You are on page 1of 28

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.

HCM
KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------    ----------

BÀI GIẢNG

THỰC HÀNH HOÁ SINH

Biên soạn: TS. Nguyễn Hoài Hương


CN. Bùi Văn Thế Vinh

Tp. Hồ Chí Minh, 04/2009


Lời mở đầu

Bài giảng “Thực hành sinh hoá” dành cho sinh viên năm thứ hai khoa Môi
trường & Công nghệ Sinh học, trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM.
Với thời lượng 30 tiết và tuỳ thuộc điều kiện, cơ sở vật chất của phòng thí
nghiệm cho phép, sinh viên tiến hành làm 5 bài thực hành gồm các nội dung
chính của học phần lý thuyết sinh hóa cơ sở.
1. Giới thiệu phòng thí nghiệm sinh hóa, cách pha chế các dung dịch
chuẩn độ và các dung dịch đệm;
2. Định lượng đường khử bằng phương pháp acid dinitro-salicylic (DNS);
3. Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl;
4. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford;
5. Xác định hoạt tính enzyme amylase.

2
BÀI 1: CÁCH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH CHUẨN ĐỘ
VÀ CÁC DUNG DỊCH ĐỆM

1. Yêu cầu đối với sinh viên làm thí nghiệm:


- Sinh viên phải có mặt đủ và đúng giờ trong các buổi thí nghiệm. Nếu
nghỉ học có lí do chính đáng thì sinh viên phải xin phép giáo viên sắp xếp cho
làm thí nghiệm bù. Thiếu một bài thí nghiệm coi như chưa hoàn tất chương trình.
- Sinh viên phải đọc kỹ, nắm vững nội dung bài thí nghiệm và chuẩn bị
sẵn bản báo cáo kết quả trước khi đến phòng thí nghiệm (PTN). Trước buổi thí
nghiệm giáo viên hướng dẫn sẽ kiểm tra việc chuẩn bị của sinh viên. Đạt yêu
cầu, sinh viên mới được làm thí nghiệm.
- Trong PTN phải mặc áo blouse, rất thận trọng khi sử dụng dung môi dễ
cháy nổ và hóa chất độc hại.
- Khi làm thí nghiệm phải trật tự, cẩn thận, giữ sạch nơi làm thí nghiệm,
tiết kiệm hoá chất. Làm vỡ hoặc gây hư hỏng dụng cụ, thiết bị thì phải bồi
thường.
- Sau khi thí nghiệm, sinh viên phải rửa dụng cụ, sắp xếp lại dụng cụ, hóa
chất đúng chỗ, lau sạch bàn thí nghiệm và bàn giao cho cán bộ phòng thí nghiệm.
Mỗi buổi thí nghiệm, lớp cử một tổ trực nhật có nhiệm vụ nhắc nhở các bạn giữ
vệ sinh chung và làm sạch PTN sau giờ thí nghiệm.
- Cuối mỗi buổi thí nghiệm sinh viên phải nộp bản báo cáo kết quả thí
nghiệm cho giáo viên hướng dẫn. Viết báo cáo ngắn gọn, viết tay gồm nguyên
tắc, phương pháp, phương trình phản ứng, sơ đồ tiến hành thí nghiệm, bảng kết
quả thô, công thức tính và kết quả tính cùng các ý kiến giải thích hay nhận xét.
- Mỗi bài thí nghiệm sẽ có điểm. Điểm môn học sẽ gồm điểm thực hành
thao tác, sự hiểu bài, tuân thủ nội quy và điểm các bài báo cáo.

2. Hướng dẫn sử dụng một số thiết bị trong phòng thí nghiệm


1. Cân điện tử
2. Máy đo so màu quang phổ
3. Bộ chưng cất Kjendahl (hoặc máy cất nitơ tự động)
4. Máy khuấy từ
5. Máy đo pH
7. Máy ly tâm
6. Các dụng cụ thủy tinh khác: bình định mức, pipet, micropipet, burette,
bình Kjendahl, ....

3
3. An toàn khi làm việc với axit và kiềm
1. An toàn khi làm việc với axit:
Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nóng axit hoặc thực hiện
phản ứng với các hơi axit tự do
Khi pha loãng, luôn phải cho axit vào nước trừ phi được dùng trực tiếp
Giữ để axit không bắn vào da hoặc mắt bằng cách đeo khẩu trang, găng
tay và kính bảo vệ mắt. Nếu làm văng lên da, lập tức rửa ngay bằng một lượng
nước lớn
Luôn phải đọc kỹ nhãn của chai đựng và tính chất của chúng
H2SO4: Luôn cho acid vào nước khi pha loãng, sử dụng khẩu trang và
găng tay để tránh phòng khi văng acid
Các acid dạng hơi (HCl) thao tác trong tủ hút và mang găng tay, kính bảo
hộ.
2. An toàn khi làm việc với kiềm
Kiềm có thể làm cháy da, mắt gây hại nghiêm trọng cho hệ hô hấp
Mang găng tay cao su, khẩu trang khi làm việc với dung dịch kiềm đậm
đặc
Thao tác trong tủ hút, mang mặt nạ chống độc để phòng ngừa bụi và hơi
kiềm.
Amoniac: là một chất lỏng và khí rất ăn da, mang găng tay cao su, khẩu
trang, thiết bị bảo vệ hệ thống hô hấp. Hơi amoniac dễ cháy, phản ứng mạnh với
chất oxy hoá, halogen, axit mạnh.
Amoni hydroxyt: chất lỏng ăn da, tạo hỗn hợp nỏ với nhiều kimloại nặng:
Ag, Pb, Zn ... và muối của chúng.
Kim loại Na, K, Li, Ca: phản ứng cực mạnh với nước, ẩm, CO2, halogen,
axit mạnh, dẫn xuất clo của hydrocacbon. Tạo hơi ăn mòn khi cháy. Cần mang
dụng cụ bảo vệ da mắt. Chỉ sử dụng cồn khô khi tạo dung dịch natri alcoholate,
cho vào từ từ. Tránh tạo tinh thể cứng khi hoà tan. Tương tự khi hoà tan với
nước, đồng thời phải làm lạnh nhanh.
Oxit canxi rất ăn da, phản ứng cực mạnh với nước, cần bảo vệ da mắt,
đường hô hấp do dễ nhiểm bụi oxit.
Natri và kali hydroxyt: rất ăn da, phản ứng cực mạnh với nước. Các biện
pháp an toàn như trên, cho từng viên hoặc ít bột vào nước chứ không được làm
ngược lại.

4. Chuẩn bị thí nghiệm


1. Hoá chất thí nghiệm:
Các hoá chất dùng để phân tích, làm tiêu bản, tiến hành phản ứng, ... trong
phòng thí nghiệm được gọi là hóa chất thí nghiệm.

4
Hoá chất có thể ở dạng rắn (Na, MgO, NaOH, KCl, (CH3COO)2...; lỏng
(H2SO4, aceton, ethanon, chloroform, ...) hoặc khí (Cl2, NH3, N2, C2H2 ...) và
mức độ tinh khiết khác nhau:
- Sạch kỹ thuật (P): độ sạch > 90%
- Sạch phân tích (PA): độ sạch < 99%
- Sạch hóa học (PC): độ sạch > 99%
Hóa chất có độ tinh khiết khác nhau được sử dụng phù hợp theo những
yêu cầu khác nhau và chỉ nên sử dụng hóa chất còn nhãn hiệu
2. Nhãn hiệu hoá chất:

Hóa chất được bảo quản trong chai lọ thủy tinh hoặc nhựa đóng kín có
nhãn ghi tên hoá chất, công thức hóa học, mức độ sạch, tạp chất, khối lượng tịnh,
khối lượng phân tử, nơi sản xuất, điều kiện bảo quản.
3. Cách sử dụng và bảo quản hoá chất:
Khi làm việc với hóa chất, nhân viên phòng thí nghiệm cũng như sinh viên
cần hết sức cẩn thận, tránh gây những tai nạn đáng tiếc cho mình và cho mọi
người. Những điều cần nhớ khi sử dụng và bảo quản hóa chất được tóm tắt như
sau:
- Hóa chất phải được sắp xếp trong kho hay tủ theo từng loại (hữu ơ, vô
cơ, muối, acid, bazơ, kim loại, ...) hay theo một thứ tự a, b, c để khi cần dễ tìm.

