Bai Lam2

Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn
PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1. Enzym protease phân loại và đặc điểm các loại enzym protease
Protease là một trong những enzyme quan trọng nhất trong công nghiệp, có tác
dụng xúc tác cho phản ứng phân giải protein, được sử dụng trong nhiều thế kỷ,
lĩnh vực sử dụng đầu tiên enzyme này là ngành sản xuất sữa.
Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.
* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia
thành hai loại:
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi
polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một
tripeptide.
+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn
nhóm:
+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong
trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác
của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin.
Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin,
elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin
Carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở
vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 1

Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang
+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt
động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin,
bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein
proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất
rộng.
+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin,
renin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt
động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi
khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase
thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của
EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
- Protease acid: pH 2-4 có nhiều ở tế bào động vật, nấm men, nhưng ít thấy ở
vi khuẩn.
- Protease trung tính có pH 7-8 như papain từ quả đu đủ, bromelain từ quả dứa,
ficin từ Ficus sp là những protease có nguồn gốc từ động vật. Những protease
này là cystein protease, papain là protease ổn định với nhiệt độ nhất. Vi khuẩn
Clostridium histolyticum sản xuất ra enzyme clostripain và Streptococcus spp
sản xuất ra enzyme streptopain, đều là cysteine protease.
- Protease kiềm có pH 9-11.
* Ngoài ra có thể phân thành 2 loại khác:

Enzyme protease nội bào là những enzyme được tiết ra từ bên ngoài hoặc ngoại
biên màng protein và được trích ly vào môi trường bằng kỹ thuật trích ly
Enzyme protease ngoại bào được thu nhận từ quá trình lên men, như quá trình lên
men trên môi trường rắn. Enzyme được thu nhận khi quá trình lên men hoàn tất
hoặc ngay khi quá trình lên men đang diễn ra. Sử dụng chất làm sạch không có
tính chất ion như Triton X-100, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80… để
lọc các enzymes.
Nhìn chung quá trình diễn ra trong khoảng từ 50-60 phút, tỷ lệ dung môi và chất
rắn là 1:8, nếu giá trị này cao hơn thì nhiều chất rắn sẽ được hòa tan, khi đó dịch
thu được sẽ chứa nhiều phân tử không cần thiết.. Nhiệt độ trích ly trong khoảng
30oC, nhưng ở nhiệt độ 4-100C sẽ giảm sự biến tính, sự thủy phân và sự phát triển
của sinh vật. Sự trích ly được tiến hành ở pH=7, tuy nhiên để tránh xảy ra sự kết
tủa thì pH gần pI.
1.2. Ứng dụng sắc ký ái lực trong tinh sạch protease
Sự tinh sạch enzyme nói chung và protease nói riêng là một quá trình phức tạp và
có nhiều phương pháp đã được ứng dụng. Mục đích của quá trình tinh sạch là tăng
độ tinh sạch, hoạt tính và khả năng tái sử dụng của enzyme.
Sắc ký là một trong những phương pháp tinh sạch, trong đó enzym tách ra khỏi
hỗn hợp ngay khi được đưa qua matrix. Các matrix sử dụng trong sắc ký có tính
chất vật lý và hóa học có khả năng tương tác với các enzym do đó nó giữ lại
enzym.
Ví dụ như protease có tính acid sẽ tương tác với một matrix base nhiều hơn một
protease trung tính. Do vậy một matrix base có thể được sử dụng để tách các
protease mang tính acid vì nó sẽ tương tác với matrix và bị giữ lại, còn những
protease không mang tính acid sẽ chảy qua matrix. Các protease bị giữ lại sẽ được
loại bỏ hoặc tách ra khỏi matrix bằng cách phá vỡ liên kết giữa chúng hoặc làm
yếu dần các liên kết.
Hạn chế chủ yếu của các phương pháp sắc ký là thiếu tính đặc hiệu cụ thể đối với
mỗi loại protease, ví dụ như là các matrix base có khả năng giữ lại các protease
khác ngoài protease mang tính acid.
Sắc ký ái lực là có thể khắc phục được hạn chế này bằng cách bổ sung một ligand
gắn lên matrix để tạo ra tương tác đặc hiệu với phân tử cần tách. Đây là một phân
đoạn hữu ích và có hiệu quả nhất để tinh sạch các protease bằng sắc ký ái lực đơn.
Mỗi loại cơ chất tương tác với một ligand tương ứng như bảng 1.
Bảng 1: Cơ chất và ligand tương ứng trong sắc ký ái lực
Cơ Chất Ligand
Enzyme Substrate, cofactor
Antibody Antigen, Virus, Cell
Polysaccharide, glycoprotein Lectin
Nucleic acid binding protein Nucleic Acid
Hormone receptor Hormone
Đối với protease, ligand thường sử dụng nhất là các chất ức chế của nó.

PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ÁI LỰC TRONG TINH

SẠCH PROTEASE
2.1. Cơ sở khoa học
 Nguyên lý
Đầu tiên là các ligand liên kết đồng hóa trị với các matrix không hòa tan, như các
hạt agarose, sau đó matrix được cho vào cột sắc ký. Hỗn hợp dung dịch chứa
protein cần tinh sạch sẽ được cho vào cột khi đó sẽ xảy ra sự tương tác giữa
protein với các ligand được cố định trên matrix, do đó protein sẽ bị giữ lại trên
matrix, những chất không tương tác với matrix sẽ chảy qua cột. Sự tương này có
tính đặc thù và thuận nghịch. Protein được tách ra khỏi matrix bằng cách làm yếu
liên kết giữa chúng bằng phương pháp giửa giải khác nhau.
Sự tương tác sinh học giữa ligand và phân tử tinh sạch có thể là kết quả của liên
kết tĩnh điện hoặc tương tác kỵ nước, lực van der Waals hoặc là liên kết hydro.
Để rửa giải có thể sử dụng ligand cạnh tranh đặc trưng, hoặc là không cạnh tranh
bằng cách thay đổi pH, nồng độ ion hoặc là sự phân cực để phá vỡ liên kết.

 Qui trình thực hiện
Hình 1: Các bước trong sắc ký ái lực
Buớc 1: Chọn môi trường ái lực
Chọn môi trường có sẵn (ligand liên kết sẵn với matrix). Nếu không có thì phải
chọn ligand thích hợp để tạo môi trường ái lực đặc hiệu.
Ổn định môi truờng ái lực trong dung dịch đệm liên kết (binding buffer).
Buớc 2: Chuẩn bị môi trường và dung dịch đệm

Các dung dịch và chất bảo quản cần phải rửa trước khi sử dụng. Nước và các hoá
chất sử dụng phải có chất lượng cao. Dung dịch phải được lọc qua lưới lọc 0.45
µm hoặc 0.22 µm.
Việc tái sử dụng môi trường ái lực cần phải phụ thuộc vào bản chất của mẫu. Lưu
ý tránh những chất béo.
Bước 3: Chuẩn bị mẫu và chạy mẫu
Chuẩn bị mẫu: Mẫu cần được làm sạch trước khi chạy sắc ký. Nếu có thể nên
kiểm tra ái lực của ligand với protease cần tách. Sau đó, hiệu chỉnh pH mẫu và
loại bỏ các thành phần gây gián đoạn liên kết.
Chạy mẫu: Chạy mẫu dưói điều kiện tối ưu cho quá trình liên kết các phân tử cần
tách với ligand. Cần phải kiểm soát tốc độ dòng chảy, thể tích mẫu không ảnh
hưởng đến hiệu quả liên kết.
Bước 4: Rửa giải
Thu hồi protease mục tiêu bằng cách thay đổi các điều kiện thích hợp cho quá
trình rửa giải. Có nhiều phương pháp rửa giải, không có phương pháp chung nhất
định. Có thể tiến hành quá trình rửa giải đặc hiệu bằng cách sử dụng một ligand
cạnh tranh hoặc quá trình rửa giải không đặc hiệu bằng cách thay đổi pH, lực ion
hoặc độ phân cực. Kết quả thu được protease ở dạng tinh sạch hoặc cô đặc.
 Phương pháp 1: Thay đổi dung dịch đệm
 Phương pháp 2: Thay đổi pH hoặc nồng độ tác nhân cần cho quá trình rửa giải.
Phương pháp này có thể gây hại cho ligand.

