Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH

THƯ

MỤC LỤC
1.TỔNG QUAN..........................................................................................................................3

1.1) định nghĩa enzyme...................................................................................................3

1.2) bản chất của enzyme...............................................................................................3

1.3) phân loại enzyme....................................................................................................3

1.4) enzyme cố định.......................................................................................................3

1.5) Đặc tính enzyme cố định........................................................................................4

1.6) Ý nghĩa enzyme cố định.........................................................................................5

2. CÁC PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH ENZYME...............................................................6

2.1) Nguyên tắc..............................................................................................................6

2.2) Các phương pháp....................................................................................................7

2.2.1) phương pháp gắn enzyme bằng phương pháp cộng hóa trị......................7

2.2.1.1) Kết hợp phân tử protein vào chất mang không hòa tan....................8

2.2.1.2) Kết hợp đồng hóa trị các phân tử enzyme riêng biệt với chất mang lại

lại thành một đại phân tử...............................................................................14

2.2.2) Phương pháp gói enzyme trong khuôn gel................................................16

2.2.2.1) Gói enzyme trong gel là các polymer tổng hợp................................16

2.2.2.2) Nhốt enzyme trong các lỗ nhỏ của các sợi tổng hợp.......................16

2.2.2.3) Phương pháp gói enzyme trong các bao vi thể................................18

2.2.2.4) Phương pháp tiền polymer để gói các chất xúc tác sinh học...........20

2.2.3) Phương pháp hấp phụ trên bề mặt các chất có hoặc không có điện tích. .21

3. MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH................................................22

-1-
Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN

................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................
................................................................................................................................................

-2-
 Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

1. TỔNG QUAN
1.1) Định nghĩa enzyme

Enzyme là những chất xúc tác sinh học mang bản chất protein, có đầy đủ tính chất của
một chất xúc tác. Tuy nhiên enzyme có cường lực xúc tác mạnh hơn nhiều so với các loại xúc tác
vô cơ.

1.2) Bản chất của enzyme

Enzyme là một loại protein do sinh vật tổng hợp, và tham gia vào các phản ứng sinh học.

Enzyme là những chất hữu cơ có phân tử lượng lớn từ 20 000 đến 100 0000 dalton. Do
có kích thước lớn như vậy nên cũng như protein, enzyme không đi qua màng bán thấm.

Enzyme có thể hòa tan trong nước, dung dịch muối loãng, trong dung môi phân cực,
nhưng không hòa tan trong các dung môi không phân cực. Dung dịch của enzyme có tính chất
của một dung dịch keo ưa nước. Khi hòa tan trong nước, các phân tử nước lưỡng cực sẽ kết hợp
với các ion, các nhóm ion hoặc các nhóm phân cực trong phân tử enzyme tạo thành lớp vỏ
hydrat.

Cũng giống như protein, enzyme không bền với tác dụng của nhiệt độ. Dưới tác dụng của
nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính và mất khả năng xúc tác, mức độ giảm hoạt tính của enzyme
tương ứng với mức độ biến tính của protein enzyme. Enzyme cũng có thể bị mất hoạt tính do các
tác nhân gây biến tính như axit, kiềm mạnh hay các loại muối có nồng độ cao.

Trong điều kiện điện li của môi trường, enzyme có thể tồn tại ở dạng anion, cation hay
dạng trung hòa về điện. Chính do tính chất này, chúng ta có thể phân tách cũng như xác định độ
thuần khiết của enzyme bằng phương pháp điện di.

Từ những đặc điểm trên cho thấy bản chất hóa học của enzyme là protein.

1.3) Phân loại enzyme

-3-
 Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

Dựa vào tính đặc hiệu phản ứng của enzyme , từ năm 1960 hội hóa sinh quốc tế (IUB) đã
thống nhất phân loại enzyme thành 6 lớp, đánh số từ 1 đến 6. Các số thứ tự này là cố định cho
mỗi lớp:

1- Oxydoreductazase: các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa – khử.
2- Transpherazase: các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị.
3- Hydrolazase: các enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân.
4- Liazase: các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt không cần nước , loại nước tạo thành
liên kết đôi hoặc kết hợp phân tử vào liên kết đôi.
5- Izomerazase: các enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa.
6- Ligazase: các enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu năng
lượng của ATP,…

1.4) Enzyme cố định

Enzyme cố định hay còn gọi là enzyme không hòa tan được hiểu theo nghĩa hẹp
và nghĩa rộng.
Theo nghĩa hẹp: enzyme không tan là những enzyme được đưa vào những
pha riêng rẽ, pha này được tách riêng với pha dung dịch tự do. Pha enzyme không
hòa tan trong nước và được gắn với những polimer ưa nước có trọng lượng phân
tử lớn (Michael Trevan).
Theo nghĩa rộng: các chất xúc tác cố định là các enzyme, tế bào, cơ thể
sống ở trạng thái cho phép sử dụng lại (Klaus mosbach).
Như vậy theo nghĩa rộng, enzyme cố định bao gồm cả enzyme đã được cố
định vào một chất mang, bao gồm cả enzyme có trong tế bào sống được cố định
trong các bình phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép ta sử
dụng nhiều lần.
Enzyme cố định thường là enzyme hòa tan được gắn vào một chất mang
bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Nhờ quá trình gắn kết này mà enzyme chuyển từ
trạng thái hòa tan sang trạng thái không hòa tan gọi là enzyme cố định.

