P. 1
các phương pháp cố định enzyme

các phương pháp cố định enzyme

|Views: 686|Likes:
Được xuất bản bởinguyetrinh

More info:

Published by: nguyetrinh on May 18, 2011
Bản quyền:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOCX, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

06/19/2013

pdf

text

original

Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.

PHAN MINH ANH THU

ŵŴ

MUC LUC


1.TONG QUAN ..................................................................................................................... 3
1.1) dinh nghia enzyme .............................................................................................. 3
1.2) ban chât cua enzyme ........................................................................................... 3
1.3) phân loai enzyme ................................................................................................ 3
1.4) enzyme cô dinh .................................................................................................. 3
1.5) Dác tinh enzyme cô dinh .................................................................................... 4
1.6) Y nghia enzyme cô dinh ..................................................................................... 5
2. CÁC PHUONG PHÁP CÓ DINH ENZYME ............................................................ 6
2.1) Nguyên tác ......................................................................................................... 6
2.2) Cac phuong phap................................................................................................ 7
2.2.1) phuong phap gán enzyme báng phuong phap công hoa tri ..................... 7
2.2.1.1) Kêt hop phân tu protein vao chât mang không hoa tan ................... 8
2.2.1.2) Kêt hop dông hoa tri cac phân tu enzyme riêng biêt voi chât mang lai
lai thanh môt dai phân tu ............................................................................ 14
2.2.2) Phuong phap goi enzyme trong khuôn gel .............................................. 16
2.2.2.1) Goi enzyme trong gel la cac polymer tông hop .............................. 16
2.2.2.2) Nhôt enzyme trong cac lô nho cua cac soi tông hop ...................... 16
2.2.2.3) Phuong phap goi enzyme trong cac bao vi thê .............................. 18
2.2.2.4) Phuong phap tiên polymer dê goi cac chât xuc tac sinh hoc .......... 20
2.2.3) Phuong phap hâp phu trên bê mát cac chât co hoác không co diên tich .. 21
3. MOT SÓ UNG DUNG CUA ENZYME CÓ DINH .............................................. 22

Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

ŶŴ

NHAN XÉT CUA GIÁO VIÊN





.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................
.........................................................................................................................................


Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

ŷŴ

1. TONG QUAN
Dšnh nghîa enzvme
nzyme la nhung chât xuc tac sinh hoc mang ban chât protein, co dây du tinh chât cua
môt chât xuc tac. Tuy nhiên enzyme co cuong luc xuc tac manh hon nhiêu so voi cac loai xuc tac
vô co.
n chât cua enzvme
nzyme la môt loai protein do sinh vât tông hop, va tham gia vao cac phan ung sinh hoc.
nzyme la nhung chât huu co co phân tu luong lon tu 20 000 dên 100 0000 dalton. Do
co kich thuoc lon nhu vây nên cùng nhu protein, enzyme không di qua mang ban thâm.
nzyme co thê hoa tan trong nuoc, dung dich muôi loãng, trong dung môi phân cuc,
nhung không hoa tan trong cac dung môi không phân cuc. Dung dich cua enzyme co tinh chât
cua môt dung dich keo ua nuoc. Khi hoa tan trong nuoc, cac phân tu nuoc luõng cuc së kêt hop
voi cac ion, cac nhom ion hoác cac nhom phân cuc trong phân tu enzyme tao thanh lop vo
hydrat.
Cùng giông nhu protein, enzyme không bên voi tac dung cua nhiêt dô. Duoi tac dung cua
nhiêt dô cao, enzyme bi biên tinh va mât kha náng xuc tac, muc dô giam hoat tinh cua enzyme
tuong ung voi muc dô biên tinh cua protein enzyme. nzyme cùng co thê bi mât hoat tinh do cac
tac nhân gây biên tinh nhu axit, kiêm manh hay cac loai muôi co nông dô cao.
Trong diêu kiên diên li cua môi truong, enzyme co thê tôn tai o dang anion, cation hay
dang trung hoa vê diên. Chinh do tinh chât nay, chung ta co thê phân tach cùng nhu xac dinh dô
thuân khiêt cua enzyme báng phuong phap diên di.
Tu nhung dác diêm trên cho thây ban chât hoa hoc cua enzyme la protein.

1.3) Phân loai enzyme
Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

ŸŴ

Dua vao tinh dác hiêu phan ung cua enzyme , tu nám 1960 hôi hoa sinh quôc tê (IUB) dã
thông nhât phân loai enzyme thanh 6 lop, danh sô tu 1 dên 6. Cac sô thu tu nay la cô dinh cho
môi lop:
1- Oxydoreductazase: cac enzyme xuc tac cho phan ung oxy hoa khu.
2- Transpherazase: cac enzyme xuc tac cho phan ung chuyên vi.
3- Hydrolazase: cac enzyme xuc tac cho phan ung thuy phân.
4- Liazase: cac enzyme xuc tac cho phan ung phân cát không cân nuoc , loai nuoc tao thanh
liên kêt dôi hoác kêt hop phân tu vao liên kêt dôi.
5- Izomerazase: cac enzyme xuc tac cho phan ung dông phân hoa.
6- Ligazase: cac enzyme xuc tac cho phan ung tông hop co su dung liên kêt giau náng
luong cua ATP,.

1.4) Enzyme cô dinh
nzyme cô dinh hay con goi la enzyme không hoa tan duoc hiêu theo nghia hep
va nghia rông.
Theo nghia hŕp: enzyme không tan la nhung enzyme duoc dua vao nhung
pha riêng rë, pha nay duoc tach riêng voi pha dung dich tu do. Pha enzyme không
hoa tan trong nuoc va duoc gán voi nhung polimer ua nuoc co trong luong phân
tu lon (Michael Trevan).
Theo nghia rũng. cac chât xuc tac cô dinh la cac enzyme, tê bao, co thê
sông o trang thai cho phep su dung lai (Klaus mosbach).
Nhu vây theo nghia rông, enzyme cô dinh bao gôm ca enzyme dã duoc cô
dinh vao môt chât mang, bao gôm ca enzyme co trong tê bao sông duoc cô dinh
trong cac binh phan ung sinh hoc co su gán kêt vao môt chât mang cho phep ta su
dung nhiêu lân.
nzyme cô dinh thuong la enzyme hoa tan duoc gán vao môt chât mang
báng nhiêu kÿ thuât khac nhau. Nho qua trinh gán kêt nay ma enzyme chuyên tu
trang thai hoa tan sang trang thai không hoa tan goi la enzyme cô dinh.



Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

ŹŴ

1.5) Dàc tính enzyme cô dinh
nzyme cô dinh co hoat dô riêng thâp hon hoat dô riêng cua enzyme hoa
tan
Do khi gán enzyme vao chât mang duoi anh huong cua diên tich o
chât mang cho hinh thê enzyme thay dôi do do kha náng xuc tac
cùng bi thay dôi.
Do cac enzyme bi nhôt trong khuôn gel môt sô co chât co kich
thuoc phân tu lon không tiêp xuc duoc voi enzyme do do ma hoat
luc enzyme giam.
Do tuong tac protein - protein giua cac phân tu enzyme dã cô dinh
lam biên dang môt phân câu truc không gian cua phân tu enzyme.
nzyme cô dinh tuân theo dinh luât Michaelis-Menten. Tuy nhiên, trong
phan ung giua co chât voi enzyme cô dinh co nhung sai khac nhât dinh:
Co thê së xay ra hiên tuong canh tranh co chât voi enzyme va chât
mang.
Hiên tuong can tro khuyêch tan co chât va cac san phâm cua phan
ung lam giam tôc dô phan ung.
nzyme cô dinh co tinh bên nhiêt hon enzyme hoa tan cung loai vi chung
duoc bao vê trong chât mang.
nzyme cô dinh co xu huong chuyên dich pH tôi uu sang kiêm hoác acid
so voi PH tôi uu enzyme hoa tan chu không trung voi pH tôi uu cua
enzyme cung loai.
nzyme cô dinh co kha náng bao quan lâu hon va bên voi cac chât kim
hãm cùng nhu cac tac nhân gây biên tinh hon.
Co thê su dung nhiêu lân.

nghîa enzvme cŧ dšnh
nzyme hoa tan sau khi su dung thuong lân vao cung voi san phâm không tach ra
duoc. Nêu tach ra thi enzyme bi vô hoat, vi vây voi môt luong enzyme nhât dinh chi co
thê su dung duoc môt lân, hon nua kem bên.
Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

źŴ

$u dung enzyme cô dinh co môt sô y nghia:
Môt luong enzyme su dung láp di láp lai duoc nhiêu lân trong môt thoi
gian dai ma hoat tinh enzyme cô dinh it thay dôi trong nhung lân tai su
dung. Dác diêm nay co y nghia rât lon trong kÿ thuât, nho do co thê tai su
dung nhiêu lân giam chi phi cho viêc san xuât enzyme.
nzyme không lân vao trong san phâm do do tranh duoc anh huong không
tôt dên san phâm. Do do giam chi phi cho viêc tach enzyme ra khoi san
phâm. $an phâm cuôi cung co thê coi nhu la san phâm tuong dôi sach.
Dung enzyme cô dinh co thê ngung nhanh chong phan ung khi cân thiêt
báng cach tach ra khoi co chât.
$u dung enzyme cô dinh co y nghia kinh tê lon hon su dung enzyme hoa
tan nhiêu lân.

