950C hay aceton (tỷ lệ 1:3) (Có thể tủa bằng cồn cao độ hay các dung môi hữu cơ
thích hợp như: metylic, etylic, aceton ở nhiệt độ gần 0 – 3 0C). Sau đó ly tâm, sấy tủa ở
nhiệt độ ≤ 450C. Phương pháp tủa cần đựơc tiến hành ở nhiệt độ thấp 0 – 50C để đảm bảo
hoạt tính của enzym.

Ví dụ: Quy trình tách chiết, thu nhận chế phẩm pepsin từ dạ dày động vật của Payeda và
cộng sự
 Nguyên liệu

Tách màng nhầy

Xay nhuyễn, cân HCl 0.5% (tỷ lệ 1:2), 40-

500C, khuấy, để tự phân

24 -48 giờ
Tự phân

Ly tâm

Lọc
NaCl nồng độ bão hòa 25%,
khuấy, để yên 30 phút
Kết tủa

Sấy khô

Bảo quản

Sản phẩm
Pepsin thô
 - Nguyên liệu: Dạ dày động vật tươi vừa mới giết mổ; bảo quản lạnh đông trước khi
thực hiện (0 – 30C).
- Tách màng nhầy: rửa sạch bên ngoài trứơc khi lộn ngược dạ dày, rửa thật nhẹ màng
nhày bằng nước lạnh chỉ để loại bỏ thức ăn thừa (rửa bằng tay) không làm tổn thất lớp
màng nhấy chứa pepsin và tiến hành bóc màng nhầy.
- Xay nhuyễn: màng nhầy dạ dày sau khi tách cắt nhỏ và xay nhuyễn đồng nhất.
- Tự phân: màng nhầy sau khi xay bổ sung dung dịch HCl 0.5% với tỷ lệ (theo khối
lượng) 1: 2 và nhiệt độ 40- 500C, khuấy đều; thời gian 24 – 48 giờ.
- Lọc: vớt bỏ hết lớp mỡ phía trên mặt, sau đó lọc qua nhiều lớp vải mùn thu dung dịch.
- Kết tủa: kết tủa bằng NaCl nồng độ bão hòa 25%. Cho muối từ từ, khuấy nhẹ cho đến
khi dung dịch bão hòa, để yên dịch thủy phân 30 phút. Có thể dùng các tác nhân tủa
như: amon sulphat, cồn 85%, aceton, izopropanol, polyetylenglycol – PEG 6000.
- Trong quá trình kết tủa bằng dung môi hữu cơ sinh ra một nhiệt lượng lớn, có thể làm
mất hoạt tính enzym. Do đó, dung dịch sau tự phân đựơc lọc cùng dung môi đã làm
lạnh và dung môi phải được cho từ từ và khuấy liên tục để tránh sự tăng nhiệt độ cục
bộ bên trong hỗn hợp. Thời gian 5 – 10 phút, nhiệt độ ≤ 50C.
- Tác nhân PEG 6000: (tương tự như muối vô cơ). Cho PEG dạng rắn cho từ từ vào
dung dịch enzym và khuấy liên tục cho tan hết.
- Ly tâm: hỗn hợp dung dịch sau khi kết tủa để yên đem ly tâm 10 - 15 phút với tốc độ
5000 – 6000 vòng/phút.
- Sấy khô: sau khi ly tâm thu phần kết tủa, đem sấy khô có thổi khí ở nhiệt độ 30 –
400C hoặc sấy chân không hay thiết bị sấy đông khô. Để tránh bị mất hoạt tính ngừơi
ta trộn thêm vào chế phẩm enzym các chất độn như tinh bột hòa tan, maltose
dextrin… trong quá trình sấy.
- Bảo quản: chế phẩm pepsin thô cần đựơc bảo quản ở điều kiện khô, kín, lạnh, tránh
tiếp xúc trực tiếp ánh sáng và các tác nhân vật lý, hóa học có thể ảnh hưởng đến hoạt
tính của enzym.

