P. 1
Giao Trinh Di Truyen Hoc

Giao Trinh Di Truyen Hoc

|Views: 1,040|Likes:
Được xuất bản bởinguyenkienhuyen

More info:

Published by: nguyenkienhuyen on Jul 24, 2011
Bản quyền:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

04/19/2013

pdf

text

original

MỤC LỤC

Chương 1. Bản chất của vật chất di truyền............................................ 1 I. DNA là vật chất di truyền...................................................................1 1. Các chứng minh gián tiếp .................................................................1 2. Thí nghiệm biến nạp DNA ( Transformation)................................... 2 3. Sự xâm nhập của DNA virus vào vi khuẩn........................................ 4 II. Thành phần và cấu tạo hóa học của acid nucleic.............................. 5 1. DNA................................................................................................... 7 1.1. Cấu tạo hóa học của DNA.............................................................. 7 1.2. DNA cuộn lại trong tế bào .......................................................... 11 2. RNA .................................................................................................14 2.1. RNA riboxom (ribosomal RNA-rRNA)....................................... 14 2.2. RNA vận chuyển (Transfer RNA - tRNA)................................... 15 2.3. RNA thông tin (messenger RNA – mRNA)................................. 17 2.4. Ribozym và self-splicing.............................................................. 18 III Các tính chất của DNA................................................................... 20 1. Biến tính (denaturation) và hồi tính (renaturation)........................ 20 2. Lai acid nucleic............................................................................... 22 IV. Những cấu trúc chứa DNA trong tế bào........................................ 23

1. Những đoạn DNA chứa thông tin di truyền.....................................23 2. Virus chứa DNA và virus chứa RNA............................................... 24 3. Nhiễm sắc thể chính và plasmid của vi khuẩn.................................25 4. Nhiễm sắc thể Eukaryota.................................................................25 4.1 Các trình tự lặp lại và đơn độc....................................................... 25 4.2 Nhiễm sắc thể của Eukaryota.........................................................27 4.3 Trình tự CEN................................................................................. 29 4.4. Trình tự Tel................................................................................... 29 Câu hỏi ôn tập .................................................................................... 30 Tài liệu tham khảo .............................................................................. 30 Chương 2. Sao chép DNA................................................................... 31 I. Sự bền vững của DNA với thời gian và qua nhiều thế hệ................ 31 1. DNA bị biến đổi ngay cả không sao chép .......................................31 2. Trình tự nucleotid được duy trì với mức chính xác rất cao qua nhiều thế hệ................................................................................................... 32 3. Các hệ thống bảo vệ DNA............................................................... 33 4. Sửa sai do phục quang hồi.............................................................. 34 5. Hệ thống SOS.................................................................................. 35 II. Cơ chế phân tử của sao chép DNA ................................................ 36 1. Nguyên tắc chung............................................................................ 36 2. Thí nghiệm tổng hợp nhân tạo DNA................................................37 3. Thí nghiệm chứng minh có sự tự nhân đôi theo nguyên tắc bán bảo tồn........................................................................................................ 37

4. Diễn biến sao chép DNA ở nhiễm sắc thể E.coli.............................38 4.1. Giai đoạn khởi sự (initiation)........................................................38 4.2. Giai đoạn nối dài (elongation)...................................................... 39 III. Sao chép DNA trong tế bào........................................................... 40 1. Sao chép ở nhiễm sắc thể Prokaryote............................................. 40 2. Sao chép nhiễm sắc thể ở tế bào Eukaryote.................................... 41 Câu hỏi ôn tập .................................................................................... 42 Tài liệu tham khảo .............................................................................. 42 Chương 3. Cơ sở tế bào học của tính di truyền....................................44 I. Các cấu trúc tế bào và khả năng tự tái sinh...................................... 44 1. Các cấu trúc có khả năng tự tái sinh...............................................44 2. Nhiễm sắc thể.................................................................................. 45 2.1. Hình thái NST............................................................................... 45 2.2. Kiểu nhân và nhiễm sắc đồ:.......................................................... 47 2.3. Chất nhiễm sắc..............................................................................47 3. Các nhiễm sắc thể đặc biệt.............................................................. 48 II. Chu trình tế bào và phân bào ở Eukaryote...................................... 51 1. Chu trình tế bào...............................................................................51 2. Nguyên phân (Mitosis) ....................................................................52 3. Giảm phân (meiosis)........................................................................53 III. Các kiểu sinh sản........................................................................... 59