2. CÁC PHUONG PHÁP CÓ DINH ENZYME
Theo kÿ thuât chê tao enzyme cô dinh, enzyme duoc gán vao môt vât mang nao do.
Nhung vât mang nhu vây co thê la cellulose va cac dân xuât cua no, cac hat kinh xôp, gel
polyacrylamide, sephadex, collodium, tinh bôt, cac loai allumosilicate va oxide kim loai.
2.1) Nguyên tàc
Co 3 phuong phap diêu chê cac enzyme cô dinh:
Gán báng liên kêt dông hoa tri phân tu enzyme vao chât mang không hoa
tan hoác gán cac enzyme voi nhau dê tao nên dai phân tu không hoa tan.

Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

ŻŴ

Dinh enzyme lên bê mát chât mang hoác vao trong long khuôn gel
co kich thuoc lô kha nho du dê giu enzyme, con dê cac chât khac qua lai tu
do

Hâp phu enzyme lên trên cac chât mang không hoa tan co mang hoác
không mang diên tich

.

Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

2.2) Các phuong pháp.
2.2.1) Phuong pháp gàn enzyme bàng liên kêt dông hóa tri.
Da sô enzyme cô dinh thu duoc báng phuong phap nay. Voi phuong phap nay co
thê thu enzyme cô dinh báng hai cach:
Kêt hop phân tu protein enzyme vao chât mang không tan.
Kêt hop dông hoa tri giua cac phân tu enzyme voi chât mang.


2.2.1.1) Kêt hop phân tu protein vào chât mang không tan.

Các yêu câu dôi vói chât mang: chât mang cân co nhung tinh chât nhu sau:
Co dô hoa tan thâp va bên vung dôi voi cac tac dông co hoc va hoa hoc.
Không co tac dung kim hãm dên enzyme.
Không hâp phu phi chon loc dôi voi cac protein khac.
Chât mang phai co ban chât hao nuoc tôt vi chât mang ki nuoc co thê së gây ra tac dung
uc chê dên enzyme duoc liên kêt.
Viêc gán enzyme së co hiêu qua khi diên tich cua enzyme va chât mang khac nhau.
Môt sô chât mang thuòng dùng
Cac chât mang loai nay thuong la polypeptit, polysacarit dân xuât xelluloza, dextran
(DA xelluloza, CM xelluloza, DA sephadex, CM sephadex), agaroza va cac chât
polyme tông hop khac nhu: polyacrylamit, polystirol, polyamid va cac chât vô co: silicagel,
bentonit, nhôm hydroxit,.Chât mang phô dung hon ca la dextran co liên kêt ngang (sephadex)
va agaroza hat (sepharoza) ca hai loai chât nay dêu co câu truc lô xôp khiên cho cac phân tu lon
co thê xâm nhâp vao gel môt cach dê dang. Polyacrylamit cùng la chât mang rât tiên loi vi co dô
bên vung co hoc va hoa hoc cao.
Chât mang vô co thuong rât bên dôi voi nhiêt, co hoc, voi dung môi huu co va voi cac vi
sinh vât va nhât la không bi biên dôi câu hinh cua khuôn khi thay dôi tinh chât cua môi truong
xung quanh. Nhiêu dân liêu dã chung to ráng enzyme dinh voi khuôn vô co khi bao quan thuong
bên vung hon enzyme gán voi khuôn polyme huu co.
Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

Tham gia tao thanh cac liên kêt dong hoa tri co thê co cac nhom chuc cua phân tu protein
enzyme nhu nhom þ- va v- carboxyl COOH cua acid asparaginic va aid glutamic, nhom c-NH2
cua lysine, nhom þ-$H cua cysteine, vong phenol cua tyrosine, nhân imidasol cua histidine, cac
nhom OH cua serine, threonine, nhom guanidine cua arginine va imidasol cua tryptophan.
Quá trình cô dinh enzyme.
Qua trinh kêt hop enzyme co thê xay ra qua môt giai doan nêu chât mang co chua cac
nhom co kha náng tham gia truc tiêp voi nhom amin cua protein enzyme. Vi du: chât dông trung
hop anhydrid maleic va etylen dê liên kêt dông hoa tri giua nhom 1-amin cua lyzin o phân tu
enzyme voi gôc anhydrit maleic cua polyme.
Truong hop nguoc lai la qua trinh xay ra qua hai giai doan:
Giai doan dâu dê hoat hoa chât mang báng cach dua vao cac nhom co kha náng phan ung
hon.
Giai doan hai la giai doan kêt hop voi enzyme.
Cac chât mang co chua nhom amin nhu aminobenzoylxelluloza, polyaminostriol,
copolyme cua paminophenylalanin co thê duoc hoat hoa báng phan ung Diazo:
Vi du: polyaminostyrol truoc hêt duoc diazo hoa báng natri nitrit trong dung dich môi
truong acid thanh muôi diazo, sau do moi kêt hop voi enzyme:



Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

ŵŴŴ

Muôi diazo cua chât mang hoat hoa co thê phan ung không chi voi nhom amine, ma ca
voi nhom phenol, imidazol cua protein cua cac enzyme.
Vi du:


Phan ung kêt hop enzyme duoc tiên hanh nhanh chong trong diêu kiên nhiêt dô thuong
va trong dung dich nuoc trung tinh.
Nêu chât mang co chua nhom amin co thê hoat hoa báng cach cho tac dung voi
phosgen hoác tiophosgen dê tao thanh dân xuât izozianat hoác izotioxianat. Cac nhom
izoxianat hoác izotioxianat o pH trung tinh së liên kêt dê dang voi gôc N cuôi va
nhom 1 - amin cua enzyme.



Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

ŵŵŴ

Báng phuong phap nay nguoi ta dã diêu chê duoc cac dân xuât enzyme không tan nhu
tripxin, kimotripxin, -, . - amilasae, glucoamilaza.
Nêu chât mang co chua nhom COOH nhu CM xelluloza hoác nhua tông hop cân
duoc hoat hoa truoc khi cho tac dung voi enzyme báng cac phuong phap azide,
cacbodiimit, anhydrit kep.
- Hoat hoa báng phuong phap azide:
Hiên nay phuong phap nay duoc xem la phuong phap hang dâu. Cac chât mang chua
nhom chuc COOH cua CM-cellulose polyacrylamide va nylon co thê hoat hoa báng phuong
phap nay. Truoc hêt la ester hoa CM-cellulose. $au do chuyên ester thanh hydrazide, rôi azide.
Azide trong môi truong kiêm së phan ung voi NH
2
cua enzyme.
Phan ung së diên ra theo so dô:







Cac enzyme không tan nhu tripxin, AND-aza, kimotripxin, Iixin, bromelin dã duoc diêu
chê báng phuong phap nay.
- Hoat hoa báng phuong phap cacbodiimit:
Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

ŵŶŴ

Cac chât mang co ban chât polysaccharide (-OH) thuong duoc hoat hoa so bô báng
cyanogenhalogenur. Phan ung hoat hoa xay ra trong môi truong kiêm. Chât mang hoat
hoa co kha náng liên kêt công hoa tri voi NH
2
cua protein enzyme.
.
PORAH va Bar-li lân dâu tiên dã hoat hoa cellulose, agarose va dextran báng phuong
phap nay. Qua trinh hoat hoa diên ra nhu sau:







Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

ŵŷŴ

Giai doan kêt hop:


Khi xu ly polysaccharide báng BrCN së tao ra imidocarbonate va carbamate. Carbamate
bên vung, con imidocarbamate tuong tac voi NH
2
bâc nhât cua enzyme trong diêu kiên môi
truong kiêm vua phai. Chât hoat hoa BrCN va cac san phâm trung gian tao thanh rât dôc, do do
cân co cac thiêt bi bao vê trong khi tiên hanh nghiên cuu, san xuât. Dê tranh tinh trang ô nhiêm
nay, Kohn va Wilchek dã cai tiên thanh phuong phap 'cyano-transIer¨, phuong phap nay hiêu
qua va don gian hon. Mác du vân su dung BrCN nhung duoc hoa tan trong dung môi acetonitrile
hoác aceton va thêm vao triethilamin. Dang triethylammonium nitrile co kha náng hoat hoa tôt
cac polysaccharide o môi truong pH trung tinh. Tuy nhiên nêu nhom hoat hoa qua nhiêu së la
nguyên nhân lam giam hoat tinh enzyme cô dinh.



Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

ŵŸŴ

2.1.1.2) Kêt hop dông hóa tri các phân tu enzyme riêng biêt vói chât mang lai thành
môt dai phân tu không hòa tan
Cùng co thê diêu chê cac enzyme báng cach dinh cac phân tu enzyme lai voi nhau nho
cac tac nhân luõng hoác da chuc.
Nguoi ta thuong dung aldehit glutaric dê gán cac nhom amin cua lyzin o cac phân tu
enzyme.
Krechards (1964) dã cho cac tinh thê 'cacboxipeptidaza A¨ tac dung voi dung dich
aldehit glutaric 1° sau khi tac dung enzyme tro nên không tan trong NaCl 1M va vân giu duoc
30° hoat dô so voi ban dâu.
Habeed (1967) cùng dã diêu chê dân xuât tripxin không tan báng cach dung aldehit
glutaric 2° dê liên kêt cac phân tu enzyme cùng nhu gán enzyme vao aminoetyl -xelluloza.
Cac enzyme thu duoc báng liên kêt dông hoa tri thuong co tinh rán do enzyme duoc liên
kêt vao chât mang. Tuy sô luong enzyme duoc cô dinh it hon truong hop goi hoác cô dinh báng
hâp phu, nhung su tôn thât do giai phong ra môi truong lai tôi thiêu.
Ngoai ra, kiêu cô dinh nay thuong lam táng tinh chông chiu cua enzyme dôi voi cac yêu
tô biên tinh, do do dê thuc hiên duoc trong công nghiêp phai dung cac binh phan ung liên tuc.
Khi su dung phuong phap hoat hoa báng cyanogen bromide, cyanogen bromide va cac
san phâm trung gian tao thanh rât dôc. ChloroIormate co thê duoc su dung dê tao ra cac san
phâm trung gian tuong tu nhung không co dôc tinh.
Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

ŵŹŴ

phuong pháp gói enzyme trong khuôn gel
nzyme acrylamine monomer:

":v trinh cŧ dšnh enzvme bœng phuong phap nhŧt
Dây la phuong phap dua trên co so tao môt mang boc hay môt polymer. Cac chât tham
gia phan ung va san phâm phan ung cua no co thê thâm thâu vao trong hoác ra ngoai thông qua
mang boc nay va enzyme së duoc giu nguyên trong khuôn gel do.
Dê goi enzyme vao khuôn gel nguoi ta tiên hanh trung hop hoa cac gel khi co mát dông
thoi enzyme. $au khi hoan thanh qua trinh thi enzyme bi giu chác trong gel. Gel dã co enzyme
co thê nghiên nho báng cach dông hoa hoác ep qua rây co lô nho rôi dem sây khô o nhiêt dô
thâp.
Nguyên liêu tao gel dê nhôt enzyme duoc nghiên cuu kÿ va dã duoc ap dung rât thanh
công o nhiêu nuoc trên thê gioi.
Dân xuât enzyme loai nay lân dâu tiên do BernIeld (1993) thu duoc báng cach trung hop
acrylamit voi N, N`-metylenbisacrylamit. Phuong phap nay thuong dung gân dây do chât trung
Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

ŵźŴ

hop thu duoc dê tao thanh dang hat va tuy thuôc diêu kiên tiên hanh ma gel co thê co dô xôp
khac nhau.
nzyme không tan 'goi¨ trong gel kiêu nay thuong phân bô không dêu. Chi nhung phân
enzyme nám gân bê mát gel la tiêp xuc duoc voi co chât va tham gia hoat dông xuc tac.
2.2.2) Phuong pháp gói trong khuôn gel
2.2.2.1) Gói enzyme trong gel là các polymer tông hop
Cac gel co thê duoc hinh thanh tu cac polymer tông hop nhu: polyacrylamit, hydroxyletyl
2 metacrylat dã tao phuc cang cua báng etylenglycoldimetacrylat, polyvinyl, polyureetan.
nzyme duoc hoa tan va phân tan trong môt dung dich monome va sau do trung hop
trong su co mát môt hay nhiêu tac nhân tao phuc cang cua. Gel co thê cát thanh mang dát trên
môt gia rán, hoác cùng co thê nghiên nho thanh bôt sau khi khu nuoc.
Alginat va caraghenan lây tu rong biên thuong co kha náng tao gel tôt va rât thuân loi dê
bao goi cac enzyme hoác tê bao nguyên ven. Co thê tao khôi duoi dang viên co duong kinh 0.5
4 mm báng cach nho tung giot dung dich natri alginat 2° vao trong dung dich giau canxi clorua.
2.2.2.2) Nhôt enzyme trong các lô nho cua các soi tông hop
Nám 1972, Dinelli dã tiên hanh môt thi nghiêm kha dôc dao la nhôt enzyme trong hê soi
va nhung nghiên cuu nay duoc kêt thuc vao nám 1978. Theo kêt qua nghiên cuu cua Dinelli,
enzyme khi duoc nhôt vao hê soi phat huy kha náng xuc tac rât tôt.
Voi cach nay nguoi ta cho dich long chay tuân hoan bên trong soi do do han chê duoc su
phân cuc bê mát va su bit lâp thuong gáp voi cac mang.
Phuong phap Dinelli duoc tiên hanh giông nhu tao soi xellulose trong công nghiêp dêt.
Môt nhù tuong cua xellulose triaxetat trong metylen clorua va enzyme trong dung dich dêm co
chua glycerol duoc ep dun qua môt khuôn loc duoi ap suât nito. Cac soi di ra khoi khuôn duoc
nhung vao trong môt cai bê dông tu co chua toluel, sau do duoc lam khô trong chân không.
Phuong phap nhôt enzyme trong soi co kha náng xuc tac phan ung tôt hon phuong phap
nhôt enzyme trong gel. Boi vi cac soi nay bên voi axit yêu hoác kiêm yêu, luc ion cao va chiu
Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

ŵŻŴ

duoc môt sô dung môi huu co. Tinh chât trên phu thuôc rât nhiêu vao ban chât hoa hoc cua cac
polymer tao ra loai soi nay. Tuy nhiên phuong phap nay chi thich hop dôi voi nhung enzyme kho
bi mât hoat tinh trong cac dung môi không hoa lân voi nuoc.
Bang - Các loai soi duoc dùng dê nhôt enzyme
STT Loai soi Enzyme cô dinh
1
Cellulose
Amyloglucosidase (C.3.2.1.3)
Acetyl cholinesterase (C.3.1.1.7)
2
Cellulose acetate
Amino acylase (C.3.5.1.14)
Fumarate hydratase (C.4.2.1.2)
Glucoamylase (C.3.2.1.3)
D-gluco isomerase (C.5.3.1.5)
Dihhydropyrimidinase (C.3.5.2.2)
.-D-Iructo Iuranosidase (C.3.2.1.26)
Penicillin amidase (C.3.5.1.11)
Tryptophan synthetase (C.4.2.1.20)
Dipeptidyl peptidase (C.3.4.14.1/2)
3
Polyvinyl alcohol and
cellulose
Urate oxidase (C.1.7.3.3)
Urease (C.3.5.1.5)
4
Polyvinyl alcohol
Iibers
Invertase (C.3.2.1.26)
Amynoacylase (C.3.5.1.14)
5 Polysulphone/ Glucoamylase (C.3.2.1.3)
Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

ŵ%Ŵ

Polyethylenenimine
6 PVC Lipase (C.3.1.1.3)
7 Polypropylene Iibers Lipase (C.3.1.1.3)

Trong sô cac loai soi trên thi Cellulose acetate duoc su dung nhiêu nhât.
2.2.2.3) Phuong pháp gói enzyme trong bao vi thê (microcapsul)
Nám 1964, Chang la nguoi dâu tiên tao ra vi nang dê nhôt enzyme. Phuong phap nay co
uu diêm la enzyme duoc nhôt trong do kha bên voi moi tac dông bên ngoai va su dung duoc
nhiêu lân.
nzyme duoc goi trong cac bao vi thê co mang ban thâm duoc tao ra tu cac polymer co
kich thuoc lô du nho dê ngán can su khuêch tan cua enzyme ra ngoai va du lon dê co chât di vao
va san phâm di ra.
Co nhiêu phuong phap goi enzyme trong microcapsul, sau dây la môt trong nhung
phuong phap do. Cho môt dung dich long chua enzyme va môt monome ua nuoc trong môt dung
môi huu co không hoa lân trong nuoc dê tao nhù tuong, sau do thêm môt monome ky nuoc dê
phan ung trung hop tao ra môt mang bao quanh nhung giot long nho, thuong phai thêm vao môt
tac nhân hoat dông bê mát dê lam bên nhù tuong cùng nhu dê diêu chinh kich thuoc, cac capsul
co duong kinh mong muôn co thê tu 1 dên 100 3m.






Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

ŵ%Ŵ

Bang - Nguyên liêu tao vi nang dê nhôt enzyme
$TT Nguyên liêu tao vi nang nzyme
1
Nitro cellulose
.-D-galactosidase (C.3.2.1.23)
Asparaginase (C.3.5.1.1)



2
Collodion
Alcohol dehydrogenase (C.1.1.9.1)
Maltate dehydrogenase (C.1.1.1.37)
Catalase (C.1.11.1.6)
Piruvate Kinase (C.2.7.1.40)
Hexokinase (C.2.7.1.1)
Urease (C.3.5.1.5)
3 Nylon .-D-galactosidase (C.3.2.1.23)
4
Polyurea
Asparaginase (C.3.5.1.1)
D-glucose oxidase (C.1.1.3.4)
5 Polyelectrolyte complex Lactate dehydrogenase (C.1.1.1.27)
6 Poly (2-hydroxyethyl)
methacrylate
Urokinase (C.3.4.21.31)
7 K-Carrageeman .-D-galactosidase (C.3.2.1.23)
8 Coated liposomes D-glucose oxidase (C.1.1.3.4)
9 Polyethylen glycol Alkaline Protease (C.3.4.21.14)
10 $tyrenebutadien
ruber/polyvinyl alcohol
Lipase (C.3.1.1.3)
Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

ŶŴŴ

11 thyl cellulose Triacylglycerol lipase (C.3.1.1.3)
12
Polystyrene
Catalase (C.1.11.1.6)
Urease (C.3.5.1.5)

2.2.2.4) Phuong pháp tiên polyme dê gói các chât xúc tác sinh hoc
Cô dinh enzyme báng phuong phap nay co nhung uu diêm nhu sau:
Qua trinh goi rât don gian trong nhung diêu kiên nhe nhang.
Cac chât tiên trung hop không chua cac monome co anh huong xâu dên enzyme dã duoc
goi.
Câu truc mang luoi cua gel co thê duoc diêu chinh báng cach dung cac tiên polyme co
chiêu dai chuôi bât ky.
Cac tinh chât hoa ly cua gel (nhu su cân báng hao nuoc ky nuoc, ban chât ion) co thê
dinh huong truoc báng cach chon cac tiên polyme thich hop vôn dã duoc tông hop hoa
hoc trong diêu kiên váng mát enzyme.
Môt sô phuong pháp tiên polymer thuòng dùng:
Phuong pháp tao liên kêt chéo giüa các tiên polyme bàng cách chiêu quang dê gói
enzyme
Khi chiêu tia cuc tim gân lên dung dich co chua tiên chât polyme va enzyme thi së tao ra cac
liên kêt cheo giua cac gôc cua tiên polyme va môt gel duoc hinh thanh bao lây enzyme.
$u bao goi enzyme báng phuong phap nay co thê tiên hanh o diêu kiên nhe nhang, tranh
duoc cac thay dôi pH qua kiêm hoác axit, va thoi gian lai rât nhanh, chi trong vong 3-5 phut.
Chât nhua tiên polyme co thê quang liên kêt cheo thuong la nhung chât sau:
O PGM: polyetylenglycol dimetacrylat duoc tông hop tu polyetylenglycol.
O NT: metacrlat va NTP duoc tông hop tu hydroxyetylacrylat trong do
PGM va NT hoa tan trong nuoc con NTP không hoa tan trong nuoc.
Voi phuong phap nay co thê goi enzyme, tê bao vi sinh vât, hoác cac co quan bao báng cach
trôn môt hôn hop gôm co chât tiên polymer, môt chât nhay quang nhu: benzoinetyleter (hoác
Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

ŶŵŴ

benzoinizobutyleter) môt dung dich huyên phu co chua enzyme, dung dich dêm thich hop cho
chât tiên polyme hao nuoc (hoác môt dung môi thich hop nêu chât tiên polyme la ki nuoc). $au
do chiêu tia cuc tim gân co chiêu dai song tu 300 400 nm) (dat cuc dai o buoc song 360 nm)
trong 3 phut.
Phuong pháp tiên polyme ureetan
Cô dinh cac enzyme báng cach trôn chât tiên polyme ureetan voi dung dich nuoc cua enzyme
la phuong phap kha don gian va thuân loi vi cac gôc chuc náng izoxianat o hai dâu cuôi cua
ureetan chi phan ung voi nhau trong diêu kiên co mát nuoc dê tao thanh liên kêt cheo ure va giai
phong cacbon dioxit. Gel dê dang hinh thanh trong vai phut va bao goi lây enzyme.
Co thê thu duoc cac tiên polyme hao nuoc, hoác ky nuoc báng cach thay dôi ty lê giua
polyetylenglycol va polypropylenglycol. Vi du: PU 3 co nông dô polyprotylenglycol cao së tao
cac gen ky nuoc, trong khi do PU-6 va PU-9 co nông dô polyetylenglycol cao së tao duoc gel
hao nuoc.
Dang công thuc chung cua tiên chât polyme nuoc (PU):

2.2.3). Cô dinh enzyme bàng phuong pháp hâp phu trên bê màt các chât có hoàc không có
diên tích.
Voi phuong phap nay enzyme duoc hâp phu trên cac chât co hoat tinh bê mát nhu: than
hoat tinh, xellulose, tinh bôt, dextran, collagen, albumin, agarose, kitin, polyacrylamit, nylon,
polystirol,.va môt sô nhua trao dôi ion, silicagel thuy tinh.
Trong truong hop chât mang không co lô enzyme duoc dinh vao chât mang thanh tung
lop trên bê mát.
Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

ŶŶŴ

Khi chât mang co lô xôp, cac phân tu enzyme së bam vao toan bô bê mát phia trong va
phia ngoai lô xôp.
Nêu chât mang co diên tich thi së tao thanh cac liên kêt ion. Phuong phap nay dua trên
kha náng tao liên kêt ion giua chât mang va enzyme, nguoi ta gán enzyme vao chât mang. Liên
kêt ion thuong không bên báng su hâp phu cua enzyme dôi voi chât mang. Voi phuong phap
nay, nguoi ta dã cô dinh duoc glucoamilase trên DA xellulose hoác trên DA sephadex.
Noi chung cac protease acid tinh nhu pepxin rât dê dang cô dinh trên DA xellulose, con cac
protease kiêm tinh nhu: tripxin, kimotripzin dê dang liên kêt voi CM-xellulose. Cac nhua trao
dôi ion co nên xellulose co kha náng hâp phu tu 2 50° protein enzyme.
3). MOT SÓ UNG DUNG CUA ENZYME CÓ DINH
Trong công nghiêp
Nám 1969 Wilson dã xây dung thanh công môt xuong thuc nghiêm dê san xuât liên tuc
glucoza báng glucoamilaza không tan.
Nám 1971 nguoi ta dã thanh công trong viêc dung kimotipin liên kêt dông hoa tri voi cac
cacboxmetylxelluloza dê lam dông tu sua thay cho renin dát tiên.
nzyme raxemaza không tan dã duoc su dung dê chuyên toan bô dang D - axit amin
thanh dang L - axit amin, lam táng gia tri dinh duõng cua san phâm lên gâp dôi.

Trong y hoc
Ureaza gán trong vi tiêu câu dã duoc su dung co kêt qua dê loai ure cua mau trong thân
nhân tao
Vi tiêu câu chua catalaza dã co thê thay thê môt cach co hiêu qua cac catalaza con thiêu
trong co.
Dua vi tiêu câu co gán enzyme L - asparaginaza vao co thê, co kha náng uc chê su phat
triên cua môt sô u ac tinh boi su phat triên cua cac u nay phu thuôc vao su co mát cua L-
asparagin.
Glucozidaza trong anh dao va hanh nhân dáng la .- enzym phân dôi cac heterosid, tao ra
acid cyanhydric duoc su dung trong cac duoc liêu.
nzym Muronaza cua bôt mu tac la enzym thuy phân sinigrosid, tao ra alylisothioxyanat
ma nguoi ta tim hoat tinh gây do da.
Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

ŶŷŴ

Lua mach nay mâm dung dê chê 'men diastaza duoc dung¨ (co chua toan cac enzym cua
hat: enzym amylaza, sucraza, manataza.v.v..).
Dich dua tuoi cùng nhu nhua Ficus hoác du du chua nhiêu proteaza va co tac dung tri
giun dùa.