-4-
Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

1.5) Đặc tính enzyme cố định

 Enzyme cố định có hoạt độ riêng thấp hơn hoạt độ riêng của enzyme hòa
tan
 Do khi gắn enzyme vào chất mang dưới ảnh hưởng của điện tích ở
chất mang cho hình thể enzyme thay đổi do đó khả năng xúc tác
cũng bị thay đổi.
 Do các enzyme bị nhốt trong khuôn gel một số cơ chất có kích
thước phân tử lớn không tiếp xúc được với enzyme do đó mà hoạt
lực enzyme giảm.
 Do tương tác protein - protein giữa các phân tử enzyme đã cố định
làm biến dạng một phần cấu trúc không gian của phân tử enzyme.
 Enzyme cố định tuân theo định luật Michaelis-Menten. Tuy nhiên, trong
phản ứng giữa cơ chất với enzyme cố định có những sai khác nhất định:
 Có thể sẽ xảy ra hiện tượng cạnh tranh cơ chất với enzyme và chất
mang.
 Hiện tượng cản trở khuyếch tán cơ chất và các sản phẩm của phản
ứng làm giảm tốc độ phản ứng.
 Enzyme cố định có tính bền nhiệt hơn enzyme hòa tan cùng loại vì chúng
được bảo vệ trong chất mang.
 Enzyme cố định có xu hướng chuyển dịch pH tối ưu sang kiềm hoặc acid
so với PH tối ưu enzyme hòa tan chứ không trùng với pH tối ưu của
enzyme cùng loại.
 Enzyme cố định có khả năng bảo quản lâu hơn và bền với các chất kìm
hãm cũng như các tác nhân gây biến tính hơn.
 Có thể sử dụng nhiều lần.

1.6) Ý nghĩa enzyme cố định

-5-
 Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

Enzyme hòa tan sau khi sử dụng thường lẫn vào cùng với sản phẩm không tách ra
được. Nếu tách ra thì enzyme bị vô hoạt, vì vậy với một lượng enzyme nhất định chỉ có
thể sử dụng được một lần, hơn nữa kém bền.

Sử dụng enzyme cố định có một số ý nghĩa:

 Một lượng enzyme sử dụng lặp đi lặp lại được nhiều lần trong một thời
gian dài mà hoạt tính enzyme cố định ít thay đổi trong những lần tái sử
dụng. Đặc điểm này có ý nghĩa rất lớn trong kỹ thuật, nhờ đó có thể tái sử
dụng nhiều lần giảm chi phí cho việc sản xuất enzyme.
 Enzyme không lẫn vào trong sản phẩm do đó tránh được ảnh hưởng không
tốt đến sản phẩm. Do đó giảm chi phí cho việc tách enzyme ra khỏi sản
phẩm. Sản phẩm cuối cùng có thể coi như là sản phẩm tương đối sạch.
 Dùng enzyme cố định có thể ngừng nhanh chóng phản ứng khi cần thiết
bằng cách tách ra khỏi cơ chất.
Sử dụng enzyme cố định có ý nghĩa kinh tế lớn hơn sử dụng enzyme hòa
tan nhiều lần.

2. CÁC PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH ENZYME

Theo kỹ thuật chế tạo enzyme cố định, enzyme được gắn vào một vật mang nào đó.
Những vật mang như vậy có thể là cellulose và các dẫn xuất của nó, các hạt kính xốp, gel
polyacrylamide, sephadex, collodium, tinh bột, các loại allumosilicate và oxide kim loại…

2.1) Nguyên tắc

 Có 3 phương pháp điều chế các enzyme cố định:

 Gắn bằng liên kết đồng hoá trị phân tử enzyme vào chất mang không hoà
tan hoặc gắn các enzyme với nhau để tạo nên đại phân tử không hoà tan.

-6-
 Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

 Đính enzyme lên bề mặt chất mang hoặc vào trong lòng khuôn gel
có kích thước lổ khá nhỏ đủ để giữ enzyme, còn để các chất khác qua lại tự
do

 Hấp phụ enzyme lên trên các chất mang không hoà tan có mang hoặc
không mang điện tích

-7-
 Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

2.2) Các phương pháp.

2.2.1) Phương pháp gắn enzyme bằng liên kết đồng hóa trị.

 Đa số enzyme cố định thu được bằng phương pháp này. Với phương pháp này có
thể thu enzyme cố định bằng hai cách:
 Kết hợp phân tử protein enzyme vào chất mang không tan.
 Kết hợp đồng hoá trị giữa các phân tử enzyme với chất mang.

2.2.1.1) Kết hợp phân tử protein vào chất mang không tan.