1.Sinh sản vô tính................................................................................ 59 2. Sinh sản hữu tính............................................................................. 59 3. Các hình thức sinh sản đặc biệt.......................................................61 4. Chu trình sống hay vòng đời........................................................... 63 Câu hỏi ôn tập .................................................................................... 64 Tài liệu tham khảo .............................................................................. 64 Chương 4. Các quy luật di truyền của Mendel.................................... 66 I. Phương pháp thí nghiệm của Mendel............................................... 66 1. Tính trạng hay dấu hiệu (character)............................................... 66 2. Cách tiến hành thí nghiệm:............................................................. 68 II. Lai một tính trạng-Quy luật giao tử thuần khiết..............................69 1.Thí nghiệm........................................................................................ 69 2. Giải thích của Mendel..................................................................... 70 3.Tính trội không hoàn toàn và sự di truyền tương đương..................70 4. Cơ sở tế bào học.............................................................................. 70 5. Thí nghiệm chứng minh trực tiếp sự phân ly ở mức giao tử .......... 72 6. Quy luật thứ nhất (quy luật giao tử thuần khiết.............................. 72 III. Lai hai tính và nhiều tính............................................................... 73 1. Lai hai tính - Quy luật phân ly độc lập và tổ hợp tự do.................. 73 2. Lai với nhiều cặp tính trạng........................................................... 73 3. Một số tính trạng Mendel ở người...................................................75

4. Các quy luật chung của tính di truyền.............................................77 Câu hỏi ôn tập .................................................................................... 77 Tài liệu tham khảo .............................................................................. 78 Chương 5. Tương tac gen.................................................................... 79 I. Sự tương tác gen giữa các gen alen................................................. 79 1. Hiện tượng gây chết........................................................................ 79 2. Sự tương tác giữa các alen của cùng một gen.................................82 II. Sự tương tác giữa các gen không alen.............................................83 1. Tương tác át chế.............................................................................. 83 3. Tương tác đa gen............................................................................. 88 4. Tính đa hiệu của gen....................................................................... 89 III. Những phức tạp trong biểu hiện cuả gen....................................... 89 1. Gen biến đổi (Modifier gene).......................................................... 89 2. Các tính trạng bị giới hạn bởi giới tính.......................................... 90 3. Các tính trạng có sự biểu hiện phụ thuộc vào giới tính.................. 90 IV Độ thấm (penetrance) và độ biểu hiện (expression)....................... 91 1. Độ thấm (độ thâm nhập)..................................................................91 2. Độ hiện hay độ biểu hiện ................................................................92 V. Tác động của môi trường................................................................ 93 1. Tác động của môi trường bên ngoài............................................... 93 2. Tác động của môi trường bên trong................................................ 94

Câu hỏi ôn tập .................................................................................... 95 Tài liệu tham khảo .............................................................................. 95 Chương 6. Học thuyết di truyền nhiễm sắc thể....................................96 I. Sự xác định giới tính và sự di truyền liên kết với giới tính.............. 96 1. Tỉ lệ phân li giới tính....................................................................... 96 2. Các gen liên kết với giới tính...........................................................98 3. Các tính trạng liên kết với giới tính trong di truyền học người... 101 4. Gen nam giới và gen nữ giới ở người............................................101 4.1. Gen xác định nam giới................................................................ 101 4.2. Gen xác định nữ giới...................................................................102 5. NST X bất hoạt ở người................................................................. 102 6. Hiện tượng không chia ly của NST................................................104 7. Xác định giới tính do số bội thể.....................................................106 8. Xác định giới tính do điều kiện môi trường ..................................106 II. Sự di truyền liên kết...................................................................... 107 1. Hiện tượng liên kết........................................................................ 107 2. Liên kết hoàn toàn......................................................................... 108 3. Hiện tượng di truyền liên kết không hoàn toàn............................. 108 4. Các nhóm liên kết(Genelinkage)................................................... 109 III. Hiện tượng tái tổ hợp................................................................... 109 1. Tái tổ hợp và trao đổi chéo........................................................... 109