Trong phân tích hóa sinh:
Glucooxidaza gán dông hoa tri voi polytol duoc dung dê xac dinh tu dông glucoza.
Diên cuc ureaza không tan dung dê xac dinh tu dông ure trên dong liên tuc.
Diên cuc alcoloxydoreducaza không tan dung dê xac dinh metanol, ethanol trong dung
dich nuoc.

Trong thuc phâm:
nzym cua cây tao chât vani cân thiêt lam cho xuât hiên mui thom cua vani.
Amylaza duoc chê tao o quy mô lon nhám su dung trong công nghiêp (nhât la dê lam
banh va trong côg nghiêp dêt) tu cac môi truong nuôi cây nâm Aspergill:s orizae. Cac
nâm ha dáng, nguôn cung câp cac chât khang sinh (Asperglill:s. Penicilli:m) cùng nhu
cac $treptomyces, hiên nay la nguôn cung câp quan trong cua enzym.


Ung dung cua môt sô enzyme

!apain:

nzyem nay co trong cây du du (carica papaya) va du du nui (Vasconcellea
cundinamarcensis)

a). Câu trúc
Bao gôm 212 amino acid duoc ôn dinh báng 3 câu nôi disulIide. Câu truc không
gian gôm 2 phân rõ rêt voi 1 khe o giua. Khe nay chua vung hoat dông chua dung
môt "bô ba xuc tac" duoc vi nhu chymotrypsin. Bô 3 xuc tac duoc lam tu 3 amino
Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

ŶŸŴ

acid - cystein - 25, histidine-159 va asparagines - 158.

b). Chúc nàng
Lam dut liên kêt peptide liên quan dên su deproton cua cys - 25 boi his - 159. Asn -
158 giup dinh huong nhom imido cua his-159 cho phep su deproton diên ra. $au do
cys-25 thuc hiên su tân công nucleophitic vao carbon carbonyl cua 1 mach peptide,
nhom amino cuôi cung cua mach peptide duoc tu do acyl-enzyme dông hoa tri ngay
lâp tuc. nzym bi deacylated boi phân tu nuoc, giai thoat carboxy cuôi cung cua
mach peptide.

c). Su dung
Ung dung cua enzyme nay la lam dut nhung tho thit dai va dã duoc su dung hang
ngan nám o Nam Mÿ. No duoc ban nhu la 1 thanh phân trong bôt lam mêm thit co
sán o hâu hêt cac siêu thi. Papain trong bôt lam mêm thit nhu Adolph's, lam thanh
hôn hop nhão voi nuoc cùng la 1 phuong phap cuu chua cho nhung truong hop bi
sua, ong, ong báp cay dôt, vêt muôi chich hoác vêt thuong do ca duôi gai dôc gây ra.
Pha huy nhung protein gây dôc trong noc. Thanh phân chinh trong cac thuôc chông
ngua ($top Itch va $top Itch Plus), môt loai kem (aid cream) trong cac phong thi
nghiêm công nghê giai phâu o Uc.
Papain duoc su dung trong phân tach tê bao buoc dâu tiên trong viêc chuân bi nuôi
cây tê bao. Môt phuong phap "xu ly 10 phut" cho nhung mâu mô nho (be hon 1mm
3
)
së cho phep papain bát dâu pha võ cac phân tu CM giu cac tê bao voi nhau. $au 10
phut papain phai duoc xu ly voi 1 chât uc chê dung phan ung protease dê pha cac
manh mô thanh cac tê bao don le. No cùng la 1 thanh phân trong 1 loai dung dich
enzym duoc chuân bi, dang chu y la Accuzyme. $u dung cho nhung vêt thuong sâu
dê rua sach cac tê bao chêt.
No cùng duoc tim thây nhu la 1 thanh phân trong kem danh ráng, keo bac ha nhu
1 chât lam tráng ráng. Tuy nhiên hiêu qua lam tráng ráng cua no trong kem danh ráng
va keo bac ha thi rât nho, boi vi papain it tâp trung, va së nhanh chong bi nuoc bot
lam loãng. Phai mât vai thang su dung san phâm lam tráng dê co duoc môt ham ráng
tráng hon.
Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

ŶŹŴ

Papain la thanh phân chinh trong papacarie, môt loai gel dê tây ráng. Bên canh su
thuân loi cua viêc tranh su dung cac dung cu cát quay, no cùng không anh huong dên
men ráng.

d) San xuât
Papain thuong duoc san xuât o dang thô, khô báng cach lây mu cua qua du du.
Mu duoc lây sau khi rach cô qua du du, phân khô trên qua nho giot vao vât chua.
Nhua nay së duoc lam khô hon. Buoc tinh chê thi cân thiêt dê loai bo nhung hop chât
bân. Qua trinh tinh chê nay bao gôm viêc lam hoa tan va chiêt. Papain tinh khiêt duoc
phân phôi o dang bôt hoác chât long.

2) Lipase:
Lipase la 1 ezyme tan duoc trong nuoc, xuc tac cho qua trinh thuy phân liên kêt
ester trong chât nên lipid không tan trong nuoc. Do do cac lipase bao gôm cac
esterase phân lop.
Lipase thuc hiên chuc náng cân thiêt trong viêc tiêu hoa, vân chuyên va xu ly cac
chât beo nhu triglycerid, dâu, mõ trong hâu hêt cac sinh vât sông. Gen mã hoa cho
lipase thâm chi hiên diên o cac virus.

a) Chúc nàng
Hâu hêt lipase giu 1 vi tri dác biêt trên "côt sông" glycerol cua chât beo (A1, A2
hay A3), vi du HPL (human pancreatic lipase - lipase thuôc tuyên tuy nguoi), enzym
chinh dê phân nho mõ trong hê tiêu hoa nguoi, biên dôi triglyceride trong dâu án
thanh monoglyceride va cac acid beo tu do.
Cac lipase bao gôm cac phospholipase va shphingomyelinase dong cac vai tro khac
nhau.

b) Câu trúc
Trong khi môt dãy sáp xêp thay dôi khac nhau cac enzym lipase vê mát di truyên
duoc tim thây trong tu nhiên, va la kêt qua cua vai loai gâp cuôn cac protein va co chê xuc
tac, hâu hêt dêu dua vao su gâp cuôn alpha, beta hydrolase va tân dung 1 trymotrypsin giông
Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

ŶźŴ

nhu co chê thuy giai doi hoi 1 serine nucleophile, 1 acid du thua (thuong la aspartic acid) va
1 histidine.
Nhiêu lipase duoc san xuât boi vi khuân gram âm doi hoi 1 protein chi thi giup dõ, 1 lipase
cuôn dác biêt dê dat duoc trang thai tu nhiên cua chung , gâp cuôn dây du va hinh dang sinh
hoc hoat dông

c) Su dung trong công nghiêp:
Lipase tu vi khuân va nâm giu 1 vai tro quan trong trong tâp quan cua nguoi cô dai nhu
lên men yogurt va phô mai. Tuy nhiên, lipase cùng dang duoc khai thac nhu môt chât xuc tac
re va da náng dê phân giai chât beo. Vi du, cac công ty công nghê sinh hoc dã tao ra cac
enzym lipase tai tô hop dê ban ra thi truong nhám su dung vao cac ung dung cua no nhu
nuong banh, chât tây rua hoác thâm chi la chât xuc tac sinh hoc dê chuyên dâu thuc vât thanh
nhiên liêu.












