Báo Cáo Staphylococcus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐH KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM

KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

SEMINAR
STAPHYLOCOCCUS AUREUS VÀ
NHỮNG ĐIỀU CẦN BIẾT
VỀ CHÚNG
GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT

NHÓM SVTH: 1. NGUYỄN THỊ AN
2. NGUYỄN THỊ KIM HOÀNG
3. PHẠM THỊ THÙY DƯƠNG
4. VÕ THỊ HUỲNH MAI
5. LÊ THỊ THU TRÚC
TP.HCM: 3/2011
PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC
PHẨM
MỤC LỤC:
Lời mở đầu:................................................................................................2
Chương I: Tổng quan về tác nhân gây ngộ độc.................
1.1. Lịch sử phát hiện...........................................................................................
1.2. Phân loại.......................................................................................................
1.2.1. Phân loại Staphylococcus theo khoa học....................................................
1.2.2. Phân loại theo coagulase............................................................................
1.2.2.1. Tụ cầu có men coagulase........................................................................
1.2.2.2. Tụ cầu không có men coagulase.............................................................
1.2.3. Phân loại Staphylococcus bằng kháng nguyên...........................................
1.2.4. Phân loại Staphylococcus bằng phage........................................................
1.3. Đặc điểm.......................................................................................................
1.3.1. Đặc điểm chung.........................................................................................
1.3.2. Đặc điểm sinh hóa......................................................................................
1.4. Yếu tố độc lực...............................................................................................
1.4.1. Các yếu tố độc lực bên ngoài.....................................................................
1.4.2. Các loại độc tố...........................................................................................
1.4.3. Hệ gen tụ cầu vàng.....................................................................................
1.4.4. Độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B..................................................
1.5. Cơ chế gây bệnh............................................................................................
1.5.1. Cơ chế gây độc của SEB............................................................................
1.5.2. Cơ chế gây bệnh.........................................................................................
1.6. Bệnh và các triệu chứng bệnh ......................................................................
1.6.1. Ngộ độc thực phẩm-dạ dày-ruột.................................................................
1.6.2. Viêm phổi..................................................................................................
1.6.3. Hội chứng shock do độc tố.........................................................................
1.6.4. Nhiễm trùng da và mô tế bào, áp-xe, viêm não, viêm tủy xương...............
2
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
1.7. Các biện pháp phòng và xử lý bệnh .............................................................

1.7.1. Phòng bệnh................................................................................................
1.7.2. Xử lý bệnh.................................................................................................
Chương II: Các phương pháp xác định.........................

2.1. Phương pháp truyền thống...........................................................................
2.1.1. Nguyên tắc.................................................................................................
2.1.2. Môi trường và thuốc thử............................................................................
2.1.3. Phương pháp..............................................................................................
2.1.3.1. Phân tích định tính Staphylococcus aureus.............................................
2.1.3.2. Định lượng Staphylococcus aureus
bằng phương pháp đếm khuẩn lạc........................................................................
2.1.3.3. Định lượng bằng phương pháp MPN......................................................
2.1.3.4. Quy trình định lượng Staphylococcus aureus trong thực phẩm...............
2.2. Phương pháp hiện đại....................................................................................
2.2.1. Phương pháp ELISA..................................................................................
2.2.1.1. Qui trình ELISA trực tiếp dùng để
xác định Staphylococcus Aureus...........................................................................
2.2.1.2. Xác định loài Staphylococcus và những độc tố Staphylococcal bằng ELISA có
trong kem lạnh và tiêu thụ pho mát trong
tỉnh Burdur, Turkey........................................................................................
2.2.2. Phương pháp PCR......................................................................................
2.2.3. Phương pháp RPLA (Reverse Passive Latex Agglutiation).......................
2.2.4. Phương pháp lai phân tử............................................................................
2.2.5. Dùng Bacteriophage để làm Kit thử nhanh MRSA....................................
Chương III: Kết luận và đề nghị....................................

Tài liệu tham khảo:..........................................................
3
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
LỜI MỞ ĐẦU
Với tình hình an toàn vệ sinh đang diễn ra hết sức phức tạp. Song song đó, vấn đề về
sức khỏe cũng là một vấn đề mang tính thời sự nóng hổi. Chính vì thế mà không ít người
đã đặt câu hỏi: “Liệu trong thời đại thị trường cạnh tranh khóc liệt như hiện nay thì các
doanh nghiệp có thực sự chú trọng đến sức khỏe người tiêu dùng không hay lợi nhuận sẽ
được đặt lên hàng đầu?”
Các vụ ngộ độc thực phẩm thì có rất nhiều nguyên nhân như do: hóa chất, bản chất
thực phẩm chứa sẵn một số chất độc,… Nhưng quan trọng hơn hết vẫn là từ vi sinh vật,
trong đó có Staphylococus aureus-một trong những nguyên nhân chính. Điều đáng lưu ý
và quan tâm ở đây là chủng này có khả năng tiết ra một số độc tố bền với nhiệt và khó bị
phân hủy ở nhiệt độ cao. Hơn nữa, chúng lại có khả năng kháng methiciline, penicilline
khi gặp điều kiện thuận lợi còn có thể lây lan và gây nên nhưng căn bệnh nguy hiểm.
Vì thế mà nhóm chúng tôi quyết định thực hiện đề tài: “Staphylococcus aureus và
những điều cần biết về chúng”.
Nhằm mục đích tìm hiểu nguồn gốc phát sinh, những tác hại mà Staphylococus aureus
gây ra cũng như các biện pháp phòng ngừa và chữa trị... Đặc biệt là tìm hiểu các phương
pháp phân tích để nhận biết và phát hiện chúng, đây đồng thời có thể xem là một biện
pháp hữu hiệu để kiểm tra độ an toàn của thực phẩm.
4
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ TÁC NHÂN GÂY ĐỘC.
1.1. Lịch sử phát hiện:

- Ngày 9 tháng 4 năm 1881, bác sĩ người
Scotland Alexander Ogston đã trình bày tại hội
nghị lần thứ 9 Hội phẫu thuật Đức một báo
cáo khoa học trong đó ông sử dụng khái niệm
tụ cầu khuẩn (Staphylococcus ), trình bày tương
đối đầy đủ vai trò của vi khuẩn này trong các
bệnh lý sinh mủ trong lâm sàng.
Staphy
lococcus dưới kính hiển vi.
- Staphylococcus aureus do Robert Koch (1843-1910) phát hiện vào năm 1878, phân
lập từ mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời kỳ đầu
của lịch sử ngành vi sinh vật (VSV) học.
- Năm 1926, Julius von Daranyi là người đầu tiên phát hiện mối tương quan giữa sự
hiện diện của hoạt động men coagulase huyết tương của vi khuẩn với khả năng gây bệnh
của nó. Tuy nhiên mãi đến năm 1948, phát hiện này mới được chấp nhận rộng rãi
1.2. Phân loại:
1.2.1. Phân loại Staphylococcus theo khoa học:
- Giới : Eubacteria .
- Ngành : Firmicutes .
- Lớp : Bacilli .
- Bộ : Bacillales .
- Họ : Staphylococcaceae .
- Giống : Staphylococcus .
- Loài : aureus.
5
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
- Tên khoa học : Staphylococcus aureus.

1.2.2. Phân loại Staphylococcus theo men Coagulase:
Trên phương diện gây bệnh thì tụ cầu khuẩn được chia làm hai nhóm chính: có men
Coalugase và không có men Coagulase.
1.2.2.1. Tụ cầu có men Coagulase:
Nhờ men coagulase này mà trên môi trường nuôi cấy có máu, vi khuẩn tạo nên các
khuẩn lạc màu vàng. Do vậy vi khuẩn này còn gọi là tụ cầu vàng. Các vi khuẩn quan
trọng của nhóm này là:
+ Staphylococcus aureus.
+Staphylococcua intermedius.
1.2.2.2. Tụ cầu không có men Coagulase:
- Do không có men coagulase nên trên môi trường nuôi cấy có máu, khuẩn lạc có màu
trắng ngà. Trên lâm sàng thường gọi các vi khuẩn này là tụ cầu trắng. Các vi khuẩn nhóm
này có thể kể:
+ Staphylococcus epidermidis.
+ Staphylococcus saprophyticus.
+ Staphylococcus haemolyticus.
+ Staphylococcus capitis.
+ Staphylococcus simulans.
+ Staphylococcus hominis.
+ Staphylococcus warneri.
- Cùng 16 chủng tụ cầu khuẩn khác không hiện diện ở người.
1.2.3. Phân loại Staphylococcus bằng kháng nguyên:
6
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
- Các tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên: protein, polysaccharid, acid teichoic của
vách tế bào vi khuẩn. Nhưng dựa vào kháng nguyên, việc định loại vi khuẩn rất khó khăn.
Các kháng nguyên trên bề mặt tế bào được quan tâm.
- Acid teichoic : là kháng nguyên ngưng kết chủ yếu của tụ cầu và làm tăng tác dụng
hoạt hóa bổ thể. Đây là chất bám dính của tụ cầu vào niêm mạc mũi. Acid này gắn
polysaccharid vách tụ cầu vàng. Đây là kháng nguyên O.
- Protein A : là những protein bao quanh bề mặt vách tụ cầu vàng và là một tiêu chuẩn
để xác định tụ cầu vàng. 100% các chủng tụ cầu vàng có protein này.
- Vỏ polysaccharid: một số ít chủng S. aureus có vỏ và có thể quan sát được bằng
phương pháp nhuộm vỏ.
- Lớp vỏ bao gồm nhiều tính đặc hiệu kháng nguyên và có thể chứng minh được bằng
phương pháp huyết thanh học. Vỏ của tụ cầu cũng có tác dụng chống thực bào bởi vỏ đã
che phủ peptidoglycan của vách, làm cho bổ thể này không có chỗ bám để hoạt hóa theo
con đường tắt.
1.2.4. Phân loại Staphylococcus bằng phage:
- Phân loại tụ cầu dựa trên phage (phage type): tụ cầu được phân vào các nhóm
I, II, III, IV. Đây là phương pháp sử dụng nhiều trong phân loại S. aureus.
- Nhóm 1 : 29, 52, 52A, 79,80.
- Nhóm 2: 3A, 3B, 3C, 55,77.
- Nhóm 3: 6, 7, 42E, 47,53, 54, 75, 77, 83A, 84, 85.
- Nhóm 4: 42D.
1.3. Đặc điểm:
1.3.1. Đặc điểm chung:
- Stahylococcus aureus phân bố rộng rãi trong tự nhiên có nhiều trong các thực phẩm
như: thịt, trứng, sữa... và trên da, tóc, lông của người và động vật.
- Bị lây nhiễm từ người chế biến, động vật bị nhiễm bệnh, được xếp vào nhóm vi
khuẩn cơ hội, vì có mặt rộng rãi và thường xuyên trong mô và chờ đợi điều kiện thuận lợi
để xâm nhập.
7
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
- Staphylococcus có nguồn từ tiếng Hy Lạp staphyle nghĩa là chùm nho là các cầu
khuẩn kị khí tuỳ ý. Vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh nha bào và thường
không có vỏ,có hình cầu, đường kính 0.8 - 1µm, hình thức tập hợp này do vi khuẩn phân
bào theo nhiều chiều trong không gian; trong bệnh phẩm vi khuẩn có thể đứng lẻ, từng
đôi hoặc đám nhỏ.
- Một số Staphylococcus được tìm thấy khắp nơi và có thể phân lập từ không khí, bụi,
thực phẩm, thường trú ở vùng da và niêm mạc của người.
- Giống Staphylococcus có hơn 20 loài khác nhau, trong đó có 3 loài tụ cầu có vai trò
trong y học:
+ Staphylococcus aureus ( S. aureus): Tụ cầu vàng, được xem là tụ cầu gây bệnh.
+ Staphylococcus epidermidis ( Tụ cầu da).
+ Staphylococcus saprophyticus.
1.3.2. Đặc điểm sinh hoá:
- Phát triển tốt ở môi trường tổng hợp, đặc biệt ở môi trường thạch máu hoặc huyết
thanh. Sinh beta hemolysis trong môi trường thạch máu.
- Phản ứng indol, NH3, thủy phân gelatine, đông huyết tương.
- Trên môi trường thạch khuẩn lạc có hình tròn trơn bóng, đục mờ.
- Trên môi trường lỏng tế bào ở dạng cặn, vòng nhãn mờ trong ống nghiệm ở bề mặt
môi trường.
- Tính chất nuôi cấy:
+ Vi khuẩn phát triển dễ dàng ở môi trường thông thường, không thể sinh trưởng ở
nhiệt độ thấp. Theo Mc Landsborough L. (2005), nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của S.
aureus là 18 – 400C, pH=7,2. Tuy nhiên mọc tốt nhất ở 250C, hiếu khí hay kỵ khí tuỳ ý. Ở
canh thang, sau 5 – 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ làm đục rõ. Ở môi trường đặc,
khuẩn lạc tròn lồi, bóng láng, óng ánh co thể có màu vàng đậm, màu vàng cam hoặc màu
trắng, tương đối lớn sau 24 giờ. Ngoài ra S. aureus có thể sinh trưởng được trên môi
trường có hoạt độ thấp hơn các loài vi khuẩn khác hoặc môi trường có nồng độ muối cao.
8
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
+ Khi phát hiện trong môi trường, tạo sắc tố vàng sau 1-2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ
phòng và đều tổng hợp enterotoxin ở nhiệt độ trên 150C, nhiều nhất là khi tăng trưởng ở
35-370C.
+ Những chủng khác nhau làm tan máu ở những mức độ khác nhau, ở thạch máu,
typ tan máu β thường được quan sát xung quanh khuẩn lạc.
S.aureus được xác định trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản ứng đông huyết
tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập. Sự hiện
diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát
nhiệt độ kém của quá trình chế biến nên thhường có mặt trong nhóm thực phẩm đã được
qua chế biến và nấu chín.
- Tính chất sinh hoá và đề kháng:
+ Tụ cầu vàng tương đối chịu nhiệt và thuốc sát khuẩn hơn những vi khuẩn khác,
chịu độ khô và có thể sống ở môi trường nồng độ NaCl cao (9%), nhiều chủng tụ cầu
vàng đề kháng với penicillin và các kháng sinh khác.
+ S. aureus có phản ứng DNase, Catalase (+) (chuyển hoá hydrogen peroxit thành
nước và oxygen, phosphase (+), có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose,
sucrose, desoxyribonuclease là enzyme phân giải DNA. Tất cả các dòng S. aureus đều
mẫn cảm với novobiocine.
+ Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất được men penicillinase ( beta –
lactamase). Men này phá huỷ vòng beta – lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh như
penicilline G, Ampicilline và Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng.
+ Ngoài ra, cầu khuẩn S. aureus không có khả năng tạo bào tử như vi khuẩn
Chlamydomonas perfringens, Chlamydomonas botulinum và Bacillus cereus cũng thường
được tìm thấy trong các thực phẩm nhiễm khuẩn.
- Cấu trúc kháng nguyên:
+ Các tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên: protein, polysaccharide, acid teichoic ở
vách tế bào.
9
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
+ Vách tế bào chứa kháng nguyên polysaccharide, kháng nguyên protein A ở bề