5
- Tất cả các chai lọ đều phải có nhãn ghi, phải đọc kỹ nhãn hiệu hóa chất
trước khi dùng, dùng xong phải trả đúng vị trí ban đầu.
- Chai lọ hóa chất phải có nắp. Trước khi mở chai hóa chất phải lau sạch
nắp, cổ chai, tránh bụi bẩn lọt vào làm hỏng hóa chất đựng trong chai.
- Các loại hóa chất dễ bị thay đổi ngoài ánh sáng cần phải được giữ trong
chai lọ màu vàng hoặc nâu và bảo quản vào chổ tối.
- Dụng cụ dùng để lấy hóa chất phải thật sạch và dùng xong phải rửa
ngay, không dùng lẫn nắp đậy và dụng cụ lấy hóa chất.
- Khi làm việc với chất dễ nổ, dễ cháy không được để gần nơi dễ bắt lửa.
Khi cần sử dụng các hóa chất dễ bốc hơi, có mùi,... phải đưa vào tủ hút, chú ý
đậy kín nắp sau khi lấy hóa chất xong.
- Không hút bằng pipette khi chỉ còn ít hóa chất trong lọ, không ngửi hay
nếm thử hóa chất.
- Khi làm việc với acid hay base mạnh:
Bao giờ cũng đổ acid hay base vào nước khi pha loãng (không được đổ
nước vào acid hay base);
Không hút acid hay base bằng miệng mà phải dùng các dụng cụ riêng như
ống bóp cao su.
Trường hợp bị bỏng với acid hay base rửa ngay với nước lạnh rồi bôi lên
vết bỏng NaHCO3 1% (trường hợp bỏng acid) hoặc CH3COOH 1% (nếu bỏng
base). Nếu bị bắn vào mắt, dội mạnh với nước lạnh hoặc NaCl 1%.
Trường hợp bị hóa chất vào miệng hay dạ dày, nếu là acid phải súc miệng
và uống nước lạnh có MgO, nếu là base phải súc miệng và uống nước lạnh có
CH3COOH 1%.
Lưu ý các kí hiệu cảnh báo nguy hiểm.

5. Dung dịch
Dung dịch là hỗn hợp của hai hay nhiều chất tác động tương hỗ với nhau
về mặt vật lý và hóa học. Trong dung dịch gồm có chất hòa tan và dung môi. Nếu
chất hòa tan ở dạng rắn thì gọi là chất tan, nếu là chất lỏng thì gọi là dung chất.
Tùy theo tính chất của dung môi mà phân thành dung dịch nước và dung
dịch khan. Phần lớn các dung dịch acid, base, muối trong phòng thí nghiệm là
dung dịch nước, dùng dung môi là nước. Một số chất khác tan trong dung môi
hữu cơ.
Hàm lượng chất hòa tan trong dung dịch thể hiện ở nồng độ dung dịch. Có
nhiều cách biểu thị nồng độ khác nhau. Mỗi cách sẽ tiện dụng trong chuẩn bị,
phân tích và tính toán khác nhau.
1. Các đơn vị nồng độ dung dịch
* Nồng độ phần trăm, (%)

6
- Nồng độ phần trăm khối lượng - khối lượng, % (w/w): là số gam chất tan
có trong 100g dung dịch.
Ví dụ: dung dịch NH4Cl 5% (w/w) là trong 100g dung dịch có chứa 5g NH4Cl
- Nồng độ % khối lượng thể tích (w/v): là số g chất tan có trong 100ml
dung dịch.
Ví dụ: dung dịch CuSO4 10% (w/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10g CuSO4
- Nồng độ phần trăm thể tích - thể tích, % (v/v): là số ml dung chất có
trong 100ml dung dịch.
Ví dụ: dung dịch gycerine 10% (v/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10ml
glycerin
* Nồng độ gam-lit, (g/L): là số gam chất tan có trong 1 lít dung dịch.
* Nồng độ phân tử gam hay nồng độ mol, (Mol/L) hay M: là số phân tử gam
(hay số mol) chất tan trong 1 lít dung dịch.
Ví dụ: Dung dịch KH2PO4 M/15 là trong 1000ml dung dịch chứa M/15
phân tử gam KH2PO4
* Nồng độ đương lượng gam, (N): là số đương lượng gam (đlg) chất tan có
trong 1 lit dung dịch.
Ví dụ: dung dịch KOH 0,5N là trong 1000ml dung dịch chứa 0,5đlg KOH
* Nồng độ dung dịch bảo hòa: là khối lượng tối đa chất hòa tan trong dung dịch.
Ngoài ra trong các phép phân tích vi lượng còn có một số đơn vị nồng độ
khác như:
- Nồng độ mg/mL: số mg chất tan trong 1mL dung dịch
- Miligam phần trăm, mg%: mg chất hòa tan trong 100g dung dịch.
- Microgam phần trăm, µg%: là số µg chất hòa tan trong 100g dung dịch.
- Phần nghìn, 0/00: số g chất hòa tan trong 1000g dung dịch.
- Phần triệu, ppm: số mg chất hòa tan trong 1kg hay 1 lít dung dịch.
- Phần tỷ, ppb: số µg chất hòa tan có trong 1kg hay 1 lít dung dịch.
2. Cách pha dung dịch có nồng độ xác định
* Pha dung dịch có nồng độ phần trăm theo khối lượng, % (w/w)
- Chất tan là chất rắn khan:
Ví dụ: 1) Pha 500g dung dịch NaOH 40% (w/w)
100g dung dịch cần 40g NaOH
500g dung dịch cần Xg?
Lượng NaOH cần để pha dung dịch : X= (40*500)/100= 200g
Lượng nước cần thiết: 500-200=300g (hay 300ml)
Vậy, cân 200g NaOH và đong 300 ml nước cất, hòa tan ta được 500g
dung dịch NaOH 40%
- Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO4.5H2O; Na2HPO4. 12H2O;...)
Khi pha dung dịch cần phải tính thêm lượng nước kết tinh có sẵn.

7
Ví dụ: 2) Pha 320g dung dịch CuSO4 10% (w/w) từ CuSO4.5H2O
M(CuSO4) = 160 và M(CuSO4.5H2O) = 250
Lượng CuSO4 khan để pha dung dịch là: X = (10*320)/100 = 32g
Lượng CuSO4.5H2O cần dùng: Y = (250*32)/160 = 50g
Lượng nước cất thêm vào: 320 -50 = 270g (hay ml)
Vậy, cân 50g CuSO4.5H2O, đong 270ml nước cất, hòa tan ta được 320g
dung dịch CuSO4 10%.
- Pha dung dịch loãng từ một dung dịch đậm đặc hơn:
Ví dụ: 3) Pha 500g dung dịch NaOH 5% từ dung dịch NaOH 10%
Lượng NaOH cần để pha dung dịch 5% là: X = (5*500)/100 = 25g
Lượng dung dịch NaOH 10% cần dùng là: Y = (100*25)/10 = 250g
Lượng nước cất thêm vào: 500-250 = 250g
Vậy, đong 250ml nước cất và 250g dd NaOH 10%, hòa tan ta được 500g
NaOH 5%
- Pha dung dịch bão hoà:
Dung dịch bão hòa là dung dịch có lượng chất tan tối đa. Nếu cho thêm
chất tan vào dung dịch bão hòa thì lượng chất tan đó không tan được nữa và sẽ
lắng xuống.
Muốn pha dung dịch bão hòa cần phải biết độ tan tối đa của chất tan (nồng
độ bão hòa). Ở mỗi nhiệt độ khác nhau, mỗi loại dung môi khác nhau thì nồng độ
bão hòa của mỗi loại chất tan sẽ khác nhau. Tra cứu những số liệu này trong "Sổ
tay các hiện tượng hóa lý".
- Cách pha nhanh dung dịch bão hòa khi không tra được số liệu từ bảng:
Lấy chất tan cần pha vào becher, thêm một ít nước cất và khuấy cho tan.
Nếu sau khi khuấy, chất tan không tan hết lắng xuống thì phần dung dịch phía
trên là dung dịch bão hòa. Nếu chất tan tan hết, thêm chất tan và tiếp tục khuấy,
cứ như thế cho đến khi chất tan không còn tan được nữa.
* Pha dung dịch có nồng độ % theo thể tích
- Chất tan là chất rắn khan
Cân lượng chất tan cần thiết, chuyển sang bình định mức, dùng nước cất
hòa tan và định mức đến thể tích đúng.
Ví dụ: 3) Pha 1 lít dung dịch NaCL 5% (w/v)
Lượng NaCl cần để pha dung dịch: X = (5*1000)/100 = 50g
Vậy, cân 50g NaCl, hòa tan và định mức thành 1 lít bằng nước cất, ta
được 1lít dung dịch NaCl 5%.
- Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO4.5H2O; Na2HPO4. 12H2O;...)
Khi pha dung dịch ta cần phải tính đến lượng nước kết tinh có sẵn giống
như ở phần a.
- Chất tan dạng lỏng: Một số chất tan ở dạng lỏng như HCl, H2SO4 ...

