TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.

HỒ CHÍ MINH
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM
-------------------- --------------------
BỘ MÔN : SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

ĐỀ TÀI :

Lớp : ĐHTP4
GVHD : ThS Trần Đức Việt
Sinh viên thực hiện :
1. 08243421 Bùi Thị Bích Hằng
2. 08104521 Nguyễn Thị Thu Hằng
3. 08212521 Nguyễn Bảo Khuyên
4. 08108721 Đỗ Trọng Lam
5. 08234201 Nguyễn Mỹ Linh
6. 08105241 Nguyễn Thị Thuỳ Linh
Niên khoá : 2008-2012
 T.P Hồ Chí Minh, 11/2009

PHẦN MỞ ĐẦU
~~~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~~~~~~

Công nghệ tái tổ hợp DNA còn gọi là công nghệ di truyền - là sự kết hợp của
sinh học phân tử và di truyền học - ra đời vào những năm đầu của thập niên 70
trong thế kỷ 20. Phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên được nhóm các nhà nghiên cứu
Mỹ là Berg, Boyer và Cohen tạo ra năm 1972
Sau đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và tiến hành các thí nghiệm lắp
ghép gen và đã thu được nhiều kết quả ứng dụng được trong thực tiễn.
Kỹ thuật tái tổ hợp DNA ngày càng có nhiều ảnh hưởng đến nông nghiệp,
công nghệ thực phẩm, y dược, bảo vệ môi trường,... như: sản xuất thuốc kháng sinh,
vác xin, kháng thể đơn dòng và các protein có hoạt tính sinh học dùng để chữa bệnh
như insulin chữa bệnh tiểu đường, interferon chữa bệnh ung thư, các hormon tăng
trưởng cho con người. Xác định vị trí của các gen mã hóa cho các tính trạng mong
muốn, giúp cho việc lai tạo, chọn giống cũng như tạo ra các sinh vật chuyển gen
nhanh và hiệu quả cao,...
Trong công nghệ thực phẩm, công nghệ tái tổ hợp DNA đóng một vai trò quan
trọng trong việc tạo ra các vi sinh vật chuyển gen mang các tính trạng mong muốn
nhằm tạo ra năng suất và chất lượng cao cho sản phẩm. Ví dụ:
o Trong sản xuất rượu, ngày nay người ta đã dùng các chủng vi sinh vật có khả
năng tạo rượu cao và cho hương vị tốt. Phần lớn các chủng đó được nghiên
cứu, tuyển chọn, lai tạo bằng kĩ thuật tái tổ hợp DNA
o Đối với các sản phẩm lên men sữa như phomat và sữa chua, trước kia, người
ta thường sử dụng những vi sinh vật tự nhiên để lên men nên khó kiểm soát
quá trình lên men và hiệu quả không cao. Ngày nay, với kĩ thuật tái tổ hợp
DNA, người ta đã tạo được các chủng mới với các tính chất xác định và đã
điều khiển được quá trình lên men theo định hướng mong muốn.
o Trong những năm gần đây, bằng cách sử dụng kĩ thuật tái tổ hợp, người ta đã
tuyển chọn và tạo ra những chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp các

2
 enzyme chịu nhiệt, chịu axit, chịu kiềm tốt để sản xuất enzyme. Enzyme λ -
amylase chịu nhiệt đã và đang được sử dụng nhiều để sản xuất nha, đường
glucose từ tinh bột
Chính vì vậy nhóm chúng tôi đã quyết định chọn đề tài tiểu luận môn Sinh học
đại cương là “Kĩ thuật tái tổ hợp DNA” để tìm hiểu rõ hơn và nắm vững phương
pháp tiến hành của kĩ thuật này.
Tiểu luận được thực hiện dựa trên việc tìm kiếm và tổng hợp các tài liệu. Đối
tượng nghiên cứu chủ yếu là vi khuẩn

3
 PHẦN NỘI DUNG
~~~~~~~~~~~~~~~  ~~~~~~~~~~~~~~~

1. Nguyên lí cơ bản của kĩ thuật tái tổ hợp DNA

Công nghệ di truyền sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để tách DNA
từ một cơ thể sống và sau đó cắt, nối các gen trên DNA. Bằng cách như vậy, người
ta có thể loại bỏ các gen không mong muốn và đưa vào các gen mới đặc hiệu theo
chủ ý lựa chọn.
Các thao tác cắt, nối trên DNA được thực hiện bên ngoài cơ thể sống trong các
ống nghiệm (in vitro). Phân tử DNA mới được tạo dựng sau các thao tác cắt, nối có
một số đặc điểm khác với phân tử DNA ban đầu được tách ra từ tế bào sống, được
gọi là DNA tái tổ hợp và kỹ thuật này được gọi là kỹ thuật tái tổ hợp DNA.
Sự tái tổ hợp DNA được xem là thành công chỉ sau khi đưa được phân tử
DNA tái tổ hợp vào trong tế bào sống và chúng biểu hiện các hoạt tính di truyền và
ở thế hệ con cháu sẽ mang phân tử DNA tái tổ hợp
Kỹ thuật tái tổ hợp DNA được thực hiện qua nhiều bước:
- Bước 1: Nuôi tế bào cho plasmid để có vector chuyển gen và nuôi tế bào cung cấp
gen cần chuyển
- Bước 2: Tách chiết DNA plasmid và DNA tế bào cho
- Bước 3: Phân lập hai loại DNA bằng cùng một loại enzym giới hạn
- Bước 4: Trộn chung hai loại DNA đã bị cắt
- Bước 5: Bổ sung enzym nối ligase để tạo ra ADN tái tổ hợp hoàn chỉnh.
- Bước 6: Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân dòng.
- Bước 7: Chọn lọc và tạo dòng tế bào chủ mang ADN tái tổ hợp và theo dõi hoạt
động, biểu hiện của gen thông qua sản phẩm của gen lấy từ tế bào cho.

4
 Hình: Các bước tạo DNA tái tổ hợp
1,2: Cắt DNA của tế bào cho và plasmid bằng cùng một loại enzyme giới hạn
3 : Đưa DNA tái tổ hợp vào trong tế bào nhận
4 : Nhân dòng
2. Các enzyme sử dụng trong kĩ thuật tái tổ hợp DNA
2.1 Enzyme giới hạn RE (Restriction Enzyme)
Trong công nghệ di truyền muốn tạo ra ADN tái tổ hợp để đưa vào tế bào
chủ cần phải có công cụ cắt plasmid hình vòng và đoạn ADN của tế bào rồi cho
chúng nối lại với nhau. Công cụ cắt ADN là các enzym giới hạn

5
 2.1.1 Khái niệm về enzym giới hạn
Thông thường tế bào vi khuẩn bị nhiễm phage (thể thực khuẩn) thì vi khuẩn
đó bị phage phá huỷ. Một số chủng vi khuẩn sau khi bị nhiễm phage lại không bị
phá huỷ, do trong tế bào vi khuẩn này có loại enzym có khả năng cắt DNA phage
thành những đoạn nhỏ. Năm 1970, Hamilton Smith là người đầu tiên tách được loại
enzym này từ loại vi khuẩn Haemiphilus influenzae được gọi tên là HinII. Ngay sau
đó, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng, phần lớn các loài vi khuẩn mang loại
enzym có chức năng cắt DNA lạ xâm nhập để bảo vệ tế bào khỏi bị xâm nhập của
các DNA lạ. Những enzym đó được gọi là enzym giới hạn.
Enzym giới hạn là enzym có khả năng nhận biết những đoạn trình tự DNA
nhất định và cắt DNA ở ngay điểm này hay ở điểm kế cận. Tuỳ theo phương thức
cắt và nguồi gốc của enzym giới hạn mà người ta phân loại và đặt tên cho các
enzym giới hạn đó
2.1.2 Phân loại enzym giới hạn
Các enzym giới hạn được phân thành 3 loại: I, II và III.
Các enzym giới hạn được dùng phổ biến trong công nghệ DNA tái tổ hợp
thuộc kiểu II. Bao gồm những enzyme có trình tự nhận biết chuỗi nucleotide đặc
hiệu. Khi nhận biết được trình tự đó, chúng cắt ngay tại vị trí nhận biết. Các enzym
này cắt bên trong mạch DNA (không phân huỷ từ 2 đầu của DNA) nên còn được
gọi là enzym endonuclease. Enzym giới hạn kiểu II thực chất là endonuclease giới
hạn kiểu II.
Các enzym giới hạn kiểu II: Cách gọi tên các enzym giới hạn kiểu II cũng
như các enzym giới hạn khác dựa trên quy ước chung. Tên enzym giới hạn được
ghép bởi chữ cái đẩu tiên là tên chi và hai chữ tiếp theo là hai chữ cái tên loài của vi
sinh vật mà enzym được tách chiết. Nhưng chữ và số La mã tiếp theo là tên của
chủng và dòng của loài sinh vật cụ thể đã tách chiết enzym:
Ví dụ: E.coRI (thuộc chi Escherichia, loài coli, chủng Ry 13) Một số loại
khác như E.coRV, BamHI, HaeIII, Smal, …

6
 2.1.3 Tính đặc hiệu vị trí
- Trình tự nhận biết của RE: Đặc trưng quan trọng nhất của các trình tự nhận
biết là chúng có cấu trúc đối xứng nghịch đảo (palindromic), nghĩa là hai mạch của
trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng được đọc theo chiều 5’ đến 3’ ở mỗi sợi
đơn. Các trình tự nhận biết của enzyme giới hạn được cấu tạo từ 4 đến 6 đôi base.
Ví dụ như đoạn DNA được đóng khung sau:

- Các kiểu cắt của RE:

Cắt đầu bằng: Một số RE tạo vết cắt trên phân tử DNA ngay chính giữa
palindrom, tạo ra hai đoạn DNA đầu bằng. Sau khi cắt, hai đầu không có khả năng
tự kết hợp trở lại. Ví dụ:

Cắt đầu dính (đầu lệch): Cắt bên này và bên kia của tâm đối xứng để tạo ra hai
đầu lệch nhau một vài base. Trong trường hợp này, các đầu dính bổ sung có thể bị
bắt cặp trở lại.Ví dụ:

7
2.2 Nuclease
Các enzym nuclease phân hủy các axit nucleic bằng cách làm đứt các liên kết
phosphodieste là liên kết nối các nucleotit cùng một mạch với nhau. Các nuclease
có khả năng phân cắt phân tử DNA hoặc RNA. Có ba kiểu phân loại các nuclease:
1 - Dựa vào bản chất của cơ chất mà nó tác dụng, người ta chia nuclease làm 2 loại:
- Deoxyribonuclease (DNase), cơ chất của nó là DNA
- Ribonuclease (RNase), cơ chất của nó là RNA
2 - Dựa theo kiểu liên kết mà enzyme thủy phân, người ta cũng chia ra làm hai loại:
- Nuclease "a": Thuỷ phân đặc hiệu liên kết phosphodiester giữa cacbon
(C3’) và nhóm phosphate.
- Nuclease "b": Thuỷ phân đặc hiệu liên kết phosphoester giữa cacbon
(C5’) và nhóm phosphate

Hình: Phân loại nuclease theo liên kết bị cắt

8
 3 - Dựa theo hoạt tính enzyme, người ta cũng chia ra làm hai loại exonuclease và
endonuclease:
- Exonuclease: Cắt các liên kết phosphoester từ hai đầu của chuỗi
polynucleotide và từ đó cắt dần từng nucleotide, chúng đòi hỏi là phải có nhóm OH
(3’) hoặc OH (5’) tự do ở hai đầu chuỗi.
- Endonuclease: Thường thuỷ phân liên kết phosphoester ở vị trí bất kỳ bên
trong chuỗi và tạo ra các oligonucleotide.