Phương pháp hấp phụ

Có thể dùng một số chất hấp phụ đặc hiệu để hấp phụ enzym. Cơ sở khoa học của
phương pháp này là cho enzym hấp phụ chọn lọc lên các chất hấp phụ như: caolin, oxit
sắt, than… Sau đó, dùng các chất giải hấp phụ đặc biệt để tách enzym ra khỏi chất hấp
phụ và thu nhận enzym mong muốn.

Ví dụ: Phương pháp hấp phụ Pepsin. Bổ sung NH4OH 0.1N vào dung dịch pepsin thô cho
đến phản ứng kiềm nhẹ, rồi thêm hỗn hợp photphat gồm: dung dịch CaCl2 10%, dung
dịch dinatriphotphat 5.5% với tỷ lệ 1:1. Pepsin được kết tủa từ từ nhờ dung dịch NH4OH
và được hấp phụ trên mặt mỏng của tricalciphosphat và cùng với tricalciphosphat lắng
xuống. Để sự nhả hấp phụ không xảy ra, người ta cần tiếp tục cho NH4OH để giữ môi
trường phản ứng cần thiết, lọc lấy tủa và rửa với nước cất. Tiếp theo, lấy tủa xử lý với
dung dịch oxalic acid 4%, tricalciphosphat sẽ chuyển thành calcioxalat không tan, pepsin
tan trong dung dịch, lọc lấy dung dịch pepsin. Dùng NH4OH để điều chỉnh đến pH = 2.4
– 2.6. Sau đó, thêm 5 thể tích hỗn hợp cồn: ete (tỷ lệ 1:1) để tủa pepsin. Kết tủa thu đựơc
rửa với cồn, rồi với ete và sấy khô ở nhiệt độ ≤ 450C.

Phương pháp cô dưới áp suất thấp để được dung dịch pepsin đậm đặc

Với phương pháp này người ta tiến hành ở nhiệt độ ≤ 450C, áp suất thấp để enzym không
bị giảm hoạt tính, tạo dung dịch pepsin thô sẽ đậm đặc, sau đó được trộn với tá dược như
lactose, tinh bột, sấy nhẹ tạo dạng bột khô.

Ví dụ: Pajagopalanetal thực hiện xử lý dạ dày heo bằng cách tách màng nhaøy và trữ ở
trạng thái đông, rồi đưa đến pH = 2.7 – 2.9 bằng HCl và đựơc ủ ở 500C trong vài giờ.
Dịch thủy phân được trộn đều và để yên phần nhẹ hơn sẽ nổi lên trên bề mặt, để lạnh 40C
và cô đặc dưới áp suất thấp, enzym bị tủa bởi alcohol và đựơc tách ra. Sau khi pepsin bị
tủa bằng alcohol, đem lọc và làm khô.

Các phương pháp chiết tách trên đều cho pháp thu chế phẩm pepsin chưa tinh khiết, có
lẫn protein lạ và các protease khác. Pepsin này hoàn toaøn có thể sử dụng trong điều trị
trong y học hay công nghiệp.

 Phương pháp tinh sạch pepsin

Phương pháp kết tinh pepsin của Northrop

Northrop đã bắt đầu từ dung dịch pepsin tinh sạch của Parke và Davis, lấy dung dịch này
cho kết tủa bằng dung dịch sulfuric với MgSO4 bán bão hào, chất kết tủa được rửa sạch
với dung dịch MgSO4, sau đó hòa tan bằng dung dịch NaOH N/2, rồi lại cho kết tủa lần 2
bằng cách gia thêm H2SO4 N/2 pha loãng trong nước 450C, sau một lần làm lạnh nữa, tinh
thể pepsin xuất hiện và phải qua một loạt các quy trình hòa tan trong kiềm và tái kết tủa
trong dung dịch acid sẽ điều chế được tinh thể pepsin hoàn toàn tinh khiết và hoạt tính
cao.