 Phương pháp 3: Thêm một chất cạnh tranh liên kết. Phương pháp này có thể
cải thiện tính đặc hiệu của môi trường mà sử dụng các nhóm ligand đặc hiệu. Các
phương pháp rửa giải có tính chọn lọc được ứng dụng kết hợp với các nhóm
ligand đặc hiệu.
Rửa giải pH:
Sự thay đổi pH sẽ có ảnh hưởng đến mức độ ion hoá của cac nhóm trên ligand và
protease liên kết. Sự thay đổi này có thể tác động trực tiếp đến vị trí liên kết, hoặc
tác động gián tiếp đến sự thay đổi ái lực do thay đổi cấu hình.
Giảm pH là phương pháp thường sử dụng nhất để rửa giải. Tuy nhiên việc thu các
phân đoạn phải được tiến hành ở điều kiện pH trung tính (ví dụ Tris-HCl 1M, pH
9).
Rửa giải lực ion:
Thường sử dụng NaCl (dung dịch đệm) để làm tăng lực ion.
Các enzym thường được rửa giải với nồng độ thấp hơn hoặc bằng 1M NaCl.
Rửa giải cạnh tranh:
Thường sử dụng để tách những chất liên kết trên môi trường đặc hiệu nhóm hoặc
khi ái lực liên kết giữa protein mục tiêu với ligand tương đối cao. Chất rửa giải có
thể cạnh tranh liên kết với protein mục tiêu hoặc ligand. Có thể sử dụng cơ chất
với nồng độ tăng theo gradient hoặc dạng xung.
Thường sử dụng nồng độ xấp xỉ với nồng độ của ligand. Nếu cơ chất liên kết yếu
hơn thì sẽ phải sử dụng với nồng độ cao hơn.

Rửa giải với chất rửa giải có độ phân cực thấp:
Thường sử dụng dioxane (≤10%) hoặc ethylen glycol (≤50%).
Rửa giải chaotroptic:
Chỉ sử dụng khi không dùng được phương pháp khác. Phương pháp này làm thay
đổi cấu trúc của protein được rửa giải. Các tác nhân thường dùng là guanidin
hydrocloride, ure.
Bước 5: Ổn định lại môi trường ái lực trong binding buffer.
2.2. Các matrix thường dùng
Matrix ái lực thường được chuẩn bị bằng liên kết đồng hóa trị của một ligand với
chất rắn hỗ trợ. Agarose hay Sepharose, Sephadex và tinh bột là những chất rắn
hỗ trợ tốt bởi vì chúng dễ tạo dẫn xuất với các ligand khác nhau. Tuy nhiên gel
agarose là được sử dụng nhiều nhất vì có độ bền cao và cho phép các đại phân tử
xâm nhập dễ dàng.
Để chuẩn bị cột ái lực, matrix phải được hoạt hóa để có thể gắn ligand bằng các
liên kết đồng hóa trị. Trong một số trường hợp, một spacer arm được dùng trong
quá trình hoạt hóa, và sau đó ligand có thể liên kết đồng hóa trị. Liên kết này có
thể được thực hiện bằng nhiều phương pháp. Bảng 4.10 đưa ra những tác nhân
thường dùng để hoạt hóa matrix và cố định ligand. Tuy nhiên, các matrix hoạt
hóa đã được thương mại hóa và có thể sử dụng rất tiện lợi phù hợp với những
ligand được chọn.
Sản phẩm thương mại thường gặp nhất là:
Sepharose 4B, 6B: chỉ agarose được liên kết ngang 4%, 6% tương ứng.
AH Sepharose: Sepharose có nhóm amine tự do.
CH Sepharose: Sepharose có nhóm carboxyl tự do.
CNBr-activated Sepharose: Sephaose được hoạt hoá bằng CNBr…
Bảng 2: Một số tác nhân hoạt hóa matrix và cố định ligand phổ biến
2.3. Ligand sử dụng để tinh sạch protease trong sắc ký ái lực
Với mỗi protease khác nhau sẽ có một ligand tương ứng. Trong sắc ký ái lực để tinh
sạch/phân tách protease từ các nguồn khác nhau, ligand thường sử dụng nhất là các
polypeptide antibiotics gramicidin S hoặc các bacitracin.
Ngoài ra người ta còn nghiên cứu tổng hợp các ligand ái lực đặc hiệu mới từ các dẫn
xuất của polypeptide. Các peptide này có cấu trúc giống cấu trúc các cơ chất của
enzym, đồng thời chứa các liên kết kháng lại sự thuỷ phân protein.
Bảng 3: Một số ligand thường sử dụng trong sắc ký ái lực

Một số cơ chất tổng hợp tương ứng với các protease khác nhau:
 Subtilisin và thermitase: Z-Ala-AIa-Leu-pNA (p-nitroanilide).
 Subtilisin-like serine protease: Ala-Ala-Leu-pNA
 Enzyme từ rễ cây bồ công anh kininase X: Glp-Ala-Ala-Leu-pNA.
 α-Chymotrypsin: Suc-Phe-pNA.
 Kallikrein: Z-D-Ala-Leu-Arg-pNA.
 Leu-aminopeptidase: Leu-pNA.
 Trypsin của bò và cua: Bz-D,L-Arg-pNA.
 Protease PC và papain: Glp-Phe-Ala-pNA.
 Carboxypeptidase PC: DNP-Ala-Ala-Leu.
Tổng hợp một số ligand:
* Boc-Leu-N(CH2 CH2) 2O

HOBt (1-hydroxybenzotriasol) (0.69 g, 5.16 mmol) được hoà tan trong 5ml hỗn
hợp THF (tetrahydrofuran)-DMF (1:10) (1)
Boc-Leu-OH (1 g, 4.3 mmol) hoà tan trong 5ml THF (2)
Hoà trộn (1) với (2). Hỗn hợp thu được đem làm lạnh đến 0 oC. Sau đó thêm DCC
đã được hoà tan trong 3ml THF vào. Cuối cùng thêm mopholine (473 µL, 5.4
mmol) vào và khuấy 15 phút ở 20oC. Dicyclohexylurea kết tủa được lọc ra, tách
lấy dung môi.
Phần cặn dầu còn lại được hoà tan trong 120ml ethylacetate. Dung dịch này sau đó
được rửa bằng nước, bão hoà NaHCO3 và nước, làm khô với MgSO4. Cuối cùng
bốc hơi dung môi, thu được 0.91g Boc-Leu-N(CH2 CH2)2O, hiệu suất 81%.
* H-Leu-N(CH2 CH2) 2O *HCl
Boc-Leu-N(CH2 CH2)2O (0.91 g, 3 mmol) được hoà tan trong 15ml HCl 3.4M
trong dioxane. Hỗn hợp được khuấy 3 giờ ở 20oC. Sau đó, dung môi và HCl được
bốc hơi ở áp suất thấp. HCl được tách ra bằng cách rửa lại và bốc hơi với
methanol. Phần còn lại đem sấy khô chân không, thu được 0.642g H-Leu-N(CH2
CH2) 2O *HCl, hiệu suất 90%.
* Z-Ala-Ala-Leu-N(CH2CH2) 2O
0.425g (3.15mmol) HBOt được hoà tan trước trong 5ml hỗn hợp THF-DMF (5:1),
rồi được thêm vào (ở 0oC) 0.926g (3.15 mmol) Z-Ala-Ala-OH trong 20ml THF
khô. Tiếp tục cho vào hỗn hợp trên lần lượt được 0.779 g (3.78 mmol) DCC (đã
hoà tan trong 20ml THF), 0.749 g (3.15 mmol) H-Leu-N(CH 2 CH2) 2O *HCl với
484 µL (3.46 mmol) triethylamine.