Các loại nuclease chủ yếu:

- Enzym ADNase I (endonuclease) tách chiết từ tụy của bò, xúc tác phản ứng
thủy phân các liên kết ngay sau một bazo nito ở cả mạch đơn và mạch kép hoàn toàn
ngẫu nhiên.
- Enzym S1 nuclease (endonuclease) là enzym tách chiết từ nấm mốc
Aspegillus oryzae. S1 nuclease BAL 3 (endonuclease) phân cắt cả 2 đầu 5’ và 3’ của
ADN và không có khả năng cắt nội liên kết.
- Enzym exonuclease III là một 3’ exonuclease cắt đầu 3’ của mạch đơn và
tạo thành các đoạn ADN có đầu 5’ nhô ra.
- Enzym ARNase tách chiết từ tụy bò. Enzym này thường được sử dụng để
loại bỏ ARN trong hỗn hợp ADN và ARN.
- Enzym ARNase H dùng để loại bỏ ARN trong các phân tử lai ADN-ARN,
nhất là sau phản ứng phiên mã ngược để hình thành mạch thứ hai của cADN, từ đó
tạo nên phân tử cADN kép.

9
2.3 Enzyme nối
2.3.1. Ligase
Để kết nối hoặc hàn hai mảnh DNA hoặc RNA người ta phải sử dụng enzyme
ligase trong sự có mặt của ATP. Khi đó tạo ra một liên kết ester giữa một mảnh
chứa 5’ −phosphat và một mảnh chứa 3’−OH => liên kết phosphodiester. Chúng
thường được sử dụng kết hợp với enzyme khác như kinase và alkaline phosphatase.
Thông thường, chắp hai mảnh đầu dính dễ hơn hai mảnh có đầu phẳng.
Có 3 loại enzym nối thường dùng trong công nghệ di truyền:
- Enzym E.coli ADN ligase được tách chiết từ vi khuẩn E.coli, xúc tác phản
ứng nối hai đoạn trình tự ADN có đầu sole.
- Enzym T4 ADN ligase được tách chiết từ phage T4 xâm nhiễm vào E.coli,
có chức năng giống như E.coli ADN ligase nhưng lại có khả năng nối hai đoạn trình
tự ADN có đầu bằng và là enzym nối được ưa chuộng nhất hiện nay.
- Enzym T4 ARN ligase tách chiết từ phage T4 xâm nhiễm E.coli, có khả năng
nối hai trình tự ARN bằng các liên kết phosphodiester.
Ngoài các loại enzym nối kể trên, hiện nay người ta còn sử dụng các đoạn
nối (đầu dính–adaptor) cho các enzym cắt đầu bằng. Adaptor xúc tác nối các đoạn
ADN do có các enzym giới hạn cắt đầu bằng từ đó tạo nên đầu so le. Mỗi đoạn
enzym cắt đầu bằng đều có các loại adaptor đặc trưng riêng.
2.3.2. Các enzyme dephosphoryl hoá ( khử nhóm PO4-3 )
Alkaline phosphatase:
Được trích ly từ E. Coli hay từ ruột bê. Đặc tính của enzyme này là hoạt động
ở pH kiềm và có khả năng xúc tác khử nhóm phosphate 5’ của một chuỗi DNA
hoặc RNA và các nucleotide tự do.
Alkaline phosphatase được ứng dụng để:
- Loại bỏ nhóm phosphate 5’ trên trình tự DNA hoặc RNA trước khi đánh dấu
phóng xạ 5’ của chúng bằng P32 làm mẫu dò phân tử lai.
- Loại bỏ nhóm phosphate 5’ trên một vector vừa mới bị cắt bởi enzyme RE.
Nhằm tránh vector này đóng kín trở lại, khiến cho việc cài mảnh DNA ngoại lai vào
bị cản trở. Trong trường hợp này, sợi kép được cài vào có mang hai nhóm phosphat
ở 5’ sẽ tạo ra hai trong bốn liên kết este để hình thành một DNA tái tổ hợp kép vòng
kín có chứa hai khe hở.

10
 Hình: Phản ứng nối DNA ngoại lai với vector đã khử nhóm PO4.3

Sự chắp nối vector đã bị khử PO4.3 ở 5’ với DNA ngoại lai tạo ra DNA tái tổ
hợp sợi kép có hai chỗ trống (OH) do OH 3’ của đoạn ngoại lai không tạo liên kết
ester với OH 5’ của vector đã khử nhóm PO4.3
2.4 Các enzym polymerase
2.4.1 Khái niệm
Các enzym polymerase xúc tác cho quá trình sao chép các axit nucleic
(ADN, hoặc ARN) được sử dụng nhiều trong công nghệ tái tổ hợp DNA. Khi nói về
một enzym polymerase nào đó, người ta thường dùng thuật ngữ “ phụ thuộc ADN ”
hoặc “ phụ thuộc ARN ” để chỉ axit nucleic mà enzym này xúc tác cho việc sao
chép. ADN polymerase phụ thuộc ADN thì sao chép ADN sang ADN; ADN
polymerase phụ thuộc ARN thì sao chép ARN sang ADN, còn enzym ARN
polymerase phụ thuộc ADN thì phiên mã ADN sang ARN. Các enzym này tổng
hợp axit nucleic bằng cách nối các nucleotit với nhau theo nguyên tắc bổ sung dựa
theo mạch khuôn. Quá trình tổng hợp mạch mới bổ sung diễn ra theo chiều 5’-3’ và
sự khởi đầu cần có đầu 3’-OH tự do.

11
 2.4.2 Phân loại
Các enzyme DNA polymerase: Enzym ADN polymerase I, Enzym T4 ADN
polymerase, Enzym Taq polymerase…Hiện nay còn có nhiều loại ADN polymerase
khác lưu hành trên thị trường như T7 ADN polymerase, Vent ADN polymerase …
Các enzyme RNA polymerase: Có ba loại enzym ARN polymerase thường
được dùng trong thực tế, đó là SP6 ARN polymerase, T3 ARN polymerase và T7
ARN polymerase …
Enzym phiên mã ngược (Reverse transcriptase): Có khả năng tổng hợp DNA
một mạch gọi là DNA bổ trợ (cDNA) từ khuôn mARN, hoặc từ một đoạn
polynucleotit được tổng hợp bằng con đường hóa học. Nhờ có con đường phiên mã
ngược này mà có thể tổng hợp được hầu hết các gen riêng biệt nào đó nếu như có
mặt mARN của gen đó. Các cDNA mạch đơn có thể biến thành mạch kép nhờ DNA
polymerase và được gọi là cDNA mạch kép (c-DNA duplex). Đoạn cDNA mạch
kép có thể gắn vào plasmid rồi biến nạp vào vi khuẩn, từ đó tạo dòng c-DNA. Nếu
cDNA có nguồn gốc từ một gen thì ta tạo được dòng gen. Trong trường hợp mARN
trưởng thành khi đã ở ngoài nhân thì ta sẽ thu được dòng gen chỉ chứa những đoạn
mã hóa (exon). Không có đoạn không mã hóa (intron).

3. Thu nhận gen

Ngày nay, người ta có thể thu nhận gen để thực hiện kỹ thuật di truyền bằng ba
phương pháp: tách chiết DNA trực tiếp từ tế bào, tổng hợp bằng phương pháp hoá
học, tổng hợp từ mARN tương ứng
3.1 Tách chiết DNA trực tiếp từ tế bào
Đây là phương pháp sử dụng rộng rãi ngay từ buổi đầu tiên của sự phát triển
kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Toàn bộ phân tử DNA của một sinh vật được cắt nhỏ
thành những đoạn có kích thước 1,5÷2kb bằng restriction enzyme (RE).
Điện di hoặc sắc kí để tách đoạn DNA tinh khiết.
Nhược điểm: tốn nhiều công sức và thời gian nhưng ngày nay người ta vẫn sử
dụng để tạo ngân hàng DNA bộ gen (genonic DNA libraries).
3.2 Tổng hợp bằng phương pháp hoá học
Năm 1969, gen nhân tạo đầu tiên được tổng hợp do nhóm nghiên cứu
Khorama, đó là gen mã hoá tổng hợp tRNA vận chuyển amino axit (alamin) ở nấm

12
 men gồm 77 cặp nucleotide. Gen đầu tiên không được biểu hiện vì không có các
trình tự điều hoà.
Về sau, chính nhóm này đã tổng hợp được gen có hoạt tính: đó là gen mã hóa
cho chất ức chế tRNA vận chuyển tyrosine ở E. Coli, có chiều dài khoảng 200 cặp
nucleotide.
Vào năm 1977, K. Itakura và Boyer đã tổng hợp được gen mã hóa sinh tổng
hợp hormone somatostatin của động vật có vú được biểu hiện ở E. Coli. Và từ đó,
nòi E. Coli mang gen tổng hợp hóa học được tạo ra. Sau này, người ta tổng hợp hóa
học gen mã hóa hormone tăng trưởng của người dàì 584 cặp nucleotide.
Phương pháp tổng hợp hóa học gen cũng được sử dụng để tạo ra nòi vi khuẩn
tổng hợp insulin, một loại hormone chữa bệnh tiểu đường cho người. Gen insuline
được tổng hợp từ hơn 40 đoạn oligonucleotide khác nhau, sau đó, được nối lại nhờ
enzyme lygase để tạo ra hai chuỗi polynucleotide dài 271 và 286 cặp nucleotide mã
hóa, tổng polypeptide A có 21 aminoaxit, polypeptide B có 30 aminoaxit.
Qua các kết quả thu được, các nhà khoa học đã khẳng định rằng: muốn tổng
hợp được gen bằng phương pháp hoá học cần phải biết trình tự của axit amin ở
protein mà gen đó chịu trách nhiệm tổng hợp.
3.3 Tổng hợp từ mRNA của gen tương ứng
Tổng hợp cDNA từ mRNA nhờ kỹ thuật của Gubler và Hoffman với sự có mặt
của enzyme phiên mã ngược (Rever transcriptase). Sau đó, cDNA (complementary)
gắn vào plasmid và biến nạp vào vi khuẩn để tạo dòng cDNA.
Phương pháp:
- Tổng hợp cDNA sợi kép đầu bằng từ mRNA dưới tác dụng của enzyme sao
chép ngược.
- Metyl hóa các vùng hạn chế (có trong đoạn cDNA sợi đôi) được nhận biết
bởi enzyme EcoRI để bảo vệ vùng này không bị cắt khi thao tác với EcoRI.
- Tạo đầu dính bằng cách sử dụng đoạn nối linker có chứa trình tự nhận biết
bởi EcoRI, sau đó, cắt bằng enzyme EcoRI. Trong trường hợp này, chỉ có đoạn nối
bị cắt còn cDNA vẫn còn nguyên vẹn (do được metyl hóa). Đưa cDNA vào vector
tạo DNA tái tổ hợp.
- Ghép cDNA đầu dính vào vector thích hợp đã được mở EcoRI và đã khử
nhóm phosphat.