Phương pháp lọc qua gel sephadex.

Nguyên tắc

Khi cho một hỗn hợp nhiều chất chảy qua cột chứa gel sephadex đã trương nước, những
phân tử nào lớn sẽ không chui vào trong hạt gel đựơc mà chỉ di động ở ngoài gel, do đó
di chuyển ra khỏi cột sephadex nhanh. Còn những phần tử nhỏ hơn chui vào trong các hạt
với mức độ khác nhau tùy theo kích thước của chúng. Do đó những kỹ thuật này dùng để
tách các chất có phân tử lượng khác nhau, phân tử lượng càng lớn ra khỏi cột càng nhanh,
phân tử lượng càng nhỏ ra càng chậm.

Hóa chất và dụng cụ:

Tùy theo đặc điểm cột và loại gel sephadex dùng trong thí nghiệm mà ta ngâm một lượng
gel sephadex thích hợp. Ở đây dùng 1 buret có đường kính 1 cm, cao 35cm và gel
sepphadex G-100, cân 1.2g gel ngâm trong 1 lượng thừa dung dịch NaNO3 0.028 trong
72 giờ để gel trương nở hoàn toàn. Gel sau khi ngâm NaNO 3 đựơc rửa sạch bằng nước
cất sau đó nhồi vào cột, hay dùng gel sepphadex G-75.

Dung dịch đệm Mc Ilvaine pH 2.2. Cách pha đệm p.H 2.2: X: dung dịch acid citric 0.1M
(hòa tan 21,008g acid citric trong 1 lít nứơc cất), Y: dung dịch dianatri hydrophotphat
0.2M (hòa tan 35.6 g Na2HPO4.2H2O hay 71.7g Na2HPO4.12H2O trong 1 lít nứơc cất).
Pha 98 ml dung dịch X và 2 ml dung dịch Y, ta có dung dịch đệm pH = 2.2. Chọn cột có
Φ = 1.8 cm, chiều cao h = 80cm.
Kỹ thuật nhồi cột

Cột sau khi rửa sạch (rửa cột để đổ gel): cột đựơc rửa sạch bằng HNO3 50% rồi rửa lại
bằng nước cất nhiều lần, tráng bằng aceton, đem sấy khô.

Rửa các dụng cụ khác: các ống nghiệm được rửa sạch rồi ngâm vào dung dịch sulfo
cromic trong một ngày, rửa sạch lại, traùng nước cất rồi sấy khô.

Tiến hành nhồi cột với G- 75 đã trương nở hoàn toàn: gel được đưa vào cột cùng với
dung dịch đệm qua phễu một cách từ từ và tránh tạo bọt khí và phân lớp.

Sau khi đã cho một ít gel lắng thành lớp cao khoảng 5 cm mới mở khóa cho dung dịch
đệm chảy ra từ từ. Sau đó tiếp tục cho gel vào cột cho đến khi đạt độ cao cần thiết. Bề
mặt dung dịch bên trên của cột phải phẳng, trên mặt gel luôn có một lớp dung dịch đệm
cao khoảng 2 cm để gel không bị khô.

Khóa ống mao dẫn lại, để cột gel ổn định trong 3 giờ, sau đó rửa cột bằng dung dịch đệm
p H = 2.2 khoảng 24 giờ ( thể tích dung dịch đệm dùng để rửa gấp khoảng 3 lần thể tích
cột).

Đưa mẫu vào cột

Đem kết tủa 50 ml dung dịch enzym thu đựơc sau quá trình tự phân đã qua lọc bằng 283
ml cồn 85%. Sau đó ly tâm, kết tủa đựơc hòa tan lại bằng 50 ml dung dịch đệm pH 2.2 ta
thu được dung dịch A.
Hút 3 ml dung dịch A, thêm vào khoảng 2 ml dung dịch đệm pH 2.2, đem ly tâm bỏ cặn.