Các yêu cầu đối với chất mang: chất mang cần có những tính chất như sau:
 Có độ hòa tan thấp và bền vững đối với các tác động cơ học và hóa học.
 Không có tác dụng kìm hãm đến enzyme.
 Không hấp phụ phi chọn lọc đối với các protein khác.
 Chất mang phải có bản chất háo nước tốt vì chất mang kị nước có thể sẽ gây ra tác dụng
ức chế đến enzyme được liên kết.
 Việc gắn enzyme sẽ có hiệu quả khi điện tích của enzyme và chất mang khác nhau.
Một số chất mang thường dùng
Các chất mang loại này thường là polypeptit, polysacarit dẫn xuất xelluloza, dextran
(DEAE – xelluloza, CM – xelluloza, DEAE – sephadex, CM – sephadex), agaroza và các chất
polyme tổng hợp khác như: polyacrylamit, polystirol, polyamid và các chất vô cơ: silicagel,
bentonit, nhôm hydroxit,…Chất mang phổ dụng hơn cả là dextran có liên kết ngang (sephadex)

-8-
 Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

và agaroza hạt (sepharoza) cả hai loại chất này đều có cấu trúc lỗ xốp khiến cho các phân tử lớn
có thể xâm nhập vào gel một cách dễ dàng. Polyacrylamit cũng là chất mang rất tiện lợi vì có độ
bền vững cơ học và hóa học cao.

Chất mang vô cơ thường rất bền đối với nhiệt, cơ học, với dung môi hữu cơ và với các vi
sinh vật và nhất là không bị biến đổi cấu hình của khuôn khi thay đổi tính chất của môi trường
xung quanh. Nhiều dẫn liệu đã chứng tỏ rằng enzyme đính với khuôn vô cơ khi bảo quản thường
bền vững hơn enzyme gắn với khuôn polyme hữu cơ.

Tham gia tạo thành các liên kết dòng hoá trị có thể có các nhóm chức của phân tử protein
enzyme như nhóm β- và γ- carboxyl – COOH của acid asparaginic và aid glutamic, nhóm ε-NH2
của lysine, nhóm β-SH của cysteine, vòng phenol của tyrosine, nhân imidasol của histidine, các
nhóm OH của serine, threonine, nhóm guanidine của arginine và imidasol của tryptophan.

Quá trình cố định enzyme.

Quá trình kết hợp enzyme có thể xảy ra qua một giai đoạn nếu chất mang có chứa các
nhóm có khả năng tham gia trực tiếp với nhóm amin của protein enzyme. Ví dụ: chất đồng trùng
hợp anhydrid maleic và etylen để liên kết đồng hóa trị giữa nhóm -amin của lyzin ở phân tử
enzyme với gốc anhydrit maleic của polyme.

Trường hợp ngược lại là quá trình xảy ra qua hai giai đoạn:

 Giai đoạn đầu để hoạt hóa chất mang bằng cách đưa vào các nhóm có khả năng phản ứng
hơn.
 Giai đoạn hai là giai đoạn kết hợp với enzyme.
 Các chất mang có chứa nhóm amin như aminobenzoylxelluloza,
polyaminostriol, copolyme của paminophenylalanin có thể được hoạt hóa bằng phản
ứng Diazo:

Ví dụ: polyaminostyrol trước hết được diazo hoá bằng natri nitrit trong dung dịch môi
trường acid thành muối diazo, sau đó mới kết hợp với enzyme:

-9-
 Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

Muối diazo của chất mang hoạt hóa có thể phản ứng không chỉ với nhóm amine, mà cả
với nhóm phenol, imidazol của protein của các enzyme.

Ví dụ:

Phản ứng kết hợp enzyme được tiến hành nhanh chóng trong điều kiện nhiệt độ thường
và trong dung dịch nước trung tính.

 Nếu chất mang có chứa nhóm amin có thể hoạt hóa bằng cách cho tác dụng với
phosgen hoặc tiophosgen để tạo thành dẫn xuất izozianat hoặc izotioxianat. Các nhóm
izoxianat hoặc izotioxianat ở pH trung tính sẽ liên kết dễ dàng với gốc N cuối và
nhóm  - amin của enzyme.

- 10 -
 Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

Bằng phương pháp này người ta đã điều chế được các dẫn xuất enzyme không tan như
tripxin, kimotripxin, ,  - amilasae, glucoamilaza.

 Nếu chất mang có chứa nhóm COOH như CM – xelluloza hoặc nhựa tổng hợp
cần được hoạt hóa trước khi cho tác dụng với enzyme bằng các phương pháp azide,
cacbodiimit, anhydrit kép.
- Hoạt hoá bằng phương pháp azide:

Hiện nay phương pháp này được xem là phương pháp hàng đầu. Các chất mang chứa
nhóm chức –COOH của CM-cellulose polyacrylamide và nylon có thể hoạt hóa bằng phương
pháp này. Trước hết là ester hóa CM-cellulose. Sau đó chuyển ester thành hydrazide, rồi azide.
Azide trong môi trường kiềm sẽ phản ứng với –NH2 của enzyme.

Phản ứng sẽ diễn ra theo sơ đồ:

- 11 -
 Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

Các enzyme không tan như tripxin, AND-aza, kimotripxin, fixin, bromelin đã được điều
chế bằng phương pháp này.