8
Việc cân không thuận lợi, có thể đưa về đơn vị thể tích theo công thức
V = M/d
V: Thể tích chất lỏng; M: khối lượng chất lỏng cần cân; d: tỷ trọng chất
lòng
Chú ý: Các hóa chất lỏng bán trên thị trường thường không ở dạng nguyên chất
mà là các dung dịch đậm đặc. Giới hạn hòa tan tối đa được tính bằng % thể tích
và thay đổi tùy theo loại hóa chất. Ví dụ như H2SO4 - 96%; HCl - 37%; H3PO4 -
65%; NH4OH - 25%. Do đó khi pha các dung dịch từ các loại hóa chất nàyta phải
chú ý đến nồng độ của dung dịch đậm đặc.
Ví dụ: 5) Pha 440ml dung dịch HCl 1% từ dung dịch HCl 37% (d=1,19g/ml)
Lượng HCl cần để pha dung dịch 1% là: X= (1*440)/100 = 4,4g
Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là : Y = (100*4,4)/37 = 11,9g
= 11,9/1,19 = 10 ml
Lượng nước cất thêm vào:440-10 = 430ml
Vậy, dùng ống đong lấy 10ml dung dịch HCl37%, và 430ml nước cất ta
được 440 ml HCl 1%
Do việc sử dụng các loại bình định mức làm cho việc pha chế dung dịch
thí nghiệm trở nên đơn giản và chính xác vì vậy ngày nay đa số các dung dịch thí
nghiệm được pha chế theo nồng độ khối lượng - thể tích (w/v).
* Pha dung dịch nồng độ phân tử gam
Mol (M) hay phân tử gam (ptg) là khối lượng của các chất tính ra gam
bằng khối lượng phân tử của nó.
Dung dịch nồng độ 1M là dung dịch chứa 1ptg chất hòa tan trong 1 lít.
Muốn pha dung dịch nồng độ 1M của một chất nào đó, ta tính khối lượng
phân tử chất đó ( hoặc tra bảng) theo đơn vị gam. Cân chính xác lượng chất tan,
qua phễu cho vào bình định mức có dung tích 1 lít. Cho vào từng lượng nước cất
nhỏ, lắc để hòa tan hoàn toàn và đưa nước cất tới mức. Chuyển dung dịch sang
bình chứa, lắc để trộn đều đồng nhất.
Khi phải đun nóng dung dịch để hòa tan, hoặc quá trình hòa tan có toả
nhiệt thì phải chờ nhiệt độ trở lại bình thường (nhiệt độ không khí) rồi mới thêm
nước tới vạch định mức.
Ví dụ: 6) Pha 1 lít dung dịch KOH 1M
Phân tử lượng của KOH: MKOH = 39 +16 +1 =56
Lượng KOH để pha 1 lít dung dịch 1M là: 56g
Vậy, cân 56g KOH, hòa tan trong 1 ít nước, cho vào bình định mức 1000.
Đây là phản ứng tỏa nhiệt, cần làm nguội dung dịch trước khi định mức
thành 1 lít.
Nếu muốn pha dung dịch 2M; 3M hay 0,1M; 0,05M ta cũng tiến hành
tương tự với lượng cân tương ứng.

9
Ví dụ: 7) Pha 500ml dung dịch KCl 3M
Phân tử lượng của KCl: MKCl = 39 +35,5 = 74,5
Lượng KCl để pha 500ml dung dịch 3M là: X= (74,5 *3*500)/1000 =
111,75g
Vậy, cân 111,75g KCl, hòa tan trong 1 ít nước, cho vào bình định mức
500, định mức đến vạch.
Trường hợp chất rắn có ngậm nước, ptg chất đó phải tính luôn cả khối
lượng các phân tử nước.
Nếu chất tan là dung dịch, ta phải tính toán dựa vào nồng độ dung dịch đó.
Ví dụ: 8) Pha 1 lít dung dịch HCl 1M từ HCl 37%
Phân tử lượng HCl: MHCl = 1+35,5 = 36,5
Lượng HCl 37% để pha dung dịch 1M là: X = (36,5*100)/37 = 98,65g
Hay 98,65/1,19 = 83ml
Vậy, đong 83ml HCl 37% cho vào bình định mức 1000 có sẵn 1 ít nước.
Định mứ c thành 1 lít. Tiến hành pha trong tủ Hotte vì hơi acid bay lên rất
độc hại.
* Nồng độ đương lượng gam (N)
Dung dịch nguyên chuẩn là dung dịch có nồng độ 1N
Đương lượng gam(đlg) được định nghĩa theo mỗi trường hợp riêng biệt từ
phương trình phản ứng dùng để định phân.
Định phân acid- base:
- Đlg của một axit là khối lượng chất đó để tạo ra trong phản ứng 1 ion
gam H+.
- Đlg của một base là khối lượng chất đó để tạo ra trong phản ứng 1 ion
gam OH-.
Ví dụ: 9) Phản ứng giữa HCl và NaOH
H+Cl- + Na+OH- → Na+Cl- + H2O
1ptg HCl cho ra 1 ion gam H+, vậy 1 N (HCl) = 1M (HCl)
1ptg NaOH cho ra 1 ion gam OH-, vậy 1N (NaOH) = 1M (NaOH)
Ví dụ: 10) Phản ứng giữa H2SO4 và NaOH
2H+SO42- + 2 (Na+OH-) → 2 Na+SO42- + 2H2O
1ptg H2SO4 cho ra 2 ion gam H+ vậy 1N (H2SO4) = 2 M (H2SO4)
1ptg NaOH cho ra 1 ion gam OH- vậy 1N (NaOH) = 1M (NaOH)
Số ion gam tạo ra từ 1 ptg được gọi là hệ số nguyên chuẩn độ (ký hiệu là
n)
N= M/n
Phản ứng oxy hoá khử: Tùy theo số điện tích trao đổi ở từng phản ứng mà
hệ số n khác nhau. Tính N theo công thức trên.
Ví dụ: 11) 2 Na2S2O3 + I2 → Na2S4O6 + 2 NaI

10
I2 + 2e → 2I-
2 S2O32- -2e → S4O62-
Trong phản ứng này n =1 nên N = M/1 = M
Việc pha dung dịch nồng độ đương lượng gam (N) cũng tương tự với cách
pha dung dịch nồng độ phân tử gam (M).
3. Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch
Khi pha hóa chất, có nhiều nguyên nhân làm cho nồng độ dung dịch
không chính xác như việc cân đong không chính xác, các hóa chất không tinh
khiết hay bị hút ẩm. Thời gian tàng trữ lâu nên chất tan bị thăng hoa, bị oxy hóa,
dung môi bay hơi, vì vậy phải kiểm tra nồng độ thực của các dung dịch pha sẵn
dựa vào các dung dịch có nồng độ chính xác được gọi là dung dịch chuẩn
(fixanal)
* Dung dịch chuẩn
Dung dịch chuẩn là các dung dịch được chuẩn bị sẵn, đảm bảo chính xác
và được dùng để định chuẩn các dung dịch tự pha chế khi làm thí nghiệm. Các
chất dùng trong dung dịch chuẩn phải khá bền vững sao cho nồng độ của chúng
không thay đổi nhanh chóng theo thời gian.
Pha dung dịch chuẩn, ta phải dùng ống chuẩn. Ong chuẩn là một ống
ampun thủy tinh hay nhựa đóng kín. Bên trong chứa một lượng cân chính xác
chất tan hoặc dung dịch chất tan. Khi chuyển hết lượng chất tan trong ống vào
bình định mức và pha thành 1 lít ta được dung dịch chuẩn có nồng độ đã ghi trên
nhãn ngoài ống.
* Cách pha dung dịch chuẩn từ ống chuẩn
- Dùng đinh thủy tinh chọc thủng ampun, hứng lên phểu vào bình định
mức, dùng bình tia rửa sạch chất tan có trong ampun vào bình định mức 1 lit, vừa
thêm nước cất vừa lắc và đưa nước cất tới vạch mức.
- Đối với các hợp chất bền vững, có thành phần không thay đổi như NaCl,
AgNO3, acid oxalic, ... có thể pha dung dịch chuẩn trực tiếp bằng cách cân chính
xác chất cần pha, pha loãng và định mức tới thể tích đúng.
- Đối với các chất như NaOH, HCl, Na2S2O3, ... không thể pha ngay được
dung dịch chuẩn, do các chất này thường không bền vững và dễ thay đổi thành
phần, vì vậy sau khi pha phải hiệu chỉnh lại nồng độ.
Ví dụ: 12) NaOH thường nhiễm một lượng Na2CO3 rất dễ chảy nước, HCl
dễ bay hơi, Na2S2O3 dễ bị mất nước tinh thể khi để ngoài không khí.
* Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch
Đối với các chất dễ thay đổi thành phần khi ở dạng rắn, nếu muốn pha
dung dịch có nồng độ chính xác, ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng, sau đó
hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch dựa vào phản ứng với một dung dịch chuẩn
thích hợp.