Ngưng khóa dòng dung dịch đệm chảy qua cột, khi lớp dung dịch đệm vừa cạn đến mặt
gel thì cho mẫu vào cột, lượng mẫu cho vào cột là 5 ml (từ 1 – 5% thể tích cột.). Sau khi
cho mẫu vào cột hết thì tiếp tục cho dung dịch đệm chảy qua cột.

Thu mẫu qua cột

Sau khi mẫu đã vào hết trong cột, bắt đầu hứng dung dịch chảy qua cột. Số phân đoạn là
n ống (ví dụ khoảng 30 ống), mỗi phân ñoạn ta thu khoảng 4 ml, các phân đoạn thu được,
đem đo mật độ quang OD ở bước sóng 280nm. Vẽ đồ thi biểu diễn mối quan hệ giữa
từng phân đoạn và giá trị OD tương ứng, ghi nhận các peak chính được tạo thành. Sau đó
xác định hoạt tính pepsin của các ống tương ứng với peak chính. Theo kết quả tính hiệu
suất về hoạt tính enzym và hàm lượng protein thu được qua lọc gel.

Ví dụ: Một số phương pháp và kết quả thu nhận tinh sạch pepsin dê.

Tinh sạch pepsinogen: pepsinogen là dạng zymogen của pepsin, là enzym chính trong dạ
dày. Có hai loại chính pepsinogen A và C được biết đến ở hoạt động ở động vật trưởng
thành.

Dạ dày dê đựơc cắt nhỏ để tiến hành tinh sạch. Tất cả những tiến trình trên đựơc thực
hiện ở 0-40C, ngoại trừ FPLC thực hiện ở nhiệtt độ phòng. Sắc ký trên DEAE- Sephacel
là lọc gel được thực hiện trong đệm Na2SO4 0.01M, pH 7.0 (Thực hiện FPLC trong đệm
Tris-HCl 0.01M, p H 7.0). Bản chất những tiến trình dùng tinh sạch pepsinogen Suncus
(chuột xạ nhà) và được mô tả sau đây:

- Phần múi khế của dạ dày (tổng khối lượng trung bình 6.1g) được đồng hóa với 20 ml
đệm Na2SO4 0.01M, dung dịch đồng nhất đựoc ly tâm ở 15.000 vòng/phút. Phần bên
trên đem tiến hành qua cột DEAE- Sephacel (1.5 x 30cm). Protein đã hấp phụ được
giải phóng theo thiều gradient nồng độ của NaCl từ 0- 0.5M. Hoạt động thủy phân Hb
 được phát hiện tạo thành ba peak. Peak I chứa loại pepsinogen C và peak II, III chứa
pepsinogen A. Protein của mỗi peak sau khi qua lọc gel tren cột sephadex G-100 (1.5
x 100cm). Dung dịch protein được thực hiện FPLC trên một cột mono Q, HR 5/5 để
tinh sạch lần cuối. Protein được giải phóng theo chiều gradient nồng độ của muối
NaCl từ 0- 0.5M hơn 30 phút ở mức chảy thấp 1.0 mol/phút. Hỗn hợp pepsinogen A
và C được phân tách hoàn toàn chia ra từng loại isozymogen.

Bảng 2.1 Phương pháp tinh sạch các pepsinogen

Hoạt tính Hoạt tính riêng

Protein
Bước (đơn vị/ mg Hiệu suất
(mg) (đơn vị) Protein)
1- Phần thô phía trên đồng 321 64 1.1 100
nhất

2- DEAE-Sephacel

Pepsinogen A-1
9.2 11 0.2 17
Pepsinogen A-2 +A-3
8.2 15 1.8 23
PepsinogenC-1 + C-2
20.0 14 0.7 22
3- Sephadex G-100

Pepsinogen A-1
0.82 8.1 9.9 13
PepsinogenA-2 + A-3
1.3 11 8.5 17
Pepsinogen C-1 +C-2
1.4 4.8 3.4 7.5
4- Mono Q FPLC

Pepsinogen A-1
0.43 5.6 13 8.8
Pepsinogen A-2
0.32 4.4 14 6.9
Pepsinogen A-3
0.21 3.1 15 4.8
Pepsinogen C-1
0.23 2.4 10 3.8
 Pepsinogen C-2 2.3
0.13 1.5 12

- Điện di các protein: pepsinogen đã tinh sạch được thực hiện để không biến tính dựa
theo phương pháp PAGE (polyacrtlamyl gel electrophoresis) của Ornstein và Davis,
và SDS-PAGE theo Weber và osborn. Protein được nhuộm bằng Coomassie briliiant
blue.