- Hoạt hóa bằng phương pháp cacbodiimit:

 Các chất mang có bản chất polysaccharide (-OH) thường được hoạt hóa sơ bộ
bằng cyanogenhalogenur. Phản ứng hoạt hóa xảy ra trong môi trường kiềm. Chất mang
hoạt hóa có khả năng liên kết cộng hóa trị với –NH2 của protein enzyme.
.
PORAH và Bar-Eli lần đầu tiên đã hoạt hóa cellulose, agarose và dextran bằng phương
pháp này. Quá trình hoạt hóa diễn ra như sau:

- 12 -
 Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

Giai đoạn kết hợp:

Khi xử lý
polysaccharide
bằng BrCN sẽ tạo
ra imidocarbonate
và carbamate.
Carbamate bền
vững, còn
imidocarbamate
tương tác với –
NH2 bậc nhất của
enzyme trong điều kiện môi trường kiềm vừa phải. Chất hoạt hóa BrCN và các sản phẩm trung

- 13 -
 Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

gian tạo thành rất độc, do đó cần có các thiết bị bảo vệ trong khi tiến hành nghiên cứu, sản xuất.
Để tránh tình trạng ô nhiễm này, Kohn và Wilchek đã cải tiến thành phương pháp “cyano-
transfer”, phương pháp này hiệu quả và đơn giản hơn. Mặc dù vẫn sử dụng BrCN nhưng được
hòa tan trong dung môi acetonitrile hoặc aceton và thêm vào triethilamin. Dạng
triethylammonium nitrile có khả năng hoạt hóa tốt các polysaccharide ở môi trường pH trung
tính. Tuy nhiên nếu nhóm hoạt hóa quá nhiều sẽ là nguyên nhân làm giảm hoạt tính enzyme cố
định.

2.1.1.2) Kết hợp đồng hóa trị các phân tử enzyme riêng biệt với chất mang lại thành
một đại phân tử không hòa tan

Cũng có thể điều chế các enzyme bằng cách đính các phân tử enzyme lại với nhau nhờ
các tác nhân lưỡng hoặc đa chức.

Người ta thường dùng aldehit glutaric để gắn các nhóm amin của lyzin ở các phân tử
enzyme.

Krechards (1964) đã cho các tinh thể “cacboxipeptidaza A” tác dụng với dung dịch
aldehit glutaric 1% sau khi tác dụng enzyme trở nên không tan trong NaCl 1M và vẫn giữ được
30% hoạt độ so với ban đầu.

Habeed (1967) cũng đã điều chế dẫn xuất tripxin không tan bằng cách dùng aldehit
glutaric 2% để liên kết các phân tử enzyme cũng như gắn enzyme vào aminoetyl -xelluloza.

Các enzyme thu được bằng liên kết đồng hóa trị thường có tính rắn do enzyme được liên
kết vào chất mang. Tuy số lượng enzyme được cố định ít hơn trường hợp gói hoặc cố định bằng
hấp phụ, nhưng sự tổn thất do giải phóng ra môi trường lại tối thiểu.

Ngoài ra, kiểu cố định này thường làm tăng tính chống chịu của enzyme đối với các yếu
tố biến tính, do đó để thực hiện được trong công nghiệp phải dùng các bình phản ứng liên tục.

- 14 -
 Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

Khi sử dụng phương pháp hoạt hóa bằng cyanogen bromide, cyanogen bromide và các
sản phẩm trung gian tạo thành rất độc. Chloroformate có thể được sử dụng để tạo ra các sản
phẩm trung gian tương tự nhưng không có độc tính.

 phương pháp gói enzyme trong khuôn gel

Enzyme acrylamine monomer:

Quy trình cố định enzyme bằng phương pháp nhốt

Đây là phương pháp dựa trên cơ sở tạo một màng bọc hay một polymer. Các chất tham
gia phản ứng và sản phẩm phản ứng của nó có thể thẩm thấu vào trong hoặc ra ngoài thông qua
màng bọc này và enzyme sẽ được giữ nguyên trong khuôn gel đó.

Để gói enzyme vào khuôn gel người ta tiến hành trùng hợp hóa các gel khi có mặt đồng
thời enzyme. Sau khi hoàn thành quá trình thì enzyme bị giữ chắc trong gel. Gel đã có enzyme

- 15 -
 Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

có thể nghiền nhỏ bằng cách đồng hoá hoặc ép qua rây có lỗ nhỏ rồi đem sấy khô ở nhiệt độ
thấp.

Nguyên liệu tạo gel để nhốt enzyme được nghiên cứu kỹ và đã được áp dụng rất thành
công ở nhiều nước trên thế giới.

Dẫn xuất enzyme loại này lần đầu tiên do Bernfeld (1993) thu được bằng cách trùng hợp
acrylamit với N, N’-metylenbisacrylamit. Phương pháp này thường dùng gần đây do chất trùng
hợp thu được dễ tạo thành dạng hạt và tùy thuộc điều kiện tiến hành mà gel có thể có độ xốp
khác nhau.

Enzyme không tan “gói” trong gel kiểu này thường phân bố không đều. Chỉ những phần
enzyme nằm gần bề mặt gel là tiếp xúc được với cơ chất và tham gia hoạt động xúc tác.

2.2.2) Phương pháp gói trong khuôn gel

2.2.2.1) Gói enzyme trong gel là các polymer tổng hợp

Các gel có thể được hình thành từ các polymer tổng hợp như: polyacrylamit, hydroxyletyl
– 2 – metacrylat đã tạo phức càng cua bằng etylenglycoldimetacrylat, polyvinyl, polyureetan.

Enzyme được hòa tan và phân tán trong một dung dịch monome và sau đó trùng hợp
trong sự có mặt một hay nhiều tác nhân tạo phức càng cua. Gel có thể cắt thành màng đặt trên
một giá rắn, hoặc cũng có thể nghiền nhỏ thành bột sau khi khử nước.