11
Ví dụ: Pha dung dịch NaOH 0,1 N từ NaOH rắn và dùng dung dịch chuẩn
H2SO4 0,1N để chuẩn độ lại. Dung dịch KOH 0,05N tron cồn phải dung dung
dịch chuẩn là H2SO4 0,05N
Đối với các dung dịch dễ thay đổi trong quá trình bảo quản, mỗi lần sử
dụng lại phải xác định lại hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch
Xét một phản ứng trung hòa acid - base, 1 ion gam H+ sẽ phản ứng với 1
ion gam OH-. Vậy nếu dùng dung dịch acid và dung dịch base có cùng nồng độ
N, thì phản ứng sẽ đạt điểm cân bằng khi thể tích hai chất bằng nhau
C1V1 = C2V2
Nếu gọi Cp là nồng độ dung dịch định pha và Ct là nồng độ thực của dung
dịch ta có hệ số hiệu chỉnh K:
K= Cp/Ct = Vp/Vt
Ví dụ: 13) Dung dịch chuẩn là H2SO4 0,1N, dung dịch định pha là NaOH
0,1N
Lấy 10ml H2SO4 0,1N cho vào erlen, thêm ba giọt chỉ thị màu phenolphtalien,
dùng burette định phân bằng NaOH được 11 ml NaOH
Vậy nồng độ thực tế NaOH đã pha là : Ct = (10*0,1)/11 = 0,091 N
Hệ số điều chỉnh K: K= 0,091/0,1 = 10/11 = 0,91
6. Dung dịch đệm:
Dung dịch đệm là dung dịch tạo môi trường ổn định pH cho dung dịch,
thường gồm một acid yếu và một base yếu với tỉ lệ của chúng sẽ quyết định pH
của dung dịch.
Việc pha dung dịch đệm tuân theo nguyên tắc chọn cặp acid – base có
hằng số phân ly pK A/B gần với pH đệm muốn pha và phối trộn chúng với số
mol bằng nhau. Thí dụ, để có đệm pH ở giá trị 4.75, chọn cặp acid - base
CH3COOH (0,1M)/CH3COONa (0,1M). Nếu thêm vào dung dịch 0.001 mol HCl
thì pH của hệ vẫn chỉ ở mức 4.748 gần bằng 4.75. Nghĩa là pH thay đổi rất ít.
Trong cơ thể sống, dung dịch đệm đóng vai trò quan trọng, ví dụ như ổn
định pH của máu bằng các hệ đệm carbonate và phosphate.
Về nguyên tắc thì phối hợp các loại đệm có các khoảng đệm khác nhau
thành 1 dung dịch là không có vấn đề gì. Tuy nhiên sử dụng các đệm nào còn tùy
thuộc vào ứng dụng sao cho thành phần của đệm không phản ứng với các cấu tử
trong hệ phản ứng khảo sát theo chiều hướng có hại. Các phản ứng thường thấy
là phản ứng tạo kết tủa hay tạo phức hoặc oxy hóa khử.
Có dung dịch chứa hỗn hợp 1 acid yếu (Ví dụ: acid acetic) với muối của
nó (Ví dụ: muối natri acetate), dung dịch sẽ cân bằng dạng như sau:
CH3COOH + H2O -----> CH3COO- + H3O+

12
Có dung dịch khác chẳng hạn, chứa hỗn hợp base yếu (Ví dụ: amoniac)
với muối của nó (Ví dụ: muối amoni clorua),trong dung dịch cân bằng có dạng
sau:
NH3 + H2O ----------> NH4+ + OH-
Dung dịch đệm có pH thay đổi rất ít khi thêm một lượng acid hoặc base.
Khi thêm một lượng acid mạnh (H3O+), base liên hợp kết hợp với nó cho acid
yếu (cân bằng chuyển dịch theo chiều nghịch)  pH của dung dịch giảm không
đáng kể.
Trái lại, khi thêm một lượng base mạnh (OH-), acid điện li cho H3O+ (cân
bằng chuyển dịch theo chiều thuận), ion hidroni H3O+ trung hòa OH- cho base
yếu H2O. Kết quả pH của dung dịch tăng không đáng kể.
Khả năng đệm của hỗn hợp đệm phụ thuộc vào hàm lượng acid và base
liên hợp có trong hỗn hợp.
* Dung dịch đệm borat:
- Dung dịch acid boric (a): 12,404 g H3BO3 hòa tan và định mức đến 1000
ml.
- Dung dịch borat (b): 19,108 g Na2B4O7.10H2O hòa tan và định mức đến
1000 ml
Dung dịch đệm borat có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a)
và dung dịch (b) theo bảng dưới đây:

A b pH a b pH
9,80 0,2 6,60 6,50 3,50 8,20
9,70 0,6 6,77 6,00 4,00 8,31
9,40 0,6 7,09 5,50 4,50 8,41
9,00 1,0 7,36 5,00 5,00 8,51
8,75 1,25 7,50 4,50 5,50 8,60
8,50 1,50 7,60 4,00 6,00 8,69
8,00 2,0 7,78 3,00 7,00 8,84
7,70 2,30 7,88 2,00 8,00 8,98
7,50 2,50 7,94 1,00 9,00 9,11
7,00 3,00 8,08 0,00 10,0 9,24

*Dung dịch đệm citrate (pH = 3,0 – 6,2)


- Dung dịch acid citric 0,1M (a): 21,01 g C6H8O7.H2O hòa tan và định
mức đến 1000 ml.
- Dung dịch trinatri citrate 0,1M (b): 29,41 g C6H5O7Na3.2H2O hòa tan và
dẫn nước đến 1000 ml.
Dung dịch đệm citrate có giá trị pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung
dịch (a) và số ml dung dịch (b) theo bảng sau:

A b pH a b pH
46,5 3,50 3,0 23,0 27,0 4,8

13
43,8 6,20 3,2 20,5 29,5 5,0
40,0 10,0 3,4 18,0 32,0 5,2
37,0 13,0 3,6 16,0 34,0 5,4
35,0 15,0 3,8 13,7 36,3 5,6
33,0 17,0 4,0 11,8 38,2 5,8
31,0 19,0 4,2 9,5 40,5 6,0
28,0 22,0 4,4 7,2 42,8 6,2
25,5 24,5 4,6 - - -

*Dung dịch đệm phosphate (pH = 5,7 – 8,0)


- Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M (a): 27,8 g NaH2PO4 hòa tan
và định mức đến 1000 ml.
- Dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M (b): 53,05 g Na2HPO4.7H2O
hoặc 71,7 g Na2HPO4.12H2O hòa tan và định mức đến 1000 ml.
Dung dịch đệm phosphate có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung
dịch (a) và số ml dung dịch (b) định mức đến 200 ml.

a b pH a b pH
93,5 6,50 5,6 45,0 55,0 6,9
92,0 8,00 5,8 39,0 61,0 7,0
90,0 10,0 5,9 33,0 67,0 7,1
87,7 12,3 6,0 28,0 72,0 7,2
85,0 15,0 6,1 23,0 77,0 7,3
81,5 18,5 6,2 19,0 81,0 7,4
77,5 22,5 6,3 16,0 84,0 7,5
73,5 26,5 6,4 13,0 87,0 7,6
68,5 31,5 6,5 10,5 89,5 7,7
62,5 37,5 6,6 8,50 91,5 7,8
56,5 53,5 6,7 7,00 93,0 7,9
51,0 49,0 6,8 5,30 94,7 8,0

*Dung dịch đệm Na2HPO4 – KH2PO4 (pH = 5,0 – 8,0)


- Dung dịch dinatri hydrophosphate 1/15M (a): 23,9 g Na2HPO4.12H2O
hòa tan và định mức đến 1000 ml.
- Dung dịch kali dihydrophosphate 1/15M (b): 9,07 g KH2PO4 hòa tan và
định mức đến 1000 ml.
Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số
ml dung dịch (b).

a b pH a b pH
10 990 5,0 372 628 6,6
18 982 5,2 492 508 6,8
30 970 5,4 612 388 7,0
49 951 5,6 726 274 7,2
79 921 5,8 818 182 7,4

14
121 879 6,0 885 115 7,6
184 816 6,2 936 64 7,8
264 736 6,4 969 31 8,0

*Dung dịch đệm Glycine – HCl (pH = 2,2 – 3,6)


- Dung dịch glycine 0,2 M (a): 15,01g glycine hòa tan và định mức đến
1000 ml.
- Dung dịch HCl 0,2 M (b): 16,8 ml HCl đặc (37%) pha thành 1000 ml.
Dung dịch đệm Glycine có pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X
ml dung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml.