- Deglycozyl hóa: mỗi pepsinogen (khoảng 0.2 µg) được ủ với 1 đơn vị tối thiểu của
glycopeptidase F dựa theo công thức sản xuất, việc làm giảm khối lượng của
pepsinogen được phân tích bằng phương pháp SDS-PAGE. Pepsinogen C-2 suncus
được sử dụng như một kiểm chứng dương tính quá trình glycozyl hóa pepsinogen.
- Xác định nồng độ protein: nồng độ của protein trong dung dịch các enzym ở mỗi
bước tinh sạch được xác định bởi phương pháp Lowry và cộng sự và đo ở bước sóng
280nm với serum albumin heo như một tiêu chuẩn. Số lượng pepsinogen đã tinh sạch
được xác định bằng cách tính hệ số tiêu hủy phân tử từ thành phần amino acid và khối
lượng phân tử.

- Phân tích amino acid: mẫu để phân tích amino acid (10µg protein) bị thủy phân bằng
HCl bay hơi ở 1500C/1giờ ở hệ thống Water PICCO- TAGTM Worj Station
(Millipore Corp, Milford, MA). Mẫu được phân tích bằng máy phân tích amino acid.

 Rennin [E.C.3.4.4.3]

Rennin là enzim đông tụ sữa, đựơc tìm thấy ở dịch tiêu háo của ngăn thứ tư dạ dày bê.

 Thành phần cấu tạo.

Renin chứa nhiều amino acid acid tính hơn amino acid kiềm tính, nhưng tỷ lệ thấp hơn
pepsin.

 Đặc tính và khả năng thuỷ phân của rennin

Rennin tinh khiết có những đặc tính của một globulin. Điểm đẳng điện của rennin pI =
4.5. Rennin là enzim thuỷ phân liên kết peptide trong protein, và không làm ảnh hưởng
đến liên kết ester và amine. Rennin đặc biệt tác động mạnh lên các liên kết tạo bởi
tyrosine và phenylalamine.

Rennin tác động lên cơ chất casein của sữa bò và những loại sữa khác. Đặc tính thuỷ
phân của rennin phụ thuộc rất nhiều vào pH.

 Sự hoạt hoá prorennin

Trong môi trường acid ở pH = 5 sự hoạt hoá prorennin thành rennin xảy ra không đáng
kể, nhưng ở pH < 3 thì quá trình này xảy ra rất mạnh.

 Các yếu tố ảnh hưởng

pH tối ưu của rennin pH = 3.7. Đặc điểm của rennin là tác động ở môi trường acid vừa
Nguyên liệu
phải và cần có sự hiện diện Ca2+. Ở pH 3.7 các ion làm tăng hoạt độ rennin, những cation
hoá trị +1 làm giảm hoạt tính của nó. Chất kìm hãm có tác dụng hiệu quả nhất lên rennin
là dung dịch H2S 0.0001M và MgCl2.
Tách màng nhầy

 Quá trình thu nhận dịch rennin

Xay nhuyễn, cân HCl 0.2% hoặc nước muối
10% , 0.7% acid boric trên
tổng V, chỉnh pH 4
Tự phân