Cac phuong phap cŧ dšnh enzvme GJHD.PHAN MINH ANH THU

ŶŻŴ

Tai liêu tham khao:
1/ Công nghê enzyme Nguyên Duc Luong ,NXB Dai hoc Quôc Gia TP.HCM 2004
2/ Hoa sinh công nghiêp Lê Ngoc Tu. NXB Khoa Hoc va Kÿ Thuât Ha Nôi 2005



E.535E5.  30320'!%  
 

A% 

'  

                                                                             

  

...9.3O2434.943. /7.E...0320574903      !340320     . ..9 . 3  9:39.O9J3..9E. /397:3.33.49-3.293g3..33.895 .397433..43 . 39 .0320-35.. 3 J3/49J3.2.297.E.$.E.   32033. 29.E.3.0320 9.9. 9E..9E..2.9935 ..23-E392   320.O9939/3..9..4.943 4 ..3.../3. 297H3. ..4.9743539032094935.O9539E.83.2....E....9E.0320 320294574903/483.9E..04..9   333./3.. /:3/.35E5 3/   %33 .0320.O9-29499J3/4.O9.343 . 2499J3.OJ..9.53383.E./:32353.9.397433.93 .3.574903 03203 6:...23.3 0320.2:43 9743/:3253.9574903 .3-3.9O.33..0320 32033.E. 2..4 0320--39J3..E.9:.42:.O33 .9E.9E...33.39...3H3.339   3  /.O.  3..      3.33.5393.33-39J33.  30320'!%    %"&    l 33..535E5.E..39  .O539.33:84.4   %743 :3 3..29/:3/.9.9.3O253.574903 03203-3.. %:3H30320.. -39J3.. :3/.3.9 223.39743. .9E.9.O  9J3.E.E.5749030320 320. 9.

353 93 .3 .-K353383.4533.453353...3 0320./:3/.8 /33:3  320.E.9/4 !.E.:9043.429.836:.7 3.9E. 3 320..E..3  %043.:39 9739E.. .0320.0%70.E.3354207.  . 3-.45F59.3.9. 3. .9.429.3.4 53 3 93 5 .    .93.45F58/3 .9.3 ..0320.E.O839..4H39     4207.80.E.33.4533953    .3 -33:9:9E.0320  .O97439-483 .9. 43.:533.80.80.49J3 .8993...  30320'!%  .45334O.:3.E.3 -..429.0320....O 8 /3 H3 9 : 3g3 .80 ...9E.3.80.42.E.433 5..3.03203 .%!     320.7H37 5.. 3 ..O973.9.E.38507.0320....9..0320 9 -4 .9E. 3 9743..3330320 ...397433.42. 3.9E.3 .: 6:E97K339320320.5 .39739E3..7H3.5.303203... 0320 .9493 H39 4.3.92.4 25   /470/:.E.38..9E. . 3          .:8248-.. 9E.0320.95539. 5032039..9E.30320..3.9043...73 0320.     %7..0320 93g2 O.. 39..73  %043.9.    /74..4533 353O.9 839739E.9E..80.0320.. 3.3 .92.535E5..92.9 &   93395340320935  E389 3 E.

 533   320.    4 . 9.397.K. 9.293 .:97. 3 973 .3/.:8/39.3   320.E.9 . 3  320. :9E.E.0320.3.9....3 .3. .53 3229..: 0320 .03202   49.  3 320.O  3g3 -4 6:3 : .9.9K0320-.-4.92. 39J.9J30320..:8.574903 574903.3   O98/33:3      3.29.59. 3.4. 3.E....835239E.5393395.  /4 O  3g3 .08 03903  %: 3H3  9743 533.39....0320/4 O249 ..9E.9 2..7.F2-3      .O:.535E5. .0320.:3/.39E....3 ..33. .92.5390320 .O49 7H395. 3.3.4 K3 9 0320 9.. 3.34.3-9. -3 .E. .324.9743.3.9./ 84 .8352.3..30320.O338..4.: .3032039 3.3 .38.7. ..9 K2 2.3.0320.3.39 3  O987.9.9 2. 9.9..397:..33-39J3. 0320.3   39. 0320 - 39 9743 :3 0 29 8 .O9J3-339.  30320'!%     l.33..E.0320.34   320 . .E.O J..3..3..K.3  430320.3 . 3 9:3 904 3 :9 .33.49 .3. 5 9 .5390320   320 .349 7H3. ! 9 .. 9E. . 3 .9E3..E.O 98/3 . 3 2-3/32953.

O 3.O99E8 /33:32.9E..03207. 3O  .9 2.E.  30320'!%  $/30320.O 9  ..E..38/30320.3:39743299 .303208/35 5 . 3.5J.3. 23..79397439:9 3 O.E.E..35E5 :.92.34.   30320.:248..O298 3..: 943H3 539349.7.7.393. /3 :9 .3/2499J30320.0:480 .4/024    :H39. 3  3-3H39 34E975390320.O 3.4.2/0 805.E.3       .44/:2 93-9 .83 52 $352. 3  0320 .3.334 9.535E5..9  $/30320.4. .3.83:90320   32033.9 2.3 34 O  3 . 3..33:3      !.83529.! !l %04  9:9 . 9 J3 5  0 54.399 -3.  O5. .0320. 9.33 99 38352 4 O2.E.O9333.0320.4. 3.3 8.  9..3.4 29 .O3533.:.E.. 97433339E8 /3 l../0 .43. 3 .497438352/4 O97E3 .3.5J.90. 3J99.3 3.. .4. 94 0320 ..O9..9E.

E.92.3 .E..497433:30 .E3  0320 . .OJ.E.9.9 2.9E.3 .3 3 4 9.9 /4   5 5 0320 H3 97H3 .O 2.3 39J.34.6:. 32.535E5..        .3 4.  30320'!%   lJ30320H3-29..

:35420:.9 805.9.4029......:39.339...297.74.-3...3  0:4..3...5.9E./3 .3 4 3 9..35/3.79 /3 :9 0:4.3..  30320'!%    E. .393--3 ..379-3 . .74.4.3 :36:.E.4.E.535E5.O9E.29  548974  54. 39: ..O.4. 30320 . 8.   0:4..35E53.99..3   95 34E97..3.3E./0  805..3.3.3           E.9E43.O:6: 39J.339./3K22 30320   3555.E.-35.   3..3 805.O  -3.92.92.. .O987.39..3.35E5     !./0 .K..74.3  5450599  548.//3 !4..5390320.7.92.53.  805.35.303203./0  .:   98.K..E.3.93 :.O9235..4..O-3.4  92..574903E. ...93. .3 -3..:97.80320.OH393.9.3 :/3: .3.395. 54. 9J3.0320.3/3 E.92.35E530320-3H39 3O. 3.9.92..35E53 '5.:  O ...9.H:.303208.0  -039439 32/749 92.O.9 2.: ..H39   '. .   92./:32:..3.37993..O 99:0320.  95539574903.E.8.33.E.9 5420 93 5 E.O339J3.9E. .E..39730320 J3...3..92.  /097...5393 .3. 3.  955395749030320... 83.E.29.3  %   .. 3-3.-46:39.2/ .39 .7.E..E../097.O..:3..92...9 .:K3.3 ....92.92.97   l.

/:9.4. 3O2.2/.3/7/ 2.. 3O2 .E..O...35034...3/792.3O2.3   .80730 9704330 3O2:.23. 43  ..H39/34E97.3O2..3..E.2. 9 .O3g3533 .234503.  30320'!%  %.O9 7. 3O2‚  .O .E.3   ":E97K3...O..3 .O9.O9 ..95.  54.4 8. 3  53 9 0320.3O2× . 29.975945.6:E97K37.45420. /.89/30 ..5.5749030320 'J/.O3g39.. 2 97..2348974 97.4 4E -3 3.-3533.. 43 : 49O. 43.49O.E.97./..234-0340:4.2348974  .0320    %   .E. 3O2 1 ..89030 .84...: O295.2.9 2.6:.535E5.. 30320  ":E97K39 5 0320.9 3973 5 .7...7330. 3O2 .85...539574903 03203...0..84..3.3/30.92.7-4  .0. 97 .3..6:...2.9 2.5420  %7. 0903  H3 9 3O. . 4395.E. .23 .9493..353.23 3..0320   E.974830 332/.. .830 3O2× $.3-3..4 'J / 54.3O2.33. 43 3: .Ø .97 3979 9743 /:3 /.E.. ../932:/..

94.3.O .3.494. 494.3.9 2.3 ..4 9E.3O2 4.3O25034 2/.92.230 2...E.9 4..349O...O 9 49 O.0320   'J/   !33950320 .9454803 9493/3:94.9  5 97:3 9J3 8 H3 9 / /3 .23 . /3 . . 3O21 .E.3. -3 .3O2.O95333.97:39J3   : ..9333.O39743 :339 9. .4.  .3.3.23.: .4..9743/:3/..  30320'!%   :/.E.535E5.574903.. 3O2 .0320        .3 . .9 E.. 548034.

9../0     ..3...8.E. -3 5.3 5E5 .  . 4.3 5E53 %7.4. 97.032039. 5.9 2.2. 0320 -3 ...908907O.328533.35E5.. .935.. : .O.9048.35E5. 5.. .2../0 3 3.0 :.7. 3O2 .3 . 249753 13 -74203  ../0 7.0:480 54.  :...O 9 49 O.-35.-4/29 3.         E. 3O2 .-35....../3 :9032039.../0  /09743297.535E5....: O. 02  5.4 9E.E.3 .  .-4/29 . 343 . 0:4.   :.33.0320  !338/37..3 5E5 3 :  E. .  30320'!%   35... .3/79F5  494E-35.3 3.   .3 5E5 3 . .2/0 .9 2..E. /3 ..35E53  49O. 3. 9753 249753 .35E5 3 3. 49 O.0:480 $.9753  .:30890793/7.

