Professional Documents
Culture Documents
LỜI CẢM ƠN
Hoàn thành Đồ án này cho tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu
sắc đến thầy giáo Thầy Tạ Ngọc Ly đã tận tình giúp đỡ tôi trong
suốt thời gian học tập, thực tập nghiên cứu vừa qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong bộ môn Công
Nghệ Sinh Học đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi được trang bị nhiều
kiến thức bổ ích cũng như hoàn thành Đồ án này.
Cuối cùng xin cho phép con được cảm ơn các bạn trong lớp
09SHLT đã động viên, giúp đỡ cho tôi hoàn thành Đồ án này. Xin
được tri ân tất cả những người.
Gạo là thức ăn chính cho hơn 3 tỷ người trên thế giới, cung cấp chủ yếu nguồn
năng lượng và protein trong khẩu phần ăn của người dân châu á cũng như châu Phi.
Hạn chế ở gạo là không có hoặc chứa ít các vi chất dinh dữơng thiết yếu, như không
chứa vitamin A, rất ít vitamin E, sắt và kẽm. Thêm vào đó, nhiều trường hợp vi chất
lại ở dạng khó hấp thu. Điều này là nguyên nhân chính gây ra hiện tượng suy dinh
dưỡng ở nhiều nước đang phát triển nơi người dân dựa vào gạo là nguồn thức ăn
chính. Hiện nay trên thế giới có khỏang trên 2 tỷ người suy dinh dưỡng do thiếu chất
vi lượng sắt, vitamin A, iốt và kẽm. Vì vậy, thiếu vi chất dinh dưỡng đang còn là vấn
đề sức khỏe cộng đồng ở các nước đang phát triển. ở Việt Nam, tình trạng thiếu chất
sắt, vitamin A còn khá phổ biến nhất là ở các vùng sâu, vùng xa, miền núi.
Hậu quả cho xã hội và cá nhân do thiếu vi chất dinh dưỡng rất lớn như hạn chế khả
năng làm việc, giảm phát triển trí tuệ, dễ mắc các bệnh nhiễm trùng. Trong các năm
qua, các hoạt động chính của chiến lược thanh toán bệnh do thiếu dinh dưỡng là bổ
sung vi chất bằng đường uống cho các đối tượng có nguy cơ cao, đa dạng hóa bữa ăn,
tăng cường vi chất vào thực phẩm. Tuy nhiên, biện pháp này chưa thể giải quyết được
vấn đề vì tốn kém. Các loại thực phẩm giàu dinh dưỡng nằm ngoàI khả năng thu nhập
của cộng đồng dân cư nghèo. Vì vậy, hiện nay một giải pháp mới được đề nghị là chọn
tạo các giống cây trồng, đặc biệt là lúa, có chứa hàm lượng các vi chất dinh dưỡng cao
hơn các giống đang có. Giải pháp tăng cường vi chất bằng sinh học (biofortification)
này được xem là hiệu quả, kinh tế và bền vững.
Theo hướng này, các trung tâm nghiên cứu lúa gạo trên thế giới đã tiến hành
nghiên cứu tạo được nhiều dòng lúa giàu β-caroten (tiền vitamin A) bằng phương pháp
chuyển nạp gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens và chọn lọc bằng mannose
thay thế cho hệ thống chọn lọc bằng chất kháng sinh hoặc chất diệt cỏ. Phương pháp
chuyển nạp gen này có ý nghĩa trong việc tạo ra các dòng lúa biến đổi gen sạch, khắc
phục các mối lo ngại về tính an toàn của cây biến đổi gen hiện nay. Để góp phần phổ
biến cho mọi người hiểu về ý nghĩa của việc nghiên cứu lúa (gạo) chuyển gen giàu β-
caroten, cũng như cách thức mà các nhà khoa học tạo ra giống lúa này, em đã chọn đề
tài “Tìm hiểu Phương pháp chuyển gen thực vật tạo gạo vàng giàu vitamin A” để vừa
phát triển kiến thức của bản thân vừa tạo ra một nguồn tư liệu cho mọi người cùng
tham khảo. Do thời gian có nhiều hạn chế, kiến thức chuyên môn còn non kém nên
những gì trình bày trong đề tài này khó lòng tránh khỏi nhiều thiếu xót. Kính mong
nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý của quý thầy cô và các bạn để bài tìm đề tài
của tôi được hoàn thiện hơn.
Phần 1:
TỔNG QUAN
1.2.1. Vi tiêm
Nguyên tắc của phương pháp vi tiêm là một lượng nhỏ DNA được tiêm trực tiếp
vào nhân tế bào phôi trần hoặc tế bào nguyên vẹn một cách cơ học dưới kính hiển vi.