NaCl nồng độ bão hòa

Lọc
hoặc HCl

Kết tủa

Ly tâm
 Sấy khô

Bảo quản

Sản phẩm
rennin thô

- Nguyên liệu: ngăn thứ tư dạ dày bê non dưới 5 tháng tuổi. Lấy phần múi khế của bao
tử và lộn ngược một cách nhẹ tay để bỏ hết thức ăn dư, tách bỏ phần mỡ, rửa nhẹ
bằng nước lạnh, sau đó rửa bằng dung dịch muối NaCl 15%.
- Hoá chất: Muối NaCl, HCl sử dụng để thu tủa enzim phải tinh khiết, khô không lẫn
tạp chất, đặc biệt là kim loại nặng vì gây tủa và bất hoạt enzym. Natribenzoat: chất
bảo quản.
- Thiết bị sử dụng: máy điều nhiệt, máy ly tâm, máy quang phổ kế, máy nghiền đồng
hoá, máy đo pH.
 - Phương pháp thu nhận: có 2 cách
+ Cách 1: Dạ dày xay nhuyễn, HCl 0.2%, bổ sung 0.7% acid boric trên
tổng V  tỷ lệ 1:3 theo V.
+ Cách 2: Dạ dày xay nhuyễn, nước muối 10%, chỉnh HCl pH = 4 
tỷ lệ 1:3 theo V. Cho 0.7% acid boric trên tổng V (tác dụng bảo quản). Giữ ở 35 –
400C cả 2 mẫu qua 30 giờ trong tủ ấm. Sau đó dùng HCl N chỉnh pH = 4. Lấy ra
đem lọc qua vải màn và vải nhiều lớp được dịch trích rennin thô (a) có chứa rennin.
Dịch rennin được kết tủa bằng cách acid hoá dung dịch hoặc bão với NaCl. Gelatin
thường xuyên được thêm vào để giúp kết tủa vá tách renin ra khỏi dung dịch bằng
sự ly tâm 45 phút ở 5.000 vòng/ phút.
- Thu rennin dạng bột
+ Tiến hành tủa enzim theo phương pháp diêm tích với muối trung
tính bằng cách cho từ từ vào dung dịch (A) một lượng NaCl kkhoảng 22 – 23% cho
đến khi bão hoà NaCl.
+ Để tủ lạnh 20 phút.
+ Lấy ra ly tâm lọc. Cạo lấy tủa để lên đĩa petri, sấy khô rồi để vào
bình hút ẩm.
+ Phương pháp thẩm tích bằng túi colodion.
+ Màng bán thấm dializ dùng để tách muối và chỉ cho chất có phân tử
lượng nhỏ thẩm tích qua túi mà giữ lại những chất có phân tử lượng lớn.
+ Cân chính xác một lượng enzim bột vào túi colodion (cellophane).
Cân trọng lượng túi có chứa enzym, cho túi vào becher đựng nước cất và cho thẩm
tích trong môi trường nứơc lạnh 0 – 40C. Khuấy và thay đổi nước lạnh thường
xuyên ( hai ngày đêm) làm khô nhanh túi bằng cách sấy quạt gió, nhiệt độ 30 -
400C. Cân trọng lượng túi sau khi sấy khô.
+ Hiệu số trọng lượng túi ban đầu và sau khi thẩm tích là lượng NaCl:
m1 – m2 = m
m1: Trọng lượng túi + mẫu thí nghiệm trước thẩm tích (g)

m2: Trọng lượng túi + mẫu thí nghiệm sau thẩm tích (g)

m: Trọng lượng muối NaCl đã thẩm tích qua màng (g)

- Tinh sạch rennin: Rennin được chiết và làm sạch bằng sắc ký DEAE- Sephadex.
- Tái chế: tách enzim từ nước sữa (dung dịch còn lại sau khi tách phần ñông tụ) và tái
sử dụng bằng phương pháp sắc ký.