13
 - Hàn kín mạch nhờ enzyme phosphoryl hóa và enzyme ligase để tạo vector tái
tổ hợp.
- Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ và nuôi cấy trong các điều kiện thích
hợp để tạo dòng.
Ưu điểm: Gen thu nhận bằng phương pháp này đã loại bỏ được những trình tự
không mã hoá. Bằng con đường này, người ta đã tạo dòng gen mã hoá tổng hợp
globine của người, động vật và chim, protein thủy tinh thể mắt bò, ovalbumine
(protein lòng trắng trứng) và fibroin tơ tằm.
Phương pháp tổng hợp gen từ mRNA ngày càng được phát triển, nó kết hợp
với các phương pháp khác của sinh học phân tử và được ứng dụng trong nhiều lĩnh
vực.

Hình: Sơ đồ tổng hợp gen từ mRNA

4. Vector chuyển gen
Trong kĩ thuật tái tổ hợp DNA, chúng ta không thể đưa trực tiếp một gen từ tế
bào này sang tế bào khác mà cần thông qua một phương tiện để chuyển gen được
gọi là vector chuyển gen
4.1 Yêu cầu của vector chuyển gen
Phải có trình tự nhận biết để enzyme restriction endonuclease có thể nhận biết
và cắt
Vector phải có khả năng tự sao chép tích cực trong tế bào chủ, không phụ
thuộc vào sự sao chép bộ gen của tế bào chủ

14
 Có trình tự điều hoà thuận lợi cho sự phiên mã gen lạ
Có kích thước tương đối nhỏ để dễ xâm nhập vào tế bào.
Có khả năng tạo nhiều bản sao để khi tách khỏi tế bào được số lượng lớn, đảm
bảo sự khuếch đại của gen lạ mong muốn được gắn vào.
Dễ theo dõi sự biểu hiện của gen tái tổ hợp, yêu cầu này là cần thiết cho việc
phát hiện dòng cần tìm (chứa các gen đánh dấu, thường là các gen kháng chất kháng
sinh, hoặc gen tổng hợp chất màu)
4.2 Vector chuyển gen là plasmid
Các plasmid là những mẫu DNA nhỏ, ngắn, dạng vòng (khép kín), sợi đôi nằm
ngoài nhiễm sắc thể, được tìm thấy đầu tiên trong tế bào một số vi khuẩn. Chúng
sao chép được là nhờ một số enzyme có mặt trong tế bào vi khuẩn và không phụ
thuộc vào sự sao chép nhiễm sắc thể vi khuẩn do mỗi plasmid đều có vị trí khởi
đầu phiên mã (ori) riêng.
Do kích thước nhỏ nên plasmid chỉ chứa rất ít gen chọn lọc, thường đặc tính
chọn lọc là kháng kháng sinh. Từ khi được phát hiện đến nay, các plasmid không
ngừng được cải tiến và ngày càng được có thêm nhiều đặc tính quí cho việc tạo
dòng.
Trong phòng thí nghiệm, người ta sử dụng các plasmid nhân tạo mà được tạo
ra từ các plasmid tự nhiên và cài thêm một số chuỗi DNA.
4.2.1 Các plasmid thế hệ thứ nhất
Là những plasmid đầu tiên được sử dụng để tách dòng - được tìm thấy trong
tự nhiên như pSC101 (Stalay-Cohen), ColE1. Tuy vậy các plasmid này có rất ít
những đặc tính cần thiết. Sau này, các nhà nghiên cứu đã tìm ra các plasmid nhân
tạo thế hệ hai, ba bằng cách tập trung nhiều đặc tính quí của nhiều plasmid tự nhiên
vào một cấu trúc duy nhất.
4.2.2 Plasmid thế hệ thứ hai
Plasmid thế hệ thứ 2 được tạo ra bằng cách kết hợp các đặc tính quý của
nhiều plasmid tự nhiên, gắn thêm gen chỉ thị để tạo nên một plasmid mới. Điển hình
cho plasmid thế hệ thứ hai và cũng là một trong những plasmid được sử dụng rộng
rãi nhất trong Công nghệ di truyền, đó là plasmid pBR322
pBR322 - là plasmid được sử dụng rất phổ biến vào những năm 1980 để nhân
dòng trong tế bào E. Coli. Nó được tìm ra vào năm 1977 bởi Bolivar Rodrigues.

15
 (PstI, PvuI, ScaI)

(EcoRV, BamHI, SphI, SlaI,

XmaIII, NnuI.)

Hình: Cấu tạo plasmid pBR322

Có nhiều điểm nhận biết bởi enzyme cắt hạn chế và trong số đó có nhiều điểm
nhận biết nằm trong gen kháng kháng sinh. Ví dụ: gen kháng ampicilline (AmpR )có
ba trình tự nhận biết bởi ba enzyme cắt hạn chế là PstI, PvuI, ScaI. Còn gen kháng
tetracycline (TetR )có sáu điểm nhận biết là: EcoRV, BamHI, SphI, SlaI, XmaIII,
NnuI.
Ưu điểm của pBR322 là chúng có số bản sao lớn. Thực nghiệm cho thấy cứ 15
plasmid tái tổ hợp được biến nạp trong E. Coli, số lượng này có thể tăng lên từ
1.000 đến 3.000 bản sao trong điều kiện nuôi cấy tốt.
4.2.3 Các plasmid thế hệ ba
Đây là các plasmid mạnh và đa năng, tiện sử dụng cho nhiều loại RE khác
nhau với hàng chục trình tự nhận biết của chúng được nối tiếp nhau thành một đoạn
dài gọi là polylinker. Kích thước nhỏ, sao chép nhanh trong tế bào vi khuẩn, tạo số
lượng bản sao lớn
Các plasmid thế hệ 3 được chia làm 3 nhóm lớn:
- Dãy pUC như: pUC18, pUC19
- Dãy Gemini: Plasmid pGEM3, Plasmid pCR 2.1
- Nhóm các plasmid Bluescript
4.3.2.1 Dãy pUC:
pUC là plasmid của University California, có kích thước 2,6kb và có một số
đặc trưng sau:

16
 - Có một mảnh operon lacZ, các vi khuẩn chủ yếu sử dụng với pUC dùng để
tổng hợp enzyme β-galactosidase.
- Có vùng polylinker với 13 vùng giới hạn của 13 enzyme cắt hạn chế.
- Ở pUC18, vùng hạn chế (EcoRI, SacI, KnpI, XmaI, BamHI, XbaI, SalI,
HindI, AccI, BspmI, PstI, SphI, Hind III).
- Ở pUC19, vùng polylinker có trình tự ngược lại (Hind III.....EcoRI).
- Có một gen bền với ampicilline, gen này mã hoá cho protein (enzyme) vốn
được tiết ra trong khoảng ngoại biên màng sinh chất của vi khuẩn.

Hình: Cấu tạo plasmid pUC

Sự hiện diện của lacZ tạo thuận lợi cho vector tái tổ hợp bằng cách quan sát
các vi khuẩn trên thạch để chọn vi khuẩn có khả năng tiếp nhận một plasmid. Sự có
mặt của gen kháng ampicilline cho phép pUC được tiến hành nuôi cấy trên môi
trường có ampicilline
Ưu điểm: Kích thước nhỏ, dễ biến nạp vào tế bào vi khuẩn. Vùng polylinker
cho phép gắn xen bất kỳ trình tự DNA lạ nào, hoặc có thể cho phép tạo dòng đoạn
DNA có hai đầu dính khác nhau mà không cần chất gắn.
4.3.2.2 Plasmid pGEM3 :

Hình: Cấu tạo plasmid pGEM3 (Gemini)

17
 Kích thước khoảng 3kb, mang gen kháng ampicilline (AmpR) và vùng
polylineker gồm 13 trình tự nhận biết bởi 13 enzymee cắt hạn chế tương tự như
vùng polylineker của pUC19.
Hai promotor đặc trưng cho RNA-polymerase Sp6 và T7 ở hai bên vùng
polylinker. Vì vậy có ưu điểm là cho phép phiên mã đoạn DNA gắn trong vector
thành nhiều RNA, mà các RNA này thường được dùng làm mẫu dò, hoặc dùng
trong nghiên cứu cấu trúc chức năng của RNA.
4.3.2.3 Nhóm các plasmid bluescript:
Bluescrip là vector lai nhân tạo phage sợi và plasmid vì vậy nó được kết hợp
tất cả những ưu điểm của các phage và ưu điểm của các plasmid, có thể xem đó là
nhóm có tiềm năng nhất hiện nay.
Cấu tạo: Bluescript có cấu tạo dạng vòng khép kín, kích thước vào khoảng
2.961bp, bao gồm:
- Một mảnh lacZ ở đầu 5’ của gen này có cài sẵn polylinker gồm 21 vùng giới
hạn: KpnI, ApaI, DraII, XhoI, AccI, HindII, SalI, ClaI, HindIII, EcoRV, EcoRI,
PstI, SmaI, BamHI, SpeI, XbaI, NotI, XmaI, SacII, BstXI, SacI hoặc ngược lại. Ở
vùng polylinker người ta còn tìm thấy một vùng nhận biết tương đối hiếm (NotI)
mà không có ở dãy pUC. Với 2 promoter T3 và T7 để thu được đoạn cài RNA cùng
chiều hoặc ngược chiều qua việc sử dụng RNApolymerase của phage T3 nhận biết
promoter T3 hoặc ngược lại.
- Một mảnh DNA của phage tùy mục đích sử dụng có thể là phage M13 hoặc
phage f1.Vùng này sẽ sử dụng khi người ta muốn DNA tái bản dưới dạng sợi đơn
hoặc sợi đôi, ngoài ra ở vùng này còn chứa điểm khởi đầu cho sự tái bản (ori). Song
sự tái bản chỉ có thể xảy ra bởi sự đồng gây nhiễm với một virus trợ giúp (virus
helper). Virus này sẽ bổ khuyết những chức năng thiếu bằng cách mang đến những
gen mã hóa các enzyme cần thiết cho sự tái bản. Phụ thuộc vào sự cài đặt của mảnh
DNA này so với chiều của gen lacZ, người ta sẽ có vector bluescipt + hoặc −. Cặp
này cho phép nhận được sợi cùng chiều hoặc ngược chiều.
- Một gen chống chịu được ampicilline, gen này cho phép chọn lựa tất cả
những vi khuẩn đã sát nhập một bluescript. Trong vector bluescript còn có điểm
khởi đầu sao chép colEI ori, chuỗi này cho phép nhân bản của phagemid
(bluenscript) ở trong E. Coli như plasmid. Giống gốc E. Coli được sử dụng thường

18
 là XL1Blu, trong bộ máy di truyền của chúng có chứa gen mã hóa tổng hợp
tetracycline. Điều này cho phép dễ dàng chọn lựa những vector đã sát nhập vào vi
khuẩn.