Alginat và caraghenan lấy từ rong biển thường có khả năng tạo gel tốt và rất thuận lợi để
bao gói các enzyme hoặc tế bào nguyên vẹn. Có thể tạo khối dưới dạng viên có đường kính 0.5 –
4 mm bằng cách nhỏ từng giọt dung dịch natri alginat 2% vào trong dung dịch giàu canxi clorua.

2.2.2.2) Nhốt enzyme trong các lỗ nhỏ của các sợi tổng hợp

Năm 1972, Dinelli đã tiến hành một thí nghiệm khá độc đáo là nhốt enzyme trong hệ sợi
và những nghiên cứu này được kết thúc vào năm 1978. Theo kết quả nghiên cứu của Dinelli,
enzyme khi được nhốt vào hệ sợi phát huy khả năng xúc tác rất tốt.

- 16 -
 Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

Với cách này người ta cho dịch lỏng chảy tuần hoàn bên trong sợi do đó hạn chế được sự
phân cực bề mặt và sự bịt lấp thường gặp với các màng.

Phương pháp Dinelli được tiến hành giống như tạo sợi xellulose trong công nghiệp dệt.
Một nhũ tương của xellulose triaxetat trong metylen clorua và enzyme trong dung dịch đệm có
chứa glycerol được ép đùn qua một khuôn lọc dưới áp suất nitơ. Các sợi đi ra khỏi khuôn được
nhúng vào trong một cái bể đông tụ có chứa toluel, sau đó được làm khô trong chân không.

Phương pháp nhốt enzyme trong sợi có khả năng xúc tác phản ứng tốt hơn phương pháp
nhốt enzyme trong gel. Bởi vì các sợi này bền với axit yếu hoặc kiềm yếu, lực ion cao và chịu
được một số dung môi hữu cơ. Tính chất trên phụ thuộc rất nhiều vào bản chất hóa học của các
polymer tạo ra loại sợi này. Tuy nhiên phương pháp này chỉ thích hợp đối với những enzyme khó
bị mất hoạt tính trong các dung môi không hoà lẫn với nước.

Bảng - Các loại sợi được dùng để nhốt enzyme

ST Loại sợi Enzyme cố định

T

1 Amyloglucosidase (EC.3.2.1.3)
Cellulose
Acetyl cholinesterase (EC.3.1.1.7)

2 Amino acylase (EC.3.5.1.14)

Fumarate hydratase (EC.4.2.1.2)

Glucoamylase (EC.3.2.1.3)

D-gluco isomerase (EC.5.3.1.5)

Cellulose acetate Dihhydropyrimidinase (EC.3.5.2.2)

-D-fructo furanosidase (EC.3.2.1.26)

Penicillin amidase (EC.3.5.1.11)

Tryptophan synthetase (EC.4.2.1.20)

Dipeptidyl peptidase (EC.3.4.14.1/2)

3 Polyvinyl alcohol and Urate oxidase (EC.1.7.3.3)

- 17 -
 Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

cellulose Urease (EC.3.5.1.5)

4 Polyvinyl alcohol Invertase (EC.3.2.1.26)

fibers Amynoacylase (EC.3.5.1.14)

5 Polysulphone/
Glucoamylase (EC.3.2.1.3)
Polyethylenenimine

6 PVC Lipase (EC.3.1.1.3)

7 Polypropylene fibers Lipase (EC.3.1.1.3)

Trong số các loại sợi trên thì Cellulose acetate được sử dụng nhiều nhất.

2.2.2.3) Phương pháp gói enzyme trong bao vi thể (microcapsul)

Năm 1964, Chang là người đầu tiên tạo ra vi nang để nhốt enzyme. Phương pháp này có
ưu điểm là enzyme được nhốt trong đó khá bền với mọi tác động bên ngoài và sử dụng được
nhiều lần.

Enzyme được gói trong các bao vi thể có màng bán thấm được tạo ra từ các polymer có
kích thước lỗ đủ nhỏ để ngăn cản sự khuếch tán của enzyme ra ngoài và đủ lớn để cơ chất đi vào
và sản phẩm đi ra.

Có nhiều phương pháp gói enzyme trong microcapsul, sau đây là một trong những
phương pháp đó. Cho một dung dịch lỏng chứa enzyme và một monome ưa nước trong một dung
môi hữu cơ không hòa lẫn trong nước để tạo nhũ tương, sau đó thêm một monome kỵ nước để
phản ứng trùng hợp tạo ra một màng bao quanh những giọt lỏng nhỏ, thường phải thêm vào một
tác nhân hoạt động bề mặt để làm bền nhũ tương cũng như để điều chỉnh kích thước, các capsul
có đường kính mong muốn có thể từ 1 đến 100 m.