Khuấy hỗn hợp trên ở 20oC trong 15 giờ, sau đó lọc dicyclohexylurea ra. Dịch lọc
bốc hơi ở áp suất thấp, và hoà tan phần cặn dầu còn lại trong 130ml ethyl acetate.
Dung dịch được rửa với nước, bão hoà với NaHCO3 và được làm khô với MgSO4.
Cuối cùng bốc hơi ở áp suất thấp, thu được 0.83g Z-Ala-Ala-Leu-N(CH2CH2) 2O,
hiệu suất 56%.
* Ala-Ala-Leu-N(CH2CH2) 2O
508g Z-Ala-Ala-Leu-N(CH2CH2) 2O được hoà tan trong 7ml methanol, sau đó

được bài khí với ảgon và thêm 50mg chì vào. Dẫn H 2 qua dung dịch trong 48 giờ
ở 20oC. Rồi thêm HCOOH để hạ pH xuống còn 2-3.
Lọc hỗn hợp và bốc hơi dung môi dưói áp suất thấp, thu được 0.33g Ala-Ala-Leu-
N(CH2CH2) 2O, hiệu suất 95%.
2.4. Một số phương pháp cố định ligand trên matrix
2.4.1. Cố định ligand thông qua tác nhân hoạt hóa cyanogen bromide
Tác nhân phổ biến nhất để liên kết ligand với matrix là cyanogen bromide
(CNBr). Nó phản ứng với nhóm hydroxyl của Sepharose ở pH kiềm.
Phản ứng:
Phản ứng của CNBr rất phức tạp. Hình 4.9 thể hiện cơ chế của việc hoạt hóa
Agarose cũng như các matrix chứa hydroxyl khác bằng CNBr. ở pH cao (khoảng
11), CNBr phản ứng với nhóm hydroxyl của matrix để tạo ra thành phần hoạt hóa
chính, cyanate ester, và các thành phần phụ khác, imidocarbonate (cyclic hoặc
acyclic), carbamate và carbonate. Tuy nhiên, các vòng imidocarbonate chiếm ưu
thế hơn trong việc hoạt hóa các dextran liên kết ngang và cellulose. Trong điều
kiện kiềm nhẹ (pH 9-10), cyanate ester và vòng imidocarbonate phản ứng dễ dàng
với các nhóm amine cơ bản của ligand, kết quả tạo ra các dẫn xuất isourease và
imidocarbonate thay thế tương ứng (hình 2). Các nhóm amino phản ứng như
trung tâm của phản ứng này, vì vậy cần thiết phải tiến hành phản ứng ở pH 8 –
10. Ở pH này các nhóm amino vẫn không nhận thêm proton. Phản ứng cặp đôi
này không nên tiến hành trong một dung dịch đệm chứa các amine cơ bản, như
tris, glycine hoặc ethanol amine. Vì những tác nhân này sẽ cạnh tranh với các
ligand cố định. Dung dịch đệm được chọn thuồng là sodium carbonate hoặc
bicarbonate, và điều kiện cặp đôi tối ưu là ở pH 8.3. Sau khi ligand được liên kết
và loại bỏ các ligand thừa, các nhóm hoạt hóa còn lai trong matrix có thể bị khóa
lại bằng cách thêm vào một lượng dư các amine cơ bản nhỏ như tris, glycine,
ethanolamine…
Ưu điểm:
Việc hoạt hóa bằng CNBr thì đơn giản và ôn hòa cho việc liên kết các phân tử
sinh học nhạy cảm như enzym, lectin và kháng thể. Hoạt hóa CNBr có thể được
ứng dụng không chỉ với agarose, dextran hay Sephadex, mà còn có thể ứng dụng
cho các polymer tổng hợp chứa nhóm hydroxyl. Một khi được hoạt hóa các
ligand nhỏ cũng như các ligand có khối lượng phân tử lớn chứa các amine cơ bản
có thể được liên kết.

Nhược điểm:
Một nhược điểm chính của các matrix ái lực hoạt hóa bằng CNBr là các ligand đã
cố định bị rơi ra liên tục. Liên kết yếu là nguyên nhân chính của sự không ổn định
của liên kết isoureas giữa matrix hoạt hóa và ligand.
Một nhược điểm khác của matrix này là chúng có thể hoạt động như một chất trao
đổi anion yếu, làm thúc đẩy các liên kết không đặc hiệu. Điều này làm cho dẫn
xuất isourease tích điện dương ở pH trung hòa.
Hình 2: Cơ chế hoạt hóa agarose (hoặc các polymer có nhóm hydroxyl) bằng
CNBr.
Quy trình làm việc:

Các tác nhân:
1. Cyanogen bromide (Aldrich, Milwaukee, WI)
2. Sepharose 4B hoặc 6B (Pharmacia)
Sự hoạt hóa:
(Lưu ý: CNBr có độc tính rất cao, phải tiến hành hoạt hóa CNBr trong thiết bị kín
có van thông hơi tốt)
1. Rửa 100ml Sepharose 4B với 1 lít nước đã được de-ion hóa trong phễu
thủy tinh và làm khô.
2. Tạo huyền phù gel trong 100ml sodium carbonate 2M trong becher.
3. Hòa tan 10g CNBr trong 5ml acetonitrile và thêm dung dịch CNBr vào
huyền phù gel và khuấy liên tục, sử dụng cánh khuấy overhead paddle.
(Chú ý: không dùng cánh khuấy từ để tránh làm vỡ hạt gel).
4. Để phản ứng hoạt hóa tiếp tục trong đúng 2 phút ở nhiệt độ phòng.
5. Rửa nhanh các hạt gel đã được hoạt hóa với 1 lít nước đá lạnh, sau đó
rửa với dung dịch đệm liên kết lạnh (sodium bicarbonate 0.1M, chứa NaCl
0.5M, pH 8.5).
6. Tiến hành cố định ligand ngay.
Cố định ligand:
7. Tạo huyền phù gel đã được hoạt hóa trong dung dịch đệm liên kết (sodium
bicarbonate 0.1M, chứa NaCl 0.5M, pH 8.5) chứa protein (5-10mg/ml gel).

Tiếp tục tạo phản ứng liên kết trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng (hoặc qua đêm ở
4oC), khuấy liên tục, sử dụng cánh khuấy paddle.
8. Rửa gel đã liên kết với dung dịch đệm liên kết, để loại bỏ các ligand không liên
kết.
9. Khóa các nhóm hoạt động còn lại trong gel bằng cách tạo huyền phù trong 100
ml ethanolaminr 1M hoặc glycerine 0.2M, pH 8.0 trong 2 giờ ở nhiệt độ
phòng.
10. Rửa gel với dung dịch đệm liên kết, sau đó rửa với dung dịch đệm acetate
0.1M (pH 4.0) chứa NaCl 0.5M. Và rửa lại với dung dịch đệm liên kết.
11. Cuối cùng rửa gel với nước. Rửa tiếp với dung dịch đệm được chọn cho quá
trình sắc ký ái lực.
Ví dụ ứng dụng
Tinh sạch enzym protease thủy phân insulin (ISP – Insulin Specific Protease)
phân lập từ tế bào xương của chuột, sử dụng sắc ký ái lực trên agarose được liên
kết với insulin:
Tổng hợp Insulin-agarose:
Hoạt hóa trước agarose với cyanogen bromide. Sau đó cho phản ứng với insulin ở
2 điều kiện khác nhau: dd đệm natri citrate 0.2M ở pH 5. Ở điều kiện pH acid,
đầu N của phenylalanin của chuỗi B của insulin sẽ liên kết với agarose.
Tinh sạch enzym:
Dịch huyền phù chứa enzym (sau khi qua các công đoạn ly tâm tách tạp chất thô)
được tách phân đoạn bằng ammonium sulfate (0.21g rắn (NH4)2SO4 trên 1 ml
dịch huyền phù – bão hòa 30%), thêm NH4OH 0.1M hoặc HCl 0.1M để duy trì
pH 6.2. Ly tâm loại bỏ kết tủa, thêm 0.21 g rắn (NH4)2SO4 trên 1 ml dịch huyền
phù nữa (bão hòa 60%), ly tâm tách kết tủa. Dung dịch thu được đem tinh sạch.
2-3 ml đ enzym thô được chạy qua cột Sephadex G-100 (1.5 x 8.3cm) trong
20mM đệm acteate, pH 6.2. Peak hoạt tính được rửa giải, kéo ra khỏi cột và được
hấp phụ lên cột QAE-Sephadex (1.5 x 7cm). Cột này được rửa giải bằng NaCl
0.1M trong 20mM acetate – sử dụng 20 lần thể tích trong 2 giờ với 3 lần thay đổi.
Enzym sau đó được hấp phụ lên Sepharose-liên kết với insulin trong cột 0.5 x
6cm. Rửa với 20mM đệm acetate (pH 6.2), rửa giải với NaCl 0.1M trong 20mM
acetate.
Enzym sau tinh sạch được phân tích và xác định hoạt tính. Kết quả như bảng 4 và
hình 3.
Bảng 4: Tổng hợp độ tinh sạch ISP qua các công đoạn:

Hình 3: Kết quả rửa giải ISP từ insulin-agarose. Mũi tên bên trái: thêm enzym
vào; mũi tên bên phải: rửa giải với NaCl 0.2M trong 20mM acetate, pH 6.2.
2.4.2. Cố định ligand lên AH-Sepharose và CH-Sepharose:
Đối với một số các matrix ái lực như AH- và CH-Sepharose, ligand có thể được
liên kết thông qua các spacer arm. Một spacer arm thì được sử dụng để làm tăng
khả năng xâm nhập của các protein lớn mà cần liên kết với các ligand nhỏ. AH-
Sepharose được chuẩn bị bằng liên kết đồng hóa trị của 1, 6-diaminohexane với
Sepharose nhờ CNBr (hình 4).
Hình 4: Chuẩn bị AH-Sepharose
AH-Sepharose có thể phản ứng với nhiều tác nhân khác nhau để hình thành các
nhóm chức năng thay thế, như diazonium, bromoacetamidoalkyl, và dẫn xuất thiol
(hình 8). CH-Sepharose được tạo ra do phản ứng của Sepharose và 6-
aminohexanoic acid được hoạt hóa bởi CNBr (hình 9).

CH-Sepharose phải được hoạt hóa trước khi tạo liên kết với ligand. Nó có thể
đưucọ hoạt hoá với carbodiimide và có thể liên kết với ligand chứa cả nhóm
carboxylic acid và amino. Carbodiimide bắt nguồn từ một phản ứng giữa một
nhóm amine tự do và một nhóm carboxyl tự do để tạo nên riêng một liên kết
peptid bằng cách loại bỏ nuớc với xúc tác acid. CH-Sepharose cũng có thể được
hoạt hoá bằng cách ester hoá nhóm carboxyl của CH-Sepharose với N-
hydroxysuccinimide. Các nhóm amino không được nhận proton ở pH kiềm sẽ tấn
công nhóm carbonyl thiếu electron, bỏ qua N-hydroxy-succinimide.
VÍ DỤ ỨNG DỤNG
Dùng N-Acetyl-D-arginine gắn trên hạt agarose để thu nhận protease II từ

Escherichia coli.
Gắn N-Acetyl-D-arginine lên hạt agarose:
Nhóm carboxyl của N-acetyl-D-arginine và nhóm amine của L-arginine cho vào
tương ứng với AH-Sepharose và CH-Sepharose. Tạo huyền phù gel Sepharose 4
B (6 gam) thu được 20mL gel, rửa huyền phù lần lượt bằng 20 ml nước cất, 20
ml ligand 100 mM. Thêm vào 1.2g 1-ethyl-3carbodiimide (3-
dimethyllaminopropyl), và pH 5.5. Tiến hành phản ứng trong 24 giờ ở nhiệt độ
phòng, khuấy nhẹ ; duy trì pH 5 bằng HCl 1M . Trộn và rửa với 200ml nước cất,
rồi cho vào cột thủy tinh (1.6×30cm). Rửa liên tục cột với 200ml NaCl 1M và
100mM dung dịch đệm Tris/HCl 1M (pH 8.2) với 200ml 1M NaCl và 100 mM
acetic acid . Sau đó cân bằng với 220 mM potassium phosphate pH 7.6.
Sắc ký ái lực trong 220mM potassium phosphate pH 7.6 bằng CH-Sepharose 4B

có gắn L-arginine, tách enzyme không đáng kể, trong khi đó dùng AH-Sepharose

4B gắn N-acetyl-D-arginine giữ được nhiều hơn .Vì vậy dùng N-acetyl-D-
arginine để sử dụng là ligand.
Sepharose –AH-N-acetyl-D-arginine thu được chứa 4.5 - 5 µmol arginine/ml

trong gel trạng thái ổn định.
Enzyme thô thu được từ E.coli có hai phần với trọng lượng phân tử khác nhau và
có họat độ khác nhau. Trong đó, chỉ một enzyme có ái lực với trypsine, gọi là
protease II. Enzyme protease còn lại có tính ái lực với dẫn xuất của arginine và
L-arginine tự do. Chúng ta sử dụng tính chất này để tách protease II dùng sắc ký
ái lực với hạt agarose gắn N-acetyl –D-arginine. Phương pháp này thu nhận được
lượng enzyme 30-37%.
Hình 5: Sắc ký thu nhận protease II dùng AH-Sepharose, ở 40C . Cột (0.9×6 cm)
cân bằng với (A) 120 mM potassium phosphate pH 7.6, (B) 220 mM potassium
phosphate pH 7.6 . Lấy khỏang 6ml protein (họat tính 277 units/ml) hòa tan 0.6

ml dung dịch đệm vào mỗi cột. Rửa bằng dung dịch đệm cho đến khi họat tính
enzyme ít hơn 10 units/ml . Dung dịch đệm có bổ sung vào 150 mM KCl cho vào
mỗi cột và tổng họat độ enzyme nhận được . Dòng chảy tốc độ 6 ml/giờ . Đo ở
bước song 280 nm (●). Họat tính đo với Bz-Arg-ONAn (○)d
Hình 6: Sắc ký ái lực sử dụng N-acetyl-D-arginine gắn với AH-Sepharose. Hai

peak ở 290-306 và 310-330 ml là phần A và B của enzyme.
Bảng 5: Kết quả tách protease II

Cột AH-Sepharose dùng N-acetyl-D-arginine dùng để thu nhận protease II từ

Escherichia coli . Sắc ký ái lực thực hiện sau khi DEAE-Sephadex ( quy trình làm
sạch truyền thống).
Quá trình tinh sạch không hòan tòan khi khi tinh sạch enzyme nguồn enzyme có
sự hiện diện của proteins khác có khả năng gắn vào ligand với ái lực tương tự
protease II . Sắc ký ái lực của enzyme cải thiện khi có sự hiện diện enzyme sử lý
với diisopropylphosphofluoridate.
* SO SÁNH AH-SEPHAROSE, CH-SEPHAROSE VÀ CNBr-activated

SEPHAROSE:
Hình 7: So sánh cấu trúc của các loại Sepharose thường dùng

AH-Sepharose 4B và CH-Sepharose 4B: để liên kết với các ligand chứa một
nhóm carboxyl tự do hoặc một nhóm amino cơ bản lên matrix Sepharose thông
qua một nhóm“spacer” 6 phân tử carbon. AH-Sepharose 4B, với 1 nhóm amino
cố định, và AH-Sepharose 4B, với 1 nhóm carboxyl cố định làm giảm đáng kể sự
cản trở về không gian để có thể hình thành liên kết giữa ligand nhỏ với matrix
Sepharose.
Các ligand có thể liên kết trực tiếp với những nhóm “spacer” này, sử dụng một
phản ứng carbodiimide, do đó làm giảm số bước tổng hợp chất hấp phụ.
AH-Sepharose 4B, chứa nhóm –(CH2)6NH2 và CH-Sepharose 4B chứa –