Hình: Cấu tạo pBluescript SK (+/-)

Ứng dụng: Tùy theo điều kiện thao tác người ta có thể sử dụng bluescript để
nhân bản một đoạn DNA sợi đơn hoặc sợi kép hoặc sao chép RNA invitro để sản
xuất đầu dò lai hóa hoặc tạo ngân hàng cDNA.
4.3 Vector chuyển gen là phage
Phage (thực khuẩn thể) là virus xâm nhiễm vi khuẩn làm phân giải vi khuẩn.
Việc sử dụng phage làm vector chuyển gen có nhiều ưu điểm hơn so với vector là
plasmid:
- Dễ xâm nhập vào vi khuẩn.
- Khả năng nhân lên nhanh trong tế bào chủ.
- Khả năng tiếp nhận đoạn DNA lạ lớn hơn plasmid.
Tuy nhiên, việc sử dụng phage có nhiều bất lợi như:
- Thao tác ghép DNA lạ phức tạp.
- DNA tái tổ hợp không tạo thành khuẩn lạc như DNA tái tổ hợp là
plasmid, mà thành đĩa phân giải xuất hiện trên mặt thạch phủ đầy vi khuẩn.

19
 Phần lớn các nhóm phage sử dụng làm vector đều bắt nguồn từ phage λ thuộc
thế hệ thứ nhất.
 Phage λ (thế hệ đầu)
Cấu tạo gồm hai phần: Phần đầu chứa DNA và được đóng gói trong vỏ
protein. Phần đuôi cho phép virus có thể tự cố định trên các tế bào chủ là vi khuẩn:
DNA của phage: Sợi đôi, mạch thẳng, dài 48,5kb gồm hàng chục gen. Đầu tận
cùng cuả DNA là sợi đơn gồm 12 nucleotide và chúng được gọi là những đầu dính.
Phage sinh sôi nẩy nở theo hai cách:
- Chu kỳ tan: phage được sinh sôi nẩy nở trong vi khuẩn. Các phage mới được
tạo ra sẽ đi ra khỏi vi khuẩn bằng cách làm tan vi khuẩn này.
- Sinh tan: Là một kiểu sinh sản khác của virus, phage không làm tiêu tan vi
khuẩn, thay vì tự sinh sản trong tế bào chất, phage sát nhập DNA của mình với
DNA của vi khuẩn.

Hình: Cấu tạo của phage λ

Hình: Tạo DNA tái tổ hợp

20
4.4 Các vector chuyển gen khác
4.4.1. Các cosmid
4.4.1.1 Đặc tính cấu tạo
Cosmid vector được thiết kế để nhân dòng những đoạn ADN lớn (khoảng
40-45 kb). Đây là loại vector nhân tạo kết hợp các thuộc tính của plasmid với
phage. Cosmid vector có chứa đầu cos (đầu dính) của phage giúp ADN của phage
từ dạng thẳng nối lại thành vòng tròn nên có thể gói bọc dễ dàng trong phần đầu của
phage. Mặt khác cosmid vector lại có phần gốc plasmid, do vậy chúng có khả năng
tự nhân đôi như những plasmid của vi khuẩn.
Do hầu như toàn bộ phần ADN của phage đã được cắt bỏ, nên chúng có khả
năng mang đoạn ADN ngoại lai có kích thước lớn. Khi đoạn ADN ngoại lai được
ghép nối, các cosmid tái tổ hợp sẽ được gói bọc trong phage. Phage mang ADN tái
tổ hợp không tự nhân lên được vì phần ADN phage đã bị loại bỏ nhưng chúng vẫn
có khả năng lây nhiễm vào vi khuẩn. Tuy nhiên sau khi vào vi khuẩn, chúng lại có
khả năng tự nhân lên do bản thân trong vi khuẩn đã có plasmid bình thường.
Cosmid mang đoạn gen lạ có thể dài đến 45 kb dùng để lập thư viện gen ở ruồi
giấm, chuột, thậm chí cả ở người.
4.4.1.2 Ưu điểm và ứng dụng của cosmid
Cũng như phage, cosmid cho khả năng xâm nhiễm tế bào vi khuẩn lớn, nhận
đoạn cài có kích thước lớn.

Hình: Cấu tạo cosmid

Trong tế bào chủ, nó tự nhân bản như plasmid. Cho nên người ta nhận được
những khuẩn lạc, chứ không phải đĩa phân giải trên mặt thạch, thuận lợi cho việc
quan sát.

21
 Với những tiện lợi trên, người ta dùng cosmid để tách dòng từ những gen lớn
để tạo ngân hàng genom (bộ gen). Những vi khuẩn mang vector này có khả năng
chống chịu với môi trường có ampiciline.
Tuy vậy việc ứng dụng cosmid để tách dòng cũng rất khó khăn và vất vả.
4.4.2 Các nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC(Yeart - Artificial -
Chromosomes)
Do nhu cầu tạo dòng với những trình tự DNA ngày càng lớn, các nhà nghiên
cứu tìm tòi phát triển những vector ngày càng mới. Ngày nay người ta đã tạo ra
YAC cho phép tạo dòng với những đoạn DNA dài 150÷1.000kb, trung bình là
350kb. Bằng nghiên cứu cho thấy ở nấm men (Saccharomyces Cerevisiae), nhiễm
sắc thể muốn nhân đôi và phân ly tốt cần ba trình tự:
- 2 TEL (telomere): Trình tự đầu cuối của NST
- CEN (centrmere - tâm động): Trình tự trung tâm của NST, đảm bảo sự chia
đôi và đi về 2 cực của tế bào
- ARS (autonomously replicating sequence): Trình tự sao chép tự chủ tương tự
như ori ở plasmid
Dựa vào đó người ta đã cấu tạo NST nhân tạo có đủ ba trình tự nói trên với
cấu tạo gồm 2 cánh tay, giữa 2 cánh tay người ta có thể cài đặt một đoạn DNA cần
tạo dòng với kích thước khoảng 150 đến 1.000kb. Trên mỗi cánh tay gồm các gen
đánh dấu di truyền để chọn lọc các tế bào nấm men có chứa YAC và các chuỗi tận
cùng có chức năng telomer đoạn cuối của NST. Một trong hai cánh tay mang một
mảnh DNA hoạt động như một tâm động và một nguồn tái bản ori. Việc cài DNA lạ
vào gen mã hóa chất ức chế tRNA vận chuyển tyrsine sẽ làm biến đổi màu sắc
khuẩn lạc tế bào gốc có mang gen hổ phách (khuẩn lạc từ trắng sang đỏ) khi có mặt
của DNA lạ. Đây là dấu hiệu về sự hiện diện của YAC tái tổ hợp trong tế bào nấm
men.
Các nhiễm sắc thể này được đưa vào tế bào chủ (nấm men), nó được nhân lên
như NST khác ở trong tế bào nấm men và ta có được những gen mong muốn.

22
5. Các bước tiến hành trong kĩ thuật tái tổ hợp DNA
5.1 Tạo DNA tái tổ hợp
5.1.1 DNA tái tổ hợp là gì?
DNA gồm 3 thành phần chính: base nitơ dạng purine và pyrimidine (A,T,C,G),
đường pentose (đường 5 carbon) và axit phosphoric (H3PO4). Ba thành phần này
có tỷ lệ 1:1:1 và chúng liên kết với nhau tạo thành một nucleotide:

Hình: Cấu tạo một nucleotide

Cấu trúc của DNA được Watson-Crick khám phá ra. Đó là chuỗi xoắn kép
cong nhẹ nhàng, có cấu trúc không gian 3 chiều, gồm hai sợi song song, đối xứng
và bổ sung cho nhau theo một qui luật nghiêm ngặt: A bắt cặp với T và C bắt cặp
với G nhờ các liên kết hydro.
Với cấu trúc đặc biệt của phân tử DNA và sự bắt cặp nghiêm ngặt của các base
nitơ, nhiều nhà nghiên cứu đã nảy ra ý tưởng: nếu tạo ra được những đuôi ở một
trong hai sợi của phân tử DNA khác nhau thì chúng có thể nối lại với nhau nhờ bắt
cặp bổ sung.
Vào những năm 70, người ta đã tạo được những phân tử DNA tái tổ hợp đầu
tiên bằng nhiều phương pháp khác nhau.
DNA tái tổ hợp (recombinant DNA) là DNA lai - được tạo ra từ hai hay nhiều
nguồn vật liệu di truyền khác nhau. Phân tử DNA tái tổ hợp được tạo ra nhờ kỹ
thuật ghép nối các đoạn DNA của các cá thể khác nhau trong cùng một loài, hoặc
của các loài khác nhau.
Ví dụ: Hai vector là plasmid, phage λ được cài mảnh DNA lạ để tạo ra DNA
tái tổ hợp. Các DNA lạ này được gọi là đoạn cài hay DNA ngoại lai. Nó chính là

23
 một mảnh (đoạn) DNA hay là gen mà người nghiên cứu quan tâm và ghép nó vào
DNA của plasmid hay DNA của virus.

