PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU

KHÍ
- Tổng số vi sinh vật hiếu khí: là tổng số tất cả các loài vi khuẩn ưa khí ( điều kiện
có oxy tự do ) có trong mẫu thực phẩm.
- Chỉ số này cho ta biết sơ bộ mức độ nhiễm khuẩn nói chung của các mẫu thực
phẩm, không có giá trị quyết định để kết luận mẫu đạt hay không đạt tiêu chuẩn vi
sinh.
- Muốn đánh giá mẫu đạt hay không đạt tiêu chuẩn thì cần phải thêm chỉ tiêu vi
sinh chỉ danh và vi sinh gây bệnh có trong mẫu.

I. NGUYÊN TẮC
Sử dụng kĩ thuật đổ đĩa, đếm số khuẩn lạc đã mọc trên môi trường thạch dinh
dưỡng ssau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 30 – 37oC trong thời gian từ 24 – 48 giờ. Số
lượng vi khuẩn hiếu khí trong 1ml mẫu thực phẩm kiểm nghiệm được tính từ số
khuẩn lạc đếm được trong các hộp nuôi cấy theo các nồng độ pha loãng .
II. DỤNG CỤ VÀ MÔI TRƯỜNG
- Đĩa petri có đường kính từ 90 – 100mm.
- Ống nghiệm.
- Pipet 1ml, 10ml.
- Erlen 250ml, 100ml, cốc thủy tinh 100ml.
- Môi trường (Nutrien agar, plate count agar).
- Pepton đệm.
- Nước pepton.
III. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG
- Dụng cụ được rửa sạch, sấy khô và tiệt trùng với nồi hấp Autoclave ở áp suất
1,5at/ 1h.
- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy.
 Môi trường thạch thường glucoza :
• Pepton 10g.
• NaCl 5g.
• Cao thịt 5g.
• Glucoza 1g.
• Thạch 15 – 20g.
 • Nước cất 1000ml.
 Môi trường thạch pepton glucoza :
• Trypton 5g.
• Cao men 2,5 g.
• Cao thịt 5g.
• Glucoza 1g.
• Thạch 15 – 20g.
• Nước cất 1000ml.
- Có thể sử dụng các môi trường đã được pha chế sẵn của hãng Sanofi.
- Cách pha chế : hòa tan bột môi trường vào nước, đun nhỏ lửa, khuấy đều để hòa
tan các chất đến khi sôi. Để nguội 70 -800C cho môi trường vào ống nghiệm đã
được sấy khô (khoảng 15ml). Hấp tiệt khuẩn ở 1at trong 20 phút.
Để nguội cho thạch đông tự nhiên.
Bảo quản lạnh trong môi trường tủ lạnh (5 – 10 0C).
- Tiến hành nuôi cấy :
 Kĩ thuật lấy mẫu :
 Mẫu được đồng nhất và pha loãng.
Dùng pipet 1ml vô khuẩn hút 1ml sữa tươi từ mẫu đã được lắc đều, cho
vào ống nghiệm có chứa sẵn 5 ml pepton đệm.
Pha loãng mẫu để có nồng độ định cấy sao cho sau khi nuôi cấy trên
các hộp thạch có số khuẩn lạc từ 30 – 300 khuẩn lạc. Mỗi mẫu nuôi cấy 2–
3 nồng độ liên tiếp (tùy theo mức độ ô nhiễm của mẫu, mỗi nồng độ pha
loãng cấy 2 đĩa petri). Thời gian từ khi pha loãng mẫu đén khi đổ thạch
vào trộn không quá 20 phút.
 Cấy mẫu
Dùng pipet 1ml vô trùng hút 1 ml mẫu ở các nồng độ pha loãng 1/
10; 1/ 100; 1/ 1000 cho vào giữa đĩa petri (chỉ mở nắp hé không được mở
hết).
 Đổ thạch dinh dưỡng đã hấp vô trùng để nguội 45 -500C vào từng
đĩa petri, nếu dùng thạch bảo quản lạnh thì phải đun cách thủy cho thạch
tan hết, để nguội 45 – 500C rồi cho vào đĩa petri đã có sẵn 1 ml mẫu.
Trộn đều môi trường và mẫu bằng cách xoay xuôi, xoay ngược nhiều
lần nhẹ nhàng (không làm quá mạnh thạch bị sóng ra ngoài hoặc dính lên
nắp hộp) rồi để các đĩa thạch khô tự nhiên.
Úp ngược đĩa petri thạch lại để tủ ấm 30 – 370C (24 – 48 giờ).
Sau 224 -48 giờ, đọc kết quả : đếm số khuẩn lạc mọc trên các hộp
thạch đã cấy bằng ánh sáng tự nhiên hoặc qua kính phóng đại có ánh
sáng đèn.
Chọn các hộp có số khuẩn lạc từ 15 – 300 khuẩn lạc để đếm. Ở 2 đậm
độ pha loãng liên tiếp, nếu khuẩn lạc nhiều quá có thể chia hộp thành 2 –
4 phần bằng nhau để đếm.
 Kết quả:
Tính số N khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí cho 1 ml sản phẩm bằng
cách tính công thức trung bình cộng tổng số khuẩn lạc của các
hộp trên theo công thức sau :

∑C
N =———————
(n1 + 0,1 n2). D

Trong đó : C là số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn.

n1, n2 là số đĩa ở 2 độ pha loãng liên tiếp đã chọn để
đọc.
d là hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng.
Làm tròn kết quả có được, chỉ giữ lại 2 chữ số có nghĩa và biểu thị
kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n (n là số mũ).
 SƠ ĐỒ ĐẾM TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ
1.Chuẩn bị đồng nhất mẫu:

9 ml mẫu sữa + 10 ml nước pepton đệm

2. Pha loãng mẫu:

1ml 1ml 1ml

9ml nước pepton

 1: 100 1: 1000 1: 100.000
3. Cấy 1 ml vào đĩa petri:

1ml 1ml 1ml

1ml 1ml 1ml

4. Đổ Nutrien Agar 15ml vào mỗi hộp

5. Ủ 35oC trong 24 – 48 giờ, lật úp đĩa lại
6. Đếm những đĩa có số khuẩn lậc 30-300, lấy trung bình cộng của 2 đĩa nhân với nồng
độ pha loãng.