 . ...3403./37. 8.3 . .32 92...0:480  .7480 .3 5E53 ":E97K349O.535E5.403:7 !3349O.9 548.E.7/0   9..7  3 : 9H3  49 O.349 O..3.97.. 49 O. - -3 ..3O.:           .3 -3 5.3 . /097..9743297.  30320'!%     E.8.5749030320   ! # .9 2.7.O3g3H39. .O -3 .

 0320 9743 : 3 2 97. .E.0  .90 -3 ..39743/:32.3597:39J3  %: 3H3 3: 3O2 49O.90..99--4.835297:3.3 9E..: 83:9 l97E39K397332 3  43 .535E5.2.O.7-43. .34 97..23 39709.7/0 297.9.38107 5..E.  30320'!%   .7-.3 ..7-...3  .548.9H2 ..7../.33.E...E.3949379 ..2...90 .5 949O.0943.35E5 3 : 6:. 3        .  -..38/373.3 5E5 .93935. 39 ...3 2/4.3.O 3g3 49O..32.90 9.7/0-378947.49709.6:E3: 8  3:H33322499J30320.2/4.7-. 4395    548. /4 O ..97439333H3..2243:2 3970.99 .2.0943970 4.3 .. .

329g39J3.3355/3. /3 .  E.9J3     .3 .-00/   .E. 53 9 0320  70.3 . .E.3 /3 .-45059/.E.  3 .35O4.393 29 5393.3403 -742/0 .:9E. /3 .39. 3J9...4 .. 9..4.3 94 93 79 .3.E.: 9-39J3 /4 O 9. .399:  47..9.53903207H3-9.7... ./09 :9...979..:3 . /:3 /. .E.E.0320 .39743.30320.389399/45O37.7/8    .9743.O 9 .O9J373/40320 ./09 :9.3 3.-K3533H39.E..33..90 .  .8.23 .-. 83 5297:3.297.  4741472. 93 9 .4..7.. 83 52 97:3 .3 :  . 9.33. 3O2 .92..E.3..:./09:9.92.30320 .33.-3H39 3O.H3 9.. 339.O ..E./30320973H339.23409 0:4.3 -3 .E.3 5E5 49 O.97.393.34.O9 :. J3.3  : .. :.9E. /3 :9 9753 3 9.3.3403 -742/0  . H39..  49 84.535E5.E.   8 /3 5.7.E.. 8 /3  94 7.03209: ..   9E.0320-3.. 3-3 55 3. -3 .E.5390320.E.E.5390320.3 %:8.  30320'!%      95 3O.. 3  ..397.

3/33 /4.97H3..O9929:..3.  20903-8.7.3535E53 9 l5.4:303..9735 .3O.0.535E5.29 !.2 .97430 0 .97H39   3:90320433 :9H3/407310/  9: .533.2302434207  ":97K3.7.34936:...  30320'!%   5. 7 .33:3.  30320.  .9.O0320 ..-3...8352533.99. F5 6:.E.E.03208 .35E5/.O29 3 90320 $.35E539...497434.O  3 7 02 8   39  95   :H3 :940  390320 .. 23-.7..2954207 E. 3H3.E.9339735O..:43936:E97K39K0320-.O9 33 3 -3 .35E5O03209743:30 320..9973    ..E5/37993 .E.: .7..29..3:H39743:30 O   lO0320. 3 4E 4.8942923-.

9.E.35E539032097438.94:0 8.:   32039.3.7999   '.9:4..O . 8.3939/:3/.3J3   22-3.E.9480:4809743..9E..O3g394099.7.3..: 3 . .: O .485E9:3g3.3.F5 36:. 9 9..E- 39..799:3  -..49743/:3/.3.. .29743.:.353-3 : 3353 0320323-29095.35...33.3   320 .39743-39.49 3.43.7.9. 33.:..0..3..8935  g2 30 933299J32E .O 5 E.39. 0.4/.9E.E.9..9-43:H3...2.3.: .3 O994/.      903209743.97.4 3g2   %04 9 6: 3H3 ..E.E.54..33   !.:.4O.03209743/:3/... 53 9E3 9743 29 /:3 /.7.47:..O9.:    .8-959.-30903. E.03204.074 .-29..09.  30320'!%  59: .335/9  939.2: .535E5. .E.9 945...3. :393 3 20.H3. 33 3H3 ...8 53./9493/3 9 .35.35E530 . .:3..E...O9..4.3 54:7009.47:.99323 997H3 29E73 4.O2929..E.: O 973 5 97438.8 7.:3 .3.99:.K.9E.3 O 97430:39.542079353.33945.03.E58:939.../3.29:3.O933393-98.35E5O9743:30     O032097430.E..53399.9974320903.      !.3. 2.   3.O3g3. 243420 .9.3 .O.K3939..3.9 54..9..O .7.29 /7409  209. 30  0320 .35E5 39032097430 .3:9E..83-3./..O9 .4/209.3.9:343-H397438/4 O3..54207935  E.93333....4974329. 9. E439032097438 ..E.0:48097.23   !.

2.5 .80        :.793:. 54207947.  3 E.80       .E.330320O -29499J39743./3 390320 $%%  0:480 .80       !03...80        234..E.483 %:3H35.997H359:...90 /74572/3.2/..80       %75945..4308907.80       5059/5059/..35E53.09..  30320'!%  .9O.E.9J.  17:.484207..383909.3.09.90/7.7.298/:32:./:32343.80       0:480.4.348/.80       :2.80     .941:7.48 .. %J3.3.535E5.80       :.9.4-3..

3.0:480  !4.   !4.3.44 1-078  !48:5430..3/ .44..

80          .904/.80       234..80       &70.80       :.80       3. 3 24:.4..80       48 320.079.2. &7.48/.

90 .46:.09.4.80        %7438.35E5O03209743-..O ..429 9E.80       5.3J32432:3.E.E.   O 3: 5.O99 3 32         %   ...  :.9.3.3 5E5 O 0320 9743 2.3.74..35E5 O 429/:3/.58:  8.947.4.3. :9H3947.:   29 9743 33 5..974329/:3 2:.O J.4 .0320.... 2 9E. 8 /3 ..E.58:   g2 .  30320'!%  !4090303230   !' !457450301-078 5....54207..-.34.2923-... 3:3   320 .9.29243420.: O9H2292434203.9E3.E.9 2.359H2.3.38:.  5339735947.8352 7.E...74..O23-E392 ..4897H39K0:480.3J. 399743 O E -3 .8/33:39      !.35E53.. 3 . 9439.: 2  0320 ...03207.535E5.3 390320 !.3349 3-29 2-339..3. . 3 -H3 34 ...397433. 3 3g3.9.58: .33..O .9.3 8.33.O9743.9 ..333933 9.

80         !4:70.3 4.535E5..97490.002.77.E./03 7:-07.80       043.90       .90/5484208 !40903.3.4 $97030-:9.0:480 85..80       &70.3.4250 !4  /7409  209.80         !400.  30320'!%  3 :H3:94.  :.903.3 390320 $%%  974.7.7.4804/.80          44/43  !7:.

.90/0/7403.44 .54.948/.  .9.  .80       &743.3.80       .7..80        %   .90/0/7403.3..44/0/7403.80       :H3:94.9..9.80       .948/.80       ..  .30!7490...80       5..80       .80       43 ..4804/.3 320 .80       .948/.80        :.3.80       85.

O33.  30320'!%    !4897030 &70.7..935420.3 59  93.93.9 4..9.9...    9.3%!3.935O.F4.7. O   :97.3: 30320  .6:.. H39..:9.3-3E43.F49.8.33974333 :3333   E. %! .3-4-3..535E5..243420......35E594H39.-3.E.83..:  ":E97K3O79 .. .9 3 6:.35E593542079...4 O 0320 -3 5.9359540903.9..9 .397433..4/209.99397353..3/3  !.80       ..O9 .3793.E..935420.397.E.  '5.9 . -3.3 3.397433.. -0343090907 4.03209K8947...943 .K393-..935420.9.8..:6:.3 5E5 3 ..9.0745..3 O 0320 .%..9.9 . 93 5 9 /7409.0 3...3 -3.98.9 93 54207  29 ...  30320-35.E.80            !.3.E. 973 29 3 5 2 ...O 9 93 3  : 3 3 33  97E3 .F4.40320  $ -.9354209J.E.290 .O96:.O3. .0:480 %7.9J23H3/:3/. 3.35E5935420 O..4  O % 209.9E..3290320   985.3H39.O.9743.23 .333.E.9 9743 O !.35E53.95420.:-9   E.83..9J3.E.7...3  .E./3..E.E.: 23.5..O9 3. 56:E24.O9O0320 9-4.O .35E53.E.3 .O .9743 :3.: O !540903...9O.:/. :.0..E.E...935420-3..80       .