Hình: Mô hình biểu diễn sự tạo ra DNA tái tổ hợp

5.1.2 Công đoạn chính tạo DNA tái tổ hợp

Năm 1973, Staley Cohen và Annie Chang đã tạo ra những phân tử DNA tái tổ
hợp từ các loài khác nhau, có nhiều ưu điểm và đã được biến nạp trong tế bào chủ.
Và từ đây, công nghệ DNA tái tổ hợp ra đời. Sau đó, nhiều nhà khoa học đã lao vào
các thí nghiệm lắp ghép gen và nhanh chóng thu được những kết quả có ứng dụng
trong thực tiễn.
5.1.2.1 Chuẩn bị nguyên liệu
Nuôi các tế bào vi sinh vật cho vector chuyển gen (thường là DNA plasmid
hoặc DNA phage). Tách chiết và làm sạch các vector chuyển gen
Nuôi tế bào cung cấp gen cần chuyển. Sau đó cũng tách chiết và làm sạch các
gen này.Ngoài ra, người ta còn sử dụng DNA tổng hợp bằng phương pháp hóa học
hoặc tổng hợp từ mRNA nhờ enzyme sao chép ngược
Chuẩn bị các enzyme để cắt, nối các đoạn DNA lại với nhau như enzyme
restriction, enzyme ligase cùng với sự hợp tác của một số enzyme khác như kinase
và alkanline phosphotase,…
5.1.2.2 Công đoạn cắt
RE (Restriction Endonuclease) kiểu II: là những enzyme cắt hạn chế ở những
vị trí xác định và được dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp bởi vì chúng có một
số ưu điểm: Hầu như chỉ có một kiểu hoạt tính cắt, enzyme khác đảm nhiệm việc
cải biên. Mỗi một enzyme cắt ở vị trí phù hợp định trước ngay ở bên trong hay cạnh

24
 trình tự nhận biết. Chúng chỉ cần ion Mg +2 và không cần năng lượng ATP. Các
enzyme này gặp chuỗi đích của nó trên phân tử DNA và cắt DNA thành hai mảnh
dạng đầu bằng hay đầu dính
Ví dụ:

5.1.2.3 Công đoạn nối

Dùng enzyme DNA ligase để nối các đoạn DNA và vector chuyển gen để tạo
thành DNA tái tổ hợp
DNA ligase là một enzyme xúc tác các phản ứng nối hai mảnh DNA bằng cách
tạo cầu nối phosphodiester giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH) của hai nucleotide đứng
cạnh nhau. Trong sinh học phân tử, người ta coi DNA ligase như một chất keo phân
tử để kết dính các mẫu DNA lại với nhau.
1 - Nối đầu bằng:
Nối đầu bằng được xảy ra khi hai đoạn DNA đầu bằng đứng cạnh nhau. Dưới
tác dụng của enzyme ligase, liên kết phosphodiester giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH)
được hình thành và hai nucleotide được nối lại với nhau
Khả năng nối hai đoạn DNA đầu bằng rất thấp. Để tăng hiệu suất phản ứng,
thường người ta phải tăng nồng độ của các đoạn DNA.
2 - Nối đầu lệch:
Đầu tiên, hai mảnh DNA đầu lệch do có những base bổ sung nên chúng tiến gần lại
nhau để tạo liên kết hydro giữa các base nitơ bổ sung. Sau đó, hai nucleotide của hai
đầu nối tạo liên kết este giữa OH(3’) và P(5’) dưới tác dụng của enzyme DNA
ligase.

25
 Hình: DNA và các phản ứng nối

5.1.3 Các phương pháp tạo DNA tái tổ hợp

5.1.3.1. Phương pháp đơn giản dùng đầu lệch
1 - Chọn và xử lý DNA plasmid:
Plasmid được tách từ tế bào E. Coli hoặc tế bào nấm men theo phương pháp
chiết tách DNA plasmid. Sau đó, dùng enzyme RE II (như EcoRI) cắt để tạo ra
plasmid hở có hai đầu lệch nhau.
2 - Chọn và xử lý đoạn cài:
DNA đoạn cài được thu nhận và lựa chọn, tinh chế theo mục đích của từng
nghiên cứu. Cắt DNA bằng enzyme RE loại II cùng loại với enzyme cắt plasmid
(EcoRI) để tạo ra các vết cắt giống nhau.
3 - Tạo plasmid tái tổ hợp:
26
 Ghép đoạn cài vào plasmid bằng cách ủ các DNA đoạn cài với plasmid với sự
có mặt của enzyme DNA ligase, ta thu được DNA tái tổ hợp.

Hình: Phương pháp dùng đầu lệch

5.1.3.2. Phương pháp sử dụng đoạn nối (linker)

1 - Chọn và xử lý vector plasmid: (tương tự như trên)
2 - Chọn và xử lý đoạn cài:
Linker là những đoạn DNA dài 10 đến 15 nucleotide, được tổng hợp bằng
phương pháp hóa học, sao cho ở giữa mỗi linker phải có trình tự nhận biết bởi một
enzyme cắt hạn chế loại II. Ví dụ như EcoRI có chuỗi đích là G/AATTC.
cDNA đầu bằng được tổng hợp từ mRNA nhờ enzyme sao chép ngược theo
cơ chế nuclease S1. Metyl hóa các vùng hạn chế có trong đoạn cDNA sợi đôi được
nhận biết bởi enzyme EcoRI.

27
 Ủ linker có chứa chuỗi đích G/AATTC với cDNA và enzyme DNA ligase để
tạo phân tử lai. Cắt phân tử DNA lai bởi enzyme EcoRI, ta được phân tử lai có hai
đầu lệch.
3 - Tạo vector tái tổ hợp:
Để tạo vector tái tổ hợp, người ta ghép phân tử DNA lai đầu lệch vào plasmid
mà cũng được cắt bởi cùng một enzyme EcoRI. Nhờ tác dụng của enzyme DNA
ligase mà vector tái tổ hợp được tạo thành

Hình 4.5. Dùng các đoạn nối linker tạo DNA tái tổ hợp

28
 5.1.3.3. Phương pháp sử dụng enzyme terminal transferase (ETT)
Nguyên tắc: Dựa vào đặc tính của enzyme terminal transferase có khả năng
gắn cùng một loại nucleotide vào đầu 3’(OH) của phân tử DNA.
Cách tạo DNA tái tổ hợp bằng phương pháp này được tiến hành theo 4 bước:
1 - Bước 1:
Chọn và phân lập DNA lạ đầu bằng và plasmid, giả sử ta phân lập plasmid có
chứa chuỗi đích được nhận biết bởi enzyme BamHI(G/GATCC).
Cắt plasmid bằng enzyme BamHI để tạo plasmid hở có hai đầu dính.
Cắt DNA lạ bằng enzyme exonuclease theo hướng 5’→ 3’ để tạo DNA có hai
đầu lệch nhau.
2 - Bước 2:
Ủ DNA lạ với cùng một loại nucleotide dCTP với sự có mặt của enzyme
terminal transferase để tạo đuôi polyC ở đầu 3’(OH) của DNA lạ.
Ủ plasmid với cùng một loại nucleotide dGTP với sự có mặt của enzyme
terminal transferase để tạo đuôi polyG ở đầu 3’(OH) của plasmid hở.
3 - Bước 3:
Đưa DNA lạ vào plasmid với sự có mặt của enzyme DNA ligase, các đầu mút
của homopolymer có trình tự bổ sung (---GGGG 3’/3’CCCC---)sẽ bắt cặp với nhau.
4 - Bước 4:
Bổ sung enzyme DNA-polymerase I để gắn các nucleotide tương ứng vào chỗ
trống theo nguyên tắc bổ sung. Ligase nối liên kết phosphodiester và cuối cùng tạo
được plasmid tái tổ hợp có hai chuỗi đích được nhận biết bởi enzyme BamHI.
Ưu điểm của phương pháp là ghép DNA lạ đầu bằng vào plasmid để tạo DNA
tái tổ hợp và chế tác được DNA đầu lệch từ DNA đầu bằng.

29
 Hình: Cách tạo DNA tái tổ hợp dùng enzyme terminal transferase

5.2 Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận

5.2.1 Hoá biến nạp
Theo Mandel và Higa cho thấy rằng, E. Coli trở nên rất dễ bị biến nạp bởi
DNA ngoại lai khi các tế bào vi khuẩn được xử lý trong môi trường có CaCl2 và
trước đó được sốc nhiệt ở 42°C.
Hóa biến nạp là phương pháp sử dụng chất hóa học, tạo điều kiện để đưa
vector tái tổ hợp vào tế bào chủ. Quá trình được thực hiện theo hai buớc sau: Xử lý

30
tế bào chủ trong dung dịch CaCl2 ở nhiệt độ thấp nhằm để thay đổi màng tế bào và
ủ vector tái tổ hợp với tế bào chủ đã xử lý.
Hiệu suất của phương pháp hóa biến nạp này vào khoảng 105 đến 106 tế bào
biến nạp trên 1mg DNA tái tổ hợp. Qua các kết quả thực nghiệm, người ta thấy
rằng, các tế bào phát triển ở pha sớm đến pha giữa dễ được biến nạp hơn.
Những nghiên cứu sau này cho thấy việc xử lý tế bào bằng các ion kim loại
hóa trị hai như Mg+2, Mn+2 và Ba+2 cũng cho khả năng biến nạp lớn. Ngoài ra, hiệu
suất biến nạp còn phụ thuộc vào kích thước của plasmid, plasmid càng nhỏ thì hiệu
suất biến nạp càng cao.
5.2.2 Điện biến nạp
Nguyên tắc: Sử dụng dòng điện cao thế cục bộ theo xung để tạo lỗ nhỏ trên
màng sinh học của tế bào, tạo điều kiện cho tế bào hấp thụ DNA tái tổ hợp dễ dàng.
Hiệu suất: Từ 109 đến 1010 tế bào biến nạp cho 1mg DNA tái tổ hợp, tuy
nhiên, lượng tế bào biến nạp bị chết nhiều có khi lên tới 70%. Hiệu suất của phương
pháp này phụ thuộc vào các yếu tố sau:
- Độ mạnh của điện trường tác động lên các loại tế bào khác nhau là khác nhau
- Độ dài của hằng số thời gian (thời gian ngắt xung - ms). Theo nhiều nghiên
cứu, hầu hết đối với các loại tế bào sinh vật, hiệu quả biến nạp cao khi hằng số thời
gian đạt được khoảng 6ms
- Nồng độ tế bào chủ
- Nồng độ DNA tái tổ hợp
- Giai đoạn phát triển của tế bào (quá già hoặc quá non đều không thích hợp)
- Môi trường dung dịch đệm
- Cấu trúc màng tế bào.
5.2.3 Bắn gen
Nguyên tắc: Người ta sử dụng hạt kim loại nặng được bao bọc DNA và bắn
trực tiếp vào tế bào.
Ưu điểm: Phương pháp này có thể biến nạp cho tất cả các loại tế bào thực vật.
Thao tác dễ dàng, bắn một lần được nhiều tế bào.
Nhược điểm: Hiệu suất biến nạp thấp, thường xuyên nhận được cây biến nạp
khảm (cây có tế bào biến nạp và tế bào không biến nạp).