(CH2)5COOH, đều có sẵn dạng chế phẩm thương mại, 15g tưong ứng với 60ml 1
thể tích gel.
Sepharose hoạt hoá bằng CNBr là một matrix đã được hoạt hoá. Do đó, những
protein và những nhóm amino cơ bản có thể liên kết trực tiếp.
Matrix này ứng dụng tốt trong các trường hợp cố định các đại phân tử được chạy
sắc kí ái lực.
Sepharose 4B hoạt hoá bằng CNBr là một vật liệu thưòng được chọn trong cố
định các đại phân tử; khi chuẩn bị chất hấp phụ có tính đặc hiệu sinh học để chạy
sắc ký ái lực. Nó được sử dụng trong nghiên cứu protein, nucleic acid,
polysaccharide… Sepharose cung cấp một matrix rất ổn đinh, có khả năng cao,
thậm chí là đối với phân tử rất lơn, và nó không có tính hấp phụ đặc hiệu.
Sepharose 4B được hoạt hoá bởi CNBr ở dạng sấy lạnh được đóng gói sẵn, tương
ứng với cột 50ml.
2.4.3. Cố định ligand bằng sự hoạt hoá với Divinylsulfone

Divinylsulfone đựoc sử dụng rộng rãi để hoạt hoá các matrix có chứa nhóm
hydroxyl như Sepharose và agarose. Nhóm vinyl tái hoạt hoá của Divinylsulfone
có thể liên kết với các nhóm hydroxyl, sulfhydryl, và amine. Quá trình hoạt hoá và
liên kết rất hiệu quả ở pH cao, nhưng các ligand được cố định bằng phưong pháp
này cũng không ổn định ở pH cao và bị thuỷ phân theo thời gian. Vì vậy quá trình
hoạt hoá và liên kết Sepharose với ligand phải dung hoà với nhau. Các sản phẩm
cố định đưucọ cân bằng trong dung dịch đệm thích hợp ở pH 6 – 7.5. Đối với các
monosacchride và oligosaccharide, hydroxyl ở vị trí C-1 (đối với oligosaccharide
là C-1OH của đường khử) thường tham gia vào liên kết này.
Hình 8: Phản ứng của AH-Sepharose


Hình 9: Chuẩn bị CH-Sepharose
Phản ứng:
Divinylsulfone, một tác nhân liên kết có hai chức năng, phản ứng với matrix chứa
nhóm hydroxyl như Sepharose hoặc agarose thông qua nhóm vinyl tái hoạt hoá
của nó ở một đầu. Agarose được hoạt hoá có thể phản ứng với các nhóm
hydroxyl, sulfhydrin và amine của ligand thông qua nhóm vinyl tái hoạt hoá thứ 2.
Ưu điểm:
Quy trình đơn giản và hiệu quả.
2.4.4. Cố định ligand thông qua sự hoạt hoá bằng Tosyl/Tresyl
Toluen sulfonyl chloride (tosyl chloride) và 3,3,3-trifluoroethanesulfonyl chloride

(tresyl chloride) là những tác nhân đơn chức năng mà phản ứng với matrix chứa
nhóm hydroxyl như agarose. Những tác nhân này không tạo thêm spacer nào cho
matrix. Sự hoạt hoá matrix được tiến hành trong acetone khô để ngăn chặn sự thuỷ
phân tosyl chloride/ tresyl chloride. Gel hoạt hoá sau đó được sử dụng để liên kết
với ligand trong cả dung môi hữu cơ lẫn dung môi ưa nuớc. Các ligand được cố
định trên gel đuợc tosyl hoá ở pH cao (9-10.5), trong khi liên kết của ligand với
gel đựơc tresyl hoá thì thực hiện được ở pH trung hoà.
Phản ứng:
Cả tosyl chloride và tresyl chloride đều phản ứng với nhóm hydrosyl của matrix
(hình 10). Nhóm amine cơ bản trong ligand sau đó có thể phản ứng với matrix đã
hoạt hoá, tạo ra một liên kết amine thứ hai rất ổn định.
Ưu điểm:

Ligand cố định ổn định hơn isourea được tạo ra bằng cyanogen-bromide.
Nhược điểm:
Ở pH trung hoà, liên kết amine thứ hai tích điện duơng.
Quy trình thực hiện:
Tác nhân:
1. Tosyl chloride/ tresyl chloride (Aldrich)
2. Pyridine
3. Sepharose 4B hoặc 6B


Hình 10: Hoạt hóa matrix bằng Tosyl/ Tresyl Chloride
Sự hoạt hoá:
Sự hoạt hoá nên đưụơc tiến hành trong thiết bị kín có van thông hơi tốt.
1. Sử dụng phễu thuỷ tinh gắn với thiết bị chân không, trao đổi liên tục 100 ml
Sepharose 4B (được trương nở trong nước trước) trong acetone khô với mỗi
40 ml hỗn hợp acetone/nuớc (tỷ lệ 30/70 v/v). Tiếp theo trao đổi với hỗn hợp
có tỷ lệ 60/40, 80/20, và cuối cùng là với acetone khô tinh khiết (3 lần).
2. Rửa gel trong 100ml acetone khô có chứa 6g tosyl chloride, tạo huyền phù
acetone.
(Chú ý: để hoạt hoá bằng tresyl chloride, tiến hành nhỏ giọt 1ml tresyl chloride
vào 100 ml huyền phù gel trong acetone khô trong khoảng thời gian 1 phút)
3. Thêm 10 ml pyridine khô để trung hoà HCl tự do và tiếp tục khuấy ở nhiệt độ
phòng trong 1 giờ (10 phút cho sự hoạt hoá tresyl chloride), sử dụng cánh
khuấy overhead paddle).
(Chú ý: không sử dụng cánh khuấy từ để tránh làm vỡ hạt gel)
4. Rửa gel hoạt hoá bằng 1l acetone (2 lần), sau đó rửa với 1 mM hỗn hợp
HCl/acetone với tỷ lệ lần lựot 30/70, 50/50, 70/30. Cuối cùng rửa gel với 1
mM HCl.
Cố định ligand:
5. Tạo huyền phù gel đã được hoạt hoá với tosyl (100ml) trong 100ml
sodiumcarbonate 0.25M, pH 9.5 (gel hoạt hoá bằng tresyl trong

sodiumphosphate 0.2M, pH 7.5) chứa 5-10 mg/ml protein. Để phản ứng liên
kết tiếp tục ở 4oC trong 24 giờ và khuấy liên tục bằng cánh khuấy overhead
paddle.
6. Rửa gel đã liên kết bừng dung dịch đệm liên kết để loại bỏ những ligand
không phản ứng.
7. Khoá những nhóm hoạt hoá thừa của gel bằng cách tạo huyền phù gel trong
100ml ethanolamine 1M, pH 9 trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
8. Rửa gel với lượng dư NaCl 1M và nước.
2.4.5. Cố định ligand thông qua sự hoạt hoá bằng N-hydroxysuccinimide ester
Sự hoạt hoá matrix chứa hydroxyl bằng N-hydroxysuccinimide ester (NHS) có