X pH X pH
5,0 3,6 16,8 2,8
6,4 3,4 24,2 2,6
8,2 3,2 32,4 2,4
11,4 3,0 44,0 2,2

*Dung dịch đệm Glycine – NaOH (pH = 8,6 – 10,6)


- Dung dịch glycine 0,2 M (a): 15,01g glycine hòa tan và định mức đến
1000 ml.
- Dung dịch NaOH 0,2 M (b): 8 g NaOH hòa tan và định mức đến 1000
ml.
Dung dịch đệm Glycine có pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X
ml dung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml.

X pH X pH
4,0 8,6 22,4 9,6
6,0 8,8 72,2 9,8
8,8 9,0 32,0 10,0
12,0 9,2 38,6 10,4
16,8 9,4 45,5 10,6

*Dung dịch đệm acetate (pH = 3,6 – 5,6)


- Dung dịch acid acetic 0,2M (a): 11,55 ml CH3COOH đặc và định mức
đến 1000 ml.
- Dung dịch natri acetate 0,2M (b): 16,4 g CH3COONa hoặc 27,2 g
CH3COONa.3H2O được hòa tan và định mức đến 1000 ml.
Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào X ml dung dịch (a) và Y
ml dung dịch (b) và định mức đến 100 ml.

a b pH a b pH
46,3 3,7 3,6 20,0 30,0 4,8
44,0 6,0 3,8 14,8 35,2 5,0
41,0 9,0 4,0 10,5 39,5 5,2
36,8 13,2 4,2 8,8 41,2 5,4

15
30,5 19,5 4,4 4,8 45,2 5,6
25,5 24,5 4,6

*Dung dịch đệm vạn năng 0,1M


- Dung dịch acid acetic 0,1M (a): 5,7 ml CH3COOH đặc và định mức
bằng nước cất đến 1000 ml.
- Dung dịch acid phosphoric 0,1M (b): 6,45 ml H3PO4 đậm đặc và định
mức bằng nước cất đến 1000 ml.
- Dung dịch acid ortho-boric 0,1M (c): hòa tan 6,18 g acid ortho-boric
trong nước cất và định mức đến 1000 ml.
- Dung dịch natri hydroxide 1N (d): hòa tan 40 g NaOH trong nước cất và
định mức đến 1000 ml.
Trộn lẫn các dung dịch (a), (b), (c) với thể tích bằng nhau nhận được dung
dịch đệm 0,1M có pH = 1,8. Điều chỉnh giá trị pH của dung dịch đệm trong
khoảng pH = 1,8 đến pH = 12,0 bằng cách bổ sung dung dịch NaOH 1N (d). Các
dung dịch đệm vạn năng nồng độ khác được chuẩn bị tương tự.

16
BÀI 2. ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG
PHƯƠNG PHÁP ACID DINITRO-SALICYLIC (DNS)

1. Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với
thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ
thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Dựa theo đồ thị
đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng
đường khử của mẫu nghiên cứu.
Tùy đối tượng nghiên cứu (hạt, quả,...) mà cách chuẩn bị dung dịch
nghiên cứu dùng để định lượng đường có khác nhau đôi chút, nhưng nguyên tắc
chung như sau:
- Trường hợp nguyên liệu thí nghiệm không chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin,
có thể chiết đường từ nguyên liệu bằng nước. Cân và cho vào cối sứ 1 g nguyên
liệu hạt hay các mẫu thí nghiệm thực vật khô như cây, lá hoặc quả khô,... đã được
nghiền nhỏ (và sấy khô đến khối lượng không đổi). Nếu là nguyên liệu tươi (như
hoa, quả tươi) thì cân 5 – 10 g. Nghiền cẩn thận với bột thủy tinh hay cát sạch và
30 ml nước cất nóng 70 – 80oC. Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức
dung tích 1000 ml. Đun cách thủy 70 – 80oC trong 35 – 40 phút, kết tủa protein
và các tạp chất bằng dung dịch chì acetate [Pb(C2H2O2)2.3H2O] hoặc chì nitrate
[Pb(NO3)2] 10%. Tránh dùng quá dư chì acetate (dùng 2 – 5 ml chì acetate). Sau
đó loại bỏ lượng chì acetate dư bằng dung dịch Na2SO4 bão hòa, để yên hỗn hợp
10 phút. Tiếp đó thêm nước cất tới vạch mức và đem lọc qua giấy lọc vào cốc
hay bình khô. Nước lọc dùng làm dung dịch thí nghiệm.
- Trường hợp nguyên liệu chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin như khoai lang,
sắn, khoai tây,... cần chiết đường bằng rượu 70 – 80oC, đun hỗn hợp cách thủy
trong bình cách thủy có lắp ống làm lạnh không khí. Trong trường hợp này
không cần kết tủa protein bằng chì acetate vì lượng protein chuyển vào dung dịch
không nhiều.
- Trường hợp các nguyên liệu chứa nhiều acid hữu cơ như cà chua, dứa, chanh,
khế,... cần chú ý là trong quá tình đun khi chiết, đường saccharose có thể bị thủy
phân một phần. Do đó cần xác định riêng đường khử và riêng saccharose. Trước
khi đun cách thủy hỗn hợp phải trung hòa acid bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa
tới pH 6,4 – 7,0.

2. Dụng cụ - hóa chất:


1 Dụng cụ
- Bình định mức 50ml

17
2. Hóa chất - nguyên liệu
- Mẫu rau quả chứa đường (rau cải ngọt, dứa)
- Thuốc thử DNS
- Dung dịch glucose chuẩn
3. Tiến hành
- Chiết xuất đường trong thực vật
5g rau cải ngọt → nghiền nhỏ → cho vào becher 100ml + 10ml cồn 900
→ đun cách thủy (sôi 3 lần) → khuấy đều bằng đũa thủy tinh → để nguội → lọc
(chỉ gạn lấy phần trong).
Cho tiếp 10ml cồn 800 vào cốc đựng bã, khuấy đều, đun sôi 2 lần trên nồi
đun cách thủy→ Để nguội → lọc (lặp lại 2 lần)
Đưa phần bã lên lọc và rửa bằng rượu nóng (800)
Rượu qua lọc được cho bay hơi ở trong phòng hoặc trên nồi cách thủy đun
nhẹ. Sau khi cho bay hơi rượu, mẫu có thể để lâu trong bình hút ẩm.
Cặn khô trong cốc được pha loãng thành 50ml với nước cất. Để lắng cặn
khi đem làm hiện màu. Và tuỳ theo nồng độ đường nhiều hay ít mà pha loãng
thêm 5-10 lần.
- Dựng đường cong chuẩn và xác định hàm lượng đường
Cho vào 5 ống nghiệm sạch với các chất có thể tích như bảng sau
Hoá chất Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5
Glucose 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
(10 mg/ml)
Nước cất 9.8 9.6 9.4 9.2 9.0
(ml)
Nồng độ 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Từ các ống nghiệm trên lấy 1ml ở mỗi ống vào 5 ống nghiệm khác và
thêm vào mỗi ống 3ml thuốc thử DNS. Đun sôi đúng 5 phút. Làm lạnh đến nhiệt
độ phòng. Pha loãng mẫu nếu cần sao cho mật độ quang nằm trong khoảng 0,2 –
0,8. Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm với đối chứng là nước. Vẽ đường
chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ glucose.
Đường thẳng thu được có thể cắt trục hoành ở 0,04 mg glucose do glucose bị oxy
hóa.
Trong mỗi ống nghiệm sẽ chứa tương ứng 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg
glucose. So màu rồi vẽ đồ thị mẫu (vẽ trên máy tính)
Làm tương tự với mẫu dung dịch đường được chuẩn bị ở trên và một mẫu
thử không (nước cất)
4. Tính kết quả
Từ phương trình đồ thị đường cong chuẩn tính được % lượng đường trong
mẫu vật.