31
 Một số thành tựu đã đạt được bằng phương pháp bắn gen: Năm 1988,
Mc.Cabe và cộng sự đã nhận được cây đậu tương biến nạp đầu tiên bằng phương
pháp bắn gen. Năm 1990, Promm, Gordon, Kamm và cộng sự đã nhận được cây
ngô biến nạp ở nhiều phòng thí nghiệm. Những năm gần đây có hàng loạt công bố
về biến nạp thành công ở lúa. Năm 1996, Zthang và cộng sự đã biến nạp ở đu đủ,
mía và bông. Điều đó đã khẳng định tính ưu việt của phương pháp này.
5.2.4 Vi tiêm
Phương pháp vi tiêm là phương pháp sử dụng vi kim và kính hiển vi để đưa
DNA tái tổ hợp vào mỗi tế bào nhất định. Đây là quá trình lai ghép cho tế bào bậc
cao hoặc tế bào hợp tử. Tùy thuộc từng trường hợp cụ thể, người ta có thể chọn
phương pháp sao cho việc đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào có hiệu quả cao.
Ưu điểm: Có thể tối ưu lượng DNA tái tổ hợp đưa vào tế bào và quyết định
đưa DNA vào loại tế bào nào. Đưa chính xác và thậm chí vào tận nhân của tế bào
và có thể quan sát được. Các tế bào có cấu trúc nhỏ như hạt phấn, tế bào tiền phôi
cũng có thể tiến hành một cách chính xác. Có thể biến nạp cho mọi giống cây.
Nhược điểm: Một phát tiêm chỉ được một tế bào và thao tác cần phải khéo léo
và tỉ mỉ.
5.2.5 Tải nạp
Tải nạp là hiện tượng chuyển vật liệu di truyền qua vector là virus từ vi khuẩn
cho sang vi khuẩn nhận, trong đó có quá trình chuyển gen và tái tổ hợp gen ở vi
khuẩn nhờ thực khuẩn thể (Bacteriophage).
Thực nghiệm đã chứng minh được tải nạp ở E. Coli qua phage λ, phage P1 và
ở Bacillus subtilis qua phage SP10. So với các phương pháp trên, tải nạp cho hiệu
suất cao hơn.
Như vậy, đến nay đã có nhiều phương pháp hóa học, hóa lý, cơ học và sinh
học để đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ. Tùy các đối tượng và yêu cầu cụ thể,
phương pháp này hay phương pháp khác có hiệu quả và được sử dụng nhiều hơn.
5.3 Phương pháp xác định dòng cần tìm
Sau khi đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ, người ta chọn ra những tế bào có
mang gen lạ và kiểm tra. Sau đó những dòng tế bào này được đem nhân lên tạo
thành dòng tế bào và duy trì lâu dài. Để nhận biết tế bào chưa DNA tái tổ hợp và tế
bào thường, người ta thường dùng các phương pháp sau:

32
 5.3.1. Phương pháp lai axit nucleic(sử dụng gen đánh dấu)
Khái niệm đầu dò: Các đầu dò là những mảnh DNA được đánh dấu, có khả
năng nhận biết một chuỗi DNA hoặc RNA đồng đẳng qua lai hóa.
Đặc điểm của đầu dò: Là một đoạn axit nucleic (DNA hoặc RNA) sợi đơn.
Đầu dò phải bổ sung các base nitơ, đối song song với đoạn axit nucleic cần nhận
biết. Đầu dò phải so mốc được, đó là các đầu đánh dấu phóng xạ.
Các loại đầu dò:cDNA làm đầu dò cực tốt, ngoài ra, mRNA và oligonucleotide
cũng có thể làm đầu dò
Nguyên tắc: Dựa vào khả năng biến tính khi nhiệt độ tăng và hồi tính kho nhiệt
độ giảm từ từ của DNA. Khi nhiệt độ tăng quá nhiệt độ sinh lý(80 – 950C), hai sợi
đơn DNA sẽ tách rời nhau do liên kết hydro bị đứt. Khi hạ nhiệt độ từ từ, các mạch
đơn bắt cặp trở lại
Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu (đầu) dò đã được đánh dấu bằng đồng vị phóng
xạ hoặc hóa chất. Biến tính dòng cần tìm ở dưới dạng một sợi, sau đó hạ nhiệt độ từ
từ, các sợi đơn tương đồng bắt cặp với nhau. Sự bắt cặp xảy ra giữa DNA và DNA,
RNA và DNA, RNA và RNA.

Biến tính DN

5.3.2. Phương pháp sử dụng kháng thể

Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng đặc trưng của một số protein và kháng thể mà
chúng ta có thể nhận biết được qua phản ứng đặc trưng đó như phản ứng tạo màu,
phản ứng kết tủa.
Cách tiến hành: Chọn kháng thể đặc trưng cho protein (thuốc thử cho protein).
Tách protein được biểu hiện trong quá trình tạo dòng. Ủ protein với kháng thể đặc

33
trưng. Sau đó tiến hành nhận biết thông qua các dấu hiệu của phản ứng đặc trưng
giữa protein và kháng thể.
Ứng dụng: Chủ yếu sử dụng trong y học với hai yêu cầu sau: DNA cần nghiên
cứu được gắn vào vector phải biểu hiện protein khi tạo dòng và đồng thời, vector
tạo dòng phải là vector biểu hiện (ví dụ như vector λgt11). Protein biểu hiện cần
phải có kháng thể đặc trưng.
5.3.3. Phương pháp phát hiện do mất hoạt tính vì xen đoạn
Nguyên tắc: Dựa vào sự mất khả năng kháng thuốc của vi khuẩn mang vector
tái tổ hợp khi chúng được nuôi cấy trong môi trường kháng sinh.
Phạm vi sử dụng: Phương pháp này dùng cho vector có từ hai gen kháng thuốc
trở lên, ví dụ như vector pBR322. Trong plasmid pBR322 có hai gen kháng thuốc
AmPR và TetR. Trên các gen này có những điểm nhận biết của các RE nơi cài đặt
DNA lạ. Khi gắn DNA lạ vào một trong hai gen nói trên thì gen nhận đoạn cài mất
khả năng kháng thuốc. Quan sát những khuẩn lạc bị mất gen kháng thuốc, chứng tỏ
những khuẩn lạc đó có chứa gen cần tạo dòng.
Ưu điểm của phương pháp là ít tốn kém so với phương pháp lai.
5.3.4. Phương pháp phát hiện do thay đổi kiểu hình
Nguyên tắc: Dựa vào sự thay đổi màu sắc của khuẩn lạc, chứng tỏ rằng, khuẩn
lạc đó có chứa gen lạ.
Cách tiến hành: Chuẩn bị hai mẫu thử nghiệm mà plasmid tạo dòng có chứa
gen lacZ (ví dụ như dãy pUC), một mẫu để so sánh còn mẫu kia để cài DNA lạ vào
gen lacZ. Sau đó, nuôi cấy cả hai mẫu trong môi trường có chất cảm ứng X-Gal
(5.brom-4chloro-3indolyl D-galactopynoside). Chất cảm ứng này bị phân hủy bởi
enzyme β-galactosidase tạo ra galactose và X (dẫn xuất indol), ngoài môi trường,
dẫn xuất này bị oxy hóa cho màu xanh đậm. Qua quan sát, ta thấy plasmid không
chứa gen lạ cho khuẩn lạc màu xanh do gen lacZ tổng hợp enzyme β-galactosidase.
Còn plasmid thứ 2 cho khuẩn lạc màu trắng, điều đó chứng tỏ nó chứa DNA lạ
được cài trong gen lacZ và chọn những khuẩn lạc màu trắng.

6 Ứng dụng
Công nghệ di truyền được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu và sản
xuất liên quan đến nông nghiệp, y dược, bảo vệ môi trường, công nghệ thực phẩm...

34
 6.1.Trong y dược:
Vận dụng kỹ thuật di truyền, các nhà khoa học đã có thể chẩn đoán các bệnh
do rối loạn di truyền và tiến tới điều trị bằng cách thay gen bệnh bằng gen lành, đưa
gen lành vào cơ thể để bù đắp cho các gen bị thiếu hụt- đây là một hướng ứng dụng
khó thực hiện nhất hiện nay.
Ứng dụng công nghệ di truyền mạnh nhất trong y tế là nghành sản xuất thuốc
kháng sinh, vác xin, kháng thể đơn dòng dùng để phân tích miễn dịch, định vị các
khối u, phát hiện một số protein có liên quan đến sự hình thành khối u…
Nhờ công nghệ sử dụng DNA tái tổ hợp mà người ta có thể sản xuất một số
protein có hoạt tính sinh học dùng để chữa bệnh như insulin chữa bệnh tiểu đường,
interferon chữa bệnh ung thư, các hormon tăng trưởng cho con người. Bản chất của
công nghệ này là làm thay đổi bộ máy di truyền của tế bào bằng cách đưa gen mã
hóa cho một protein đặc hiệu và bắt nó hoạt động để tạo ra một lượng lớn loại
protein mà con người cần.
6.2. Trong nông nghiệp:
Kỹ thuật di truyền được sử dụng để xác định vị trí của các gen mã hóa cho các
tính trạng mong muốn, giúp cho việc lai tạo, chọn giống cũng như tạo ra các sinh
vật chuyển gen nhanh và hiệu quả cao như: chuyển gen để tạo ra giống cây trồng có
khả năng chống sâu hại, kháng lại vi sinh vật gây bệnh, chống chịu thuốc trừ cỏ,
quả chín chậm, năng suất chất lượng cao... Đối với các động vật nuôi, công nghệ di
truyền tạo ra các vật nuôi chuyển gen hormone sinh trưởng làm cho chúng tăng
trọng nhanh hoặc tạo động vật nuôi tăng sản lượng và chất lượng sữa, tạo sữa, có
chứa các protein có tác dụng kháng sinh hoặc tạo phủ tạng có thể thay thế cho
người.... Ví dụ:
Chuyển gen kháng được nhiều loại thuốc diệt cỏ từ thuốc lá cảnh vào cây đậu
tương (1989).
Cấy gen qui định khả năng chống chịu lại 1 số chủng vi rút gây thối củ vào
khoai tây (1990).
Ở Việt Nam, chuyển gen kháng rầy nâu, kháng sâu, gen tổng hợp vitamin A
vào một số loại cây trồng: lúa, ngô, khoai tây, cà chua, đu đủ...
Cây trồng chuyển gen cải tiến các protein hạt: người ta đã đưa gen mã hóa một
loại protein chứa các amino acid có lưu huỳnh vào cây đậu lupin. Kết quả là tăng

35
100% hàm lượng protein trong hạt. Hạt này được dùng để nuôi cừu, tăng trọng
lượng 7% và sản lượng lông tăng 8% so với cừu nuôi bằng loại hạt bình thường.
Cây trồng chuyển gen mang tính bất dục đực: ứng dụng trên các cây tự thụ
phấn như bắp,… vì các cây có ưu thế lai cao thường là kết quả của quá trình ngoại
phối. Nguyên lý chung của phương pháp là chuyển một gen mã hoá enzyme phân
giải ARN tên là barmnase tách từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens gắn
promotor TA29. Promotor TA29 chỉ hoạt động ở vùng hạt phấn do vậy, khi gen
barmnase gắn với promotor được chuyển vào cây thì toàn bộ ARN ở hạt phấn bị
phá huỷ mà không ảnh hưởng tới các vùng khác. Kết quả là tạo được các dòng bất
dục đực
Ngoài ra, ta còn tạo được động vật biến đổi gen: như chuyển gen sinh trưởng
của bò vào lợn, chuyển gen xác định mùi sữa ở người vào tế bào phôi bò cái làm
sữa bò có mùi sữa người và dễ tiêu hoá dùng để nuôi trẻ em trong vòng 6 tháng
tuổi, chuyển gen tổng hợp hoocmon sinh trưởng ở người vào cá trạch.