mặt. Người ta có thể căn cứ vào các kháng nguyên trên để chia tụ cầu thành nhóm, tuy
nhiên phản ứng huyết thanh không có giá trị trong chuẩn đoán vi khuẩn.
- Độc tố - Enzym:
+ Khả năng gây bệnh của tụ cầu vàng là do vi khuẩn phát triển nhanh và lan tràn
rộng rãi trong mô cũng như tạo thành nhiều độc tố và enzyme. Một số chủng thuộc loài S.
aureus có khả năng sinh tổng hợp enterotoxin khi chúng nhiễm vào thực phẩm
+ Độc tố: Hầu hết các dòng S. aureus có thể tổng hợp enterotoxin trong môi trường
có nhiệt độ trên 15oC hơn cả vi khuẩn. Độc tố ruột enterotoxin sản xuất bởi S. aureus là
một protein ổn định nhiệt,nhiều nhất khi tăng trưởng ở nhiệt độ 35 – 370C và có thể tồn tại
nhiệt ở 100 °C trong vòng 30 – 700 phút.
+ Các enzyme ngoại bào:
 Protease phân giải protein của tế bào chủ.
 Lipase phân giải lipid.
 Deoxyribonuclease ( DNase) phân giải DNA và các enzyme sửa đổi acid
béo (FAME).
1.4. Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus:
1.4.1. Các yếu tố độc lực bên ngoài:
- Laminin và fibronectin tạo thành mạng lưới dày đặc trên bề mặt biểu mô và nội mạc
của tế bào kí chủ.
- Fibrin được tạo từ tiền chất thúc đẩy quá trình đông máu và tổn thương mô.
- Adhesion tương tác với collagen giúp vi khuẩn bám lên tế bào mô bị hư hỏng, được
tìm thấy ở các chủng gây bệnh viêm xương tủy và viêm khớp.
- Vỏ polysaccharide: một số chủng S. aureus có thể tạo vỏ polysaccharide . Vỏ này
cùng với protein A có chức năng bảo vệ vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào.
- Thành vi khuẩn có techoic acid (TE), lypoteichoic acid (LTA), peptidoglycan
(PGN), protein A. Gần đây một số nghiên cứu cho thấy màng S. aureus có thành phần
diacullipoprotein (DLP) cũng đóng vai trò quan trọng để kích hoạt các miễn dịch tại chỗ
10
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
và hệ thống. S. aureus còn có các protein giúp cho việc gắn vào da dễ dàng. Đó là các
Clumping protein, Pindin protein.
- Sự kháng kháng sinh của S. aureus là một đặc điểm rất đáng chú ý. Đa số S. aureus
kháng lại peniciline G kháng lại do vi khuẩn này sản xuất được men peniciline A nhờ gen
của R.plasmid. Một số còn lại kháng lại được methycilin gọi là methycilin resistance S.
aureus (MRSA), do nó tạo ra được các protein gắn vào các vị trí tác động của kháng sinh.
Hiện nay, một số rất ít S. aureus còn đề kháng được với Cephulosporin các thế hệ. Kháng
sinh còn dùng trong các trường hợp này là vancomycin.
1.4.2. Các loại độc tố:
- Hemolysis: gồm 4 loại (alpha, beta, gamma, delta), mang bản chất protein gây tan
máu beta, tác động khác nhau lên các hồng cầu khác nhau. Có khả năng sinh kháng, gây
hoại tử da tại chổ và giết chết súc vật thí nghiệm.
+ Alpha-hemolysis: làm hư hỏng màng tế bào mạnh nhất, có khả năng ức chế thẩm
thấu của màng, liên kết với các tế bào nhạy cảm như tiểu cầu, bạch cầu có khả năng phân
hủy hồng cầu tổn thương hồng cầu. Alpha-hemolysin tiết ra sẽ gắn vào màng của tế bào
nhạy cảm, sự gắn kết đó tạo thành một màng đầy nước tạo điều kiện thấm nước không
kiểm soát được các ion và các phân tử hữu cơ nhỏ. Khi các phân tử quan trọng đi qua như
ATP, ion thì không thể đảo ngược thẩm thấu dẫn đến phá vỡ thành tế bào gây ra cái chết
cho tế bào chủ.
+ Beta-hemolysis: là một trong những exotoxins được sản xuất bởi hầu hết các
chủng S.aureus, là protein có khả năng gây thoái hóa sphingomyelin gây ngộ độc cho
nhiều tế bào kể cả hồng cầu người.
+ Delta-hemolysis: là một peptide rất nhỏ sản xuất bởi hầu hết các chủng S.aureus,
là một protein hoạt động bề mặt và có thể dễ dàng chèn thêm chính nó vào cấu trúc màng
kỵ nước và các kênh ion.
+ Gamma-hemolysis: nhạy cảm với các loại hồng cầu của thỏ, cừu, người, chuột,
bò, ngựa. Gây ra hoại tử nhẹ ở da thỏ, chuột, có thể gây chết thỏ.
- Độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc TSST ( toxic shack syndrome toxin): thường
gặp ở những phụ nữ có kinh dùng bông băng dày, bẩn hoặc những người nhiễm trùng vết
11
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
thương. Khó phân biệt độc tố này với enterotoxin F. TSST kích thích giải phóng TNF
(Tumor neerosis factor, yếu tố hoại tử u) và các interleukin I,II. Cơ chế gây sốc của nó
giống như độc tố ruột.
- Độc tố exfoliatin hay epidermolitic: Là các men phá hủy thượng bì. Men này gây tổn
thương da tạo các bọng nước, Gây hội chứng phồng rộp và chốc lở da ở trẻ em. 85% các
chủng S.aureus thuộc loại phage nhóm II tạo độc tố này. Nó gồm 2 loại A và B, đều là
polypeptide, loại A bền với nhiệt độ 1000C/20 phút, còn loại B thì không. Kháng thể đặc
hiệu có tác dụng trung hòa độc tố này.
- Alpha toxin: bản chất là protein gây tan các bạch cầu đa nhân và tiểu cầu, từ đó gây
ra ổ áp xe, hoại tử da và tan máu. Độc tố có tính kháng nguyên nhưng kháng thể của nó
không có tác dụng chống nhiễm khuẩn.
- Độc tố bạch cầu (Leucocidin): là nhân tố giết chết bạch cầu của nhiều loại động vật,
bản chất là protein, không chịu nhiệt. Tụ cầu gây bệnh có thể bị thực bào như tụ cầu
không gây bệnh nhưng lại có khả năng phát triển bên trong bạch cầu. Gồm hai mảnh F và
S có thể tách rời nhau, trọng lượng phân tử là 32000, 38000 Dalton. Nếu hai mảnh này
tách rời nhau thì chúng sẽ mất khả năng gây độc. Chúng gây ra nhiễm trùng da và hoại tử.
- Ngoại độc tố sinh mủ (pyrogenic): độc tố này tương tự như độc tố sinh mủ của liên
cầu. Protein ngoại độc tố này có tác dụng sinh mủ và phân bào lymphocyte, đồng thời nó
làm tăng nhạy cảm với nội độc tố như gây shock, hoại tử gan và cơ tim. Gồm 3 loại ký
hiệu A, B, C. Ba loại này khác nhau về trọng lượng phân tử và về tính đặc hiệu kháng
nguyên, giống nhau về khả năng sinh mủ và phân bào.
- Dung huyết tố (hemolycin staphylolycin): phá hồng cầu (tan máu) và gây chết các tế
bào hạt cũng như đại thực bào.
- Fribrinolysin (enzyme Staphylokinase): Nhiều chủng của S.aureus thể hiện một hoạt
hóa plasminogen gọi là staphylokinase. Nó làm phá hủy fibrin. Là một enzyme đặc trưng
cho các chủng gây bệnh ở người trong các cục máu và gây vỡ các cục máu này tạo nên tắc
mạch. Cơ chế này giống với Steptokinase, được sử dụng trong y học để điều trị bệnh nhân
bị huyết khối động mạch vành.
12
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
- Coagulase: làm đông huyết tương người và thỏ, chống đông với citrate natri và
oxalate natri. Coagulase làm dính tơ huyết vào bề mặt vi khuẩn và do đó cản trở sự thực
bào. Men này gắn với prothrombin trong huyết tương và hoạt hóa quá trình sinh fibrin từ
tiền chất fibrinogen. Enzyme này cùng với yếu tố kết cụm và một enzyme vách vi khuẩn
giúp S. aureus tạo kết tủa fibrin trên bề mặt của nó.
- Hyaluronidase: men này có khả phá hủy chất cơ bản của tổ chức, giúp vi khuẩn có
thể phát tán trong tổ chức. Thủy phân axit hyaluronic của mô liên kết.
- Beta- lactamase: men này phá hủy vòng beta lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng
sinh như penicilline G, Ampicilline và Uredopenicilline làm cho các kháng sinh này mất
tác dụng.
- Độc tố ruột (enterotoxin): Trong đó có SEB (Staphylococcal enterotoxin B ). Do một
số chủng tụ cầu vàng tạo thành, đặc biệt lúc phát triển ở nồng độ CO2 lớn (30%) và môi
trường đặc vừa. Đây là những loại protein tương đối chịu nhiệt không bị phân hủy bởi sự
đun nấu. Nó đề kháng với sự đun sôi trong 30 phút cũng như tác động của enzyme ở ruột.
Các độc tố ruột này gây nhiễm khuẩn thức ăn và viêm ruột cấp. Bao gồm 6 loại được ký
hiệu từ A-F. Về mặt miễn dịch 6 loại này được phân biệt rõ ràng mặc dù chúng có kháng
nguyên chéo về cơ chế gây bệnh, kích thích tạo ra một lượng lớn interleukin I và II.
1.4.3. Hệ gen tụ cầu vàng S.aureus:
Hiện nay người ta đã thành công trong việc giải trình tự gen của tụ cầu vàng được kí
hiệu: Newman, COL, UMRSA 252, MW2, MSSA476, N315, Mn50, RF122. Steven và
cộng sự đã thành công trong việc giải trình tự gen dài 2809422 bp của chủng S.aureus
COL. Kết quả giải trình tự đã được ghi nhận trên Genbank với mã số CP000046.1 cho hệ
gen nhân và CP000045 cho hệ gen plasmid. Trình tự gen của tụ cầu vàng có chứa ít nhất
các cặp G-C, điều này gây ra mối nguy hại về việc chuyển gen từ chủng tụ cầu vàng sang
các tác nhân gây bệnh Gram dương khác. Các chủng S.aureus được phân lập từ các chủng
thực phẩm tỷ lệ enterotoxigenic được ước tính khoảng 25%. Tại Pháp trong số 61 chủng
phân lập từ phomat và sữa tươi có 15,9 % chủng là giống enterotoxigenic. Trong 332
chủng S.aureus phân lập từ nhiều loại thức ăn có 57% chủng chứa gen SEG, SEH, SEI,
SEJ.
13
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
1.4.4. Độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B:

- Được sản xuất phần lớn bởi các chủng S.aureus. Các độc tố này là những protein
tương đối bền với nhiệt, không bị phá hủy khi đun nấu, có trọng lượng phân tử 28000-
30000 Da gồm 6 loại được kí hiệu A, B, C, D, E, F. Năm 2008 tìm ra được hai loại độc tố
mới là SES và SET cũng nằm trong nhóm độc tố ruột do S.aureus sinh ra.
- Cấu trúc phân tử của Staphylococcal enterotoxin B (SEB):
SEB là một trong các ngoại độc tố được sinh ra bởi vi khuẩn S.aureus. Thông thường
không bị lây nhiễm vào cơ thể, SEB sẽ tác động chủ yếu lên các hệ vận chuyển ion và
nước của ruột, do đó được gọi là enterotoxin.
+ SEB được hình thành khi S.aureus sống trong điều kiện khắc nghiệt như: nhiệt
độ môi trường gia tăng đột ngột, thiếu oxy, sự mất cân bằng trong áp suất thẩm thấu.
+ Đóng vai trò là một trong những nội độc tố quyết định của vi khuẩn S.aureus nên
SEB được nghiên cứu khá chi tiết. Trình tự a.a của SEB được xác định từ năm 1970.
Giống như các cấu trúc protein ngoại bào khác của S.aureus thường được tìm thấy trong
môi trường nuôi cấy hay trong thực phẩm bị ô nhiễm, protein SEB bao gồm một trình tự
tính hiệu gồm 27 a.a ở đầu N’. Đoạn trình tự tín hiệu này có chức năng “dẫn” SEB ra
ngoài môi trường nuôi cấy, sau đó trình tự này sẽ bị cắt bởi protease ở vị trí nhất định.
SEB dạng hoạt động trong môi trường ngoài tế bào gồm 239 a.a rong một chuổi
polypeptide đơn có khối lượng phân tử khoảng 28,336 KDa. Ở dạng hoạt động protein
SEB có cấu gồm: 7 cấu trúc xoắn anpha và 14 phiến gấp nếp beta và một cầu nối disuifide
nối cystein ở vị trí 120 và 140. SEB có khả năng chống lại sự tác động của protease trysin
và chymotrysin và papain có trong ruột.
- Năm 1986, Christopher và cộng sự đã xác định thành công trình tự SEB của chủng
S.aureus S6. Trình tự của một gen hoàn thiện được tính từ codon mở đầu ATG ở vị trí
nucleotide 244, sau đó là vùng khung đọc mở gồm 798 nucleotide và kết thúc tại codon
TGA tại vị trí nucleotide 1042.
1.5. Cơ chế gây bệnh:
1.5.1. Cơ chế gây độc của SEB:
14
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
- SEB là trung gian kích thích các lympho T ở hệ miễn dịch của các vật chủ các độc tố
liên kết trực tiếp đến phức hợp protein (MHC) lớp II trên bề mặt tế bào đích sao đó kích
thích gia tăng số lượng lớn các lympho T. SEB được xem là một siêu kháng nguyên của
vi khuẩn vì có thể tạo thành một cầu nối giữa MHC lớp II của các tế bào trình diện kháng
nguyên và vùng Vbeta của các thụ thể tế bào T như: CD4, CD7. Từ đó kích thích hoạt hóa
các tế bào T biểu hiện các đoạn gen Vbeta mà không cần thiết phải có một quá trình chế
biến và trình diện thông thường.
- Điều này gây ra sự sản sinh một số lượng lớn của cytokine và interleukin (IL-2), các
yếu tố hoại tử khối u beta (TNF-beta) và các interferon. Nếu ăn thực phẩm có SEB bệnh
nhân có các triệu chứng như: chán ăn, buồn nôn, tiêu chảy… Các triệu chứng này xuất
hiện là do các cytokine trong các tế bào T của lông ruột được sinh ra ồ ạt.
- SEB dễ hòa tan trong nước, tính chất hóa học tương đối ổn định, chịu được các tác
động cơ học vừa phải, chịu được nhiệt độ sôi.
1.5.2. Cơ chế gây bệnh:

- Bước quan trọng đầu tiên trong quá trình tương tác giữa tác nhân gây bệnh và vật
chủ là sự bám dính của tác nhân gây bệnh vào các bề mặt của vật chủ các bề mặt này bao
gồm:
+ Da, niêm mạc: Khoang miệng, mũi hầu, đường tiết niệu.
+ Các tổ chức sâu hơn: Tổ chức lympho, biểu mô dạ dày ruột, bề mặt phế nang, tổ
chức nội mô.
- S.aureus bám dính vào bề mặt vật chủ nhờ các adhensin có bản chất polypeptide.
- Tác nhân gây bệnh như S.aureus mới có khả năng khởi động các quá trình sinh hóa
đặc hiệu như: tăng sinh, bài tiết đôc tố, xâm nhập và hoạt hóa các chuỗi tín hiệu tế bào vật
chủ.
15
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
- S.aureus xâm nhập ngoại bào bằng cách tiết một số enzyme như: hyaluronidase,
hemolysin, leukocidin… phá hủy các thành phần tế bào vật chủ.
- Hầu hết các chủng S. aureus đều có khả năng tổng hợp một loại protein bề mặt
(protein A) có khả năng gắn với mảnh Fc của các globuline miễn dịch. Chính nhờ hiên
tượng gắn độc này mà số lượng mảnh Fc giảm xuống. Vì mảnh Fc của các globuline miễn
dịch có vai trò quan trọng trong hiện tượng opsonin hóa, chúng là các receptor cho các đại
thực bào. Qúa trình gắn trên giúp S. aureus tránh không bị đại thực bào. Ngoài ra, phần
lớn các chủng S. aureus một chất kết dính gian bào. Nhờ chất này vi khuẩn tạo được một
lớp màng sinh học bao phủ chính nó và vi khuẩn có thể phát triển trong lớp màng nhầy
niêm mạc.
- Ước tính khoảng 0,1µg S.aureus đã đủ gây ngộ độc thực phẩm ở người.
1.6. Bệnh và các triệu chứng bệnh:
- S.aureus có mặt ở khắp nơi trong thiên nhiên như: không khí, nước, da, họng, mũi,
tóc hay lông của các loài động vật máu nóng…và chỉ gây độc khi hình thành độc tố ruột
(Enterotoxin). Những trường hợp nhiễm độc đầu tiên do ăn bánh kẹo gây ra bởi tụ cầu
vàng đã được nói đến từ những năm 1901-1914. Ở Việt Nam cũng như trên khắp thế giới,
ngộ độc thực phẩm xảy ra thường xuyên.
- Khả năng gây độc chỉ xảy ra khi ăn thức ăn cùng độc tố của vi khuẩn. Còn nếu chỉ ăn
vi khuẩn thì không gây ra ngộ độc. Điều đó chứng tỏ, ngộ độc là do độc tố của vi khuẩn
được sản xuất ra trong môi trường thức ăn với sự hoạt động của vi khuẩn, độc tố ruột là
một loại độc tố mạnh.
- S.aureus là tác nhân gây nhiều bệnh nhiễm trùng như: mụn nhọt, chốc lở, viêm da,
viêm phổi, viêm não, viêm tủy sương, viêm cơ tim, viêm màng trong tim, viêm màng
ngoài tim, viêm màng não, áp-xe trong cơ, đường tiết niệu, hệ thần kinh trung ương,
nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng vết thương hậu phẩu.
1.6.1. Ngộ độc thực phẩm-viêm dạ dày, ruột:
- Ngộ độc thực phẩm là một căn bệnh của ruột, ngộ độc thực phẩm có thể do ăn uống
phải độc tố ruột của S.aureus cư trú trong đường ruột chiếm ưu thế về số lượng. Nguyên
nhân là do ăn thức ăn bị nhiễm độc tố (105 vi khuẩn/g thức ăn) hoặc do vi khuẩn tăng
16
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
sinh trong đường ruột (có đến 2-30% số người mang vi khuẩn này trong ruột. S.aureus có
thể nhiễm từ môi trường hoặc từ người chế biến sẽ sinh sôi rất nhanh trong thức ăn có
hàm lượng dinh dưỡng thích hợp (thường gặp nhất là các loại thực phẩm giàu protein
như: thịt bò muối, đùi lợn muối, xúc xích, kem, sốt, pho mát) và sinh ra độc tố đường
ruột, gây ngộ độc. Khả năng trúng độc của cơ thể phụ thuộc vào loại độc tố, số lượng độc
tố, khả năng đề kháng của cơ thể.
- Triệu chứng: các triệu chứng thường xảy ra 2-4 h sau khi ăn thực phẩm nhiễm độc.
Triệu chứng ban đầu là sự tiết nước bọt, buồn nôn, nôn mửa và đi ngoài dữ dội, phân có
lẫn nước, đau bụng, co rút vùng bụng, tiêu chảy. Triệu chứng thứ cấp là đổ nhiều mồ hôi,
ớn lạnh, đau đầu, mất nước.
1.6.2. Viêm phổi:

- S.aureus thể xâm nhập vào nhu mô phổi qua hai đường: hít vào đường hô hấp trên
hoặc lây lan qua đường máu. Thường sau khi mắc bệnh cúm hoặc ở người suy giảm miễn
dịch, tụ cầu vàng theo dịch tiết đường hô hấp trên bị hít vào phổi. Tuy đây là bệnh ít gặp
nhưng đó lại là bệnh nhiễm khuẩn nghiêm trọng. Vi khuẩn tạo vỏ bọc dễ xâm nhập vào
máu gây nhiễm khuẩn huyết. Viêm phổi thường gồm nhiều ổ, tâm ổ viêm là phế quản
hoặc tiểu phế quản viêm hoại tử, xuất huyết. Các ổ viêm này vỡ ra tạo ra các ổ áp-xe. Ở
những ca nặng, thành phế nang thường bị phá hủy, không khí vào phế nang bị phá hủy
nhưng không thoát ra được, tạo ra các túi khí thành mỏng. Các yếu tố gây nguy cơ mắc
bệnh là điều kiện sống kém, sử dụng kháng sinh bừa bãi, bệnh nhân nằm viện lâu ngày
làm giảm sức đề kháng của cơ thể tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn dễ dàng xâm nhập
vào đường hô hấp, đồng thời làm giảm chức năng miễn dịch của cơ thể.
17
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
- Triệu chứng: phổ biến là sốt cao, mạch nhanh, thở nhanh, ho, ít gặp ho ra máu. Có
thể suy hô hấp, sốc nhiễm khuẩn, nhiễm độc hệ thống, khó thở, hoại tử và hình thành ổ
áp-xe. Hai biến chứng hay gặp nhất là tràn dịch màng phổi và mủ màng phổi.
1.6.3. Hội chứng shock do độc tố:
- Là căn bệnh gây ra bởi độc tố TSST-1 được tiết ra bởi vi khuẩn S.aureus phát triển
trong điều kiện có ít hoặc không có oxy. Bệnh thường gặp ở những phụ nữ trong kỳ kinh
nguyệt có dùng băng thấm hút mạnh, các bông này có khả năng gắn các magnesium do đó
làm giảm lượng ion này trong âm đạo. Khoảng 20% phụ nữ có mang tụ cầu ở đường âm
đạo. Do lượng ion magnesium giảm xuống, vi khuẩn này tăng cường sản xuất các ngoại
độc tố gây sốc.
- Hội chứng Thukydides là thể đặc biệt của hội chứng sốc nhiễm độc. Hội chứng này
có thể gặp ở thanh thiếu niên cả hai giới, thường gặp do bội nhiễm tụ cầu sau khi bị cúm.
Tỷ lệ tử vong của hội chứng này khá cao trên 50%. Biểu hiện lâm sàng về mặt hô hấp và
tiêu hóa rất giống với bệnh dịch hạch do Thurykodides mô tả ở Athen và năm 430 trước
công nguyên.
- Triệu chứng: đột ngột sốt cao, cảm giác mệt mỏi, tiêu chảy toàn nước, nhức đầu, đau
cơ, nổi bang ngoài da, có một vài dấu hiệu của sốc, nôn mửa, hạ huyết áp. Có thể có phát
ban như bị cháy nắng, lột da, vết đỏ đặc hiệu ngoài từng đám hay lan toàn thân nhanh, có
thể có biểu hiện xung huyết, kết mạc, họng đỏ, phù ngoại biên. Thay đổi các chỉ số cận
lâm sàng như: urê máu tăng, albumin máu giảm, calcim máu hạ, hạ phosphate máu, tăng
creatin phosphakinase, giảm tiểu cầu. Gây ra các rối loạn chức năng thận và cơ tim, quá
tải dịch, suy hô hấp ở người lớn. Sau khoảng 1 tuần bệnh nhân bị tróc da vùng thân mình
và tứ chi. Di chứng muộn gồm hoại thư ngoại biên, mất móng có thể phục hồi yếu cơ suy
nhược, kéo dài và rối loạn tâm thần kinh. Nếu bệnh nặng có thể tử vong ở tỷ lệ khá cao.
1.6.4. Nhiễm trùng da và mô tế bào, áp-xe, viêm não, viêm tủy xương:
- S.aureus từ lâu đã được công nhận là một trong những vi khuẩn quan trọng nhất gây
bệnh ở người. Nó là nguyên nhân hàng đầu của nhiễm trùng da và mô mềm, nó cũng có
thể gây nhiễm trùng nghiêm trọng như nhiễm trùng xương khớp, viêm thần kinh…
18
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
- Nhiễm trùng da và mô tế bào, áp-xe: những bệnh nhiễm trùng da và các phần phụ
chủ yếu là các chân lông và tuyến mồ hôi tạo thành bệnh cảnh áp-xe kinh điển của tụ cầu
vàng. Nó tạo fibrin bao bọc ổ áp xe. Các ổ nhiễm trùng này có thể chỉ nhỏ như đầu đinh
nếu viêm nang lông và kích thước như quả táo như áp-xe cơ. Mủ của ổ áp-xe do tụ cầu
vàng thường có màu vàng, đặc và không hôi.
+ Triệu chứng: trên da hình thành những khu vực thường là màu đỏ, đau và xưng
lên, chứa đầy mủ, xung quanh khu vực bị áp xe có thể cảm thấy ấm khi chạm vào.
+ Đối với mô tế bào thì sự nhiễm trùng là ở các lớp cơ bản dưới da, cũng bị sưng
đỏ và đau, nổi mụn nhọt và lây nhiễm.
+ Vi khuẩn có thể xâm nhập vào từ những vết cắt, vết cạo hoặc những thương tích
nhỏ, có thể xảy ra bất cứ nơi nào trên cơ thể nhưng thường xảy ra trên hai tay và hai chân.
- Viêm não, viêm tủy xương:
+ Nhiễm trùng các cơ quan bên trong cơ thể có thể do đường nội sinh: từ một ổ
nhiễm ngoại vi, vi khuẩn theo đường máu và bạch huyết đến các cơ quan khác. Chúng đi
vào cơ thể qua các vết rách trên da sau chấn thương hoặc trong quá trình phẩu thuật.
+ Triệu chứng: não sau viêm nội tâm mạc, chóng mặt, viêm màng não mủ, tràn mủ
dưới màng cứng, viêm tắc tĩnh mạch, viêm xoang, viêm xoang chũm, yếu tay, chân, thay
đổi thị giác. Gây sốt tỷ viêm mãn, viêm khớp nhiễm trùng, thường gặp ở khớp gối, hông
và khớp cùng chậu, gây viêm mũi cơ.
1.7. Phòng và xử lý bệnh:
1.7.1. Phòng bệnh:
- Ở những vùng có điều kiện vệ sinh cá nhân kém, nơi đông dân cư, đặc biệt là thiếu
nước sạch trong sinh hoạt, thời tiết nóng ẩm là điều kiện thuận lợi cho bệnh phát sinh
mạnh.
- Phòng bệnh tụ cầu khuẩn cũng như các bệnh nhiễm khuẩn khác thì yếu tố vệ sinh cá
nhân là điều quan trọng, rửa tay sạch trước khi ăn và sau khi đi vệ sinh là yêu cầu cơ bản
để phòng bệnh, ăn uống hợp vệ sinh, nấu kỹ trước khi dùng, giữ gìn sạch sẽ những vết
trầy xước trên da. Những bệnh nhân tai biến mạch máu não nằm liệt giường có thể dẫn
19
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
đến xuất hiện những vết loét cần phải chăm sóc hổ trợ vận động như xoa bóp mạch máu
lưu thông, còn đối với bệnh nhân đái tháo đường cần giữ gìn bàn chân trách bị phòng loét.
- Các biện pháp như mang mũ hoặc khăn trùm đầu, mang khẩu trang và rửa tay
thường xuyên là biện pháp phòng chóng lây truyền hữu hiệu trong bệnh viện.
- Những người làm việc trong các bếp ăn tập thể hoặc trong các xưởng chế biến thực
phẩm cũng cần thực hiện các biện pháp phòng hộ trên.
- Đối với thực phẩm thì nên bảo quản cẩn thận, không để lẫn đồ ăn sống lẫn với đồ ăn
chín. Nếu nghi ngờ thực phẩm đã bị nhiễm khuẩn thì nên loại bỏ.
- Khám sức khỏe định kỳ cho công nhân làm việc trực tiếp với thực phẩm, chú ý khám
tai, mũi, họng.
- Không để những người bị viêm xoang, viêm mũi họng, có mụn mủ ở tay tham gia
chế biến thực phẩm.
- Dùng kẹp khi phục vụ thức ăn.
- Tăng cường uống vitamin, năng cao sức khỏe, rửa tay bằng nước nóng và xà phòng,
hạ pH thực phẩm để ức chế vi khuẩn phát triển.
1.7.2. Xử lý bệnh:
- Đối với những tổn thương khu trú trên da thì không cần phải đều trị kháng sinh trừ
khi nhiễm khuẩn lan rộng hoặc có biến chứng. Tại chổ mưng mủ cần làm sạch da tại chổ
bằng dung dịch sát khuẩn, dùng kháng sinh trực tiếp bôi ngoài da. Các loại áp-xe cần rạch
mủ và kết hợp dùng kháng sinh đường uống hoặc tiêm. Những loại nhiễm khuẩn xương,
não thì cần dùng các loại kháng sinh đặc hiệu và khi điều trị thì phải theo dõi chặt chẽ
nhất là đối với những người cao tuổi người bị xơ vữa động mạch hay đáy tháo đường.
- Cần sử dụng những loại kháng sinh phù hợp cho từng bệnh nhân. Thường dùng
gamma globuline để điều trị bệnh. Mặc dù S.aureus có thể sản xuất được men
penicillinase phá hủy vòng beta-lactamase làm bất hoạt các loại kháng sinh như
penicilline G, Ampicilline... Nhưng hiện nay trong điều trị nhiễm trùng S.aureus người ta
vẫn sử dụng peniclline và cephalosporine kháng với beta-lactamase.
- Nafcilline và Oxacilline là hai loại peniclline được dùng bằng đường tiêm. Nếu
nhiễm trùng nặng thì nên sử dụng cephalosporine thế hệ thứ nhất như cephazoline.
20
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
- Nếu bệnh nhân không dung nạp với kháng sinh nhóm beta-lactamase thì nên thay
bằng vancomycine và clidamycine bằng đường tiêm. Dicloxaciline và cephalexine là
kháng sinh dạng uống.
- Dùng gamma-globuline chống tụ cầu.
CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH.