thể được tiến hành bằng cách sử dụng N,N’-disuccinimidyl carbonate trong một
môi trường không có nuớc. Hoạt hoá bằng NHS là một phương pháp khá đơn
giản và có thể dễ dàng thực hiện trong phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, hai loại
matrix agarose có liên kết ngang được hoạt hoá bằng NHS (Affi-gel 10 và Affi-
gel 15) có sẵn chế phẩm thưong mại (Bio-Rad, Hercules, CA). Affi-gel 10 chứa
spacer không tích điện và được khuyến cáo dùng để liên kết với những protein
base hoặc gần trung tính, với pI khoảng 6.5 – 11. Affi-gel 15 chứa spacer arm có
nitrogen tích điện dương, nên thích hợp cho liên kết với protein acid.
Liên kết của ligand với matrix được hoạt hoá bằng NHS có thể tiến hành trong cả
môit trưòng nuớc và môi trường không có nứoc. Sự lựa chọn tuỳ thuộc vào khả
năng hoà tan của ligand. Đối với protein hoặc các phân tử sinh học, một hệ nuớc
thì thích hợp hơn, vì chúng có xu hướng biến tính trong môi truờng không có
nứoc. Liên kết ligand có chứa amine cơ bản với matrix hoạt hoá bằng NHS cần
những nhóm amine cơ bản không tích điện, và do đó việc liên kết được tiến hành
ở pH 7.5 -8. Để ưu tiên cho liên kết xảy ra, matrix hoạt hoá đựoc mang từ dung
môi hữu cơ sang một hệ nuớc. Tại điểm này, nên thêm ligand vào ngay bởi vì
matrix hoạt hoá dễ dàng bị thuỷ phân trong môi truờng có nuớc.
Phản ứng:
N,N’-disuccinimidyl carbonate phản ứng với matrix chứa hydroxyl. Matrix hoạt
hoá sau đó có thể tạo liên kết amide với các amine cơ bản.
Ưu điểm:
Liên kết amide không tích điện.
Nhược điểm:
Ở pH kiềm, liên kết amide không ổn định.
* Ngoài những matrix và ligand thông dụng ở trên, trong tinh sạch protease còn
sử dụng một số matrix khác với ligand tương ứng:
Ví dụ Silica matrix với ligand n-butanol.
Silica matrix:
Silicon tetrachloride (25 ml) cho phản ứng với amyl alcohol (120ml) tạo thành
tetraamyl orthosilicate. Trộn hỗn hợp 24 giờ và sản phẩm thu được khi tetraamyl
orthosilicate thu được bằng phương pháp chưng cất Tetraamyl orthosilicate bão
hòa với ammonia trong hỗn hợp nước:methanol:isopropanol (1:2:6), khuấy 300
v/phút 24 giờ . Silica thu được rửa với nước cất và methanol, đem sấy 150 0C 24
giờ. Kích thước và hình dạng silica matrix dùng máy Scaning electron microscope
(SEM).
Hoạt hóa silica matrix bằng aminopropyl:

Huyền phù Silica matrix (4g) trong aceton khô (150 ml) tạo thành silanized với 3-
aminopropyl triethoxysilane dưới áp suất khí quyển. Khuấy trộn cho phản ứng
trong 16 giờ . Cho huyền phù Silica lần nữa trong aceton khô và rửa bằng phương
pháp trích ly Soxhlet với methanol, aceton, và diethylether. Quá trình trích ly
ngừng khi không có phản ứng silane với 0.5 % ninhydrin (cho ninhydrin vào dung
dịch màu không thay đổi sau 30-60 phút). Thu nhận Aminopropyl silica matrix và
rửa, làm khô. Một số nhóm amino bao bọc ngòai silica matrix được phá vỡ bằng
HCl.

Hình 11: Mẫu silica nhân tạo quang sát trên máy scanning electron microscope
(SEM) , đường kính (a) 12 µm,(b) 5µm, (c) 14 µm
Gắn n-butanol ligand lên aminopropyl silica matrix:
Aminopropyl silica matrix (0.15 g) phản ứng với n-butanol 10% (10 ml) và EDC
(0.02 g) trong dung dịch đệm MES pH 4.78( 15ml), lắc 170 v/phút trong 90 phút ở
nhiệt độ phòng, sau đó đem lọc. Gel nhận được rửa với nước, NaCl 1N, và nước.
Dùng NaOH 0.05 N để phá vỡ ligand không liên kết nổi lên trên.
2.5. Ảnh hưởng của quá trình sắc ký ái lực đến hiệu suất thu hồi enzyme và
độ tinh sạch của enzyme protease
2.5.1 Ảnh hưởng của bản chất enzym cần phân tích

Hình 12: các đồ thị sắc ký thu được bằng cách cho chạy một số enzym qua cột
Sepharose có gắn α -amino caproyl-D-tryptophan methyl ester (0.5x5 cm). Cột này
được cân bằng và chạy với dung dịch đệm tris- Cl 0.05M, pH 8, khoảng 3mg protein
(từ A tới E) được hòa tan trong 0.5 ml dung dịch đệm trên và chạy trên cột. Rửa giải
α -chymotrypsin với acid acetic 0.1M (mũi tên). Mẫu F chứa 1ml dich huyền phù
(280 mµ độ hấp phụ khoảng 15) thu được bằng cách hòa tan 100mg bột pancrease
của bò trong 3 ml tris-Cl, pH 8, rồi đem ly tâm 20 phút ở 4000 x g. Hoạt tính enzym
thể hiện qua độ hấp phụ (256 mµ ) /phút/5 µ l mẫu, với cơ chất là benzoyl-L-tyrosin
ethyl ester. Các điều kiện khác như hình 4, 5.
Điều thú vị là chymotrypsinogen A được giữ lại đáng kể (mặc dù không nhiều)
bởi cột đặc hiệu cho chymotrypsin (hình 12A và 12B). Điều này cho thấy các tiền
enzym này có khả năng được nhận ra yếu với các cơ chất tương tự. Enzym thủy
phân protein có tính đặc hiệu rộng với cơ chất như subtilisin thì không được hấp
phụ (hình 12D) một lượng nhỏ protein giống chymotrypsin cũng có thể được dễ
dàng phân tách khỏi hệ enzym tiêu hóa thô (hình 12F). Loại nguyên liệu này chứa
tất cả hoạt tính chymotrypsin của hệ enzym tiêu hóa thô nhưng nguyên nhân ái
lực đặc hiệu thấp cũng như bản chát chính xác của nó vẫn chưa được xác định. Có
thể rửa giải với dung dịch α -phenyl propionamid 0.018M, một chất ức chế với
K1 = 7mM. Nếu cột Sepharose được cân bằng trong dung dịch phenyl
propionamid 0.0058M, α -chymotrypsin chỉ được giữ lại ít. Những kết quả này
lại một lần nữa cho thấy quá trình phân tách rõ ràng là có liên quan đến ái lực về
chức năng của vị trí liên kết enzym với cơ chất đặc hiệu.
Hình 13: sắc ký ái lực carboxypeptidase A trên cột Sepharose có gắn L-tyrosin-D-
tryptophan (0.5 x 6 cm). Dung dịch đệm là tris-Cl 0.05 M, pH 8, có chứa 0.3N NaCl.
Khoảng 1 mg carboxypeptidase A tinh khiết (A, B) và 1,8 mg carboxypeptidase B (C),
trong 1 ml dung dịch đệm tương tự được chạy trên cột. Rửa giải với acid acetic 0.1 M
(mũi tên).
Carboxypeptidase A: một chất hấp phụ đặc hiệu cho enzym này được chuẩn bị bằng
cách gắn dipeptide L- tyrosin-D-tryptophan lên Sepharose. Trong quá trình gắn,
khoảng 60 µ moles chất ức chế dipeptide này được thêm vào trên 1ml Sepharose.

Hình 13 cho thấy rằng enzym này được hấp phụ rất mạnh trên cột Sepharose trên.
Năng suất thu được sau rửa giải được định lượng một lần nữa.
2.5.2. Ảnh hưởng của các loại chất hấp phụ khác nhau
- Ảnh hưởng của các ligand khác nhau
D-tryptophan methyl ester là một chất ức chế α -Chymotrypsin, được cặp đôi với
Sepharose (hình 14). Khi chất ức chế được gắn trực tiếp lên Sepharose, thì enzym
sẽ không thể dung giải hoàn toàn và đạt yêu cầu (hình 14B). Tuy nhiên, enzym sẽ
được hấp phụ mạnh nếu có một chuỗi 6-cacbon (α -amino caproic acid) xen giữa
matrix Sepharose và chất ức chế (hình 14C). Điều này cho thấy ảnh hưởng rõ rệt
của sự khác nhau về cấu hình không gian. Khi chất ức chế được gắn quá gần với
gel hỗ trợ, sự hấp phụ sẽ kém. Tầm quan trọng về ái lực đặc hiệu cho vị trí liên
kết với enzym được minh họa bằng sự vắng mặt của chất hấp phụ DFP-treated-
α -Chymotrypsin (hình 14D). Kết quả cho hoạt tính enzym giảm mạnh.