Phương pháp này cho phép đưa gen vào đúng vị trí mong muốn ở từng tế bào với hiệu
quả tương đối cao.Tuy nhiên do đòi hỏi phải tinh vi, tỉ mỉ và cực kỳ chính xác nên hạn
A B
Hệ thống này gồm có hai bộ phận chính là kính hiển vi và máy vi thao tác. Kính
hiển vi dùng cho mục đích này là kính hiển vi soi ngược (vật kính xoay ngược lên). Ðộ
phóng đại thích hợp cho việc tiến hành vi tiêm vào phôi cá một tế bào là khoảng từ
40-60 lần.
Máy vi thao tác gồm 2 phần giống hệt nhau được bố trí hai bên kính hiển vi, một
dùng để điều chỉnh kim tiêm, một dùng cho kim giữ. Tính năng của máy này là cho
phép điều chỉnh các kim theo không gian 3 chiều. Kim tiêm và kim giữ được lắp vào
máy vi thao tác và được nối với syringe qua ống bằng chất dẻo được nạp đầy dầu
parafin.
Vi tiêm được tiến hành qua các bước: nạp gen vào kim tiêm bằng phương pháp
capillar (ngâm đầu kim tiêm vào dung dịch gen khoảng 10 -12 giờ) hoặc bơm trực tiếp
dung dịch gen vào, lắp kim tiêm và kim giữ vào máy vi thao tác, chuyển trứng tiền
nhân vào đĩa petri có chứa môi trường được đặt dưới kính hiển vi, giữ trứng tiền nhân
Hình 1.2. 2 – Súng bắn gen thực vật và nguyên lý hoạt động
Mục tiêu của súng bắn gen thường là callus của các tế bào thực vật giống nhau sinh
trưởng trong môi trường gel trên đĩa petri. Sau khi các hạt tungsten đã va chạm vào
đĩa, gel và callus bị phá vỡ nhiều. Tuy nhiên một số tế bào không bị phá vỡ khi va
chạm mạnhvà đã tiếp nhận các hạt tungsten được bao bọc DNA và cuối cùng các phân
tử DNA ngoại lai đã xâm nhập và hợp nhất vào nhiễm sắc thể thực vật. Các tế bào từ
đĩa petri được tập hợp lại và chọn lọc các tế bào đã hợp nhất thành công và biểu hiện
DNA ngoại lai bằng các kỹ thuật hóa sinh hiện đại như sử dụng gen chọn lọc nối
tiếp và Northern blots. Các tế bào đơn đã chọn lọc từ callus có thể được xử lý với một
số hormone thực vật như auxin, gibberelin và mỗi một tế bào có thể phân chia, biệt
hóa thành các tế bào mô, cơ quan, tế bào chuyên hóa của toàn bộ cây. Cây mới có
nguồn gốc từ một tế bào nảy mầm thành công có thể mang các đặc tính di truyền mới.
Phương pháp này có ưu điểm là thao tác dễ dàng, có thể chuyển gen vào nhiều loại tế
bào và mô, các tế bào được biến nạp có tỉ lệ sống sót cao, cho phép đưa các gen vào tế
bào ở vị trí mong muốn....Do vậy nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực.
Hình 1.2.3 – Máy xung gen và sơ đồ bố trí mạch cơ bản của máy xung điện
Khi các ion đã nạp điện và các phân tử đi qua các lỗ, màng tế bào phóng điện và
các lỗ này đóng lại một cách nhanh chóng và phospolipid kép phục hồi lại cấu trúc
cũ. Lúc này các phân tử mong muốn đã ở trong tế bào và chúng được sử dụng cho các
nghiên cứu tiếp theo.
Phương pháp này có thể sử dụng đối với tế bào thực ật ở dạng protoplast... Với một
số cây một lá mầm quan trọng (loài lúa phụ Japonica, ngô, lúa mì). Hiệu quả biến nạp
cao.
khởi đầu của vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng, môi trường để Hình 1.2. 4
nuôi cấy mô sau khi biến nạp, marker được sử dụng để chọn lọc Chuyển gen nhờ
Agrobacterium
thể biến nạp, loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật.
1.3. Mục đích, ý nghĩa, và một số thành tựu của chuyển gen thực vật
Hình 1.5.1 – Cây lúa của nông dân, kết quả của các nhà khoa học
Vì quỹ đất có giới hạn, các nhà khoa học đang nghiên cứu biến đổi gen của cây lúa
để tạo ra giống lúa mới có năng suất cao, chống được bệnh tật và thời tiết khắc nghiệt,
đồng thời rút ngắn thời gian chăm bón và sớm cho thu hoạch. Những thành công ban
đầu của lúa biến đổi gen đã được ghi nhận, song hiện các nhà khoa học vẫn chưa thống
nhất được liệu loại lúa này có tác động xấu đến sức khỏe con người hay không.