2.1. Các phương pháp truyền thống:
2.1.1. Nguyên tắc:
S.aureus được xác định dựa trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản ứng huyết
tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập.
2.1.2. Môi trường và thuốc thử:
- Môi trường canh Mannitol Salt Broth (MSB): môi trường này được dùng để định
tính S.aureus hay cũng có thể dùng trong định lượng bằng phương pháp Most Probable
Number (MPN).
- Môi trường thạch Mannitol muối – Mannitol Salt Agar (M35): Nếu không sử dụng
môi trường thạch Baird – Parker, ta có thể sử dụng môi trường thạch Mannitol muối.
Thành phần chính của môi trường này gồm có peptone, chất chiết từ thịt bò, Mannitol,
NaCl và Phenol đỏ. Nồng độ muối trong môi trường khá cao (7,5%) sẽ ức chế sự sinh
trưởng của nhiều loài vi sinh vật.
- Mannitol là nguồn Carbonhydrate duy nhất để vi khuẩn lên men. Trên môi trường
thạch Mannitol muối, S. aureus cho khuẩn lạc màu vàng, còn S. epidermidis (không lên
men Mannitol) sẽ cho khuẩn lạc màu đỏ.
- Môi trường thạch máu: máu được sử dụng là máu cừu hay máu bê non dưới 5 tháng
tuổi đã được loại bỏ các sợi máu hay máu đã được bổ sung chất chống đông citrate. Môi
trường cần được pha trước 2 ngày trước khi sử dụng để kiểm tra khả năng bị nhiễm.
- Môi trường thạch Braid Parker Agar (BPA): là môi trường chọn lọc thường sử dụng
để phát hiện S.aureus. Môi trường có chứa pepton và chất chiết thịt bò là những thành
21
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
phần dinh dưỡng cơ bản. Glycine và sodium pyruvate có chức năng kích thích sự sinh
trưởng của vi khuẩn. Lithium chloride và potassium tellurite được sử dụng để ức chế vi
khuẩn Gram âm và làm chậm sự sinh trưởng của vi khuẩn Gram dương khác. Lòng đỏ
trứng được cho vào môi trường để phát hiện khả năng sinh tổng hợp lycithinase của
S.aureus.
- Lưu ý: lòng đỏ trứng và potassium tellurite chỉ được bổ sung vào môi trường sau khi
đã khử trùng và làm nguội đến khoảng 60oC. Tụ cầu sinh tổng hợp coagulase trên môi
trường này sẽ có màu đen. Sự sinh tổng hợp lecithinase của vi khuẩn sẽ tạo nên vòng sáng
xung quanh các khuẩn lạc.
- Môi trường dịch thể tim óc-Braid heart infusion broth (M36): thành phần cơ bản của
môi trường gồm óc bê, tim bò, peptone, glucose và muối NaCl. Đây là môi trường giàu
dinh dưỡng được sử dụng để thúc đẩy sự sinh trưởng của nhóm vi sinh vật có nhu cầu về
dinh dưỡng.
- Huyết thanh thỏ có bổ sung ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA): được sử dụng
để kiểm tra hoạt tính coagulase của vi khuẩn. Huyết thanh thường được cung cấp ở dạng
đông khô. EDTA có chức năng như một tác nhân chống đông tụ. Quá trình hoàn nguyên
huyết thanh được thực hiện theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
2.1.3. Phương pháp:
2.1.3.1. Phân tích định tính S.aureus:
- Cấy 2ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 8ml môi trường MBS, trộn đều và ủ ở
nhiệt độ 37oC trong 24 giờ.
- Dùng que cấy vòng, cấy ria dịch mẫu từ ống dương tính (môi trường chuyển từ đỏ
sang vàng) lên môi trường phân lập là thạch TGA hay thạch Baird Perker, ủ ở 37oC trong
24 giờ.
- Tìm khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên môi trường phân lập tròn, lồi, có tâm đen,
trong suốt, đường kính 1-1.5mm, có vòng sáng chung quanh khuẩn lạc.
- Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy vào ống môi trường BHI, ủ 37oC 24 giờ.
- Cấy vào ống nghiệm nhỏ chứa khoảng 0.3ml huyết tương và ủ ở 37oC trong 24 giờ
để thử phản ứng đông kết.
22
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
- Thực hiện song song một ống đối chứng không được cấy dịch vi sinh vật. Mẫu được
kết luận là có S.aureus khi thử nghiệm coagulase này dương tính (nghĩa là có sự xuất hiện
của khối đông trong khi ống đối chứng thì không có).
2.1.3.2. Định lượng S.aureus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc:
a./ Đồng nhất mẫu pha loãng:
Cân chính xác 10 ± 0.1g mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 90ml dung dịch pha loãng,
đồng nhất bằng máy dập mẫu 30s. Chuẩn bị dãy pha loãng thập phân thích hợp tùy theo
mức nhiễm của từng loại mẫu sao cho khi cấy một thể tích xác định lên đĩa thạch Baird
Parker sẽ xuất hiện khoảng 10 – 100 khuẩn lạc / đĩa.
b./ Phân lập trên môi trường chọn lọc:
- Cấy 0,1 ml mẫu nguyên hoặc đã pha loãng vào đĩa môi trường thạch Baird Parker.
Dùng que cấy tam giác thủy tinh ( thanh gạt thủy tinh) trải đều mẫu lên bề mặt môi trường
cho đến khi khô. Thực hiện lập lại 3 đĩa môi trường thạch Baird Parker cho mỗi loại pha
loãng. Thực hiện tương tự với môi trường thạch máu. Lật ngược đĩa, ủ ở 37 ± 1 0C trong
24 – 48 giờ đối với môi trường Baird Parker và 24 giờ đối với môi trường thạch máu.
- Sau 24 giờ, khuẩn lạc S. aureus trên môi trường thạch Baird Parker có đường kính
0,5 – 1 mm, lồi , đen bóng, có vòng sáng rộng khoảng 1 – 2mm bao quanh.
- Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc có đặc điểm như trên và tiếp tục ủ 48
giờ. Sau 48 giờ khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 1 – 1,5mm, có màu đen bóng,
lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 – 4mm quanh khuẩn lạc. Khuẩn
lạc một số dòng S. Aureus có thể không tạo các vòng sáng quanh khuẩn lạc như trên. Cần
đến và đánh dấu cả hai loại khuẩn lạc.
- Trên môi trường thạch máu sau 24 giờ ủ S.aureus cho khuẩn lạc bóng loáng, đục,
lồi, có màu xám hay vàng nhạt, đường kính khoảng 1 – 2µm. Hầu hết S. Aureus có vùng
tan máu, tuy nhiên một số dòng không tạo vùng tan máu này.
c./ Khẳng định:
- Dùng que cấy vòng cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng từ môi
trường Baird Parker lên môi trường thạch TSA, ủ ở 37 ± 10C trong 24 giờ.
23
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
- Cấy sinh khối vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống nghiệm chứa huyết tương đã
rã đông, ủ ở 37 ± 10C. Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau các khoảng thời
gian 2,4,6,8 và 24 giờ. Tính tỉ lệ khẳng định dựa trên số khuẩn lạc đặc trưng và không đặc
trưng. Thực hiện tương tự với các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch máu. Kết
quả thử nghiệm là (+) khi có khối đông huyết tương hình thành (mọi mức độ đông kết đều
được xem là (+)). Kết quả là (-) khi không có hình thành khối đông, hỗn dịch vẫn đồng
nhất như ống không cấy.
d./ Cách tính kết quả:
- Mật độ S.Aureus trong mẫu được tính như sau :
Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) = 10.(NtHt + NaHa)/( F1+F2)
- Trong đó:
+ F: là độ pha loãng
+ Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng
+ Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng
+ Ht: tỷ số giữa số khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với
khuẩn lạc đặc trưng
+ Ha: tỷ số giữa số khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so
với số khuẩn lạc không đặc trưng.
2.1.3.3. Định lượng S.aureus bằng phương pháp MPN:
- Phương pháp này được dùng để định lượng S.aureus trong mẫu có mật độ S.aureus
thấp nhưng mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao, khó có thể xác định bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc. Dung dịch mẫu được pha loãng thập phân với 3 độ pha loãng thập phân liên
tiếp (ví dụ: 10-1,10-2,10-3,…). Tùy theo yêu cầu về độ chính xác của kết quả phân tích, có
thể sử dụng phương pháp MPN với hệ thống 9 ống nghiệm (3 độ pha loãng với 3 lần lặp
lại ở mỗi độ pha loãng) hay hệ thống 15 ống nghiệm (3 độ pha loãng với 5 lần lặp lại ở
mỗi độ pha loãng).
- Môi trường được sử dụng là canh MSB hay Tryptose Soy Broth chứa 10% muối
NaCl. Cấy 1ml dịch mẫu có độ pha loãng khác nhau vào ống 10ml môi trường, ủ ở 37 oC
trong 48 giờ. Chọn các ống (+), có vi sinh vật phát triển làm đục môi trường để tiến hành
24
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
phân lập khuẩn lạc đơn trên môi trường thạch Baird Parker, ủ 37oC trong 48 giờ. Chọn
các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường Baird Parker để thực hiện thử nghiệm khẳng định
S.aureus tương tự trường hợp phương pháp đếm khuẩn lạc. Các đĩa cho kết quả khẳng
định S.aureus (+) được đối chiếu với các ống nghiệm trong hệ thống các dãy ống nghiệm
ban đầu và ghi lại số ống nghiệm (+) ứng với mỗi độ pha loãng. Tra bảng MPN để suy ra
mật độ S.aureus trong mẫu (số MPN/g hay MPN/ml).
Quy trình định lượng S.aureus.
Đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu thành các dãy nồng độ
thập phân 10-1,10-2,10-3…
Chuyển 1ml dung dịch 10-1,10-2,10-3 …

vào ống 10ml canh MSB ,mỗi nồng độ 3
ống lặp lại, ủ ở 37oC, 48 giờ.
Chọn ống (+) đục ở mỗi độ pha

) loãng.
Trãi lên đĩa thạch BPA, ủ ở 37oC, 24-48 giờ, trải trên đĩa
Ria lên đĩa thạch BPA, ủ 37oC,
thạch máu, ủ 37oC, 24 giờ.
48 giờ.
Chọn khuẩn lạc đặc trưng. Đếm số khuẩn lạc đặc trưng Đếm số khuẩn lạc không đặc
trưng.
Cấy vào TSA, ủ 37±1oC, 24 giờ.

Lấy 5 khuẩn lạc đặc trưng Lấy 5 khuẩn lạc khôngđặc trưng
cấy vào TSA, ủ ở 37±1oC, cấy vào TSA, ủ ở 37±1oC, 24
Thử nghiệm ngưng kết 24 giờ. giờ
coagulase.
Thử nghiệm ngưng kết coagulase.
Ghi nhận số coagulase (+) ở mỗi
độ pha loãng
Tỷ lệ khuẩn Tỷ lệ khuẩn lạc không đặc

25lạc đặc trưng,
coagulase (+) trưng, coagulase (+)
NHÓM 2_ 08DSH4
Mật độ S.aureus(CFU/g hoặc CFU/ml)
PHẨM
Tra bảng MPN
Mật độ S.aureus (MPN/g hoặc