3. $.97..O293./:3/.3.. 9743 O!& .92..9.39393 597H3-29     .9J23. 4. 29J. : .03 3..99354203.. 540903. 93 5420 E4 3..O 39J.. 5. 9493H39.4894 . .35E55597H3-29.  3. 9.O33 54574903.3 5E5 E .59.4O0320  O 9 9: .54574503..  30320'!%  -03434-:90907  29/:3/.F4:70.E.33..E.O.4894 ...2983.O33 540903. J3.. :7009...4 43 8... -3 .35E5935420:7009.  9  .. :35..4 .!& .0 E43.29  343  548974  %74397.535E5.:9743 :3.4..3  3.35.E.7.973.4..E.K .O..4.92.3.53:.3.3.9.4 'J/!& .29/:329J..:3.O0320 .-. .3 .-:23  ...0993  49 9J3  0:480  93 -9  /097.E..9935420E43..5597H3.4... -..93..7480  93  54.: .0320-3.3 3 ..E.533.  3.9.0320  5.: O.3. 9:3  . 5O3.E.9935420:7009.954203.O4.E..8O3 32  974359   !.9  .. 3g3 4.03  .. !&       30320-35.35E530320 .   '5.:/8O39   32  9.:9...O499J3-293.3  .E.-43/49 0//3K3939743.  4.4. .39.0320 /:3/..

O5 ..9:. 97.92.57490.E.505379//3.8352H35     %743. 03253 .9743.   l.0320 3.9 23.O 39J.30320.  &70.2.97H3 3g394H3943.80.39743...:3943-/3 .32 83:9H39.9K89493. 93.O3g3559  5749030320   %$l  %743.4..O30320 ..4.E.H3943 !.3.E.090748/ 947..:./9J33..7.47033 993   3207.85.....O29.333 3.3   g23.3 H3 9 43 9..3 3 -3 -3 8 5 5 .9J3-85E9973.9.E..:.4943--295J..92.97H3 805./.3... 9753  249753 / /3 H3 9 .O3g3.3   :.E..9 2.8/3.92.-42090:4.O99.3  ' 5.. 2 398.E..9 . .E.345   :...298:E.3 4..53903208-E2. 397H3 0:480 .9.7.3  .. .3.9.  0:480  E..39.3.929...3/7.E..4 43.  30320'!%   ..4.9.02.E. ..39.....-929. .8097H3 0:4804..O330:480.97.0329:5383748/ 947.3.9.329.80 2 9J3 3.9. 0320  .     ..8/39743.E.:  .335  g2843 /393.E.85E9 973.O96: 4:70. 5J.23 93/3 . .:   32:743.3.O:6:.35E53/.39743..39..48. .. 3.9K2499J3 /..2E:974393 3394  '9:.92.39: 9743.85. :.4.:.4/.9. ../32953H39 3O.:3..3..9743.9.2.././0  O..23 29g3E97/3/.8494...9:. 57490..9.535E5..-3:..3 5E5 3 3.:359:.8/3 ..4. 3 .

.3  3023.2.297...335 39 2 -E3.2./.3.328507:847.33..2.E.7.3..9./397 :3 . 39 3:7097H3/3H39..    %743539J. :  ..:3. :97.83  :.E. 3 29--.032     3/3.52  32... 03.43.44/.3973..5494 ..3.33.2980320    !.3 3O. : 3 '...:2 .. . .:70..2497583 .3992./3  .. 8:.J3..35/9 9.. 203/..39.0 E.E.5.032.3/3 E.3   2.E.. 32 3 3:3...3/3 E....O.5.349 3..O9E.29.. .E.    %7439. 39 3:.0./ .3253779.5.:84..94.0388   .322/3 ....$9705942. .9.3:57490..349743/:3 /.   l3. .39.535E5. 9032.08 33..9E. : .O9743..5.4.943. 2.234    .00...:3/8:1/0 :97./.7.56:...3 .7.42.9.33:.89.3:3. 3209.9E. .234. . .44/470/:.8.2..9743...4:9329.  30320'!%   .3 3-3.34 09.3.   . ..:3/3.97....../3 E.   l3..9E383 8507:8 !03..O.946:23328/39743.:3.

/353357490.80 5E.E..45F55.38: 7...85.90/-5393..4.$9459...3     .8..7-4.. 23293.4...83..  !. . 94E9..35 .:3-3: .535E5.5059/0 .9.8903  89/30 .3O974302 E37g3 .3/4.. ...-9 243 !29.539..:..35- 8.97433.2927g3 973..7.9K293.5059/0  3O2..7..973.E.35E5..5..E :.9-4 95. :9H39743.5. .5.. 0320 3O..93539743-922299. $.O .308    . 32-/0.3..5.. $9459.3 O..33O22/4.: O .8/33 333g2.K5..4332:23 -F.9-4...3g3 2 9H395059/0H36:.4-.929737g3 %:3H3:6:29737g3.O 83:9.92:...9E38/383522973 ..8/39743539E.9-4 .032032 933999/.2 O ..43397.E. 59.3 ....-E33.9353974302 E37g3 4-..8 9. $/3 3/3.:.234.9/4.335: .  !E33574903 .3 38/0574943.3.433.:3-  E3.9  O.9-4-. .E.35.E.. 2.  .3.8 -8  83 5 3.3-9 :5E..E.:20 $/3. 9 .45F58/0574943/37.:.!:8 29402 . 43 43-5.  30320'!%  .7-43.0459.3..3.: $.70.33:.8H:9 !.5059/0   .3J99597:3 ./ ..99... %353.7-43.35E5  59..J.539J 32.E.2.3893. .99..3 . 032 ./.3.J39743.:  595.O3-3.322  8.3935397434/:3/.9K793 -.9-4./45 8 293 3534.3 3.39743-9222993.9:.E..8 .2 9743.2.E..5.

.333.93..5.2.3.80 5.39353.:..0325..80 O3.07/09743/:g3 932434.70..97J .5.83.8092.07/0..E. 032 .809. . .E..2.:3..8534203.. :9 :/.3.5.4.42..93/39724975833    .9K.3 3 2037g3   / $3:9 !. .9335/39. . 3..97E38/3..93    5..4 5..  30320'!%  !..96:.5.E.35.574903.800209.E....397433.983..97E..E. 535/3-94.E.3.:7...3.5.399 4-335.9.80 5.3939 .96:.5.38 9:3.3.42.E.3 .29/97:3 .-997H3.80-. ..3g3 :95.3 .46:E97K3953H39 089079743.80-.E.5.9-F4   .45.9H:O.80../-F49/4  E.80535  5.J/! :2...9K29974393H3 ...9E. 4 O.9. 08907.80. 3O.J3 533297439H:O.E.9:393.8.074.E.9-F43.97. -3 97.3..6: :    .70 2940 97g3 H3..38 ..7:8   .548545.97433./74.80.83:9/39 -3.80.9 -3 ":E97K393..6: :  5397H36:39.2.3-.  .485..983 032O.3g3.07/ /: 29743:9.535E5.3 ..E.3999743.9 !..42.9.5.:97.809:.:   .J3/3. %74329/8559..E.:3.. ... E.39..E./3. 9E. -09.J397435.:3.

:3 .29...3.809.//.-9  9 .. 89/30  :5..J.3...9E.39.535E5. H32034:79...4.3 .4.32.:3  .3 .80 .:3/:9..80 ..22 574903. %:3H3 5.9E.3328/3. 9.3.9E.52.3383.993 3H3:                 . .9739E93H3. .  30320'!%  3.9.3O3.3/3./ .39739743956:E3.85..K3/E383 .E.997.E. $/39743. 947. 0325.:37.92..83....335 5.80.3g3 53.. 7.79.9-F4 'J/ .E. 3..83:9-.3 5..976:.E.997.3-E3 .:3.9.95  5.9.0450 .9 807303:.49 3  .809E95 -E37. 3..

 30320'!%  %:9.24 .E.535E5.

":.3 l...%!   .330320 :3l.

83...335 H.O.%:9         .% 4.

You're Reading a Free Preview

Tải về
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->