18
BÀI 3. ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ
BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL

1. Nguyên tắc
Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nitơ
tổng số. Nitơ có trong thành phần acid amine của protein là nitơ protein. Nitơ
không có trong thành phần protein như của các muối vô cơ, acid nitric, các acid
amin tự do, các peptid, urea và các dẫn xuất của urea, các alkaloid, các base
purine và pyrimidine,... là nitơ phi protein.
Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein
- Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có
chất xúc tác. Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau:
2H2SO4 → 2H2O +2SO2↑+ O2
- Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. Các phân
tử chứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. Ví dụ các protein bị thủy
phân thành acid amine; carbon và hidro của acid amine tạo thành CO2 và H2O;
còn nitơ được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành
(NH4)2SO4 tan trong dung dịch
2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4
Các nguyên tố P, K, Ca, Mg,... chuyển thành dạng oxide: P2O5, K2O, CaO,
MgO,...
- Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH
(NH4)2SO4 + 2 NaOH = Na2SO4 +H2O + 2NH3↑
- NH3 bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH4OH rơi vào bình hứng,
bình hứng chứa H2SO4 0.1N
2NH4OH + H2SO4 → (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 dư
- Chuẩn độ H2SO4 dư bằng NaOH 0.1N
H2SO4 dư + NaOH → Na2SO4 + H2O
2. Dụng cụ - hóa chất
a. Dụng cụ
+ Bộ chưng cất Kjeldahl định lượng Nitơ gồm:
- Bình Kjeldahl phá mẫu
- Bình cất đạm
- Ống dẫn khí
- Ống sinh hàn
- Bình hứng (becher 250ml)
- Bi thủy tinh
- Bếp đun

19
+ Pipet 20ml; pipet 10ml
+ Erlen 250ml
+ vaseline

Bộ chưng cất Kjeldahl


b. Hóa chất + nguyên liệu
+ Bột đậu nành (0.1g)
+ H2SO4 đậm đặc
+ NaOH 40%
+ H2SO4 0.1N chuẩn
+ NaOH 0.1N chuẩn
+ Thuốc thử Tasiro
+ chất xúc tác: hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 (3:1)
3. Tiến hành
- Vô cơ hóa mẫu
Cân 100mg bột đậu nành đã sấy khô tuyệt đối cho vào bình Kjeldahl, cho
tiếp 5ml H2SO4 đậm đặc sẽ thấy xuất hiện màu nâu đen (do nguyên liệu đã bị oxi
hóa). Cho thêm vào 200mg chất xúc tác, lắc nhẹ, đậy kín để khoảng 3 phút. Đặt
bình Kjeldahl lên bếp đun, đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh
Lưu ý giai đoạn này phải thực hiện trong tủ Hotte, đặt bình hơi nghiêng
trên bếp, tránh trường hợp khi sôi mạnh hóa chất bắn ra ngoài, khi đã sôi giữ
nhiệt độ bếp đun vừa phải để tránh hóa chất trào ra ngoài và không bị bay mất
amoniac.
Trong khi đun, theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi
thấy dung dịch gần như trong suốt thì có thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử
ở trên thành bình còn chưa bị oxi hoá vào trong dung dịch. Tiếp tục đun cho đến
khi dung dịch trong hoàn toàn. Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang
bình định mức 100 ml, dùng nước cất vô đạm tráng lại bình Kjeldahl và định
mức đến vạch.
- Cất đạm

20
Chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có
sẵn 50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro lúc này trong bình có màu tím
hồng. Tiếp tục cho vào bình cất 15ml NaOH 40% cho đến khi toàn bộ dung dịch
chuyển sang màu xanh lá mạ (thêm 5ml NaOH 40% nếu dung dịch trong bình
chưa chuyển hết sang màu xanh lá mạ).
Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0.1N và
3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng). Đặt bình hứng sao cho
ngập đầu ống sinh hàn. Bật công tắc cất đạm
Sau khi cất đạm 10-12 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra
không, dùng giấy qùy thử ở đầu ống sinh hàn. Nếu giấy qùy không đổi sang màu
xanh là được. Ngưng cất đạm, đợi hệ thống nguội mới tháo hệ thống đem đi rửa.
- Chuẩn độ:
Chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0.1N cho đến khi mất
màu tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ. Ghi nhận thể tích NaOH 0.1 N sử
dụng.
4. Tính kết quả:
Hàm lượng % nitơ tổng số được tính theo công thức
N (mg%) = {1,42 * (V1-V2)*100/a}*2
V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứng
V2: số ml NaOH 0.1N đã chuẩn độ
a số miligam nguyên liệu
1,42 hệ số ; cứ 1 ml H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương
với 1,42mg Nitơ

21
BÀI 4. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
BRADFORD

1. Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của
thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung
dịch mang tính acid, khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng
hấp thu cực đại 465 nm; khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại
ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực
tiếp tới nồng độ protein.
Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với
dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ. Dung dịch protein chuẩn thường
là bovine serum albumin. Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc
nhuộm, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo dung dịch
bằng máy quang phổ kế ta được ODx, độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với lượng trong mẫu.
Thực hiện một đối chứng với nước cất (OD0). Lấy giá trị OD = ODx - OD0.
Lượng protein mẫu trong dung dịch đo được xác định bằng cách chấm trên
đường chuẩn theo OD, lấy giá trị của điểm đó trên trục hoành. Đó chính là lượng
protein mẫu trong dung dịch đo.
Công thức phân tử của Coomasie Brilliant Blue G-250

2. Dụng cụ - hóa chất


1. Dụng cụ
- Máy đo quang phổ
- Ống nghiệm (14)
- Pipette 5ml, 1ml (có thể thay bằng pipetteman)
- Đồng hồ bấm giây
- Giấy thấm
- Giá để ống nghiệm
- Bình tia đựng cồn

22
2. Hóa chất
- Cồn 900
- Dung dịch protein chuẩn: cân 10 mg albumin bằng cân phân tích, pha
trong 1 ml nước cất, lắc đều cho tan. Giữ ở -200C. Khi dùng pha loãng ra 100 lần,
được dung dịch có nồng độ 0,1 mg/ml.
- Dung dịch thuốc thử Bradford: dung dịch thuốc thử có thành phần trong
100ml như sau:
Coomassie Brilliant Blue: 0,005g
Ethanol tuyệt đối: 4,7g
Phosphoric acid 85%: 8,5g
Phẩm màu Coomasie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong một
chai đựng màu tối có nắp. Bổ sung phosphoric acid và chỉnh tới 100ml bằng
nước cất. Lắc đều, giữ ở 40C
- Dung dịch cần xác định hàm lượng protein (phòng thí nghiệm cung cấp)
3. Tiến hành
- Lập một loạt 6 ống theo số thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, 5 và 1 ống nghiệm chứa
mẫu cần phân tích X
- Bổ sung các thành phần như bảng sau, riêng ống nghiệm X cho 1 ml
mẫu cần phân tích do phòng thí nghiệm cung cấp (nếu cần sinh viên tự pha loãng
mẫu trước khi phân tích)
- Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian 0 phút cho 5ml thuốc thử vào
ống nghiệm 0, lắc đều để yên. Ở thời điểm 1 phút cho 5ml thuốc thử vào ống
nghiệm 1, lắc đều để yên,... cứ tiếp tục cho đến hết.
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 X
Nước cất (ml) 1 0.9 0.9 0.7 0.6 0.5 -
Albumin chuẩn (0,1mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 -
TT Bradford 5 5 5 5 5 5 5
Nồng độ Albumin (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 ?