MPN/ml)
BẢNG TRA MPN DÙNG CHO LOẠT 3 ỐNG NGHIỆM Ở 3 NỒNG ĐỘ PHA
LOÃNG LIÊN TIẾP.
Số lượng ống dương Số lượng ống dương

tính tính Số
Số ml mẫu sử dụng Số MPN/100ml Số ml mẫu sử dụng
MPN/100ml
10 1 0.1 10 1 0.1
0 0 0 - 2 1 0 9
0 0 1 3 2 0 1 14
0 0 2 6 2 0 2 20
0 0 3 9 2 0 3 26
0 1 0 3 2 0 0 15
0 1 1 6 2 1 1 20
0 1 2 9 2 1 2 27
0 1 3 12 2 1 3 34
0 2 0 6 2 1 0 21
0 2 1 9 2 2 1 28
0 2 2 12 2 2 2 35
0 2 3 16 2 2 3 42
0 3 0 9 2 2 0 29
0 3 1 13 2 3 1 36
0 3 2 16 2 3 2 44
0 3 3 19 2 3 3 53
1 0 0 4 3 3 0 23
1 0 1 7 3 0 1 39
1 0 2 11 3 0 2 64
1 0 3 15 3 0 3 95
26
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
1 1 0 7 3 0 0 43
1 1 1 11 3 1 1 75
1 1 2 15 3 1 2 120
1 1 3 19 3 1 3 160
1 2 0 11 3 1 0 93
1 2 1 15 3 2 1 150
1 2 2 20 3 2 2 210
1 2 3 24 3 2 3 290
1 3 0 16 3 2 0 240
1 3 1 20 3 3 1 460
1 3 2 24 3 3 2 1100
1 3 3 29 3 3 3 -
BẢNG TRA DÙNG CHO LOẠT 5 ỐNG NGHIỆM Ở 3 NỒNG ĐỘ PHA LOÃNG
LIÊN TIẾP.
Số lượng ống dương Số Số lượng ống dương tính Số

tính MPN/100ml MPN/100
Số ml mẫu sử dụng Số ml mẫu sử dụng
ml
10 1 0.1 10 1 0.1
0 0 0 0 4 0 2 20
0 0 1 2 4 0 3 25
0 0 2 4 4 1 0 17
0 1 0 2 4 1 1 20
0 1 1 4 4 1 2 25
0 1 2 6 4 2 0 20
0 2 0 4 4 2 1 25
0 2 1 6 4 2 2 30
0 3 0 6 4 3 0 25
1 0 0 2 4 3 1 35
1 0 1 4 4 3 2 40
1 0 2 6 4 4 0 35
1 0 3 8 4 4 1 40
1 1 0 4 4 4 2 45
1 1 1 6 4 5 0 40
1 1 2 8 4 5 1 50
1 2 0 6 4 5 2 55
27
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
1 2 1 8 5 0 0 25
1 2 2 10 5 0 1 30
1 3 0 8 5 0 2 45
1 3 1 10 5 0 3 60
1 4 0 11 5 0 4 75
2 0 0 5 5 1 0 35
2 0 1 7 5 1 1 45
2 0 2 9 5 1 2 65
2 0 3 12 5 1 3 85
2 1 0 7 5 1 4 115
2 1 1 9 5 2 0 50
2 1 2 12 5 2 1 70
2 2 0 9 5 2 2 95
2 2 1 12 5 2 3 120
2 2 2 14 5 2 4 150
2 3 0 12 5 2 5 175
2 3 1 14 5 3 0 80
2 4 0 15 5 3 1 110
3 0 0 8 5 3 2 140
3 0 1 11 5 3 3 175
3 0 2 3 5 3 4 200
3 1 0 11 5 3 5 250
3 1 1 14 5 4 0 130
3 1 2 17 5 4 1 170
3 1 3 20 5 4 2 225
3 2 0 14 5 4 3 275
3 2 1 17 5 4 4 350
3 2 2 20 5 4 5 425
3 3 0 17 5 5 0 250
3 3 1 20 5 5 1 350
3 4 0 20 5 5 2 550
3 4 1 25 5 5 3 900
3 5 0 25 5 5 4 1600
4 0 0 13 5 5 5 1800
4 0 1 17 - - - -
2.1.3.4. Quy trình định lượng S.aureus trong thực phẩm:

- Đặc điểm quan trọng nhất của S.aureus được các nhà khoa học sử dụng để phân biệt
với các Staphylococci khác là khả năng sinh tổng hợp coagulase va khả năng sử dụng
Mannitol.
28
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
- Một số chủng thuộc loài S.aureus có khả năng sinh tổng hợp độc tố ruột enterotoxin
khi chúng nhiễm vào thực phẩm. Tuy nhiên số lượng tế bào vi khuẩn phải đủ lớn (không
thấp hơn 106 CFU/g) thì mới đủ sinh ra một lượng toxin gây ngộ độc cho người sử dụng.
Do đó việc định lượng S.aureus trong thực phẩm là rất cần thiết để dự đoán khả năng gây
ngộ độc của sản phẩm và đánh giá tổng quát mức độ an toàn vệ sinh thực phẩm.
Quy trình định lượng S.aureus trong thực phẩm.
Chuẩn bị mẫu
Cấy mẫu lên môi trường thạch Baird

Parker hoặc môi trường Mannitol
muối và ủ
Kiểm tra
Coagulase
Quan sát và chọn khuẩn lạc.
Kiểm tra
Tính chất
Tính toán kết quả. sinh hóa
Khả29
năng lên Tính mẫn cảm Khả năng sinh
NHÓM 2_ 08DSH4 men glucose với tổng hợp
và mannitol lysostaphin thermonucleas
se
PHẨM
2.2. Phương pháp hiện đại:

2.2.1. Phương pháp ELISA (enzyme – linked immunosorbent assay):
 Phương pháp Elisa: (Enzyme – Linked ImmunoSorbent Assay ) là 1 kỹ thuật sinh
hóa để phát hiện kháng thể (KT) hay kháng nguyên (KN) trong mẫu xét nghiệm. Hiện
nay, Elisa được sử dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp đặc biệt
là trong kiểm tra an toàn trong các sản phẩm sinh học.
 Có 2 loại phương pháp Elisa:
+ Phương pháp Elisa trực tiếp (direct Elisa): dùng để phát hiện kháng nguyên trong
mẫu xét nghiệm.
+ Phương pháp Elisa gián tiếp (indirect Elisa): dùng dể phát hiện kháng thể chuyên
biệt trong huyết thanh.
 Ưu điểm: Phương pháp này được sử dung cho các loại kháng nguyên với độ nhạy
và độ đặc hiệu cao, có thể phát hiện được phức hợp nhỏ KN-KT, cho phép phát hiện sớm
tác nhân gây bệnh ở giai đoạn sớm khi mầm bệnh mới xâm nhiễm.
+ Nhanh, thao tác đơn giản.
30
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
+ Ít tốn sinh phẩm, hóa chất, số lượng mẫu lớn, rất thích hợp với việc phân tích đối
với nguyên liệu thô.
 Nhược điểm: Độ chính xác không cao.
 Nguỵên tắc kỹ thuật Elisa:
Sử dụng KT đơn dòng (Mabs) phủ bề mặt những đĩa giếng và sẽ được phát hiện
bằng cách sử dụng các kháng thể thứ cấp như: horeseradich perosidase hay alkaline
phosphatase). Nếu có sự hiện diện của KN trong mẫu, KN sẽ tạo phức hợp với KT cố
định trên giếng và KT tự do có gắn enzyme tạo thành một phức hợp kép (sandwich). Khi
bổ sung cơ chất đặc hiệu của enzyme vào giếng, enzyme xúc tác phản ứng thuỷ phân cơ
chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng.
Khi bổ sung các cơ chất đặc hiệu của enzyme vào giếng, enzyme sẽ xúc tác phản
ứng thuỷ phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng. Bằng cách theo dõi
sự đổi màu có thể phát hiện sự hiện diện của KN. Cần tăng sinh chọn lọc trước khi thực
hiện phản ứng. Kỹ thuật này có độ nhạy phát hiện khoảng 106CFU/ml.
2.2.1.1. Qui trình ELISA trực tiếp dùng để xác định Staphylococcus Aureus:
Phương pháp trực tiếp Elisa đã được chứng minh là rất phổ biến để chuẩn đoán các
bệnh truyền nhiễm nhất như: ở người viêm gan siêu vi, HIV … và ở động vật như: viêm
vú, nhiễm khuẩn xuất huyết…(Nickerson và các cộng sự, 1989. Rehmant et al, 2002).
 Vật liệu và phương pháp:
+ Chuẩn bị các KN: S. aureus được nuôi cấy trên môi trường Staph.110 ủ ở 370C
trong 24h. Thu chủng vi khuẩn với nước muối đệm phosphate (pH 6.8) có chứa formalin
0.3% và đun nóng ở 1000C trong 1h (Heddleston et al, 1972; Zia và cộng sự, 2000).
+ Sản xuất KT: ba con thỏ được tiêm dịch huyền phù nói trên ở dưới da với lượng
0.5;1;1.5 và 2ml khoảng 4 ngày. Sau 7 ngày tiếp tục tiêm 1ml S.aureus được nuôi cấy
trong môi trường canh thịt vào thỏ. Sau đó 14 ngày tiêm môi trường giống như trên, thu
nhận máu và huyết thanh khi giết thỏ (Relman và cộng sự, 2002).
+ Tinh chế và ước lượng Protein: KT thỏ được phân lập và tinh khiết một phần
thông qua phương pháp kết tủa ammonium sulfate (Hudson và Hay, 1980) và hàm lượng
31
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
protein đã được ước tinh bằng phương pháp Biuret sau khi tiêu bản theo đường chuẩn của
huyết thanh bò albumin (Zia và cộng sự, 2001).
+ Sự tiếp hợp: Enzyme peroxidase từ đậu tương (10mg) đã được tiếp hợp với một
phần KT tinh khiết của thỏ, sử dụng bước hai trong phương pháp glutaradehyde (Zia và
cộng sự, 2000).
+ Lớp vỏ KT: 100µl KT thỏ (pha loãng 1/10 trong dung dịch đệm phủ) được đổ
vào từng giếng, polystyrene, tấm microtitration gồm 96 giếng ủ ở 4 0C trong 24h. Sau đó,
tấm được rửa năm lần với đệm rửa. Các tấm được giữ cố định bởi 100µl PSB đổ vào từng
giếng và ủ ở 370C trong 24h. Sau khi ủ, tấm đã được rửa sạch bằng đệm rửa (Horadagoda
et al, 1993).
Đĩa nhựa có 96 giếng dùng

trong kỹ thuật ELISA
( http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Microtiter_plate.JPG)
32
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
Các loại đĩa plasmid tiến hành xét nghiệm Elisa.