1.6.1. Tình hình phát triển của gạo vàng trên thế giới.
Gạo vàng được bắt đấu tiến hành nghiên cứu từ năm 1999. Đến năm 2000 thì GR1
ra đời.
β-caroten
Bản thân hạt gạo có chứa geranyl geranyl diphosphate (GGPP) một tiền chất quan
trọng trong tiến trình sinh tổng hợp β-caroten. Nhưng cây lúa thường thì lại không hề
chứa β-caroten, bằng chứng là hạt gạo thường có màu trong suốt mà không hề có màu
vàng đặc trưng của β-caroten. Để GGPP chuyển hóa thành các chất trung gian rồi
chuyển thành β-caroten thì cần có các Ezim xúc tác tương ứng, nhưng bản thân cây lúa
lại không có chứa các gen có nhiệm vụ sinh tổng hợp ra các enzim cần thiết để xúc tác
cho các phản ứng chuyển hóa GGPP thàn β-caroten. Khi chuyển các đoạn gen psy,
crtI, lcy vào trong cây lúa thì sẽ tạo ra một sự thay đổi rất lớn. Khi đó, gen psy là gen
mã hóa để sinh tổng hợp ra enzim phytoen synthase có nhiệm vụ xúc tác để chuyển
hóa GGPP (20 C) thành phytoen (40 C). Tiếp theo đoạn gen crtI mã hóa để sinh tổng
hợp enzim phytoene desaturase có nhiệm vụ chuyển hóa phytoen thành ζ-Caroten rồi
chuyển hóa tiếp thành Lycopen. Cuối cùng gen lcy mã hóa để sinh tổng hợp enzim
Lycopen β-Cyclase có nhiệm vụ xúc tác chuyển hóa Lycopen thành β-caroten. Và kết
quả là hạt gạo chuyển gen thể hiện kiểu hình có màu vàng đặc trưng của β-caroten và
chứa một lượng tiền vitamin A rất lớn so với hạt gạo bình thường.
Hình 2.3.1 – Sự khác biệt giữa gạo thường và gạo chuyển gen
2.3.2. Quy trình kỹ thuật
Tách chiết gen psy và gen lyc Tách chiết gen crt1 từ
từ cây Daffodil hoặc từ cây vi khuẩn đất Erwinia -
ngô uredovora
Chuẩn bị hạt giống
B4 B3
Taipei 309, IR64 và
Chuyển gen vào Plasmid Chuyển gen vào MTL 250 (Indica)
pCaCar Plasmid pFun3
B5 B1
Nuôi cấy A. tumefactien trên đĩa B7 Nuôi cấy mô tái sinh cây
thạch có chứa mầm tái sinh từ phôi từ phôi hạt lúa
B8
Nuôi tăng sinh và tái tạo cây con từ
mầm tái sinh đã chuyển gen
B9
B10
Hình 2.3.3 a – Cây lúa được trồng trong các điều kiện nhân tạo tối ưu để lấy nguyên liệu
chuyển gen
Bước 3: Tách chiết ADN từ vi khuẩn đất Erwinia uredovora, sau đó tiến hành cắt
bằng enzim EcoRI và Kpnl để thu nhận đoạn gen ctrI
Quá trình tách chiết gen ctrI được tiến hành như sau:
Lấy 1 ml nước cho và một ít giống vi sinh vật (vi khuẩn Erwinia uredovora) trên
ống thạch nghiêng cho vào ống eppendorf rồi đem cân. Lấy thêm một ống eppendorf
khác, thêm nước vào sao cho có khối lượng bằng với khối lượng của ống thí nghiệm
và đem hai ống đi ly tâm.
Đưa hai ống vào máy ly tâm, đặt sao cho 2 ống ở vị trí đối xứng tâm với nhau qua
trục quay của máy ly tâm. Đóng cửa của máy và đặt chế độ ly tâm cho máy như sau:
- Tốc độ quay: 10000 vòng/phút
- Thời gian ly tâm : 1 phút
- Nhiệt độ ly tâm: 100C
Sau khi ly tâm, lấy ống thí nghiệm ra, thấy hỗn hợp phân thành 2 lớp. Ta loại bỏ
lớp nước nổi ở phía trên đi, chỉ giữ lại phần lắng (Phần sinh khối vi sinh vật). Tiếp tục
ta thêm vào ống thí nghiệm vừa loại bỏ phần nổi 200 microlit InstaGene (InstaGene là
hỗn hợp các chất – là bộ kid để test nhanh), rồi đem ủ ở 560C trong máy ổn nhiệt
trong 30 phút để hoạt hóa enzim. Bấm đồng hồ để canh thời gian.