Hình 14: Sắc ký ái lực α -chymotrypsin trên cột Sepharose có gắn chất ức chế.
Cột (0.5 x 5cm) được cân bằng trong dung dịch đệm tris-Cl 0.05 M, pH8. Mỗi
mẫu (2.5 mg) được chạy trong 0.5 ml dung dịch đệm trên. 1 ml mỗi phân đoạn
được thu nhận, vận tốc chảy khoảng 40 ml/h, các thí nghiệm được tiến hành ở
nhiệt độ phòng. α -chymotrypsin được rửa giải bằng acid acetic 0.1 M, pH3. Các
Peak trước dấu mũi tên trong hình B, C, D là không có hoạt tính enzym.
Sử dụng các chất hấp phụ ái lực khác nhau để loại bỏ/tinh sạch serine protease,
kết quả cho thấy sự tăng liên kết đặc hiệu với serine (hình 15).
Trong đó, control gel là một matrix rắn ưa nước, có chứa nhóm hydroxyl.
Modified gel là gel ưa nước trên gắn thêm các nhóm phosphorous hữu cơ.
Chúng có dạng: Matrix – O – POF – OR
Trong đó, O là oxygen, P là phosphorous, F là fluoride, và R là một nhóm alkyl.

Matrix có thể là bất cứ polymer nào có nhóm OH-, như agarose, dextran
cellulose, hydroxyappetite hoặc các polyacrilamide thay thế.

Hình 15: Ảnh hưởng của các loại matrix khác nhau lên khả năng liên kết với
protease
- Ảnh hưởng của vị trí liên kết ligand lên matrix:
Tinh sạch enzym protease thủy phân insulin (ISP – Insulin Specific Protease)
phân lập từ tế bào xương của chuột, sử dụng sắc ký ái lực trên agarose được liên
kết với insulin:
Insulin nếu liên kết với agarose ở gốc phenylalanin sẽ là một cơ chất cho enzym
và bị enzym thủy phân, trong khi nếu insulin gắn với agarose ở gốc lysine không
bị enzym thủy phân. Do đó, chỉ có agarose liên kết với insulin tại vị trí đầu NH2

của phenylalanin trên chuỗi B mới được dùng để tính sạch, còn insulin liên kết
với agarose ở gốc lysine B-29 thì không.
Tổng hợp Insulin-agarose theo 3 cách:
Cách 1 và 2: Hoạt hóa trước agarose với cyanogen bromide. Sau đó cho phản ứng
với insulin ở 2 điều kiện khác nhau: dd đệm NaHCO3 0.2M ở pH 9 hoặc natri
citrate 0.2M ở pH 5. Ở điều kiện acid, đầu N của phenylalanin của chuỗi B của
insulin sẽ liên kết với agarose. Ở điều kiện base, phản ứng sẽ diễn ra với gốc
lysine ở vị trí 29 của chuỗi B.
Cách 3: Insulin được diacetyl hóa cho phản ứng với agarose đã hoạt hóa ở pH 9.
Ba loai insulin-agarose thu được đem ủ với ISP trong dung dịch đệm borate
0.13M (pH 7.5), ở 37oC trong những khoảng thời gian nhất định. ISP sử dụng đã
được tinh sạch một phần bằng phương pháp tách phân đoạn với ammonium
sulfate.
Dùng N-ethylmaleimide 0.1mM để dừng phản ứng. Kết quả phân tích cho thấy
mức độ liên kết với enzym ISP se khác nhau, thể hiện qua lượng cơ chất bị enzym
thuỷ phân (bảng 6).

Bảng 6: Sự thủy phân insulin lợn và những dẫn xuất insulin-agarose khác nhau
bằng ISP
- Ảnh hưởng của nồng độ ligand lên số ligand được liên kết:
Tinh sạch α -Chymotrypsin bằng Sepharose có gắn D-tryptophan methyl ester.
Ta thấy, D-tryptophan methyl ester là một chất ức chế tương đối yếu, nhưng kết
quả α -Chymotrypsin được giữ lại trong cột khá đáng kể. Như vậy, hằng số ái
lực mạnh không phải là yêu cầu thiết yếu cho kĩ thuật này. Hằng số ái lực tương
đối yếu của α -Chymotrypsin với D-tryptophan methyl ester được hỗ trợ bởi số
lượng lớn chất ức chế gắn lên Sepharose.
Có khoảng 6.5 µ mol hợp chất gắn trên 1ml Sepharose trong quá trình cặp đôi, và
có khoảng 10µ mol/1ml cột, dùng chất ức chế với một nồng độ thích hợp khoảng
10mM. Quá trình cặp đôi diễn ra trong đệm NaHCO3 0.1M, pH 9.0.
Số ligand được cặp đôi lên matrix phụ thuộc nhiều vào nồng độ của nó lúc tiến
hành quá trình liên kết. Hình 16 minh hoạ ảnh hưởng của nồng độ protein lên số
protein được cặp đôi lên 2ml CNBr-activated Sepharose 4B trong NaHCO3, dung
dịch NaCl, pH 8.

Hình 16: Hiệu suất gắn n-butanol ligand lên aminopropyl silica matrix
Khi sử dụng n-butanol 10%hiệu suất gắn là 99.96 % cao hơn những nồng độ n-
butanol khác như hình 3.
2.5.3. Ảnh hưởng của nồng độ protease
Hình 17: Ảnh hưởng của nồng độ protease đến số lượng protease liên kết
2.5.4. Ảnh hưởng của pH dd đệm
Protease kiềm tính được tinh sạch bằng phương pháp single step chromatography
trên phenyl sepharose 6 FF hiệu suất thu được đạt 28%, khối lượng phân tử 40

kDa,đã được đánh giá bằng SDS- PAGE. Enzyme đã thể hiện hoạt tính xúc tác và
sự ổn định ở pH > 8-13, ở pH tối ưu là 9-11, ổn định ở điều kiện NaCl 0- 4M và ở
nồng độ muối NaCl 150mM thì khả năng xúc tác tối ưu là 37 độ C, tuy nhiên nồng
độ muối yêu cầu cho điều kiện xúc tác tối ưu tỷ lệ thuận với nhiệt độ.Trong khi đó
ezyme chưa tinh sạch hoạt động ở 24-28 độ C nhiệt độ tối ưu là 50 độ C, Enzyme
được tinh sạch có nhiệt độ tối ưu ở 37 độ C, nhiệt độ tối ưu thay đổi là 80 độ C với
sự có mặt của NaCl 2M. Muối NaCl không chỉ làm thay đổi nhiệt độ mà còn làm
tăng ái lực với cơ chất của enzyme được thể hiện ở tăng hằng số xúc tác
Enzyme cũng phụ thuộc vào nồng độ của canxi, ở nồng độ là 2mM sự họat động
của enzyme đạt cực đại ở 50 độ C, Enzyme chưa tinh sạch thì chịu nhiệt cao hơn
trong khoảng 37-90 độ C, tuy nhiên Ezyme đã được tinh sạch thì mất sự ổn định
trên 50 độ C và mất một nửa ở 30 độ C và mất hoạt tính tăng lên 7 lần khi nhiệt độ
là 60 NaCl 1M và Ca 50mM. Hoạt tính của enzyme bị ức chế bởi PMSF chỉ ra đó
là loại serine. Trong khi đó sự hoạt tính tăng chậm khi Tween-80 (0.2%) và
Triton X-100 (0.05%), nó giảm với SDS.
Hình 18: Ảnh hưởng pH trong quá trình hấp phụ-giải hấp phụ đến specific
activity và purity protease ():Specific activity và (∆) : purity