 Elisa trực tiếp:
+ Elisa trực tiếp được thực hiện để phát hiện KT tiếp hợp enzyme. Các tiếp hợp
enzyme này pha loãng trong PBS là 1:100; 1:200; 1:400 và 1: 800. 100µl PBS được thêm
vào mỗi giếng. Huyết thanh thỏ được pha loãng trong PBS ở tỷ lệ 1:10. + Đó
là 2 lần tuần tự pha loãng từ 2 lên đến 11 giếng, như 100µl được thêm vào. Giếng 12 được
sử dụng để kiểm soát. Các đĩa được ủ ở 370C trong 2h. Sau đó rửa lại 5 lần bằng dung
dịch rửa. Tiếp tục pha loãng 100µl ở mỗi hàng, đầu tiên pha loãng A+B, thứ 2 là pha
loãng C+D, thứ 3 là pha loãng E+F, thứ 4 là Pha loãng G+H trên tấm microtitration. Ủ ở
370 C trong 2h. Sau khi ủ rửa lại 5 lần bằng dung dịch rữa. Sau đó thêm 100µl guaiaclo
(guaicol + H2O2) và ủ ở 370C trong 20 phút. Tiếp tục thêm 50µl H2SO4 1M (thuốc dừng)
vào mỗi giếng. O.D đã được ghi lại ngay lập tức trong cùng vi đĩa đọc Elisa, đọc ở bước
sóng 450nm (Kemney và Challacombe, 1989).
+ Phân tích thống kê: các dữ liệu được phân tích qua Duncan’s Multiple Range
(DMR) kiểm tra hoàn toàn theo thiết kế ngẫu nhiên (CRD) (Steel và Torrie,1984).
 Kết quả và thảo luận:
+ Các xét nghiệm huyết thanh khác nhau đã được sử dụng cho các KN phát hiện
như là thử nghiệm nhanh chóng làm ngưng kết, thử nghiệm agar gel phát hiện, nhưng tốt
nhất là phương pháp ELISA để phát hiện KN. Nề tảng của phương pháp ELISA là dựa
33
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
trên sự thay đổi màu sắc, có lợi thế hơn các xét nghiệm khác như ngưng kết, huỳnh quang
hoặc phóng xạ trong phản ứng KN-KT có thể được đo đều đặn khách quan trong sắc độ
kế đơn giản. Ngoài ra, sử dụng các tấm microtitre ELISA cho phép một số lượng lớn phản
ứng để được đọc trong thời gian ngắn (Dawkins et al,1990).
+ Có nhiều enzyme khác nhau được sử dụng trong phương pháp ELISA nhưng
peroxidase được ưu tiên hơn những loại khác bởi sự tinh khiết, hoạt tính đặc hiệu, nhạy
cảm của chất nền thăm dò, dễ tiếp hợp, tính hiệu quả khi tiếp hợp và sự ổn định về sự tiếp
hợp (Kemeny và Challacombe, 1989). Peroxidase là một chất oxy hóa sinh học quan
trọng và phổ biến trong các vật liệu từ thực vật. Trong thực vật thì nó có mặt trong cà
chua (Zia et al,2001), cải ngựa, đậu tương (Ambreen et al, 2001), khoai tây, củ cải, cà rốt,
lúa mì, lê, chuối (Reed và cộng sự, 1975).
+ Peroxidase được chiết xuất từ đậu tương do tính hoạt động cao và dễ dàng tìm,
kiếm. Hoạt động của peroxidase thô đã được chứng tỏ 146.12U/ml. Đậu tương là một
nguồn phong phú của peroxidase được báo cáo bởi Ambreen et al, 2000. Sau đó
peroxidase một phần được tinh khiết bằng cách sử dụng phương pháp làm kết tủa
ammonium sulfate. Kỹ thuật này sử dụng vì nó phổ biến nhất, sử dụng thuốc thử có muối
trong các protein, độ hòa tan cao và độ phân giải ion cao (Voet et al, 1999). KT được sản
xuất bằng cách tiêm các KN S. aureus vào thỏ và sử dụng phương pháp kết tủa
ammonium (Hudson và Hay, 1980). Lượng protein đã được ước tính bằng cách sử dụng
phương pháp biuret cũng như phương pháp U.V. và kết quả của hai phương pháp đã được
ghi trong bảng .
Bảng : Dự đoán protein của mẫu thỏ:
Sample Biuret Method (mg/ml) UV Method (mg/ml)
A 1.6 1.544
B 1.024 0.917
C 1.0791 0.932
+ Có nhiều phương pháp khác nhau để tiếp hợp giống như phương pháp
meleimide, phương pháp oxy hóa preiodate, bước một của phương pháp glutaraldehyde
và bước hai của phương pháp glutaraldehyde nhưng bước hai được ưa chuộng hơn các
phương pháp khác vì kết quả của việc tiếp hợp áp dụng hai phương pháp glutaraldehyde,
34
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
cho kết quả đáng tin cậy và hiệu quả hơn (Baker, 1989). Kháng thể được kết hợp với
10mg của peroxidase và sự kết hợp đã được thử nghiệm thông qua ELISA trực tiếp. Các
kết quả chỉ ra rằng trong pha loãng 1:100 của OD mẫu A dao động từ 1,18-0,972. Trong
1:200 OD pha loãng trong khoảng 0,97-0,93. Trong 1:400 giá trị OD dao động 0,714-
0,72. Trong 1:800 giá trị pha loãng được hấp thụ là 0,5-0,6.
+ Trong trường hợp mẫu B, pha loãng ở 1:100 OD từ 1,406-1,205 trong khi pha
loãng ở 1:200 OD dao động từ 1,185-1,103. Trong 1:400 OD dao động từ 0,714-0,72.
Trong 1:800 giá trị pha loãng được hấp thụ từ 0,99-0,93.
Mẫu C, tỷ lệ 1:100 OD pha loãng từ 1,74-1,61. Trong pha lõang 1:200 OD từ 1,36-1,23.
+ Trong 1:400 OD từ 1,21-1,40. Trong 1:800 giá trị pha loãng hấp thụ là 1,26-
1,39.
Có một sự giảm đáng kể của mẫu về giá trị OD ở độ pha loãng 1:100 so với dung dịch
pha loãng 1:200, 1:400 và 1:800 là pha loãng 1:100 cho kết quả tốt nhất.
+ Kết luận và kiến nghị: 1:100 là tôt nhất cho ELISA trực tiếp chống lại S.aureus.
Kết luận tương tự đã được rút ra khi thống kê phân tích thông qua thử nghiệm DRM theo
thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên.
2.2.1.2. Xác định loài Staphylococcus và những độc tố Staphylococcal
enterotoxins bằng ELISA có trong kem lạnh và tiêu thụ pho mát trong tỉnh
Burdur, Turkey:
 Vật liệu và phương pháp:
+ Mẫu: Trong nghiên cứu này, 50 mẫu kem và 50 mẫu pho mát trắng ( mỗi mẫu
250g) được lấy từ Burdur, Turkey. Kem và pho mát thường được nông dân sản xuất với
phương pháp truyền thống và công khai bán ở chợ. Tất cả các mẫu được thu thập trong
các túi nhựa vô trùng và vận chuyển đến phòng thí nghiệm.
+ Đếm tổng vi khuẩn hiếu khí mesophilic bacteria: Tổng vi khuẩn hiếu khí
(TAMB) được xác định bằng phương pháp thông thường (Maturin và Peeler, 1998). Mỗi
mẫu 10g huyền phù trong 90ml nước môi trường peptone vô trùng ( 0.85% NaCl 0.1%
peptone) và nhỏ 0.05ml ở các độ pha loãng 10-1- 10-6 vào đĩa thạch ( Merck, Darmstadt,
Germany). Sau 48 ± 2h ủ ở 30±10C, CFU, tính cho mỗi gram mẫu.
35
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
+ Đếm Staphylococcus spp. và S. Aureus: 10g mẫu được pha loãng với 90ml nước
môi trường peptone vô trùng và đồng nhất trong máy đồng nhất mẫu (Masticator, IUL
Instruments – Spain). Pha loãng dung dịch mẫu 10-1- 10-6 lấy 0.1ml ở mỗi độ pha loãng,
câý trang trên bề mặt thạch Baird – Parker (BD, Becton Dickinson, công ty Pháp), có
thêm lòng đỏ trứng. Ủ các đĩa thạch này ở 370 C trong 24-48h. Các khuẩn lạc được phân
lập đặc trưng là S.aureus (có tâm đen, trơn nhẵn, lồi, mép rìa tròn, mờ đục và có vòng
sáng xung quanh), (Bennet và Lancette, 1998). Mười khuẩn lạc được tuyển chọn từ mỗi
mẫu và chuyển đến từng ống nghiệm chứa môi trường TSB agar (như dung dịch gốc).
Một loạt các thử nghiệm sau đó gồm : nhuộm Gram, catalase, coagulase, lên men kỵ khí
của glucose và manitol, phân hủy đĩa thạch máu, sản xuất acetoin, methyl bred, vosges-
proskauer, urase test, DNase, TNase (Bennet và Lancette, 1998).
 Phát hiện độc tố Staphylococcal enterotoxins :
+ Sự có mặt của Staphylococcal enterotoxins (A, B,C, D, E) được xác định bởi
phương pháp Sanwich ELISA với bộ kit enterotoxins staphylococcal (RIDASCREEN ®
set A, B, C, D, E ; R-Biopharm AG, Darmstadt, Đức).
Trong thực phẩm các độc tố này được xác địnhgần như chính xác với bộ kit từ 0,2-
0,7ppb.
+ Nền tảng của sự nhạy cảm của RIDASCREEN ® set A, B, C, D, E dựa trên thí
nghiệm di truyền miễn dịch ở giới hạn 0,1mg/ml. Kết quả và các bước thử nghiệm được
hướng dẫn phía sau lời hướng dẫn của bộ kit của nhà sản xuất.
+ Cho 15ml đệm PSB (pH7.4) được cho vào 10g mẫu, lắc trong 15 phút để hòa lẫn
chúng với nhau. Sau khi lắc đem ly tâm 3500 vòng/10 phút ở 150C.
+ Thu dịch nổi bằng màng lọc (0,2µm), (SM 16534, Sartorius, Minisart), để loại
những mảnh vụn của thực phẩm ra. Sau đó cho 100µl dịch lọc vào các giếng từ A-G (từ
giếng A-E được phủ với kháng thể đặc hiệu chống lại Staphylococcal enterotoxins, giếng
từ F-G được kiểm tra và phủ với kháng thể không miễn dịch của động vật).100µl mẫu đối
chứng dương tính được đưa vào giếng H. Sự hiện diện của độc tố bị giữ lại bởi các KT
đặc hiệu. Đĩa được lắc bằng tay một cách nhẹ nhàng và giữ ở nhiệt độ phòng trong 1h.
Sau đó các giếng được rửa lại 3 lần, mỗi lần với 250µl đệm rửa cho mỗi giếng. Thêm
36
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
100 µl enzyme liên kết vào các giếng rồi lắc nhẹ nhàng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1h. Rồi
rửa l lại 3 lần với 250 µl đệm rửa. Thêm 50 µl chất nền và 50 µl chất tạo màu vào. Hòa
trộn các đĩa nhẹ nhàng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Cuối cùng thêm 50 µl thuốc
dừng vào mỗi giếng rồi lắc nhẹ nhàng. Sử dụng máy đo mật độ quang ở bước sóng 450nm
với vi đĩa đọc ( ELX 800, Universal Microplate Reader, BIO – TEK).
 Phân tích thống kê:
Kết quả phân tích sử dụng phần mềm thống kê Minitab 15 ( Minitab version
15.1.0.0,2006) với các mô tả thống kê.
 Kết quả :
+ Sự có mặt của các VSV được phân lập từ các mẫu pho mát và kem (log 10cuf/g)
được cho trong bảng 1 và 2.
Bảng 1 : The bacteria isolated from cheese samples. Number of bacteria (log 10
cfu/g).
Bacteria N n % Min Max Median SE
Total aerobic 50 50 100 6.30 10.8 8.21 0.19
mesophilic bacteria
Micrococcus/ 50 28 56 2.48 8.7 6.21 0.30
Staphylococcus( CPS
và CNS)
S.aureus 50 18 36 3.11 8.18 5.80 0.37
CPS: Coagulase Positive Staphylococcus; CNS: Coagulase negative Staphylococcus; N:
Number of cheese samples; n:Number of positive
cheese samples; SE: Standart error.
Bảng 2: The bacteria isolated from ice cream samples. Number of bacteria (log 10
cfu/g).
37
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
Bacteria N n % Min Max Median SE

Total aerobic 50 48 96 2.30 7.64 4.29 0.12
mesophilic
bacteria
Micrococcus/ 50 19 38 2.0 3.78 3.02 0.12
Staphylococcus(
CPS và CNS)
S.aureus 50 7 14 1.30 5.50 3.0 0.50
CPS: Coagulase Positive Staphylococcus; CNS: Coagulase negative Staphylococcus; N:
Number of ice cream samples; n:Number of positive ice
cream Samples; SE: Standart error.
+ Kiểm tra 50 mẫu pho mát có 3 mẫu (6%) được xác định là có độc tố
Staphylococcal enterotoxins. Sự phân loại S. aureus và sự sản sinh enterotoxin của nó
được phân lập từ các mẫu phop mát được cho trong bảng 3
Bảng 3: The count and enterotoxin type of S. aureus isolated from cheese samples.
No. of cheese samples Count of S. aureus (cfu/g) Type of Staphylococcal
enterotoxin
28 2.6x105 B
32 5.5x107 C
48 8.0x105 E
+ Tuy nhiên không có mẫu kem nào phát hiện có Staphylococcal enterotoxins.
38
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
39
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
2.2.2. Phương pháp PCR:

- PCR là phương pháp dùng enzyme khuếch đại chọn lọc một đoạn DNA theo luật số
mũ. Phản ứng được thực hiện với enzyme DNA chịu nhiệt, hai mồi tổng hợp và 4 loại
deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Mỗi chu kỳ phản ứng gồm 3 chu kỳ:
+ Biến tính DNA có tác dụng tách 2 sợi đơn từ sợi khuôn khép, nhiệt độ biến tính
khoảng 950 C trong 30-60 giây.
+ Bắt cặp hai mồi và hai sợi đơn của khuôn, nhiệt độ khoảng 40-700 C, kéo dài 30-
60 giây.
+ Bước tổng hợp, kéo dài chuỗi nhiệt độ 720 C giúp cho enzyme DNA polymerase
hoạt động tổng hợp tốt nhất.
- Ưu điểm của phương pháp này là:
+ Thời gian cho kết quả nhanh.
+ Có thể phát hiện được những vi sinh vật khó nuôi cấy.
+ Ít tốn kém về mặt nhân sự.
+ Hóa chất dễ tìm kiếm và tồn trữ.
- Khuyết điểm:
+ Tất cả các tế bào chết và tế bào sống đều cho kết quả dương tính trong kỷ thuật
PCR.
40
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
+ Mật độ vi sinh vật hiện diện trong mẫu thường thấp, nên cần phải có thêm bước
nuôi cấy để có mật độ đủ để phát hiện bằng PCR.
- Ứng dụng:
+ Dòng hóa các gene hay một đoạn gene, đoạn RNA.
+ Tạo đột biến.
+ Định lượng những khác biệt trong thể gene RT-PCR.
+ Điều tra hình sự.
+ Kiểm tra chất lượng, sự lẫn tạp sinh học.
Bảng: Hỗn hợp một phản ứng PCR (Bùi Đức Trí 2006).
Hóa chất Thể tích Nồng độ

10xPCR buffer 5µl 1X
10xdNTPs (2nM) 5µl 200µM
Primer xuôi (10pmol s/µl 5µl 1µM (50pmol s/50µl)
Primer ngược (10pmol 5µl 1µM (50pmol s/50µl)
s/µl)
Mẫu DNA 2µl 1µM
Tap DNA polymerase 0.5µl 1µg
(2U/µl)
H2 O 27.5µl 1unit
- Một vài nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện gene độc lực của S.aureus.
+ Ở Akineden, 2001 đã dùng kỹ thuật PCR khuếch đại phát hiện gene độc lực của
S.aureus trong sữa bò có độc tố ruột A (SEA), SEC, SED, SEG, SEI, SẸ, TSST-1 nhưng
không thấy SEB, SEE, SHE và có cả sự hiện diện của hai độc tố màng ngoài là ETA và
ETB.
+ Abdulmula E1-Ghodban, 2005 đã khảo xác 63 dòng S.aureus (40 từ nguồn bệnh
sốc độc tố và 23 nguồn từ thức ăn) tìm độc tố TSST-1 bằng PCR. Chỉ có 3 dòng được
phát hiện có sự hiện diện của TSST-1.
41
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
+ L.Chapaval, 2006 khảo xác 132 dòng vi khuẩn được phân lập từ sữa nguyên kem
có sự hiện diện của độc tố ruột và TSST-1.
 Phương pháp PCR xác định coaguase của S.aureus trong sữa.
- Vật liệu:
+ 628 mẫu sữa được lấy từ các trang trại nuôi bò ở Murrah. Vi khuẩn kiểm tra: lấy
10 µl sữa từ mỗi mẫu rồi cấy ria 5% đĩa thạch máu cừu và cấy trên đĩa thạch lactose của
Mac Conkey sau đó ủ trong 24 giờ ở 370C
+ Theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc : Gram dương, catalase dương tính, oxidase
âm tính → xác định là Staphylococcus. ssp. Tụ cầu phân lập được tiếp tục phân loại
coalugase (+) và (-) bằng thử nghiệm Citrate trên môi trường huyết tương thỏ (Gibbs và
Skinner, 1966). Lấy mẫu coalugase (+) tiếp tục xác định đặc điểm sinh hóa theo thử
nghiệm enzyme chịu nhiệt (Faruki và Mumbai, 1986). Sau đó kiểm tra bằng ngưng kết
Latex (Staph Latex Test Kit, Himedia , Mumbai) và lên men Mannitol.
+ DNA lấy trực tiếp từ sữa bằng phương pháp Phuektes (2001). Lấy 1,5 ml sữa li
tâm với 600 ml đệm NTE. Vorter mẫu và ổn định dịch bằng 100 µl (24% sodium dodecyl
sulphate) và giữ trong bể nước (800C, trong 10´). Sau đó cho thêm 12µl protein asek
(20mg/ml, Fermentas, USA) và ủ tiếp trong bể nước (560C, 2h)
- Hút 100µl NaCl 5M và 80µl CTAB-NaCl cho thêm vào ủ (560C, 10´). Sau đó cho
thêm PCI (phenol chloroform isoamyl alcohol) và CI (chloroform isoamyl alcohol) cho
đến khi mẫu được làm sạch.
- Thu nhận kết quả ở 1/10 thể tích sodium acetate 3M (pH=5.2) và thêm 2 thể tích
ethanol 100% lạnh vào, giữ ở -200C để kết tủa DNA. Sau đó li tâm 15000 vòng/15´ ở 40C
để tách ethanol và thu DNA, sau đó rửa DNA 2 lần bằng ethanol 70%, cuối cùng làm khô.
- Sau đó, DNA được hòa tan trong 50µl đệm TE và giữ ở -200C đến khi sử dụng tiếp.
- Tách DNA từ vi khuẩn nuôi cấy:
+ DNA được tách ra từ những vi khuẩn đã được phân lập trước đó. Những dòng
khuẩn lạc riêng rẻ được để qua đêm trong 25µl dung dịch đệm TE và đun sôi đến 990C
trong 15´ sau đó làm lạnh nhanh bằng cách đặt trên băng.
42
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
+ Các mẫu kết quả DNA thu được, được bảo quản ở -200C và 5µl của mỗi mẫu
được sử dụng để phân tích PCR.
- Phản ứng PCR thực hiện với MgCl2, Tap DNA polymerase, mồi. Cặp mồi:
F: ACCACAAGGTACTGAATCAACG
R: TGCTTTCGATTGTTCGATGC
(Aarestrupetal., 1995)
- Phản ứng PCR của Martineau et.al (1998): Sử dụng cặp mồi
F: AATCTTTGTCGGTACACGATATTCTTCACG.
R: CGTAATGAGATTTCAGTAGATAATACAACA.
- PCR được thực hiện trong bể luân nhiệt. DNA phân lập từ chủng S.aureus
ATCC25923.
- Phân tích sản phẩm PCR: sau khi khuếch đại sản phẩm PCR sẽ được chạy trên gel
agarose 2% trong đệm 0,5X Tris Borate EDTA (ethidium bromide 0,2µl/ml)
- Gen 100bp được sử dụng làm mục tiêu.
- Hiệu điện thế được sử dụng 6,5V và chạy điện di trong 1h. Sử dụng tia UV để xác
định sự hiện diện của vi khuẩn. Độ nhạy của mồi được đánh giá bằng cách sử dụng các
dung dịch pha loãng khác nhau (CFU/ml) của vi khuẩn.
- Kết quả:
43
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
Hình 1. Coa gene amplification of Staphylococcus aureus.