- Tính thời gian ống 0 được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu của dung
dịch ở bước sóng 595 nm. Ta có giá trị OD0, ở thời điểm 21 phút đo ống 1
(OD1),... tương tự cứ cách một phút đo cho hết các ống. Ghi lại giá trị OD.
4. Tính kết quả:
- Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang
OD595
- Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml)
với mật độ quang OD595 ở trên ta tính được hàm lượng protein ở trong mẫu phân
tích

23
BÀI 5. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME

1. Nguyên tắc
1.1. Enzyme và đơn vị đo hoạt tính enzyme
Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và có tính đặc hiệu
cao. Mỗi enzyme có khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định.
Hoạt động hay hoạt tính của enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất được chuyển
hóa hoặc lượng sản phẩm tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn. Vì vậy có
thể đánh giá hoạt tính xúc tác của enzyme bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa
cơ chất hoặc tốc độ tích lũy sản phẩm phản ứng.
Về nguyên tắc có thể hai nhóm phương pháp chính sau:
- Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong
một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định.
- Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ
chất hay sản phẩm tương ứng với một nồng độ enzyme xác định.
Để thực hiện được mục đích trên, nhiều phương pháp phân tích khác nhau
được sử dụng: phương pháp đo quang phổ, đo độ phân cực, áp suất, độ nhớt,
phương pháp sắc ký và phương pháp hóa học.
* Đơn vị hoạt tính enzyme :
Mục đích xác định hoạt tính enzyme là xác định số đơn vị hoạt tính. Một
đơn vị họat tính enzyme được định nghĩa theo nhiều phương pháp.
a) Đơn vị hoạt tính thông dụng nhất là đơn vị quốc tế (Enzyme Unit, viết tắt
U) do Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (International Union of Biochemistry – IUB
định nghĩa:
Một đơn vị chuẩn của enzyme (1 U) là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa
được 1 mol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 U = 1 mol sản phẩm = 1 mol cơ chất (10-6 mol)/phút
b) Năm 1979, Hội đồng Danh pháp của IUB khuyến cáo nên sử dụng Katal
làm đơn vị cơ bản của hoạt tính enzyme:
Một Katal là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được 1 mol cơ chất sau 1 giây
ở điều kiện tiêu chuẩn.
1 Kat = 1 mol cơ chất/ giây = 60 mol/ phút = 60 x 106 mol/ phút = 6 x 107 U
1 U = 1/60 x 10-6 Kat = 16,67 nKat (nanokatal)
Đơn vị Katal được khuyến cáo vì nằm trong hệ đơn vị đo lường Quốc tế (SI).
c) Đơn vị hoạt tính dựa vào sự thay đổi đặc tính hỗn hợp phản ứng, ví dụ sự
thay đổi độ đục, độ nhớt ...trong một đơn vị thời gian. Trường hợp cơ chất và sản
phẩm là một hỗn hợp phức tạp thì áp dụng đơn vị hoạt tính này.
N h ư v ậ y , có n h iề u đ ơ n v ị h o ạ t tín h en z y m e. Đ iề u q u a n trọ n g n h ất l à c ần đ ịn h
n g h ĩa rõ ràn g đ ơ n v ị h o ạt tín h .

24
Hoạt tính riêng (specific activity) của enzyme
Hoạt tính riêng của một chế phẩm enzyme đặc trưng cho độ tinh sạch của chế
phẩm enzyme. Hoạt tính riêng được biểu thị bằng số đơn vị enzyme/mg protein
protein (U/mg protein) hoặc Kat/kg protein, trong đó hàm lượng protein được
xác định theo phương pháp Lowry hoặc Bradford).
* Điều kiện phản ứng để xác định hoạt tính
 K h i tiế n h à n h th ự c n g h iệm cần trá n h n h ữ n g y ếu tố có th ể b iế n tín h p ro te in
en z y m e.
 C ác th ô n g s ố n h iệt đ ộ , p H , n ồ n g đ ộ io n v à th àn h p h ầ n d u n g d ịch đ ệ m ản h
h ư ở n g lê n h o ạ t tín h en z y m e. T h ử h o ạt tín h en z y m e p h ải đ ư ợ c tiến h à n h
tro n g đ iề u k iệ n th íc h h ợ p n h ư đ iề u k iệ n sin h lý , đ iề u k iệ n tồ n trữ th ự c
p h ẩ m h o ặc đ iề u k iệ n m à h o ạt lự c có th ể đ ạt tố i ư u .
 V ớ i n h ữ n g en z y m e cần có ch ất h o ạ t h ó a h o ặc ch ất ổ n đ ịn h th ì p h ải ch o các
ch ất n à y v à o en z y m e trư ớ c k h i ch o c ơ c h ất v à o h ỗ n h ợ p p h ả n ứ n g .
 N ồ n g đ ộ c ơ ch ất tro n g p h ả n ứ n g en z y m e p h ả i ở tro n g g iớ i h ạ n th íc h h ợ p ,
đ ủ th ừ a đ ể b ã o en z y m e , n h ư n g k h ô n g q u á cao đ ể k ìm h ãm e n z y m e. S au k h i
d ừ n g p h ả n ứ n g l ư ợ n g c ơ ch ất đ ư ợ c ch u y ể n h ó a 2 0 -3 0 % .
 T h ờ i g ia n x ác đ ịn h h o ạ t tín h th ư ờ n g 5 -3 0 p h ú t. T ố t n h ấ t l à x ác đ ịn h tố c đ ộ
b a n đ ầ u củ a p h ả n ứ n g (3 0 -6 0 g iâ y ), v ì g iai đ o ạ n n à y tố c đ ộ p h ả n ứ n g lớ n
n h ất, sau đ ó b ắt đ ầ u g iả m (H ìn h 1 ).
 K h i x ác đ ịn h h o ạt tín h p h ả i l àm m ẫ u đ ố i ch ứ n g so n g so n g v ớ i m ẫ u th í
n g h iệ m . T ro n g m ẫ u đ ố i ch ứ n g en z y m e p h ải b ị b ất h o ạt tr ư ớ c k h i tiế p x ú c
v ớ i c ơ ch ất.

Hình 1. Động học phản ứng enzyme


T ro n g b à i th ự c h à n h n ày , sin h v iê n làm q u e n v ớ i p h ư ơ n g p h á p x ác đ ịn h h o ạt tín h
en z y m e am y lase
1.2. E n zym e am ylase và ph ư ơn g ph áp xác đ ịn h h oạt tín h
* K hai quát v ề enzym e am ylase
A m y lase là các en z y m e x ú c tác ch o các p h ả n ứ n g th ủ y p h â n tin h b ộ t, g ly c o g e n , v à

25
các p o ly sacc h arid e tư ơ n g t ự . A m y lase ch ia l à m 3 lo ạ i ch ín h :
-am y lase (Endo -1,4-glucanase; E C 3 .2 .1 .1 ) có tro n g n ư ớ c b ọ t, h ạt h ò a
th ả o n ả y m ầ m , tụ y tạ n g , n ấm m ố c, v i k h u ẩ n . E n z y m e n à y p h â n g i ải liên k ế t
1 ,4 -g ly c o s id e ở g iữ a ch u ỗ i p o ly sacc h arid e (h o ạt tín h en d o am y lase) tạo
th à n h m alto se, d e x trin p h â n t ử th ấ p . D ư ớ i tác d ụ n g c ủ a en z y m e n à y , d u n g
d ịc h tin h b ộ t n h a n h c h ó n g b ị m ất k h ả n ă n g tạ o m à u v ớ i d u n g d ịc h io d e v à
b ị g iảm đ ộ n h ớ t. -am y lase b ề n v ớ i n h iệt, n h ư n g k ém b ề n v ớ i acid .
-am y lase (Exo -1,4-glucanase; EC 3.2.1.2) có nhiều ở thực vật (hạt, củ),
xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1,4-glycoside từ đầu không khử
tạo thành maltose và dextrin phân tử lớn. Enzyme này mất hoạt tính ở nhiệt
độ trên 70oC, nhưng bền với acid hơn -am y la se.
Glucoamylase (Exo -1,4-g lu ca n ase ; EC 3.2.1.3) xúc tác cho phản ứng
thủy phân liên kết 1,4- và 1,6-glycoside từ đầu không khử của chuỗi
polysaccharide. Sản phẩm chủ yếu là glucose và dextrin. Enzyme này mất
hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC. Nhiều glucoamylase hoạt động mạnh ở pH
3,5-5,5.
* C ác phư ơng pháp đo ho ạt tính enzym e -am ylase
N g u y ê n t ắc ch u n g d ự a tr ên cơ s ở th ủ y p h â n tin h b ộ t b ở i en z y m e tro n g d u n g
d ịc h en z y m e n g h i ê n c ứ u th à n h các d e x trin có p h â n t ử lư ợ n g k h ác n h au . Đ o cư ờ n g
đ ộ m à u tạo th à n h g iữ a tin h b ộ t v à các s ả n p h ẩm th ủ y p h â n củ a n ó v ớ i io d e b ằ n g
m á y so m à u s ẽ tín h đ ư ợ c h o ạt tín h en z y m e.
Đ ơ n v ị am y lase l à lư ợ n g en z y m e cần th iết đ ể th ủ y p h â n h o à n to à n 1 0 m g
tin h b ộ t sau th ờ i g ia n p h ả n ứ n g 3 0 p h ú t tro n g đ iề u k iệ n th í n g h iệm .
2. H óa ch ất – D ụng cụ :
 D u n g d ịc h đ ệ m
D u n g d ịc h đ ệ m acetate p H = 4 ,7 (x ác đ ịn h h o ạt tín h en z y m e n ấm m ố c ): trộ n
1 th ể tíc h C H 3 C O O H 1 N v ớ i 1 th ể tích C H 3 C O O N a 1 N . K i ể m tra p H .
D u n g d ịc h đ ệ m p h o sp h ate p H = 4 ,9 (x ác đ ịn h h o ạt tín h en z y m e củ a m alt):
trộ n 1 0 m l d u n g d ịc h N a 2 H P O 4 1 /1 5 M v ớ i 9 9 0 m l d u n g d ịc h K H 2 P O 4 1 /1 5 M
n h ậ n đ ư ợ c 1 l d u n g d ịc h đ ệ m p h o sp h ate p H = 4 ,9 4 . K iểm tra p H .
D u n g d ịc h đ ệ m g ly cin e – N a O H 0 ,1 M p H = 1 0 (d ù n g đ ể x ác đ ịn h h o ạt tín h
-am y lase k i ềm .
 D u n g d ịc h H C l 0 ,1 N
 D u n g d ịc h io d : h ò a tan 3 0 m g K I v à 3 m g I2 v ớ i m ộ t lư ợ n g n h ỏ n ư ớ c cất.
L ắc n h ẹ h ỗ n h ợ p đ ể h ò a ta n h o à n to à n , sau đ ó ch u y ể n d u n g d ịc h sa n g b ìn h
đ ịn h m ứ c 1 0 0 0 m l, b ổ su n g n ư ớ c cất đ ế n v ạ ch m ứ c. B ả o q u ả n d u n g d ịc h
tro n g b ìn h m à u n â u đ ể ch ỗ tố i.
 D u n g d ịc h tin h b ộ t 1 % : h ò a tan 1 g tin h b ộ t (th eo ch ất k h ô tu y ệt đ ố i) v ớ i 5 0