 Pacreatin

Pancreatin có ở trong tụy của động vật máu nóng và thường trích pancreatin tuỵ tạng của
heo.
  Thành phần

Pancreatin là hệ enzym thuỷ phân xúc tác các phaûn ứng chuyển hoá đạm, đường, chất
béo và một số chất khác ở Tụy
trongheo
ruột.
bảo quản
tươi ở nhiệt độ
đông đá
 Tính chất Pancreatin
Pancreatin có hoạt tính mạnh nhất trong môi trường kiềm và bị bất hoạt trong môi trường
acid mạnh và nó hoạt động
Táchmạnh nhất
và từ
mô2 liên
-3 giờ sau khi ăn để thực hiện quá trình tiêu
bỏ mỡ
hoá ở ruột non. Pancreatin có thể pepton hoá nhiều loại thức ăn như sữa,Nathịt, COcháo…
1.2% và
kết, xay nhỏ đem cân 2 3
chuyển dầu, chất béo thành dạng nhũ tương để dễ tiêu hoá.
(tỷ lệ 1:2), 200C, khuấy 3 giờ

Lọc lấy dung dịch bằng rây Aceton lạnh (1:4) khuấy 10
 Thu nhận pancreatin
phút, để lắng 15 phút ở
nhiệt độ lạnh
Sơ đồ thu nhận pacreatin bằng phương pháp tách chiết với aceton
Tủa thu lấy enzym

Ly tâm lấy tủa (lần 1)

Rửa tủa bằng aceton

Ly tâm lấy tủa (lần 2)

Sấy tủa nhẹ ở 30- 350C

Nghiền nhỏ

Sản phẩm
Pancreatin thô
 Tụy heo
bảo quản
tươi
Pha với nứơc cất
Tách màng nhầy (1:1) tự phân ở 200C,
để tự phân

6-8h (2:1),
H2SO4 0.25N
Lọc lấy dung dịch
pH = 3.5-4, 1h
Lọc lấy dung dịch (NH4)2SO4 60 – 70%
(1;2)
Ly tâm lấy tủa
Sơ đồ thu nhận pacreatin kết tủa bằng muối (NH4)2SO4
Sấy tủa nhẹ ở
400C

Nghiền nhỏ

Sản phẩm
Pancreatin
thô
Thu nhận pancreatin thô bằng phương pháp sấy: lấy tuỵ tươi đã được bảo quản, cân trong
lượng và trộn với tinh bột một lượng bằng 10% so với troïng lượng tuỵ tươi, sau đó đem
sấy ở những nhiệt độ 500C, 600C, 700C. Sau một thời gian sấy thì đem xay nhuyễn và
được chế phẩm pacreatin thô.
  Trypsin [ E.C.3.4.21.4]

Trypsin có trong dịch tuỵ người và động vật. Trong cơ thể sinh vật, trypsin hoạt động
trong môi trường kiềm ở ruột nên gọi là protease kiềm tính. Vai trò của trypsin là tiếp tục
thuỷ phân các protein thức ăn còn lại sau khi đã bị thuỷ phân một phần ở dạ dày. Ở trong
máu cũng có một ít trypsin hoạt động.

Sự hoạt hoá trypsinogen: Trong tuyến tuỵ, đầu tiên trypsin được tiết ra ở dạng không hoạt
động là trypsinogen. Sau đó được hoạt hoá dưới tác động của enzim đường ruột
enterokinase.

pH tối ưu của trypsin là pH = 8. Nhiệt độ thích hợp là nhiệt độ cơ thể.

Hoạt động và tính đặc hiệu: Trypsin tác dụng lên hầu hết các cơ chất là protein, tác dụng
trên hemoglobin, albumin biến tính của huyết tương, đối với collagen hay albumin của
trứng thì cần xử lý nhiệt sơ bộ thì trypsin mới có tác dụng. Trypsin không làm đông tụ
sữa như pepsin, rennin, chymotrypsin.

 Chymotrypsin [E.C.3.4.21.1]

Chymotrypsin là một protease được tiết ra từ tuyến tuỵ. Là protease quan trọng sau
trypsin.