Lane 1, 9, 11, 12: 610 bp; Lane 13: Negative control;
Lane 5, 6, 8, 10: 740bp; Lane L: 100bp Ladder
Lane 2, 7: 870bp;
Lane 3: 960 bp;
Lane 4: coa negative;
- Hỗn hợp phản ứng tối ưu hóa của gen coalugase dựa trên thí nghiệm chứa 200µl
dNTP mix, 1 dung dịch đệm PCR với 10mMTris – HCL, pH = 8,8 , 50nM KCl và 0,8%
Nonidet P40); 1,5 mM MgCl2; 20pmol của mỗi mồi; 2,5U Taq DNA polymerase và 200µl
DNA được tách chiết từ sữa và 25µl DEPC.
- Biến tính DNA ở 950C trong 5´, 36 chu kì. Sau đó ủ ở 550C trong 1´ và kéo dài ở
720C trong 1.´.
44
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
- Phản ứng PCR được tối ưu hóa khi nồng độ MgCl2 là 2,5mM.
- Kiểm tra 628 mẫu sữa thì có 238 mẫu chiếm (37, 89%) các chủng dương tính. Dựa
vào đặc điểm gram và haemolysis có 156 mẫu chứa tụ cầu (65,55%).
- Tụ cầu được phân lập từ các chủng tiếp tục phân thành 128 coalugase (+) (53,78%)
và 28 coalugase (-) (11,78%). Trên cơ sở thử nghiệm citrate coalugase huyết tương thỏ
các coalugase (+) được phân lập và xác định sinh hóa như S.aureus.
- S.aureus được phân lập và sàng lọc bằng gen coalugase dựa trên những điều kiện
tối ưu của phản ứng PCR thường có độ nhạy 100%.
- S.aureus được phân lập có sản phẩm khuếch đại có kích thước 108bp.
- Kết quả:
Hình 2. Ubiquitous PCR assay for Staphylococcus aureus.
Lane 1-4: Staphylococcus aureus Positive samples;

Lane 5: Staphylococcus aureus ATCC 25923;
Lane 6: Negative control with Nuclease free water;
Lane L: 100bp Ladder;
2.2.3. Phương pháp RPLA (Reverse Passive Latex Agglutination):
45
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
 Ứng dụng:
Phương pháp này được ứng dụng cho việc xác định sự sản sinh enterotoxin của
Staphylococus aureus trong thực phẩm và trong môi trường nuôi cấy lỏng.
 Nguyên tắc:
+ Thực phẩm nhiễm độc S.aureus thường chứa ít hơn 10ng độc tố/ 1g thực phẩm.
Để phát hiện enterotoxin với mức độ thấp như trên mà không dùng biện pháp cô đặc cao
độ, chỉ có phương pháp RIA (Radio Immuno Assay); enzyme liên kết khảo nghiệm miễn
dịch ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay); khảo nghiệm ngưng kết huyết thụ
động đảo ngược RPHA (Reverse passive hemagglutiation assay) là đủ nhạy. RPHA là
biện pháp đơn giản nhất để thực hiện nhưng đôi khi nó cũng cho ra những phản ứng
không đặc hiệu với những loại thực phẩm nhất định. Để khắc phục những vấn đề này
khảo nghiệm ngưng kết latex thụ động đảo ngược RPLA đã được phát triển. Trong thử
nghiệm này, kháng thể phủ hạt nhựa polystyrence thay thế cho các tế bào máu được sử
dụng trong phương pháp RPHA. Phương pháp RPLA được dùng để phát hiện độc tố tụ
cầu A, B,C, D (SEA, SEB, SEC, SED).
+ Kits là tên thương mại của bộ dụng cụ để thực hiện khảo nghiệm khảo nghiệm
này.
Sau đây là mô tả về phương pháp RPLA.
 Vật liệu và thiết bị:
+ Lưu ý: các thiết bị sử dụng trong Phương pháp RPLA phải được chuẩn bị và khử
trùng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
+ SET_RPLA: Kit cho độc tố A, B, C, D.(được sản xuất từ Oxoid Canada hoặc
Fisher Scientific). Gồm các chất thử sau đây đủ để thực hiện thử nghiệm trên 20 mẫu.
+ Huyền phù latex có độ nhạy sáng với kháng nguyên SEA, SEB, SEC, SED
5ml/lọ.
+ Huyền phù latex đối chứng 5ml/lọ.
+ SEA, SEB, SEC, SED được đông khô và bổ sung 0.5ml dung dịch chất làm
loãng.
46
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
+ Dung dịch pha loãng (muối đệm phosphate chứa 0.5% (w/v)) huyết thanh bò và
50ml sodium azide 0.1 %.
+ Muối đệm phosphate (phosphate 0.05M, NaCl 0.15M, chứa 0.05% sodium azide
pH 7.4).
+ Sodium hypochloride 2%(NaOCl).
+ Sodium hydroxide 4N (NaOH).
+ Acid hydrochloride 4N (HCl).
+ Tấm vi chuẩn (loại hình chữ V, có 8×12 giếng) và nắp đậy.
+ Micropipette (25µl) và các tip.
+ Platform shaker (nền lắc).
+ Blender hoặc homogenizer (máy trộn, máy làm đồng nhất).
+ Refrigerate centrifuge (máy li tâm làm lạnh).
 Cách tiến hành:
*Giới thiệu chung:
+ Kit SET-RPLA phải được bảo quản ở nhiệt độ 2-80C. Trong điều kiện này các
chất thử sẽ giữ lại khả năng phản ứng đến ngày ghi trên hộp kit. Sau khi hoàn nguyên,
những đối chứng enterotoxin nên được bảo quản ở nhiệt độ 2-8 0C. Những đối chứng
enterotoxin hoàn nguyên sẽ được giữ lại khả năng phản ứng trong 3 tháng hoặc đến ngày
ghi trên hộp kit.
+ Những chất thử có nhiều nồng độ khác nhau vì vậy không nên đổi chổ lẫn nhau.
+ Những chất thử và chất làm loãng chứa sodium azide 0.1% và được sử dụng như
chất bảo quản.
+ Một thùng chứa chất thải của sodium hypochloride 2% nên được chuẩn bị và sử
dụng cho việc xử lý tất cả các mẫu dịch từ môi trường, mẫu dịch chiết thực phẩm, đối
chứng độc tố…
*Chuẩn bị mẫu:
+ Đối với những thực phẩm có độ ẩm cao (thịt đông lạnh, hải sản, nấm đóng hộp,
…). Cho 50g mẫu và 50ml muối đệm phosphate vào một máy xay. Trộn lẫn với tốc độ
cao trong 2 phút, sau đó để yên đồng nhất trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
47
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
+ Đối với thực phẩm bán khô (pho mai, giăm bong, xúc xích, bánh ngọt,…). Cho
50g mẫu và 100ml muối đệm phosphate vào một máy xay. Trộn với tốc độ cao trong 2
phút, sau đó để yên đồng nhất trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Đối với những thực phẩm khô (mì khô, bột sữa,…). Cho 50g mẫu vào và 150ml
muối đệm phosphate vào một máy xay. Trộn với tốc độ cao trong 2 phút, sau đó để yên
đồng nhất trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. (Với mì khô, đầu tiên mẫu được trộn riêng tốc
độ cao trong 2-3 phút đến khi mẫu chuyển thành bột , sau đó thêm muối đệm phosphate
và trộn các thành phần với nhau, để yên 1-2 giờ ở nhiệt độ 40C. Trộn lại một lần nữa với
tốc độ cao trong 2-3 phút, sau đó để yên đồng nhất trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Chuẩn bị xong, ly tâm đồng nhất với tốc độ 10000 vòng/phút, trong 20 phút ở
40C.
+ Gạn bỏ phần nổi trên mặt.
+ Nếu phần nổi vẫn còn (như trong pho mai và các sản phẩm từ sữa khác), điều
chỉnh pH đến 4.6 với HCl 4N. Ly tâm như trên và trung hòa dịch huyền phù bằng NaOH
4N. Nếu huyền phù vẫn còn, tiếp tục ly tâm nữa. Phương pháp RPLA yêu cầu mẫu dịch
chiết thực phẩm không chứa vẫn đục để giảm thiểu phản ứng không đặc hiệu.
+ Một vài thực phẩm như mì khô thường cho các kết quả dương tính giả bằng thí
nghiệm trực tiếp. Như vậy dịch chiết từ thực phẩm phải được tiến hành làm sạch hoặc cô
đặc của sắc ký ái lực chelate kim loại. (Xem bảng 1).
* Khảo nghiệm RPLA:

+ Mỗi mẫu dịch chiết từ thực phẩm được khảo nghiệm ở 20 giếng của tấm vi
chuẩn như sau:
 Mỗi trong 4 độc tố (enterotoxin) SEA, SEB, SEC, SED được cho vào 4
giếng và 1 giếng đối chứng latex.
 Mỗi mẫu dịch chiết có thể cần 6 hoặc nhiều hơn 6 giếng cho 1 trong 4 độc tố
(enterotoxin) phụ thuộc vào lượng độc tố được sinh ra trong dịch chiết đó.
48
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
 Ghi kí hiệu trên tấm vi chuẩn: các lọai độc tố SEA, SEB, SEC, SED và latex
đối chứng theo chiều dọc; độ pha loãng (0, 2X, 4X, 8X…) theo chiều ngang.
Chú ý: Mỗi ngày khảo nghiệm, hoạt động của mẫu huyền phù latex có độ nhạy sáng với
kháng nguyên SEA, SEB, SEC, SED. Các mẫu huyền phù latex đối chứng được kiểm tra
sự chống lại những enterotoxin tương ứng của chúng như đối chứng dương và dung dịch
pha loãng như chứng âm. Không cần lặp lại những đối chứng này cho mỗi mẫu nếu các
mẫu được khảo sát trong cùng một ngày. Loại bỏ những chất thử không đảm bảo yêu cầu
về độ nhạy và độ đặc hiệu.
+ Cho 25µl dung dịch pha loãng vào mỗi giếng trừ giếng đầu tiên- giếng chứa
những mẫu không pha loãng để xác định mỗi loại enterotoxin và đối chứng latex.
+ Thêm 25µl dịch chiết từ thực phẩm vào giếng đầu tiên và giếng thứ 2 (2X) để
xác định mỗi loại enterotoxin và đối chứng latex (kí hiệu là A, B, C, D và L, một cách
tương ứng).
* Xác định SEA:
+ Trộn kỹ hỗn hợp ở giếng thứ 2 (2X) (kí hiệu A) bằng cách bơm dung dịch vào ra
micropipette ít nhất 5 lần.
+ Chuyển 25µl từ giếng 2 sang giếng thứ 3(4X), trộn tương tự như trên.
+ Chuyển 25µl từ giếng 3 sang giếng thứ 4(8X), trộn tương tự như trên.
+ Tiếp tục pha loãng 2 lần đến giếng thứ 5, 6 nếu thấy cần thiết.
+ Lặp lại tương tự các bước cho việc xác định SEB, SEC, SED và đối chứng Latex
(kí hiệu B, C, D và L).
+ Lắc mạnh mỗi huyền phù latex trước khi sử dụng.
+ Thêm 25µl huyền phù latex nhạy với kháng nguyên A vào một trong 4 giếng ở
loạt đầu tiên (A).
+ Thêm 25µl huyền phù latex nhạy với kháng nguyên B vào một trong 4 giếng ở
loạt 2 (B).
+ Thêm 25µl huyền phù latex nhạy với kháng nguyên C vào một trong 4 giếng ở
loạt 3 (C).
49
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
+ Thêm 25µl huyền phù latex nhạy với kháng nguyên D vào một trong 4 giếng ở
loạt 4 (D).
+ Thêm 25µl huyền phù đối chứng latex vào một trong 4 giếng ở loạt 5 (L).
+ Đặt vạch tấm vi chuẩn xuống đáy của một cái hộp với 2 lớp giấy lọc nước bão
hòa lốt hộp để duy trì ở 1atm. Ngoài ra, các giếng thí nghiệm được bịt lại bằng nắp hoặc
một tấm phủ bằng nhựa để ngăn cản sự bốc hơi nước. Trong trường hợp này không cần
thiết để tấm vi chuẩn trong một hộp ẩm.
+ Lắc tấm vi chuẩn trong hộp chứa nó 100 vòng/phút trên một nền lắc hoặc bằng
tay khoảng 1-2 phút. Phải cẩn thận để không làm tràn các thành phần trong các giếng.
+ Để yên tấm vi chuẩn trên một bề mặt dao động tự do ở nhiệt độ phòng trong 20-
24 giờ.
+ Kiểm tra các giếng có ngưng kết latex với một nền đen.
*Giải thích kết quả:
So sánh mức độ ngưng kết của các hạt latex.