- 18 -
 Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

Bảng - Nguyên liệu tạo vi nang để nhốt enzyme

STT Nguyên liệu tạo vi nang Enzyme

1 -D-galactosidase (EC.3.2.1.23)
Nitro cellulose
Asparaginase (EC.3.5.1.1)

Alcohol dehydrogenase (EC.1.1.9.1)

Maltate dehydrogenase (EC.1.1.1.37)

Catalase (EC.1.11.1.6)
Collodion
Piruvate Kinase (EC.2.7.1.40)
2 Hexokinase (EC.2.7.1.1)

Urease (EC.3.5.1.5)

3 Nylon -D-galactosidase (EC.3.2.1.23)

4 Asparaginase (EC.3.5.1.1)
Polyurea
D-glucose oxidase (EC.1.1.3.4)

5 Polyelectrolyte complex Lactate dehydrogenase (EC.1.1.1.27)

6 Poly (2-hydroxyethyl)
Urokinase (EC.3.4.21.31)
methacrylate

7 K-Carrageeman -D-galactosidase (EC.3.2.1.23)

8 Coated liposomes D-glucose oxidase (EC.1.1.3.4)

9 Polyethylen glycol Alkaline Protease (EC.3.4.21.14)

10 Styrenebutadien
Lipase (EC.3.1.1.3)
ruber/polyvinyl alcohol

11 Ethyl cellulose Triacylglycerol lipase (EC.3.1.1.3)

- 19 -
 Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

12 Catalase (EC.1.11.1.6)
Polystyrene
Urease (EC.3.5.1.5)

2.2.2.4) Phương pháp tiền polyme để gói các chất xúc tác sinh học

Cố định enzyme bằng phương pháp này có những ưu điểm như sau:

 Quá trình gói rất đơn giản trong những điều kiện nhẹ nhàng.
 Các chất tiền trùng hợp không chứa các monome có ảnh hưởng xấu đến enzyme đã được
gói.
 Cấu trúc mạng lưới của gel có thể được điều chỉnh bằng cách dùng các tiền polyme có
chiều dài chuỗi bất kỳ.
 Các tính chất hóa lý của gel (như sự cân bằng háo nước – kỵ nước, bản chất ion) có thể
định hướng trước bằng cách chọn các tiền polyme thích hợp vốn đã được tổng hợp hóa
học trong điều kiện vắng mặt enzyme.
 Một số phương pháp tiền polymer thường dùng:
 Phương pháp tạo liên kết chéo giữa các tiền polyme bằng cách chiếu quang để gói
enzyme
Khi chiếu tia cực tím gần lên dung dịch có chứa tiền chất polyme và enzyme thì sẽ tạo ra các
liên kết chéo giữa các gốc của tiền polyme và một gel được hình thành bao lấy enzyme.

Sự bao gói enzyme bằng phương pháp này có thể tiến hành ở điều kiện nhẹ nhàng, tránh
được các thay đổi pH quá kiềm hoặc axit, và thời gian lại rất nhanh, chỉ trong vòng 3-5 phút.

Chất nhựa tiền polyme có thể quang liên kết chéo thường là những chất sau:

 PEGM: polyetylenglycol dimetacrylat được tổng hợp từ polyetylenglycol.

 ENT: metacrlat và ENTP được tổng hợp từ hydroxyetylacrylat trong đó
PEGM và ENT hòa tan trong nước còn ENTP không hòa tan trong nước.
Với phương pháp này có thể gói enzyme, tế bào vi sinh vật, hoặc các cơ quan bào bằng cách
trộn một hỗn hợp gồm có chất tiền polymer, một chất nhạy quang như: benzoinetyleter (hoặc
benzoinizobutyleter) một dung dịch huyền phù có chứa enzyme, dung dịch đệm thích hợp cho

- 20 -
 Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

chất tiền polyme háo nước (hoặc một dung môi thích hợp nếu chất tiền polyme là kị nước). Sau
đó chiếu tia cực tím gần có chiều dài sóng từ 300 – 400 nm) (đạt cực đại ở bước sóng 360 nm)
trong 3 phút.

 Phương pháp tiền polyme ureetan

Cố định các enzyme bằng cách trộn chất tiền polyme ureetan với dung dịch nước của enzyme
là phương pháp khá đơn giản và thuận lợi vì các gốc chức năng izoxianat ở hai đầu cuối của
ureetan chỉ phản ứng với nhau trong điều kiện có mặt nước để tạo thành liên kết chéo ure và giải
phóng cacbon dioxit. Gel dễ dàng hình thành trong vài phút và bao gói lấy enzyme.

Có thể thu được các tiền polyme háo nước, hoặc kỵ nước bằng cách thay đổi tỷ lệ giữa
polyetylenglycol và polypropylenglycol. Ví dụ: PU – 3 có nồng độ polyprotylenglycol cao sẽ tạo
các gen kỵ nước, trong khi đó PU-6 và PU-9 có nồng độ polyetylenglycol cao sẽ tạo được gel
háo nước.

Dạng công thức chung của tiền chất polyme nước (PU):

2.2.3). Cố định enzyme bằng phương pháp hấp phụ trên bề mặt các chất có hoặc không có
điện tích.

Với phương pháp này enzyme được hấp phụ trên các chất có hoạt tính bề mặt như: than
hoạt tính, xellulose, tinh bột, dextran, collagen, albumin, agarose, kitin, polyacrylamit, nylon,
polystirol,…và một số nhựa trao đổi ion, silicagel thủy tinh.

Trong trường hợp chất mang không có lỗ enzyme được đính vào chất mang thành từng
lớp trên bề mặt.

- 21 -
 Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

Khi chất mang có lỗ xốp, các phân tử enzyme sẽ bám vào toàn bộ bề mặt phía trong và
phía ngoài lỗ xốp.