Sau 30 phút lấy ống thí nghiệm ra khỏi máy ổn nhiệt và đem ống đi lắc mạnh trong
10 giây bằng máy vortex. Sau đó tiếp tục đưa ống vào đặt trong bể ổn nhiệt ở 950C
hoặc nước sôi trong 8 phút. Bấm đồng hồ để canh thời gian.
Sau 8 phút, lại lấy ống ra đem lắc mạnh bằng vortex trong 10 giây. Rồi đem ly tâm
với chế độ ly tâm được cài đặt là:
- Tốc độ: 11000 vòng/phút
- Thời gian ly tâm: 2-3 phút
- Nhiệt độ ly tâm: 100C
Sau khi ly tâm, lấy ống nghiệm ra quan sát thấy hỗn hợp phân thành 3 lớp. Lớp trên
cùng chính là ADN có khối lượng nhỏ nhất nên nổi lên trên sau khi ly tâm.
Hình 2.3.3b – Plasmid chuyển gen (Đã được minh họa thành đường thẳng)
Bước 6: Các plasmid được chuyển vào hai đĩa petri khác nhau có nuôi vi khuẩn
Agrobacterium tumefacien dòng mannopine type Ti plasmid. Plasmid tự động chuyển
vào bên trong tế bào vi khuẩn, nhờ sự tăng sinh của vi khuẩn chúng được nhân bản với
số lượng lớn và được sử dùng trong giai đoạn tiếp theo.
Bước 7, 8: Nuôi cấy A. tumefactien trên môi trường có chứa mầm tái sinh cây lúa
đã được chuẩn bị ở bước 2. Các đoạn gen ngoại lai từ A. tumefactien sẽ được chuyển
vào mầm tái sinh từ phôi.
Môi trường để nuôi cấy được pha chế thử nghiệm như bảng dưới đây, thực nghiệm
sẽ lựa chọn ra môi trường tối ưu để sử dụng trong quá trình chuyển gen.
(Số liệu thu thập từ kết quả công bố của Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long)
Kết quả thực nghiệm của Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long cho biết trong số các
môi trường được nghiên cứu nói trên thì môi trường MSReg3 là môi trường tối ưu
nhất cho quá trình chuyển gen bằng A. tumefactien.
+ Trong giai đoạn tiếp theo vi khuẩn mang gen chuyển được đưa vào nuôi cấy
trong môi trường có chứa phôi của hạt lúa Indica đã được chuẩn bị ở trên. Vi khuẩn
Hình 2.3.3c – Quá trình chuyển gen từ A. tumefactien vào tế bào thực vật
Bước 9: Nuôi cấy mô tái sinh tạo cây con từ mầm tái sinh đã chuyển gen
Hình 2.3.3 d – Tế bào callus tái sinh từ phôi chuyển gen và cây lúa đang phát triển tốt
Bước 10: Cây lúa chuyển gen sau tái sinh được nuôi tăng sinh, rồi chuyển ra môi
trường đất và được cho tập thích nghi dần với các điều kiện môi trường ngoài phòng
thí nghiệm n sau đó cho lai với giống lúa địa phương để tăng khả năng thích nghi với
điều kiện tự nhiên tại vùng sản xuất và được trồng với số lượng lớn ngoài tự nhiên để
thu sản phẩm.
Các hạt lúa thu được sẽ được đưa đi kiểm tra kết quả chuyển gen và kiểm tra tính
an toàn trước khi trở thành sản phẩm cho con người sử dụng.
Hình 10 – Kiểm tra kết quả chuyển gen bằng cảm quang
2.5.1.1. Sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện sự có mặt của các gen psy, crt, lcy.
Phần 3
KẾT LUẬN
Cây trồng chuyển gen đã mang lại nhiều lời ích cho con người và đặc biệt là sản
phẩm gạo vàng, một lựa chọn mới cho các quốc gia nghèo. Đây là một thành cồng lớn
của nên công nghệ sinh học của thế giới. Giá trị của các sản phẩm chuyển gen cần
nhiều thời gian để thẩm định, nhưng những gì chúng đã mang lại cho chúng ta hiện
nay đã không thể phủ nhận rằng thực vật chuyển gen có ý nghĩa tích cực và to lớn
trong đời sống con người. Gạo vàng sẽ là một niềm hy vọng rất lớn cho trẻ em phụ nữ
và nhiều thành phần khác trong xã hội. Việt Nam cũng đã thành công trong nghiên cứu
về loài GM mới này. Chúng ta hy vọng một ngày không xa gạo vàng sẽ là nguồn
lương thực cho cả thế giới và đó sẽ là một tương lai mà chúng ta không còn phải lo
lắng về khủng hoảng lương thực.