+ Những giếng có khả năng ngưng kết ở mức độ từ (+) đến (+++) đươc xem là
dương tính cho loại độc tố đặc hiệu.
+ Nếu phản ứng ngưng kết không rõ ràng, quan sát phản ứng bằng kính nhìn nổi 3
chiều hoặc kính lúp với độ phóng đại 10 lần (10X).
+ Các đối chứng latex nên là âm tính.
+ Trường hợp xảy ra ngưng kết không đặc hiệu trong các giếng đối chứng latex.
Nếu điều này xảy ra các giếng mẫu vẫn có thể đọc là dương tính (nếu giếng mẫu dương
tính có nồng độ pha loãng cao hơn so với giếng đối chứng có ngưng kết không đặc hiệu).
+ Nếu tất cả các giếng của độc tố A, B, C, D đều hiển thị các kết quả là dương tính
với mức độ ngưng kết như nhau, thí nghiệm này được xem là dương tính giả.
+ Trong trường hợp này, mẫu dịch chiết thực phẩm phải qua bước làm sạch hoặc
cô đặc liên quan đến sắc ký ái lực chelate kim loại.
50
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
+ Lượng enterotoxin tồn tại trong mẫu có thể ước tính bằng cách so sánh những kết
quả ngưng kết với khả năng cô đặc chuẩn của các độc tố. Độ nhạy của thí nghiêm này là
0.5-1ng độc tố/ml mẫu dịch chiết. Nếu các enterotoxin không có giá trị, một mức độ
ngưng kết dương tính (+) có thể ước lượng là 0.5-1ng độc tố/1ml mẫu dịch chiết.
BẢNG 1: CÁCH TIẾN HÀNH SẮC KÝ CHELATE KIM LOẠI.
- Bước 1:
Trộn hỗn hợp gel của giếng trong chai chứa iminodiacetate liên kết cộng hóa trị
với Sepharose-6B và chuyển 8ml gel (cho 100-150ml dịch chiết thực phẩm) hoặc 5ml
gel (cho 50-99ml dịch chiết thực phẩm) vào một cái phễu thủy tinh nung kết (a sentered
glass funnel). Rửa gel với 100ml nước cất.
- Bước 2:
CuSO4.5H2O 0.5% được hòa tan bằng cách cho 1.25g CuSO 4.5H2O tinh thể vào
250ml nước cất (cho 2 mẫu).
- Bước 3:
Thêm 100ml dung dịch CuSO4.5H2O vào phễu nung kết chứa gel đã được rữa.(Các
gel sẽ chuyển sang màu xanh).
- Bước 4:
Sau khi gel chuyển sang màu xanh (do ion Cu 2+). Rữa gel bằng 100ml nước cất để
loại bỏ những ion Cu2+ thừa.
- Bước 5:
Chuyển gel sang chai chứa 100ml dung dịch pha loãng và dich chiết thực phẩm
(50-100ml dịch chiết thực phẩm, pH 7.4), tạo điều kiện cho dịch chiết phản ứng với gel
bằng cách trôn lẫn dung dịnh nhờ máy lắc trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
- Bước 6:
Chuyển hỗn hợp sang phễu nung kết và rữa 10 lần bằng dung dịch muối đệm
phosphate hoặc BPS (buffer có sodium phosphate 0.05M chứa NaCl 0.15M, pH 6.5).
- Bước 7:
Giữ ống tiêm thủy tinh chứa 10ml và đặt miếng thấm tròn dưới đáy ống (miếng
giấy lọc dày 0.6- 0.8mm) và thêm 2ml gel (unchared)
51
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
2.2.4. Lai phân tử:

- Phương pháp lai phân tử còn gọi là phương pháp mẫu dò, probes. Phương pháp này
dùng để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm dựa trên sự phát hiện một đoạn gen đặc
trưng của vi sinh vật. Cơ sở của việc sử dụng mẫu dò là quá trình lai phân tử. Quá trình
này bao gồm sự tách rời của hai mạch đôi của chuổi xoắn kép DNA và sự tái bắt cặp giữa
các đoạn DNA có nóng chảy tm của phân tử DNA và sự tái bắt cặp giữa các đoạn DNA
có trình tự nucleortide bổ sung khi nhiệt độ trở lại bình thường. Một trong hai mạch DNA
bổ sung được cố định trên một giá thể rắn. Sự lai phân tử xảy ra khi đoạn mồi có trình tự
nucleotide bổ sung với trình tự DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển động nhiệt.
- Mục đích sử dụng gene trak S.aureus là một phương pháp dùng để phát hiện
S.aureus trong thực phẩm. Thử nghiệm DNA hybridization sử dụng đầu dò DNA
S.aureus và thiết bị đo màu để phát hiện S.aureus trong thực phẩm sau khi đã làm giàu
mẫu. Phương pháp này dùng để định lượng xác định sự hiện diện của S.aureus ở mức độ
ô nhiễm > 3 tế bào/g trong mẫu thực phẩm gốc. Một mẫu được xem là không có sự hiện
diện của S.aureus nếu giá trị hấp thụ thu được ít hơn hoặc bằng giá trị giới hạn mà thử
nghiệm đã thành lập. Một mẫu được xem là có sự hiện diện của S.aureus nếu giá trị hấp
thụ thu được lớn hơn giá trị giới hạn mà thử nghiệm đã thiết lập.
- Thao tác thực hiện:
+ Làm phong phú các mẫu thực phẩm.
+ Lấy 0,5 ml mẫu cho vào 12x0,75 ống nghiệm.
+ Cho 0,1 ml thuốc thử để xử lý sơ bộ mỗi ống và lắc trong 5 giây, sau đó ủ trong
bồn nước 370C trong 30 phút.
+ Cho thêm 0,1 ml thuốc thử phân giải vào mỗi ống nghiệm và lắc trong 5 giây.
Thay nước và ủ trong bồn nước 370C trong 45 phút.
+ Thêm 0,5 ml mẫu dò S.aureus vào mỗi ống nghiệm.
+ Đặt dipstick vào mẫu, nâng lên, hạ xuống 5 lần để trộn và ủ ở 650C trong 1 giờ.
+ Rửa dipsticks hai lần mỗi lần 1 phút, lần đầu 650C, sau đó ở nhiệt độ phòng.
+ Chuyển tiếp vào ống chứa 0,75 ml enzyme liên kết và ủ ở nhiệt độ phòng trong
20 phút.
52
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
+ Rữa dipsticks hai lần trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.

+ Chuyển dipsticks đến ống chứa 0,75ml chất nền tạo màu và ủ ở nhiệt độ phòng
trong 20 phút.
+ Lấy dipsticks ra và thêm 0,25ml thuốc dừng.
+ Đọc kết quả bằng cách sử dụng Gene Trak quang kế. Đo ở bước sóng 450 nm,
mẫu âm tính thì OD < = 0,1, mẫu dương tính OD > 0,1. Để có kết quả chính xác nhất thì
có thể thử nghiệm lại các phản ứng sinh hóa.
- Thuốc thử phân giải là: NaOH 0,75M.
- Hóa chất rửa: 50mM Tris-HCl (pH=7,5); 2mM EDTA; 100mM NaCl.
- Chất nền tọa màu: Tetramethylbenzidine, bảo quản ở nhiệt độ 2-80 C.
- Enzyme liên kết: Antifluorescein antibody, bảo quản ở nhiệt độ 2-80 C.
- Mẫu dò phát hiện chứa fluorescein isothiocyanate.
- Thuốc dừng: sulfuric acid 2M.
- Độ nhạy 1-5gCFU/25g.
- Thời gian thử 3h (sau khi làm giàu 24h).
- Các xét nghiệm cho mỗi kit lên đến 98.
- Hệ thống dò gene trak (Framingham, USA): mẫu dò là những đoạn oligomer DNA
đánh dấu bằng hóa chất phát quang.
2.2.5. Dùng Bacteriophage để làm Kit thử nhanh MRSA.
- Kỹ thuật khuếch đại bacteriophage để dò tìm S.aureus và xem thử vi khuẩn này có
nhạy cảm hay đề kháng với methicillin hay không.
- Bộ thử nghiệm này do công ty Microphage sản xuất. Mẫu cấy máu được trộn đều
trong hai ống tách rời và đặt trong lò ủ 5 giờ. Sau đó lấy hai ống nghiệm ra và lấy mỗi
ống 6 giọt nhỏ vào giấy thử. Một ống tìm xem có S.aureus hay không, ống kia xem vi
khuẩn có nhạy cảm hay đề kháng với kháng sinh không. Thử nghiệm nhận diện S.aureus
có độ nhạy 93% và tính đặc thù 98%. Thử nghiệm chủng nhạy cảm với methicillin có độ
nhạy 99% và đặc thù 99%.
- Phương pháp là dùng vài giọt mẫu máu hoặc đàm của bệnh nhân với dịch cấy có
chứa một số lượng nhỏ bacteriophage. Nếu có vi trùng sống hiện diện trong mẫu phân
53
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
tích thì bacteriophage sẽ xâm nhập vào vi trùng và sẽ sản sinh rất nhanh trong vòng vài
tiếng đồng hồ và phóng thích ra môi trường thật nhiều phage. Sự hiện diện của phage sẽ
được định bằng immunoassay. Còn nếu muốn xem coi nó có kháng với MRSA thì phải
làm 2 thử nghiệm song song. Thử nghiệm một là thử nghiệm để phát hiện có sự hiện diện
của vi khuẩn. Thử nghiệm hai cho thuốc kháng sinh vào mẫu có vi khuẩn trước khi đưa
vào môi trường có phage. Như vậy nếu có vi khuẩn thì vi khuẩn sẽ bị kháng sinh giết chết
hết và khi cho phage vào phage sẽ không sản sinh được. Kết quả âm chứng tỏ vi trùng
nhạy thuốc. Ngược lại nếu vi trùng kháng thuốc mạnh mẽ chúng sẽ không bị giết chết bởi
thuốc và khi cho vào môi trường cấy có phage, phage sẽ xâm nhập vào vi khuẩn để tăng
trưởng sinh sản thật nhiều và cho kết quả dương tính. Có nghĩa là vi khuẩn kháng với
thuốc dùng.
54
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
CHƯƠNG III: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
- S.aureus là một trong những nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm và gây nên những
căn bệnh nguy hiểm ở người. Điều đáng lưu ý là khi gia nhiệt ta chỉ có thể tiêu diệt được
tế bào nhưng độc tố của nó lại bền với nhiêt. Vì thế thực phẩm cần đảm bảo vệ sinh từ
khâu chế biến đến khâu bảo quản. Người lao động tiếp xúc với thực phẩm phải thận trọng
giữ gìn vệ sinh tốt như đeo găng tay, khẩu trang…
- Ngoài ra một số S.aureus có độc lực mạnh còn có khả năng kháng kháng sinh như
penicillins, methicillin, dicloxacillin, nafcillin, oxacillin, cephalosporins… người mắc
bệnh có nguy cơ tử vong cao. Nguyên nhân chủ yếu là do sự lạm dụng quá nhiều kháng
sinh, chất kích thích tăng trưởng trong chăn nuôi. Cho nên, thực phẩm trước khi đưa ra thị
trường cần được kiểm định kỹ lưỡng và chặt chẽ.
55
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
TÀI LIỆU THAM KHẢO:

1. Lê Ngọc Bích Vương _ Khóa luận tốt nghiệp _ Tổng quan về các vi sinh vật chỉ thị và
biện pháp kiểm soát vi sinh vật trong thực phẩm.
2. Trần Linh Thước _ Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ
phẫm.
3. Ths. BsckII Trần Văn Hưng, Ths. Bs Nguyễn Thị Đoan Trinh _ Vi Sinh Y Học
4. Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương _ Thí nghiệm vi sinh vật thực phẩm.
5. PGSTS Nguyễn Hùng Tiến, PGSTS Bùi Minh Đức, PGSTS Nguyễn Văn Dịp _ Vi sinh
vật thực phẩm kĩ thuật kiễm tra và chỉ tiêu đánh giá an toàn thực phẩm.
6. Ths Phạm Minh Nhựt _ Giáo trình phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm.
7. www.healthinfotranslations.org/pdfDocs/MRSA_VIET.pdf
8. http://www.lrc-tnu.edu.vn
9.http://www.iasvn.org/content/detail.php?
subcatid=229&catid=108&contentid=964&langid=0
10. www.yduocngaynay.com
11.http://iascnsh.org/CNSH%C4%90%E1%BB%99ngV%E1%BA%ADt/CNSHTrongTh
%C3%BAY/tabid/60/BlogDate/2009-08-31/DateType/month/Default.aspx
12. http://thuviensinhhoc.com/day-hoc/day-hoc-sinh-hoc-12/593-mt-s-vn-v-di-truyn-hc-b-
sung-kin-thc-chng-trinh-12?start=6
56
NHÓM 2_ 08DSH4
PHẨM
13. http://web.mit.edu/7.02/virtual_lab/PBC/PBC5virtuallab.html
14. http://tcyh.yds.edu.vn/2008/2008%20PB%20T12%20so%204%20-
%20YTCC/@YTCC%2008%20Dan%20trang/T%E1%BA%A0O%20KH%C3%81NG
%20TH%E1%BB%82%20%C4%90A%20D%C3%92NG%20V%C3%80%20X
%C3%82Y%20D%E1%BB%B0NG%20QUI%20TR%C3%8CNH%20ELISA.htm
15. http://moodle.yds.edu.vn/tcyh/?Content=ChiTietBai&idBai=1043
16. http://tailieu.vn
57
NHÓM 2_ 08DSH4

Báo Cáo Staphylococcus

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Báo Cáo Staphylococcus

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐH KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM

GVHD: TH.S PHẠM MINH NHỰT

1.7. Các biện pháp phòng và xử lý bệnh .............................................................

Chương II: Các phương pháp xác định.........................

Chương III: Kết luận và đề nghị....................................

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ TÁC NHÂN GÂY ĐỘC.

1.1. Lịch sử phát hiện:

- Tên khoa học : Staphylococcus aureus.

1.2.3. Phân loại Staphylococcus bằng kháng nguyên:

+ Vách tế bào chứa kháng nguyên polysaccharide, kháng nguyên protein A ở bề

1.4.4. Độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B:

1.5.2. Cơ chế gây bệnh:

1.6.2. Viêm phổi:

CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH.

Quy trình định lượng S.aureus.

Chuyển 1ml dung dịch 10-1,10-2,10-3 …

Chọn ống (+) đục ở mỗi độ pha

Cấy vào TSA, ủ 37±1oC, 24 giờ.

Tỷ lệ khuẩn Tỷ lệ khuẩn lạc không đặc

Tra bảng MPN

Mật độ S.aureus (MPN/g hoặc

Số lượng ống dương Số lượng ống dương

Số lượng ống dương Số Số lượng ống dương tính Số

2.1.3.4. Quy trình định lượng S.aureus trong thực phẩm:

Quy trình định lượng S.aureus trong thực phẩm.

Cấy mẫu lên môi trường thạch Baird

2.2. Phương pháp hiện đại:

Đĩa nhựa có 96 giếng dùng

Các loại đĩa plasmid tiến hành xét nghiệm Elisa.

Bacteria N n % Min Max Median SE

2.2.2. Phương pháp PCR:

Hóa chất Thể tích Nồng độ

Hình 1. Coa gene amplification of Staphylococcus aureus.

Hình 2. Ubiquitous PCR assay for Staphylococcus aureus.

Lane 1-4: Staphylococcus aureus Positive samples;

* Khảo nghiệm RPLA:

So sánh mức độ ngưng kết của các hạt latex.

2.2.4. Lai phân tử:

+ Rữa dipsticks hai lần trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.

CHƯƠNG III: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

You might also like