Nếu chất mang có điện tích thì sẽ tạo thành các liên kết ion. Phương pháp này dựa trên
khả năng tạo liên kết ion giữa chất mang và enzyme, người ta gắn enzyme vào chất mang. Liên
kết ion thường không bền bằng sự hấp phụ của enzyme đối với chất mang. Với phương pháp
này, người ta đã cố định được glucoamilase trên DEAE – xellulose hoặc trên DEAE – sephadex.
Nói chung các protease acid tính như pepxin rất dễ dàng cố định trên DEAE – xellulose, còn các
protease kiềm tính như: tripxin, kimotripzin dễ dàng liên kết với CM-xellulose. Các nhựa trao
đổi ion có nền xellulose có khả năng hấp phụ từ 2 – 50% protein enzyme.

3). MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH

Trong công nghiệp

 Năm 1969 Wilson đã xây dựng thành công một xưởng thực nghiệm để sản xuất liên tục
glucoza bằng glucoamilaza không tan.
 Năm 1971 người ta đã thành công trong việc dùng kimỏtĩpin liên kết đồng hóa trị với các
cacboxmetylxelluloza để làm đông tụ sữa thay cho renin đắt tiền.
 Enzyme raxemaza không tan đã được sử dụng để chuyển toàn bộ dạng D - axit amin
thành dạng L - axit amin, làm tăng giá trị dinh dưỡng của sản phẩm lên gấp đôi.

Trong y học
 Ureaza gắn trong vi tiểu cầu đã được sử dụng có kết quả để loại ure của máu trong thận
nhân tạo
 Vi tiểu cầu chứa catalaza đã có thể thay thế một cách có hiệu quả các catalaza còn thiếu
trong cơ.
 Đưa vi tiểu cầu có gắn enzyme L - asparaginaza vào cơ thể, có khả năng ức chế sự phát
triển của một số u ác tính bởi sự phát triển của các u này phụ thuộc vào sự có mặt của L-
asparagin.
 Glucozidaza trong anh đào và hạnh nhân đắng là - enzym phân đôi các heterosid, tạo ra
acid cyanhydric được sử dụng trong các dược liệu.

- 22 -
Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

  Enzym Muronaza của bột mù tạc là enzym thuỷ phân sinigrosid, tạo ra alylisothioxyanat
mà người ta tìm hoạt tính gây đỏ da.
 Lúa mạch nảy mầm dùng để chế “men diastaza dược dụng” (có chứa toàn các enzym của
hạt: enzym amylaza, sucraza, manataza.v.v..).
 Dịch dứa tươi cũng như nhựa Ficus hoặc đu đủ chúa nhiều proteaza và có tác dụng trị
giun đũa.

Trong phân tích hóa sinh:

 Glucooxidaza gắn đồng hóa trị với polytol được dùng để xác định tự động glucoza.
 Điện cực ureaza không tan dùng để xác định tự động ure trên dòng liên tục.
 Điện cực alcoloxydoreducaza không tan dùng để xác định metanol, ethanol trong dung
dịch nước.

Trong thực phẩm:

 Enzym của cây tạo chất vani cần thiết làm cho xuất hiện mùi thơm của vani.
 Amylaza được chế tạo ở quy mô lớn nhằm sử dụng trong công nghiệp (nhất là để làm
bánh và trong côg nghiệp dệt) từ các môi trường nuôi cấy nấm Aspergillus orizae. Các
nấm hạ đẳng, nguồn cung cấp các chất kháng sinh (Asperglillus, Penicillium) cũng như
các Streptomyces, hiện nay là nguồn cung cấp quan trọng của enzym.

 Ứng dụng của một số enzyme

1. Papain:

Enzyem này có trong cây đu đủ (carica papaya) và đu đủ núi (Vasconcellea

cundinamarcensis)

a). Cấu trúc

- 23 -
Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

Bao gồm 212 amino acid được ổn định bằng 3 cầu nối disulfide. Cấu trúc không
gian gồm 2 phần rõ rệt với 1 khe ở giữa. Khe này chứa vùng hoạt động chứa đựng
một "bộ ba xúc tác" được ví như chymotrypsin. Bộ 3 xúc tác được làm từ 3 amino
acid - cystein - 25, histidine-159 và asparagines - 158.

b). Chức năng

Làm đứt liên kết peptide liên quan đến sự deproton của cys - 25 bởi his - 159. Asn
-158 giúp định hướng nhóm imido của his-159 cho phép sự deproton diễn ra. Sau đó
cys-25 thực hiện sự tấn công nucleophitic vào carbon carbonyl của 1 mạch peptide,
nhóm amino cuối cùng của mạch peptide được tự do acyl-enzyme đồng hóa trị ngay
lập tức. Enzym bị deacylated bởi phân tử nước, giải thoát carboxy cuối cùng của
mạch peptide.