2. Cở sở tế bào học của trao đổi chéo...............................................111 3. Trao đổi chéo ở trong giai đoạn 4 sợi...........................................112 4. Trao đổi chéo nhiều lần.................................................................114 5. Nhiễu (Interference) và trùng hợp (Coincidence) ........................ 114 IV. Xác định vị trí gen và bản đồ di truyền....................................... 115 1.Xác định vi trí gen.......................................................................... 115 2. Bản đồ di truyền của NST và bản đồ di truyền tế bào...................116 V. NST người và bản đồ NST người................................................ 119 1. NST người......................................................................................119 2. Kỹ thuật lai tế bào soma................................................................ 120 Câu hỏi ôn tập .................................................................................. 122 Tài liệu tham khảo ............................................................................ 122 Chương 7. Di truyền học Vi khuân................................................... 123 I. Ưu thế và các đặc điểm của đối tượng vi sinh vật .........................123 1. Thời gian thế hệ ngắn, tốc độ sinh sản nhanh...............................123 2. Có sự tăng vọt số lượng cá thể...................................................... 123 3. Có cấu tạo bộ máy di truyền đơn giản.......................................... 124 4. Dễ nghiên cứu bằng các kỹ thuật vật lý và hóa học...................... 124 II. Đặc điểm của di truyền vi sinh vật................................................124 III. Sinh học của vi khuẩn.................................................................. 125 1. Cấu tạo tế bào và sinh sản............................................................ 125

2. Đặc điểm nuôi cấy......................................................................... 127 IV. Biến nạp ( Transformation)......................................................... 127 1. Hiện tượng và điều kiện.................................................................127 2. Cơ chế biến nạp.............................................................................128 2.1. Xâm nhập của DNA....................................................................128 2.2. Bắt cặp........................................................................................ 130 2.3. Sao chép...................................................................................... 130 V. Tải nạp (Transduction)..................................................................130 1. Phage là nhân tố chuyển gen.........................................................130 2. cơ chế.............................................................................................131 3. Phân biệt các dạng tải nạp............................................................ 132 VI. Giao nạp (Conjugation)............................................................... 133 1. Chứng minh có lai ở vi khuẩn....................................................... 134 2. Sự phân hóa giới tính ở vi khuẩn...................................................135 3. Các nhân tố F' và tính nạp (Sexduction)....................................... 137 4. Cơ chế tái tổ hợp .......................................................................... 137 VII. Cơ sở di truyền tính kháng thuốc của các vi khuẩn gây bệnh ở người.................................................................................................. 139 Câu hỏi và Bài tập..............................................................................140 Tài liệu Tham khảo............................................................................140 Chương 8. Di truyền học Virus......................................................... 142 I. Di truyền học thể thực khuẩn (Bacteriophage hay phage)............. 142