Điều kiện pH khác, protease thu được có activity nhỏ hơn vì thay đổi điều kiện
thích nghi. Làm cho giảm hiệu suất gắn protease lên ligand.
Hình 19: Ảnh hưởng của pH và lực ion lên sự hấp phụ ái lực α -chymotrypsin
trên cột Sepharose có gắn α -amino caproyl-D-tryptophan methyl ester (0.5x5
cm). Chạy 1 mẫu chứa 2.5 mg α -chymotrypsin trong 0.5 ml đệm. Rửa giải α -
chymotrypsin với acid acetic 0.1M, pH3 (mũi tên), vận tốc chảy 70 ml/h. Peak đầu
tiên (các ống 2-4) thì không có hoạt tính chymotrypsin và hoạt tính đặc hiệu của
protein được rửa giải tiếp theo là một hằng số.
Hình 19 minh họa ảnh hưởng của pH và lực ion lên đồ thị sắc ký. Mặc dù trong
dung dịch đệm với lực ion yếu hơn (0,01 M) vẫn xuất hiện liên kết mạnh hơn, thì
vẫn không nên dùng bởi vì một số protein như pancreatic ribonuclease sẽ hấp phụ
không đặc hiệu lên cột Sepharose có gắn chất ức chế dưới các điều kiện trên. Hình
19 cho thấy các đồ thị thu được với một số enzym khác nhau chủ yếu nhấn mạnh
lên tính đặc hiệu của cột Sepharose đặc hiệu cho α -chymotrypsin (alpha

chymotripsin-specific Sepharose). Những tạp chát dạng chymotrypsin dù rất nhỏ

cũng dễ dàng được loại bỏ khỏi các enzym khác bằng kỹ thuật này.
Hình 20: Ảnh hưởng pH đến sự hút bám của trypsine bởi Aminobenzamidine
2.5.5. Ảnh hưởng của lực ion/nồng độ muối
Hình 21: Ảnh hưởng nồng độ NaCl trong quá trình hấp phụ-giải hấp phụ đến
specivity và purity protease ():Specific activity và (∆) : purity

Quá trình giải hấp phụ protease đạt được cao nhất nồng độ NaCl 0.5N do lực ionic
giữa Na+ và các nhóm không phải protease.
Sự giảm specific activity và purity của protease từ quá trình giải hấp phụ là do
enzyme đong tụ ở nồng độ NaCl cao .
2.5.6. Ảnh hưởng của thời gian rung lắc
Hình 22: Ảnh hưởng thời gia lắc trong quá trình hấp phụ-giải hấp phụ đến
specivity và purity protease ( ):Specific activity và (∆) : purity
Giảm activity của protease ở thời gian từ 45 đến 60 phút do quá trình gắn protease
lên ligand ở trạng thái bảo hòa. Trong khi đó thời gian ít hơn 30 phút thì protease
gắn vào ligand chưa đạt được maximum
Điều kiện lý tưởng để thu nhận protease cao nhất hấp phụ-giải hấp phụ là nồng độ
NaCl 0.5N, dung dịch đệm pH 5.7, lắc với tốc độ 170 vòng /phút trong 30 phút
như hình 4,5 và 6.

PHẦN 3: KẾT LUẬN
So sánh sắc ký ái lực với các phương pháp khác:
Bảng 7: Specific activity và purity từ các quá trình khác nhau
Hình 23: SDS-PAGE electrophoresis protease từ Bacillus sp. BAC-4. 1. Protein,

2. Mẫu thô ,3 . mẫu tách với 95% ammonium sulphate, 4. Tách với sắc ký trao
đổi anion, 5. Tách với hút ái lực.
Tách protease theo phương pháp hấp phụ ái lực sử dụng aminopropyl silica
matrix với n-butanol 10% ligand đạt được cao nhất ở điều kiện : dung dịch đệm
pH 5.7 giải hấp phụ NaCl 0.5N , lắc 170 v/phút ,30 phút . purity protease đạt
được 1248-fold cao hơn so với protease thô ban đầu.

Trong những năm gần đây, người ta quan tâm rất nhiều việc gắn đồng hóa trị các
hợp chất có hoạt tính sinh học (như enzym, kháng thể, kháng nguyên) lên các
polymer không hòa tan. Những vật liệu này đặc biệt là có dẫn xuất từ cellulose,
được sử dụng nhiều trong tinh sạch kháng thể, nucleotide, chuỗi nucleic acid, một
số tRNA và enzym. Nguyên tắc và quá trình như đã trình bày ở trên rất có giá trị
trong việc tinh sạch và phân lập nhiều loại protein hoặc polipeptide có hoạt tính
sinh học mà có thể liên kết đặc hiệu thuận nghịch lên các phân tử nhỏ.


Bai Lam2

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Bai Lam2

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn

Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.

Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 1

- Protease kiềm có pH 9-11.

* Ngoài ra có thể phân thành 2 loại khác:

Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 2

1.2. Ứng dụng sắc ký ái lực trong tinh sạch protease

Bảng 1: Cơ chất và ligand tương ứng trong sắc ký ái lực

Enzyme Substrate, cofactor

Antibody Antigen, Virus, Cell

Polysaccharide, glycoprotein Lectin

Nucleic acid binding protein Nucleic Acid

Hormone receptor Hormone

Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 4

PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ÁI LỰC TRONG TINH

2.1. Cơ sở khoa học

Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 5

 Qui trình thực hiện

Hình 1: Các bước trong sắc ký ái lực

Buớc 1: Chọn môi trường ái lực

Buớc 2: Chuẩn bị môi trường và dung dịch đệm

Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 6

Bước 3: Chuẩn bị mẫu và chạy mẫu

Bước 4: Rửa giải

 Phương pháp 1: Thay đổi dung dịch đệm

Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 7

Rửa giải pH:

Rửa giải lực ion:

Rửa giải cạnh tranh:

Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 8

Rửa giải với chất rửa giải có độ phân cực thấp:

Thường sử dụng dioxane (≤10%) hoặc ethylen glycol (≤50%).

Rửa giải chaotroptic:

Bước 5: Ổn định lại môi trường ái lực trong binding buffer.

2.2. Các matrix thường dùng

Sản phẩm thương mại thường gặp nhất là:

AH Sepharose: Sepharose có nhóm amine tự do.

CH Sepharose: Sepharose có nhóm carboxyl tự do.

CNBr-activated Sepharose: Sephaose được hoạt hoá bằng CNBr…

2.3. Ligand sử dụng để tinh sạch protease trong sắc ký ái lực

Bảng 3: Một số ligand thường sử dụng trong sắc ký ái lực

Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 10

 Subtilisin và thermitase: Z-Ala-AIa-Leu-pNA (p-nitroanilide).

 Subtilisin-like serine protease: Ala-Ala-Leu-pNA

 Enzyme từ rễ cây bồ công anh kininase X: Glp-Ala-Ala-Leu-pNA.

 Trypsin của bò và cua: Bz-D,L-Arg-pNA.

 Protease PC và papain: Glp-Phe-Ala-pNA.

 Carboxypeptidase PC: DNP-Ala-Ala-Leu.

Tổng hợp một số ligand:

Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 11

Boc-Leu-OH (1 g, 4.3 mmol) hoà tan trong 5ml THF (2)

* H-Leu-N(CH2 CH2) 2O *HCl

Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 12

508g Z-Ala-Ala-Leu-N(CH2CH2) 2O được hoà tan trong 7ml methanol, sau đó

2.4. Một số phương pháp cố định ligand trên matrix

Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 14

Quy trình làm việc:

Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 15

Các tác nhân:

1. Cyanogen bromide (Aldrich, Milwaukee, WI)

2. Sepharose 4B hoặc 6B (Pharmacia)

(Chú ý: không dùng cánh khuấy từ để tránh làm vỡ hạt gel).

6. Tiến hành cố định ligand ngay.