Lợn mang gen người  ghép nội tạng Khoai tây chuyển gen chứa vacxin ngừa
viêm gan B

Đậu được chuyển gen kháng thuốc Gạo biến đổi gen có nhiều vitamin A,
diệt cỏ protein hơn

36
Cà chua chứa gen sàn xuất sắc tối của hoa mõm chó chống oxy hóa

Chuyển gen kháng sâu bệnh vào cây bông (bên phải)

Cây đu đủ chuyển gen kháng virus (bên trái)và cây đối chứng
6.3 Trong bảo vệ môi trường
- Làm sạch đất ô nhiễm: Selen là một nguyên tố hóa học, gây độc đối với thực
vật nếu hàm lượng của chúng quá cao trong đất. Đất canh tác tại một số vùng của
bang California được tưới tiêu mạnh và nước hòa tan selen có trong đá phiến sét.
Khi nước bốc hơi trên mặt đất, senlen sẽ tích tụ ngày càng nhiều. Cây mù tạt Ấn Độ
(Brassica juncea) vốn có khả năng kháng và hấp thụ selen qua rễ. Tuy nhiên, Terry
và cs (Đại học California) đã thúc đẩy thêm khả năng trên của cây mù tạt bằng cách
bổ sung một số gen tạo enzyme đói selen. Kết quả là loại thực vật GM này có thể
hấp thụ selen cao gấp 4,3 lần so với mù tạt Ấn Độ dạng hoang dại, và chúng được
thu hoạch 45 ngày sau khi trồng.
37
 Hình: Cây mù tạt chuyển gen
- Tạo ra những chủng vi khuẩn phân hủy dầu mỏ, phân hủy chất hữu cơ làm
sạch nước bẩn: Tổ hợp 4 gen từ 4 chủng có khả năng cắt mạch hữu cơ của dầu mỏ
vào cùng một chủng vi khuẩn và dùng chủng vi khuẩn đó để phân hủy lớp dầu
loang trên biển.
6.4 Trong công nghệ thực phẩm
6.4.1 Trong công nghệ lên men
Đây là một lĩnh vực quan trọng trong sản xuất thực phẩm. Việc tuyển chọn
các chủng vi sinh vật có khả năng lên men tốt, đem lại hiệu quả cao là rất cần thiết.
Các nghiên cứu sử dụng công nghệ di truyền phục vụ cho công nghệ lên men chủ
yếu đi vào hai hướng chính là:
- Phân tích di truyền các loại vi sinh vật sử dụng trong quá trình lên men, xác
định các gen mã hóa cho các tính trạng mong muốn nhằm tạo ra năng suất và chất
lượng sản phẩm lên men.
- Tạo ra các vi sinh vật chuyển gen phục vụ cho các qui trình lên men.
Ví dụ:
Trong sản xuất rượu, ngày nay người ta đã dùng các chủng vi sinh vật có khả
năng tạo rượu cao và cho hương vị tốt. Phần lớn các chủng đó được nghiên cứu,
tuyển chọn, lai tạo bằng công nghệ di truyền.
Để sản xuất rượu vang, trước đây, người ta phải dùng hai loại vi sinh vật là S.
Cerevisiae để tạo ra hàm lượng rượu trong dịch lên men và sau đó, sử dụn
Leuconostos trong lên men phụ ở quá trình tàng trữ, nhằm nâng cao chất lượng của
rượu. Ngày nay, người ta tiến tới dùng một chủng vi sinh vật chuyển gen để thực
hiện cả hai quá trình.
Công nghệ di truyền đóng vai trò quan trọng trong việc tuyển chọn và tạo ra
các vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao, sử dụng trong công nghệ thực phẩm. Đối
38
với các sản phẩm lên men sữa như phomat và sữa chua, trước kia, người ta thường
sử dụng những vi sinh vật tự nhiên có mặt trong sữa để lên men, do vậy, người ta
khó lòng kiểm soát quá trình lên men và hiệu quả không cao. Ngày nay, với công
nghệ di truyền, người ta đã tạo được các chủng mới với các tính chất xác định và đã
điều khiển được quá trình lên men theo định hướng mong muốn.
6.4.2 Sản xuất enzyme
Trong những năm gần đây, bằng cách sử dụng công nghệ di truyền, người ta
đã tuyển chọn và tạo ra những chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme
chịu nhiệt, chịu axit, chịu kiềm tốt. Enzyme λ-amylase chịu nhiệt đã và đang được
sử dụng nhiều để sản xuất nha, đường glucose từ tinh bột.
6.4.3 Enzyme tái tổ hợp có khả năng khử độc tố Aflatoxine
Độc tố vi nấm quan trọng và nguy hiểm nhất hiện nay thuộc nhóm aflatoxin.
Các độc tố này là chất chuyển hóa của các loài vi nấm Aspergillus, nồng độ giới
hạn đã được WHO qui định được có trong thực phẩm là 5ppb (5μg/Kg).
Tập đoàn China medicine của Trung quốc đã thực hiện một dự án nghiên cứu
và sản xuất thành công một sản phẩm sinh học gọi là rADTZ (recombinant aflatoxin
detoxifizym enzyme) - enzyme tái tổ hợp khử độc tính aflatoxin.
Toàn bộ cấu trúc gen của rADTZ được tái tổ hợp từ một loại vi nấm. Để chế
tạo rADTZ phải làm nhiều công đoạn: nuôi cấy vi nấm, tinh chế protein, tạo dòng
gen, tái tổ hợp gen, và lên men.
Hợp chất này là dẫn xuất của một enzyme ngoại tế bào, enzyme này có khả
năng làm phá vỡ cấu trúc vòng bifuran làm mất độc tính, và có chức năng như là
một chất đối kháng (antidote) của aflatoxin. Do đó, rADTZ có triển vọng dùng để
làm một chất khử độc tố aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc
Những thuốc thử phát hiện sinh học dựa trên men rADTZ có thể được sử dụng
trong kiểm nghiệm y học để ứng dụng vào việc giám định và kiểm tra chất lượng
sản phẩm của ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm. Hơn nữa, hiên nay, người ta
chưa thực hiện được việc khử độc tố aflatoxin bị nhiễm trong sữa. Việc xử lý bằng
cách kiềm hoá và chiếu tia cực tím (UV) được sử dụng để khử aflatoxin trong dầu
đậu phọng, cách xử lý này có thể ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm sau xử lý.
Trong khi đó xử lý bằng rADTZ trong những điều kiện đặc biệt không làm ảnh
hưởng đến chất lượng và điều kiện bảo quản của sản phẩm.