Chymotrypsin được thu nhận ở dạng tinh thể. Chymotrypsin tiết ra dưói dạng không hoạt
động là chymotrypsinogen, sau đó chymotrypsinogen được chuyển sang dạng hoạt động
là Chymotrypsin nhờ tác dụng của trypsin.

Chymotrypsin là một protease hoạt động trong điều kiện môi trường pH kiềm, hoạt động
ở p H 7 - 8 và tối ưu là pH = 8 - 9, điểm đẳng điện pI = 5.4. Trong ruột, chymotrypsin
thuỷ phân protein và các sản phẩm đã được tiêu hoá một phần bởi pepsin để tạo ra các
peptide ngắn và các amino acid tự do. Hoạt tính của chymotrypsin tương đối hơi yếu hơn
trypsin nhưng nó lại có khả năng thủy phân protein sâu sắc hơn.
  Phương pháp thu nhận tách chymotrypsin ra khỏi trypsin

 Chuẩn bị

Đệm phosphate 0.067M, pH 7.0. Hòa tan 4.54g K2HPO4 trong nước thành dung dịch
500ml. Hòa tan 4.73g NaH2PO4 khan vào trong nước thành dung dịch 500ml. Hòa chung
38.9ml dung dịch K2HPO4 với 61.1ml dung dịch NaH2PO4. Điều chỉnh pH bằng cách nhỏ
từng giọt (nếu cần thiết) dung dịch NaH2PO4 đến khi đạt pH 7.0.

Dung dịch cơ chất: Hòa tan 23.7mg N-acetyl-D-tyrosin ethyl ester (cơ chất thích hợp
dùng để xác định chymotrypsin) vào khoảng 50ml dung dịch đệm phosphate 0.067M, pH
7.0. Giữ lạnh khi pha loãng với đệm pH 7.0 đến 100ml.

Dung dịch trypsin tinh khiết: hòa tan một lượng chính xác trypsin tinh thể vào
hydrochloric acid 0.001N để thu được một dung dịch chứa 650 đơn vị USP trypsin trong
mỗi ml.

 Cách thực hiện

Độ hấp thu được đo bằng quang phổ kế trong điều kiện nhiệt độ môi trường xung quanh
không được thay đổi quá 0.50C và nhiệt độ trong ngăn để mẫu là 25± 0.10C.

Hút 200µl dung dịch acid HCl 0.001N và 3ml dung dịch cơ chất vào trong một cuvette
1cm. Đặt cuvette này vào quang phổ kế và điều chỉnh thiết bị để có được độ hấp thu 0.2 ở
bước sóng 273nm.

Hút 200µl dung dịch trypsin tinh khiết vào một cuvette khác, thêm 3ml dung dịch cơ chất
và đặt cuvette vào quang phổ kế. Bắt đầu tính thời gian từ khi bắt đầu thêm dung dịch cơ
chất vào dung dịch enzym. Đọc độ hấp thu sau khoảng 30 giây không kém hơn 5mm kể
từ khi cho cơ chất vào dung dịch enzym. Lập lại các bước trên ít nhất một lần. Các giá trị
của độ hấp thu tuyệt đối ít quan trọng hơn sự ổn định trong ít nhất 3 phút thì phải lập lại
tiến trình trên và nếu cần thiết thì thực hiện với một nồng độ thấp hơn.

Lập lại quá trìn trên lần thứ hai với cùng nồng độ pha loãng, theo dõi sự thay đổi độ hấp
thu trong lần thực hiện đầu tiên. Xác định sự thay đổi độ hấp thu trung bình trong mỗi
phút, chỉ sử dụng các giá trị trong vòng 3 phút.

Cách tính số đơn vị USP chymotrypsin mỗi mg trysin tinh khiết theo công thức:

(A2 – A1) x (0.0075 TW)

Với A2: Độ hấp thu lần đầu

A1: Độ hấp thu lần cuối

T : Thời gian giữa lần đầu đọc và cuối (phút)

W : Trọng lượng (mg) của trypsin tinh thể trong thể tích dung dịch được dùng xác
định độ hấp thu.