26
m l n ư ớ c cất tro n g b ìn h đ ịn h m ứ c 1 0 0 m l, lắ c đ ề u . Đ ặt v à o b ế p cách th ủ y
đ a n g sô i, l ắc liê n tụ c ch o đ ế n k h i tin h b ộ t ta n h o à n to à n . S au đ ó làm n g u ộ i
v à b ổ su n g 1 0 m l đ ệ m acetate p H = 4 ,7 (h o ặc 1 0 m l d u n g d ịc h đ ệ m
p h o sp h ate p H = 4 ,9 ) b ổ su n g n ư ớ c cất đ ế n v ạch m ứ c, lắc đ ề u . D u n g d ịc h
đ ư ợ c ch u ẩ n b ị tro n g n g ày s ử d ụ n g .
 D u n g d ịc h en z y m e g ố c
3. T iến h ành:
T ríc h ly en z y m e: en z y m e đ ư ợ c tríc h ly từ ch ế p h ẩ m h a y tế b à o , m ô đ ộ n g
th ự c v ật b ằ n g d u n g d ịc h đ ệ m có p H th í c h h ợ p .
 T ríc h ly en z y m e t ừ v i k h u ẩ n : C â n m = 0 ,1 g ch ế p h ẩ m n g h i ê n c ứ u , d ù n g
đ ũ a th ủ y tin h c h à c ẩn th ậ n ch ế p h ẩm tro n g m ộ t c ố c th ủ y tin h d u n g tích 5 0
m l v ớ i m ộ t lư ợ n g n ư ớ c n h ỏ . S au đ ó ch u y ể n to àn b ộ h ỗ n h ợ p v à o b ìn h đ ịn h
m ứ c d u n g tíc h 1 0 0 m l, b ổ su n g n ư ớ c c ất tớ i v ạch m ứ c. L ọ c v à th u h ồ i d ịc h
tríc h ly en z y m e. B ảo q u ả n d u n g d ịc h en z y m e g ố c ở 2 – 4 o C tro n g th ờ i g ia n
1 ngày.
 T ríc h ly en z y m e n ấ m m ố c : C â n m = 5 g ch ế p h ẩ m en z y m e th ô đ ã n g h iề n
sơ b ộ , d ù n g đ ũ a th ủ y tin h ch à c ẩn th ậ n ch ế p h ẩ m tro n g m ộ t cố c d u n g t ích
5 0 m l. S au đ ó ch u y ể n to à n b ộ ch ế p h ẩ m v à o b ìn h tam g iác d u n g tíc h 2 5 0
m l, b ổ su n g 9 0 m l n ư ớ c cất v à d ịc h đ ệ m acetate p H = 4 ,7 . G iữ h ỗ n h ợ p ở
n h iệt đ ộ 3 0 o C tro n g th ờ i g ia n 1 g iờ có k h u ấ y đ ảo đ ịn h k ỳ . L ọ c v à th u h ồ i
d ịc h tríc h ly en z y m e. B ả o q u ả n d u n g d ị c h en zy m e g ố c ở 2 – 4 o C tro n g th ờ i
g ia n 1 n g à y .
 T ríc h ly en z y m e t ừ m alt : C ân m = 5 -1 0 g m alt đ ã n g h iề n n h ỏ , ch o v à o b ìn h
n ó n d u n g tích 2 5 0 m l, b ổ su n g 9 0 m l n ư ớ c cất v à 1 0 m l d u n g d ịc h đ ệ m
p h o sp h ate p H = 4 ,9 . G i ữ h ỗ n h ợ p ở n h iệt đ ộ 3 0 o C tro n g th ờ i g ia n 1 g iờ c ó
k h u ấ y đ ả o đ ịn h k ỳ . L ọ c v à th u h ồ i d ịc h trích ly en z y m e. B ả o q u ả n d u n g
d ịc h en z y m e g ố c ở 2 – 4 o C tro n g th ờ i g ia n 1 n g à y .
* D u n g d ịc h e n z y m e đ ể p h â n tíc h
P h a lo ã n g d u n g d ịc h en z y m e g ố c (h ệ số p h a lo ã n g n) b ằ n g d u n g d ịc h đ ệm
sao ch o tro n g 1 m l d u n g d ịc h en z y m e p h â n tíc h có c h ứ a m ộ t l ư ợ n g e n z y m e đ ủ đ ể
th ủ y p h â n 2 0 % - 7 0 % tin h b ộ t tro n g d u n g d ịc h ở đ iề u k iệ n x ác đ ịn h . N h ư v ậ y , đ ộ
p h a lo ã n g p h ụ th u ộ c v à o h o ạt tín h ch ế p h ẩ m en z y m e cần p h â n tíc h .
C h u ẩ n b ị m ẫ u th í n g h iệ m , m ẫ u đ ố i ch ứ n g v à m ẫ u trắn g
M ẫ u th í n g h iệm M ẫ u đ ố i ch ứ n g M ẫ u trắn g
D u n g d ịc h tin h b ộ t 1 % 2 ml 2 ml 0
N ư ớ c cất 0 0 2 ml
Đ ệm 1 ml 1 ml 1m l
D u n g d ịc h N a C l 3 % 0 ,5 m l 0 ,5 m l 0 ,5 m l

27
Ủ 4 0 o C , 1 0 p h ú t đ ể đ ạ t n h iệt đ ộ
D u n g d ịc h en z y m e 1 ml 0 0
o
Ủ 4 0 C , 3 0 p h ú t đ ể x ả y ra p h ả n ứ n g
H Cl 1N 1 ml 1 ml 1 ml
E nzym e 0 1m l 1 ml
N ư ớ c cất 4 ml 4 ml 4 ml
Io d e 0 ,5 m l 0 ,5 m 1 0 ,5 m 1

D u n g d ịc h đ ố i ch ứ n g có m à u x a n h
D u n g d ịc h th í n g h iệ m có m à u tím v ớ i c ư ờ n g đ ộ k h ác n h a u t ù y v à o lư ợ n g tin h b ộ t
ch ư a b ị th ủ y p h â n .
Đ o m ật đ ộ q u a n g c ủ a các d u n g d ịc h ở b ư ớ c só n g = 6 2 0 n m so v ớ i m ẫu trắn g .
4. T ính k ết quả:
D = m ật đ ộ q u a n g
( Do  D )
S ố m g tin h b ộ t b ị th ủ y p h â n S = x 20
Do
H o ạt tín h en z y m e am y lase:
S n
Hoạt tính chung =
10  m

trong đó:
n = hệ số pha loãng
m = khối lượng enzyme

28

You might also like