1. Sự hình thành vết tan và các thể đột biến phage...........................142 2. Tái tổ hợp di truyền trong một chu kỳ sinh tan (Lytic cycle)........ 144 2.1. Chu trình tan (Lytic cycle)..........................................................144 3. Sự sắp xếp của các gene trong nhiễm sắc thể phage.................... 146 4. Lập bản đồ cấu trúc tinh vi vùng rII của phage T4.......................147 5. Tính tiềm tan (Lysogeny) và phage λ............................................ 151 II. Đặc tính của các virus................................................................... 153 1. Tính đa dạng về cấu trúc và thành phần di truyền....................... 153 2. Tính đặc thù về vật chủ (Host specificity)..................................... 154 III. Tái bản của các virus................................................................... 154 1. Các virus của vi khuẩn.................................................................. 157 2. Các virus thực vật......................................................................... 157 3. Các virus động vật........................................................................ 158 4. Virus gây ung thư, HIV/ AIDS.......................................................160 Câu hỏi và Bài tập............................................................................. 163 Tài liệu Tham khảo............................................................................ 163 Chương 9. Di truyền học Vi nấm và Vi tảo.......................................165 I. Đại cương về nghiên cứu di truyền ở một số vi tảo thông dụng.... 165 II. Phân tích di truyền ở vi nấm......................................................... 166 1. Tính không dung hợp (incompatibility) ở vi nấm..........................166 2. Phân tích bộ bốn và lập bản đồ ở vi nấm......................................167

3. Phân tích di truyền trong chu trình cận hữu tính (tái tổ hợp trong nguyên phân)..................................................................................... 171 3.1. Sự đơn bội hoá (Haploidisation).................................................172 3.2. Tái tổ hợp trong nguyên phân (Mitotic recombination)............. 172 III. Nấm men như là E. coli của các tế bào eukaryote.......................173 1. Các nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo (YAC)................................173 2. Những hiểu biết mới về tổ chức của các nhiễm sắc thể của nấm men 175................................................................................................... 3. Những hiểu biết mới về tái bản và phiên mã của bộ gen nấm men..... 176 4. Những hiểu biết mới về ADN ty thể của nấm men........................ 177 Câu hỏi và Bài tập..............................................................................178 Tài liệu Tham khảo............................................................................179 Chương 10. Di truyền Tế bào chất ....................................................180 I. Sự di truyền tế bào chất.................................................................. 180 1. Sự di truyền của các gene lạp thể.................................................180 2. Sự di truyền của các gene ty thể.................................................... 183 2.1. Đặc điểm di truyền của các gene ty thể...................................... 183 2.2. Hiện tượng bất dục bào chất đực................................................ 186 3. Hiệu quả của dòng mẹ lên chiều xoắn vỏ ốc................................. 188 II. Lập bản đồ ở lạp thể và ty thể....................................................... 190 1. Lập bản đồ gene của DNA lạp thể.................................................190 2. Lập bản đồ gene của DNA ty thể...................................................192 III. Di truyền học phân tử các bào quan ............................................193

1. Các bộ gene lạp thể (cpDNA)........................................................193 2. Các bộ gene ty thể (mtDNA)..........................................................195 Câu hỏi và Bài tập..............................................................................195 Tài liệu Tham khảo............................................................................195 Chương 11. Sự điều hòa biểu hiện của gene..................................... 197 I. Các nguyên lý điều hòa và mức độ kiểm soát phiên mã................ 197 II. Điều hòa hoạt động gene ở prokaryote......................................... 199 1. Cấu trúc của operon......................................................................200 2. Điều hòa dương tính operon lactose............................................. 202 3. Điều hòa âm tính operon tryptophan............................................ 204 4. Phiên mã dở (Attenuation)............................................................ 205 III. Điều hòa biểu hiện gene ở eukaryote.......................................... 208 1. Sự biến đổi DNA............................................................................209 2. Các promoter................................................................................ 209 3. Những trình tự tăng cường phiên mã (Enhancer).........................210 4. Trình tự bất hoạt gene (gene silencing)........................................ 211 5. Promoter chọn lọc (alternative promoter).................................... 211 6. Splicing chọn lọc........................................................................... 212 Câu hỏi và Bài tập............................................................................. 213 Tài liệu tham khảo............................................................................. 213 Chương 12. Đột biến gene, tái tổ hợp và các yếu tố di truyền di động 215

