Professional Documents
Culture Documents
Báo cáo
Huế, 11/2010
Bài 1. ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ
m1 − m2
X% = x100
Mẫu (m=5g) m1 (g) m2 (g) m
6.185 3.960 44.5%
Đậu lạc
Nhận xét: Qua bảng kết quả trên cho ta thấy hàm lượng lipid
trong đậu lạc khá cao. Hàm lượng lipid chiếm gần một nữa lượng chất
có trong củ.
Qua bài thí nghiệm này giúp cho sinh viên nắm được các bước cơ
bản của phương pháp chiết rút lipid bằng máy soxlet, và rèn luyện
được kỹ năng làm thí nghiệm.
BÀI 3: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP LOWRY
Khi cho dung dịch C vào các ống nghiệm ta lắc đều và để trong 10
phút, sau đó cho vào mỗi ống nghiệm 0.5ml dung dịch Folin để yên
trong 30 phút. Sau đó đem so màu ở bước sóng 620nm ta thu được
kết quả như sau:
Sử dụng phần mềm oringin 7.5 xây dựng đồ thị chuẩn protein:
RSD N P
------------------------------------------------------------
0.99995 0.00209 5 <0.0001
------------------------------------------------------------
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
1. Nguyên tắc.
Phương pháp định lượng Cellulose dựa vào tính chất của nó trong
một hợp chất bền đối với tác dụng của acid mạnh và base mạnh,
không bị phân hủy dưới tác dụng của acid yếu, còn các chất khác
thường đi kèm theo với cellulose như hemicellulose, lignin...ít bền với
tác dụng của acid và base nên bị oxyl hóa, phân giải và tan vào dung
dịch khi xử lý nguyên liệu bằng dung dịch base hoặc hỗn hợp acid
nitric với acid acetic.
2. Hóa chất
Dung dịch acid nitric đặc(d=1.4)
Dung dịch acid acetic đặc
Rượu ethylic 96%
3. Tiến hành
3.1 Đối tượng là quả hồng
Cân 1g mẫu đã nghiền nhỏ và sấy khô ở nhiệt độ không đổi, cho vào
bình tam giác 250ml
Thêm vào bình 16.5ml hỗn hợp gồm 15ml acid nitric đặc và 1.5ml acid
acetic đặc. Lắp ống làm lạnh hồi lưu vào bình, đun sôi trong 30 phút.
Để nguội pha loãng hỗn hợp bằng nước nóng. Lọc qua giấy lọc đã sấy
khô tuyệt đối và biết trước khối lượng.
Rửa kết tử cellulose nhiều lần bằng nước cất nóng
Rửa bằng rượu ethylic 96% một đến hai lần.
Rửa bằng ete ethylic.
Sấy giấy lọc chứa mẫu ở nhiệt độ 100-105oC đến khối lượng không
đổi. Vì có thể dư lại một lượng nhỏ hemicellulose, lignin... nên cellulose
gọi là cellulose thô
4. Tính kết quả
Hàm lượng cellulose được tính như sau:
Ax100
X =
W
Trong đó: X: Hàm lượng cellulose tính %
A: khối lượng cellulose gram
W: Khối lượng mẫu thí nghiệm
0.007 x100
X = = 0.7%
1
5. Nhận xét, kết luận
Nhận xét:
hàm lượng phần trăm cellulose trong quả hồng rất thấp (0.7%).
Bởi vì, đối tượng thí nghiệm đã chín và lượng cellulose cũn không còn
nhiều.
Kết luận:
Qua bài này, em đã biết cách xác định hàm lượng cellulose thô,
nó sẽ giúp ích cho em sau này khi ra trường và đi làm. Em chân thành
cảm ơn Thầy.
Bài 6. XÁC ĐỊNH PROTEIN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI SDS
1.Yêu cầu ,mục đích :
1.1 Mục đích :
- Giúp sinh viên nắm vững lý thuyết
- Biết được phương pháp xác định protein bằng phương pháp
điện di SDS.
1.2 Yêu cầu :
- Chuẩn bị đầy đủ hóa chất và dụng cụ trước khi tiến hành thí
nghiệm. Đọc kỹ lý thuyết
-Thao tác nhanh nhẹn, cẩn thận.
2.Nguyên tắc :
-Điện SDS là phép phân ly các phân tử protein có khối lượng
khác nhau . SDS có điện tích âm rất lớn và có khả năng liên kết với
mạch peptide để biến tích cấu trúc bặc hai và bặc ba của protein bằng
cách bọc xung quanh khung polypeptide. Như vậy , số lượng SDS
tương tác với protein tỉ lệ với khối lượng kích thước phân tử protein và
điện tích SDS bám vào và có thể làm bất cứ phân tử pprotein nào cũng
chuyển động trong điện trường từ cực âm sang cực dương.Do đó, bằng
phương pháp điện di có thể tách biệt các phân tử protein có khối lượng
phân tử khác nhau.