39
 PHẦN KẾT LUẬN
~~~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~~~~~~

Từ những nghiên cứu thuần tuý ban đầu, công nghệ di truyền đã chuyển thành
một nghành công nghiệp trị giá nhiều tỷ USD
Bên cạnh những ứng dụng cực kỳ to lớn, có lợi cho con người, các nhà khoa
học cũng cảnh báo một số hiểm hoạ tiềm ẩn mà các sinh vật biến đổi gen có thể gây
ra, ví dụ như gen của các sinh vật biến đổi thất thoát ra ngoài tự nhiên, truyền sang
sinh vật khác có thể gây nguy hiểm cho hệ sinh thái.
Tuy ngày nay, các nhà khoa học đã có thể tổng hợp được các gen nhân tạo hay
ghép gen này hay gen kia vào bộ máy di truyền của một sinh vật nào đó, nhưng
chắc chắn, còn rất nhiều vấn đề về những bí ẩn của sự sống, nhất là ở các sinh vật
bậc cao vẫn chưa được khám phá. Người ta có thể chứng tỏ sự vô hại của các loại
thực phẩm từ thực vật, động vật hay vi sinh vật chuyển gen qua các thí nghiệm,
nhưng về lâu dài, người ta chưa thể khẳng định được sự vô hại đó, vì vậy, không ít
người đã tỏ ra lo lắng khi sử dụng chúng thường xuyên với một số lượng lớn.

40
 PHỤ LỤC
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

1. Restriction enzyme

Recognition
Enzyme Source Cut
Sequence
5'GAATTC 5'---G AATTC---3'
EcoRI Escherichia coli
3'CTTAAG 3'---CTTAA G---5'
5'CCWGG 5'--- CCWGG---3'
EcoRII Escherichia coli
3'GGWCC 3'---GGWCC ---5'
Bacillus 5'GGATCC 5'---G GATCC---3'
BamHI
amyloliquefaciens 3'CCTAGG 3'---CCTAG G---5'
5'AAGCTT 5'---A AGCTT---3'
HindIII Haemophilus influenzae
3'TTCGAA 3'---TTCGA A---5'
5'TCGA 5'---T CGA---3'
TaqI Thermus aquaticus
3'AGCT 3'---AGC T---5'
5'GCGGCCGC 5'---GC GGCCGC---3'
NotI Nocardia otitidis
3'CGCCGGCG 3'---CGCCGG CG---5'
5'GANTC 5'---G ANTC---3'
HinfI Haemophilus influenzae
3'CTNAG 3'---CTNA G---5'
5'GATC 5'--- GATC---3'
Sau3A Staphylococcus aureus
3'CTAG 3'---CTAG ---5'
5'CAGCTG 5'---CAG CTG---3'
PovII* Proteus vulgaris
3'GTCGAC 3'---GTC GAC---5'
5'CCCGGG 5'---CCC GGG---3'
SmaI* Serratia marcescens
3'GGGCCC 3'---GGG CCC---5'
5'GGCC 5'---GG CC---3'
HaeIII* Haemophilus aegyptius
3'CCGG 3'---CC GG---5'
HgaI Haemophilus 5'GACGC 5'---NN NN---3'

41
 gallinarum 3'CTGCG 3'---NN NN---5'
5'AGCT 5'---AG CT---3'
AluI* Arthrobacter luteus
3'TCGA 3'---TC GA---5'
5'GATATC 5'---GAT ATC---3'
EcoRV* Escherichia coli
3'CTATAG 3'---CTA TAG---5'
5'CAGCAGN 25 NN 5'---CAGCAGN 25 NN ---3'
EcoP15I Escherichia coli
3'GTCGTCN 25 NN 3'---GTCGTCN 25 NN---5'
5'GGTACC 5'---GGTAC C---3'
KpnI Klebsiella pneumoniae
3'CCATGG 3'---C CATGG---5'
5'CTGCAG 5'---CTGCA G---3'
PstI Providencia stuartii
3'GACGTC 3'---G ACGTC---5'
Streptomyces 5'GAGCTC 5'---GAGCT C---3'
SacI
achromogenes 3'CTCGAG 3'---C TCGAG---5'
5'GTCGAC 5'---G TCGAC---3'
SalI Streptomyces albus
3'CAGCTG 3'---CAGCT G---5'
Streptomyces 5'AGTACT 5'---AGT ACT---3'
ScaI
caespitosus 3'TCATGA 3'---TCA TGA---5'
5'ACTAGT 5'---A CTAGT---3'
SpeI Sphaerotilus natans
3'TGATCA 3'---TGATC A---5'
Streptomyces 5'GCATGC 5'---G CATGC---3'
SphI
phaeochromogenes 3'CGTACG 3'---CGTAC G---5'
Streptomyces 5'AGGCCT 5'---AGG CCT---3'
StuI
tubercidicus 3'TCCGGA 3'---TCC GGA---5'
5'TCTAGA 5'---T CTAGA---3'
XbaI Xanthomonas badrii
3'AGATCT 3'---AGATC T---5'
Key: * = blunt ends ; N = C or G or T or A ; W = A or T
2. H&Đ an toàn thực phẩm từ ADN tái tổ hợp
Hiện nay ngừời tiêu dùng khắp nơi trên thế giới đang quan tâm đến vần đề an
toàn thực phẩm đối với các sản phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp. Thông tin
đưa ra dưới đây dựa trên tài liệu của Institute of Food Technologists (USA). Đây là
một tổ chức phi lợi nhuận, với hơn 29.000 thành viên từ các nước khác nhau, thuộc
lĩnh vực khoa học và công nghệ thực phẩm.
42
 Hỏi: Sử dụng thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp có an toàn
không?
CÓ. Thực tế mà nói thì các quá trình của công nghệ ADN tái tổ hợp còn chính xác
và dễ dự đoán hơn so với công nghệ lai tạo giống với kỹ thuật “cổ truyền”
(conventional). Việc chuyển một hoặc vài gien đã được nghiên cứu đặc tính kỹ
lưỡng thường có ít rủi ro hơn so với phương pháp lai tạo giống “cổ truyền”. Ở
phương pháp cổ truyền, hàng trăm nghìn gien của mỗI cây tương tác lẫn nhau và tạo
nên hàng loạt tái tổ hợp ngẫu nhiên. Ngoài ra, tất cả các thực phẩm có nguồn gốc từ
ADN tái tổ hợp đều được kiểm tra nghiên cứu kỹ lưỡng trước khi đưa ra thương
mại hoá. Nhiều tổ chức khoa học quốc tế đã nghiên cứu và đưa ra kết luận rằng “Sử
dụng thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp là hoàn toàn an toàn”
Hỏi: Sử dụng thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp có làm biến đổi
ADN của ngừơi sử dụng không?
KHÔNG. ADN bị phân cắt hoàn toàn và rất nhanh trong quá trình tiêu hoá.
Hỏi: Trong trường hợp sử dụng thực phẩm chuyển gien thì người tiêu
dùng có ăn một lượng lớn ADN tái tổ hợp không?
KHÔNG. Các gien chuyển sử dụng kỹ thuật ADN tái tổ hợp chỉ chiếm 1/250.000
trên tổng số ADN của thực phẩm đó. Không có bằng chứng nào cho thấy có xảy ra
sự chuyển gien từ ADN của thực phẩm “cổ truyền” sang sinh vật hay người tiêu
dùng, nguy cơ xảy ra chuyển gien từ thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp
còn thấp hơn rất nhiều lần so với ADN từ thực phẩm “cổ truyền”
Hỏi: Đã có trường hợp nào mà tiêu thụ thực phẩm có nguồn gốc từ ADN
tái tổ hợp gây ảnh hưởng đến sức khoẻ chưa?
CHƯA. Cho đến nay chưa có báo cáo nào về vấn đề này. Tuy nhiên cũng có những
trường hợp báo cáo không chính xác. Cụ thể vào năm 1980, đã có báo cáo về 1.500
người bị ngộ độc và 37 người chết do sử dụng L-tryptophan sản xuất bởi sinh vật có
nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp. Tuy nhiên, các nghiên cứu sau đó đã cho thấy rằng,
đồng thời với việc đưa vi sinh vật có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp vào sản xuất
Tryptophan, nhà sản xuất này đã bỏ bớt một bước quan trọng trong quá trình tinh
sạch, vì thế lượng carcbon hoạt hoá còn lại trong sản phẩm rất cao. Đây là nguyên
nhân dẫn đến trường hợp trên.

43
 Hỏi: Hiện nay những yếu tố nào được sử dụng trong việc đánh giá an toàn
thực phẩm?
An toàn thực phẩm được đánh giá dựa trên nhiều yếu tố, trong đó bao gồm: vi sinh
vật, độc tố, chất gây dị ứng, và thành phần dinh dưỡng. Để đánh giá độ an toàn của
gien được chuyển, các nhà khoa học còn quan tâm đến nguồn gốc của gien. Gien
phải có nguồn gốc an toàn đối với người tiêu thụ (V.D: gien bắt nguồn từ một thực
phẩm khác). Độc tố và chất gây dị ứng đều được nghiên cứu trên các đối tượng
chuyển gien trước khi đưa ra thương mại hoá. Ngoài ra, sự tương tác giữa protein
của gien chuyển và protein của vật chủ cũng được nghiên cứu nhằm loại bỏ những
trường hợp tương tác gây thay đổi đặc tính sản phẩm của gien chuyển. Cuối cùng,
thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp còn được đánh giá, so sánh với thực
phẩm “cổ truyền” cùng loại.
Hỏi: Thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp an toàn như vậy, tại sao
vẫn có một nhóm người không ủng hộ?
Đây quả thật là một câu hỏi khó trả lời, mỗi người nhìn nhận sản phẩm mới, công
nghệ mới dựa trên nhiều yếu tố khác nhau như, khoa học, an toàn, giá thành, độ
thuận tiện, tính phổ biến, v. v. và “what’s in it for me?”. Thậm chí những công nghệ
mới trong y học chữa bệnh cũng còn cần trải qua nhiều năm mới được công nhận
hoàn toàn. Đối với thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp, nhiều vấn đề do
người tiêu dùng thể hiện đều không có những bằng chứng khoa học ủng hộ.
Hiểu biết đầy đủ về công nghệ ADN tái tổ hợp là cần thiết để hiểu biết đúng về an
toàn của thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp.
Thông tin thêm về vấn đề này hiện có ở http://www.ift.org
(Translated by Le Tien Dung 2002)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

44
1. ThS Lò Thanh Sơn, Bài giảng Công nghệ di truyền, Trường Đại hoc Tây Bắc
2. Phạm Thành Hổ, Sinh học đại cương, NXB Đại học Quốc gia TP.Hồ Chí
Minh, 2002
3. http://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_enzyme
4. http://highered.mcgraw-
hill.com/sites/dl/free/0072437316/120060/ravenanimation.html
5. http://www.cynosura.org/index.php?
option=com_content&view=article&id=10:ha-an-toan-thc-phm-t-adn-tai-t-
hp
6. http://www.ihph.org.vn/DownloadFolder/AFLATOXIN%20chau%20vinh
%20thi.pdf

MỤC LỤC
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

45
 PHẦN MỞ ĐẦU 2
PHẦN NỘI DUNG 4
1. Nguyên lí cơ bản của kĩ thuật tái tổ hợp DNA 4
2. Các enzyme sử dụng trong kĩ thuật tái tổ hợp DNA 5
2.1 Enzyme giới hạn RE (Restriction Enzyme) 5
2.1.1 Khái niệm về enzym giới hạn 6
2.1.2 Phân loại enzym giới hạn 6
2.1.3 Tính đặc hiệu vị trí 7
2.2 Nuclease 8
2.3 Enzyme nối 10
2.3.1. Ligase 10
2.3.2. Các enzyme dephosphoryl hoá ( khử nhóm PO4-3 ) 10
2.4 Các enzym polymerase
11
2.4.1 Khái niệm 11
2.4.2 Phân loại 12
3. Thu nhận gen 12
3.1 Tách chiết DNA trực tiếp từ tế bào 12
3.2 Tổng hợp bằng phương pháp hoá học 12
3.3 Tổng hợp từ mRNA của gen tương ứng 13
4. Vector chuyển gen 14
4.1 Yêu cầu của vector chuyển gen 14
4.2 Vector chuyển gen là plasmid 15
4.2.4 Các plasmid thế hệ thứ nhất 15
4.2.5 Plasmid thế hệ thứ hai 15
4.2.6 Các plasmid thế hệ ba 16
4.3 Vector chuyển gen là phage 19
4.4 Các vector chuyển gen khác 21
4.4.1. Các cosmid 21
4.4.2 Các nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC
22

46
 5. Các bước tiến hành trong kĩ thuật tái tổ hợp DNA 23
5.1 Tạo DNA tái tổ hợp 23
5.1.1 DNA tái tổ hợp là gì? 23
5.1.2 Công đoạn chính tạo DNA tái tổ hợp
24
5.1.3.1 Chuẩn bị nguyên liệu 24
5.1.3.1 Công đoạn cắt 24
5.1.3.1 Công đoạn nối 25
5.1.3 Các phương pháp tạo DNA tái tổ hợp 26
5.1.3.1 Dùng đầu lệch 26
5.1.3.2 Sử dụng đoạn nối (linker) 27
5.1.3.3 Sử dụng enzyme terminal transferase (ETT) 29
5.2 Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận 30
5.2.1 Hoá biến nạp 30
5.2.2 Điện biến nạp 31
5.2.3 Bắn gen 31
5.2.4 Vi tiêm
32
5.2.5 Tải nạp 32
5.3 Tạo dòng phân tử 32
5.3.1 Phương pháp lai axit nucleic(sử dụng gen đánh dấu) 33
5.3.2 Phương pháp sử dụng kháng thể 33
5.3.3 Phương pháp phát hiện do mất hoạt tính vì xen đoạn 33
5.3.4 Phương pháp phát hiện do thay đổi kiểu hình
34
6 Ứng dụng
34
6.1 Trong y dược 34
6.2 Trong nông nghiệp 35
6.3 Trong bảo vệ môi trường 36
6.4 Trong công nghệ thực phẩm 37
PHẦN KẾT LUẬN 40

47
PHỤ LỤC
TÀI LIỆU THAM KHẢO

48