|
 

 
  
|
 |

  
| 
 
|


 Observación microbiana
‡ Y
: exámen en fresco de una
suspensión bacteriana, se usa
principalmente para visualizar Hongos
unicelulares, protozoos y helmintios.
‡ Ayuda a observar movimiento y forma de
los Mo,s
‡2
 

: frotis o extendido que al ser
teñido permite visualizar la forma, tamaño y
disposición de los diferentes tipos de bacterias o la
observación de elementos no habituales (flagelos,
cápsula ó esporas).
 p cnica (observación in vivo)
‡ Colocar parafina o vaselina en los bordes
del cubreobjeto.
‡ Depositar una gota en el cubreobjetos
‡ Cubrir con el cubreobjetos primero desde
una arista al total de la superficie.
‡ Observación.
‡ Desventajas: falta de contraste y resolución,
p cnica ( observación coloreada)
‡ Con un portaobjeto limpio y desgrasado y con el asa y la
pipeta se le coloca una gota de agua destilada est ril.
‡ Se toma con el asa y se coloca en el portaobjeto y se le
homogeniza con el agua est ril,
‡ Se extiende la muestra sin tocar los cuatro bordes del
cubreobjetos
‡ Se deja que el portaobjeto se seque al aire o se le mantiene
a 40 cm de la llaman y se fija
‡ La fijación tiene el objeto de que las bacterias queden
adheridas al vidrio.
 fijación
‡ Existen dos m todos:
‡ 1. M todo de Koch (físico):
‡ Consiste en hacer tres pasajes lentos sobre
el mechero dejando enfriar entre cada uno
de ellos.
‡ 2. Metanol (químico):
‡ Extendido con alcohol metílico por 5
minutos y despues colorear
 Colorantes
‡ Productos químicos derivados del Alquitrán,
especialmente el benceno
‡ La mol cula del colorante está formada por dos
segmentos el    




 , el
primero tiene color y el segundo la afinidad
‡ La afinidad esta dada por la disociación
electrolítica de este segmento y la formación de
sales insolubles con las proteínas, glucoproteínas y
lipoproteinas de los tejidos y paredes.
‡ El grupo auxocromo determina que se los
clasifique en básicos o catiónicos, ácidos o
aniónicos.
‡ Colorantes Básicos: violeta de Genciana,
Fucsina básica, rojo neutro, etc.
‡ Colorantes Acidos: Fucsina ácida, eosina
‡ Neutros: eosianato de azul de metileno.
 Coloración Simple
‡ Son las que emplean un solo colorante y
tiñen todos los elementos por igual.
‡ p cnica: fijar, cubrir, lavar y observar
‡ Ventajas: Observ. Rápida y sencilla de la
morfología bacteriana.
‡ Desventajas: no es posible diferenciar si la
muestra es monoespecífica o mixta.
 Compuestas o diferenciales
‡ Usan dos colorantes lo que permite teñir de
distintos modos las diversas clases de
bacterias, los m todos más empleados son:
‡ pinción de Gram. y de Ziehl-Neelsen
‡ En estas coloraciones se usan cuatro
componentes de manera progresiva:
‡ 1.   

  

  :
colorante básico que al entrar en contacto
con las c lulas cargadas negativamente las
colorea
‡ 2.  

: le da mas intensidad y más
fijación (sales metálicas, solución yodada o
lugol, taninos y fenol)
‡ 3. a



  
: Disolvente
orgánico como el alcohol, ácido o alcohol
acetona
‡ 4.   

  



  :
‡ Colorante básico de distinto color que el
primero.
 pinción de Gram
‡ Utilizada más habitualmente
‡ Facilita la observación bacteriológica
‡ Permite diferenciar entre gram positivo y
gram negativo.
 Fundamento
‡ La afinidad por el color depende en gran medida
de la composición química de la pared celular
‡ Despu s de realizar los primeros cuatro pasos,
todas las bacterias se ven color violeta.
‡ Al finalizar la t cnica las que conservan el color
violeta se denominan O 
2



‡ Y las que no lo conservan O 




 Cont. fundamento
‡ Los decolorantes orgánicos utilizados abren los
poros de la membrana externa de las bacterias
gram negativas (constituidas principalmente por
lipoproteínas y lipopolisacáridos) y permiten la
salida del colorante principal quedando
desprovistos de color.
‡ Al agregar el contracolor stos quedan teñidos de
rojo (fucsina o safranina).
Diferencias estructurales
 p cnica
1. Una vez fijado el extendido cubrir la
superficie con  



  


   y dejar en contacto un minuto
2. Lavar con agua abundantemente.
3. Cubrir con   


por 1
minuto.
4. Lavar con abundante agua
 Cont. pinción de gram.
‡ Inclinar el portaobjeto y dejar gotear el
alcohol acetona 
  

hasta que el
preparado deje de perder color.
‡ Lavar con agua
‡ Agregar el    
fucsina básica por
1 minuto
‡ Lavar, secar al aire, observar.
 Ventajas y desventajas
‡ Es un m todo rápido y
sencillo
‡ Permite observar: forma,
tamaño y disposición.
‡ Hace diferenciación entre
biota mixta o
monoespecífica
‡ Proporciona orientación
terap utica.
‡ Se conservan los
preparados.
‡ Gram. + vrs. Gram -
‡ Algunas micobacterias
y hongos pueden no
tomar la coloración
‡ Bacterias sin pared las
tiñe d bilmente
(mollicutes)
‡ La t cnica es más
laboriosa que la t cnica
simple.
 Otras tinciones
‡ Coloración de Zielh Nielsen:
‡ Bacterias del g nero |


, la
especie 
, las especies

 

y ocasionalmente



 no se tiñen con la coloración
Gram.
‡ Estas bacterias tiene la capacidad de resistir
la decoloración por ácidos y alcohol
 Cont. Otras tinciones
‡ Esta propiedad se debe al alto contenido de lípidos
complejos (ácidos micólicos) y ceras que poseen
algunos microorganismos en su pared celular.
‡ a
a







aa

Mo,s que
resisten la decoloración se ven de color rojo.
‡ 
a
a








aa

‡ No resisten la acción de los decolorantes y se ven
de color azul.
 Coloración de Giemsa
‡ Utilizada para la diferenciación intra y extracelular
de parásitos en sangre circulante. (Ä 

y
especies de 

ÄÄ 


Ä 
 


, inclusiones
virales, | 

 
 
.
‡ Se observan tambi n los elementos celulares de la
respuesta inflamatoria.
‡ 

: Por sus características químicas no
se tiñe con colorantes básicos para ello se utiliza la
 



 


‡ No tiñe sino que se deposita alrededor resaltando
los contornos.
‡ Se utiliza pinta china (suspensión de partículas de
carbón coloidal) Mol culas grandes que no entran
en la cápsula.
‡ La utilidad de esta t cnica es que revela cápsulas
bacterianas y micóticas.
 pinción de endosporas
‡ Sin teñir se ven como estructuras
refringentes intracelulares
‡ Con la tinción de gram se ven como zonas
incoloras dentro de las c lulas teñidas
‡ Con calor + verde de malaquita y safranina.
(El calor permite la penetración del del
colorante).
 pinción de flagelos y cilios
‡ Fuera del poder de resolución del microscopio
óptico común por delgadas.
‡ Para verlos se agrega una suspensión coloidal de
sales de ácido tánico (mordiente)
‡ Formara un precipitado que engrosara el tamaño
de las estructuras
‡ Se aplica fucsina ácida y se visualizan como
estructuras rojas.