3. Hóa chất và dụng cụ
3.1 Hóa chất:
1. Acrylamide 30%
Acrylamide 29 g
Bisacrylamide 1g
Định mức 100 mL bằng nước cất 2 lần
Bảo quản 4oC
2. Tris 2 M (pH 8,8)
Tris base 121 g
Nước cất 2 lần 300 mL
Chỉnh pH = 8,8 bằng HCl đậm đặc
Định mức 500 ml bằng nước cất 2 lần
3. SDS 10%
SDS 10 g
Định mức 100 mL với nước cất 2 lần
4. APS 10%
APS 1g
Định mức 10 mL với nước cất 2 lần
5. TEMED
Bảo quản ở 4oC
6. 4X separating gel pH 8,8
Tris 2M pH 8,8 75 mL
SDS 10% 4 mL
Định mức 100 mL với nước cất 2 lần
7. 4X stacking gel pH 6,8
Tris 2M pH 8,8 25 mL
Nước cất 2 lần 25 mL
Chỉnh pH = 6,8 bằng HCl đậm đặc
SDS 10% 4 mL
Định mức 100ml với nước cất 2 lần
8. 2X SDS sample buffer
Tris 2M pH 8,8 6,25 mL
Nước cất 2 lần 30 mL
Chỉnh pH = 6,8 bằng HCl đậm đặc
SDS 4g
Glycerol 20 mL
β- mercaptoethanol 10 mL
Bromophenol blue 0,2 g
Định mức với nước cất 2 lần tới 100 mL
Bảo quản ở -20oC
9. 10X Electrophresis buffer pH 8,3
Tris base 30 g
Glycine 144 g
SDS 10 g
Nước cất 2 lần 1000 mL
Chỉnh pH = 8,3 bằng HCl đậm đặc
10. Gel staining
Coomassie brilliant blue R250 2,5 g
Methanol 450 mL
Glacial acid acetic 100 mL
Nước cất 2 lần 450 mL
11. Gel destaining
Methanol 300 mL
Glacial acetic acid 100 mL
Nước cất 2 lần 600 mL
12.Dung dịch gel destaining
13. Nước cất
14.(NH4)2SO4
3.2 Dụng cụ :
-Micro pipet,máy chạy điện di, máy ly tâm,giấy thấm,hộp nhựa.
3.3 Đối tượng :
-Thơm.
4. Các bước tiến hành:
4.1. Đổ gel
Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất đầy đủ.
Bước 2: Lau sạch các tấm kính bằng ethanol, sau đó lau lại thật
sạch bằng nước cất. Gắn các tấm kính vào giá đỡ. Thử độ thấm lắp
ghép bằng nước cất, nếu nước chảy ra từ khe ghép nhiều thì phải làm
lại.
Bước 3: Pha dung dịch separating gel 12%.
DW 1,68 mL
Acrylamide 1,92 mL
Separating buffer 1,2 mL
TEMED 6µ L
APS 30 µ L
Vortex khoảng 1 - 2 phút, đổ nhanh vào giữa 2 tấm kính đã
chuẩn bị sẵn lên đến hơn 3/4 độ cao tấm kính. Cho nhanh nước cất vô
trùng vào bên trên gel. Sau khi đông (kiểm tra bằng dung dịch thừa ở
ngoài hoặc thấy vạch phân cắt ở 2 pha trên gel), nghiêng gel lại cho
nước chảy ra hết và làm khô bề mặt gel bằng giấy thấm.
Bước 4: Pha dung dịch stacking gel 5%
DW 0,88 mL
Acrylamide 260 µ L
Stacking buffer 380 µ L
TEMED 2µ L
APS 12 µ L
Vortex khoảng 1 phút, đổ nhanh vào giữa 2 tấm kính, bên trên
separating gel cho hết độ cao tấm kính. Cẩn thận đặt lược vào giữa 2
tấm kính sao cho không có bọt khí. Theo dõi gel đông, cứ khoảng 2
phút dùng pipette thêm stacking gel vào phía trên lược để bổ sung
lương gel bị chảy ra ngoài (nếu có).
4.2. Chuẩn bị mẫu:
-Mẫu được chuẩn bị như ở bài định lượng prôtein bằng phương
pháp Bradford.
Bước 5: Tính toán lấy 5 mẫu chứa khoảng 30 µ g protein và 5 µ L
sample buffer, 5 mẫu chứa 20 µ g protein và 5 µ L sample buffer.5
mẫu chứa 10 µ g protein và 5 µ L sample buffer.1 mẫu là dung dịch
chuẩn.
4.3. Chạy điện di
Bước 6: Cho gel vào buồng điện di, đổ ngập bằng đệm chạy (1X
Electrophoresis buffer). Chú ý không để bọt khí ở phía dưới tấm kính,
dùng pipette làm sạch gel thừa trong các giếng. Chạy prerun khoảng 5
phút ở 80 - 100 V.
Bước 7: Dùng Hamilton syringe load mẫu vào các giếng, cẩn thận
để mẫu không bị tràn ra ngoài.
Bước 8: Chạy điện di ở điện thế 60 V trong khoảng từ 3 giờ cho đến
khi vạch màu đi hết độ dài tấm kính (thời gian thay đổi tùy theo mẫu).
4.4. Nhuộm và rửa gel
Bước 9: Lấy gel ra khỏi buồng điện di, cho vào dụng cụ nhuộm
(thường là các hộp nhựa) có chứa dung dịch gel staining, lắc nhẹ
khoảng 25 vòng/phút trong khoảng từ 10 - 15 phút.
Bước 10: Rửa gel bằng dung dịch gel destaining trên máy lắc nhẹ,
khoảng 10 phút thay dung dịch rửa 1 lần cho đến khi hoàn thành.
5.Kết quả :
- Hàm lượng protein của thơm tương đối thấp.
6.Kết luận:
-Hàm lượng protein tương đối thấp.
-Biết được nguyên tắc của việc xác định protein bằng phương
pháp điện di SDS
Bài 7. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD
7.Kết luận:
- Hàm lượng protein tương đối thấp