c). Sử dụng
Ứng dụng của enzyme này là làm đứt những thớ thịt dai và đã được sử dụng hàng
ngàn năm ở Nam Mỹ. Nó được bán như là 1 thành phần trong bột làm mềm thịt có
sẵn ở hầu hết các siêu thị. Papain trong bột làm mềm thịt như Adolph's, làm thành
hỗn hợp nhão với nước cũng là 1 phương pháp cứu chữa cho những trường hợp bị
sứa, ong, ong bắp cày đốt, vết muỗi chích hoặc vết thương do cá đuối gai độc gây ra.
Phá hủy những protein gây độc trong nọc. Thành phần chính trong các thuốc chống
ngứa (Stop Itch và Stop Itch Plus), một loại kem (aid cream) trong các phòng thí
nghiệm công nghệ giải phẫu ở Úc.
Papain được sử dụng trong phân tách tế bào bước đầu tiên trong việc chuẩn bị nuôi
cấy tế bào. Một phương pháp "xử lý 10 phút" cho những mẩu mô nhỏ (bé hơn 1mm3)
sẽ cho phép papain bắt đầu phá vỡ các phân tử ECM giữ các tế bào với nhau. Sau 10
phút papain phải được xử lý với 1 chất ức chế dừng phản ứng protease để phá các
mảnh mô thành các tế bào đơn lẻ. Nó cũng là 1 thành phần trong 1 loại dung dịch
enzym được chuẩn bị, đáng chú ý là Accuzyme. Sử dụng cho những vết thương sâu
để rửa sạch các tế bào chết.
Nó cũng được tìm thấy như là 1 thành phần trong kem đánh răng, kẹo bạc hà như

- 24 -
Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

1 chất làm trắng răng. Tuy nhiên hiệu quả làm trắng răng của nó trong kem đánh răng
và kẹo bạc hà thì rất nhỏ, bởi vì papain ít tập trung, và sẽ nhanh chóng bị nước bọt
làm loãng. Phải mất vài tháng sử dụng sản phẩm làm trắng để có được một hàm răng
trắng hơn.
Papain là thành phần chính trong papacarie, một loại gel để tẩy răng. Bên cạnh sự
thuận lợi của việc tránh sử dụng các dụng cụ cắt quay, nó cũng không ảnh hưởng đến
men răng.

d) Sản xuất
Papain thường được sản xuất ở dạng thô, khô bằng cách lấy mủ của quả đu đủ.
Mủ được lấy sau khi rạch cổ quả đu đủ, phần khô trên quả nhỏ giọt vào vật chứa.
Nhựa này sẽ được làm khô hơn. Bước tinh chế thì cần thiết để loại bỏ những hợp chất
bẩn. Quá trình tinh chế này bao gồm việc làm hòa tan và chiết. Papain tinh khiết được
phân phối ở dạng bột hoặc chất lỏng.

2) Lipase:
Lipase là 1 ezyme tan được trong nước, xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết
ester trong chất nền lipid không tan trong nước. Do đó các lipase bao gồm các
esterase phân lớp.
Lipase thực hiện chức năng cần thiết trong việc tiêu hóa, vận chuyển và xử lý các chất
béo như triglycerid, dầu, mỡ trong hầu hết các sinh vật sống. Gen mã hóa cho lipase
thậm chí hiện diện ở các virus.

a) Chức năng
Hầu hết lipase giữ 1 vị trí đặc biệt trên "cột sống" glycerol của chất béo (A1, A2
hay A3), ví dụ HPL (human pancreatic lipase - lipase thuộc tuyến tụy người), enzym
chính để phân nhỏ mỡ trong hệ tiêu hóa người, biến đổi triglyceride trong dầu ăn
thành monoglyceride và các acid béo tự do.
Các lipase bao gồm các phospholipase và shphingomyelinase đóng các vai trò khác
nhau.

- 25 -
Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

b) Cấu trúc

Trong khi một dãy sắp xếp thay đổi khác nhau các enzym lipase về mặt di truyền
được tìm thấy trong tự nhiên, và là kết quả của vài loại gấp cuộn các protein và cơ chế xúc
tác, hầu hết đều dựa vào sự gấp cuộn alpha, beta hydrolase và tận dụng 1 trymotrypsin giống
như cơ chế thủy giải đòi hỏi 1 serine nucleophile, 1 acid dư thừa (thường là aspartic acid) và
1 histidine.
Nhiều lipase được sản xuất bởi vi khuẩn gram âm đòi hỏi 1 protein chỉ thị giúp đỡ, 1 lipase
cuộn đặc biệt để đạt được trạng thái tự nhiên của chúng , gấp cuộn đầy đủ và hình dáng sinh
học hoạt động

c) Sử dụng trong công nghiệp:

Lipase từ vi khuẩn và nấm giữ 1 vai trò quan trọng trong tập quán của người cổ đại như
lên men yogurt và phô mai. Tuy nhiên, lipase cũng đang được khai thác như một chất xúc tác
rẻ và đa năng để phân giải chất béo. Ví dụ, các công ty công nghệ sinh học đã tạo ra các
enzym lipase tái tổ hợp để bán ra thị trường nhằm sử dụng vào các ứng dụng của nó như
nướng bánh, chất tẩy rửa hoặc thậm chí là chất xúc tác sinh học để chuyển dầu thực vật thành
nhiên liệu.

- 26 -
Các phương pháp cố định enzyme GVHD:PHAN MINH ANH
THƯ

Tài liệu tham khảo:

1/ Công nghệ enzyme – Nguyễn Đức Lượng ,NXB Đại học Quốc Gia TP.HCM 2004

2/ Hóa sinh công nghiệp – Lê Ngọc Tú. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật Hà Nội 2005

- 27 -