I. Đột biến gene..................................................................................215 1. Các kiểu đột biến gene.................................................................. 215 1.1. Đột biến thay thế cặp base.......................................................... 216 1.2. Đột biến thêm hoặc bớt base ......................................................217 2. Cơ chế gây đột biến điểm.............................................................. 221 II. Sửa chữa và bảo vệ DNA.............................................................. 225 1. Cơ chế sửa sai sinh học................................................................. 225 1.1. Quang phục hoạt (photoreactivation) .........................................225 1.2. Sửa sai bằng làm mất nhóm alkyl (dealkylation)........................226 III. Các yếu tố di truyền vận động (Transposable genetic elements).230 1. Các yếu tố di truyền vận động ở prokaryote................................. 230 1.1. Gene nhảy của prokaryote.......................................................... 231 1.2. Cơ chế của sự chuyển vị............................................................. 232 2. Các yếu tố di truyền vận động ở eukaryote................................... 233 2.1. Các retrotransposon.................................................................... 233 2.2. DNA transposon..........................................................................235 Câu hỏi và Bài tập..............................................................................237 Tài liệu Tham khảo............................................................................ 238 Chương 13. Đôt biên nhiêm săc thê...................................................239 I. Đôt biên câu truc nhiêm săc thê......................................................239 1. Biến đổi cấu trúc trên một NST:....................................................240

1.1. Sự phát sinh các đột biến cấu trúc trên NST...............................240 1.2. Mất đoạn..................................................................................... 240 1.3. Lặp đoạn (tăng đoạn - Duplication)............................................ 242 1.4. Đảo đoạn (Inversion).................................................................. 242 1.5. Chuyển đoạn (Translocation)......................................................246 II. Đột biến số lượng NST................................................................. 248 1. Đa bội nguyên................................................................................248 2. Đa bội thể lai................................................................................. 250 3. Đa bội lệch hay đa nhiễm.............................................................. 251 III. Đột biến gây tạo hay cảm ứng..................................................... 255 1. Tác động gây đột biến của bức xạ ion hóa....................................255 1.1. Bức xạ ion hóa............................................................................ 255 1.2. Ảnh hưởng của liều lượng (dose) và cường độ bức xạ (radiation intensity)............................................................................................ 255 2. Tác động của tia tử ngoại..............................................................255 3. Các tác nhân gây đột biến hóa chất.............................................. 256 Câu hỏi và Bài tập............................................................................. 256 Tài liệu tham khảo............................................................................. 257

Bài giảng điện tử Môn: Di truyền học (45 tiết)
Trương Thị Bích Phượng Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế Chương 1

Bản chất của vật chất di truyền
Mục tiêu của chương
Giới thiệu bản chất của vật chất di truyền là DNA, thành phần, cấu trúc của phân tử DNA, dạng DNA khác nhau trong tế bào.

Số tiết: 6 Nội dung I. DNA là vật chất di truyền
Năm 1968, Frederich Miescher (Thụy Điển) phát hiện ra trong nhân tế bào bạch cầu một chất không phải là protein và gọi là nuclein. Về sau thấy chất này có tính acid nên gọi là acid nucleic. Acid nucleic có 2 loại là desoxyribonucleic (DNA) và ribonucleic (RNA). Năm 1914, R. Feulgen (nhà hóa học người Đức) tìm ra phương pháp nhuộm màu đặc hiệu đối với DNA. Sau đó các nghiên cứu cho thấy DNA của nhân giới hạn trong NST. Nhiều sự kiện cho gián tiếp cho thấy DNA là chất di truyền. Mãi đến năm 1944 vai trò mang thông tin di truyền của DNA mới được chứng minh và đến năm 1952 mới được công nhận. 1. Các chứng minh gián tiếp Nhiều số liệu cho thấy có mối quan hệ giữa DNA và chất di truyền - DNA có trong tế bào của tất cả các vi sinh vật, thực vật, động vật chỉ giới hạn ở trong nhân và là thành phần chủ yếu của nhiễm sắc thể. Đó là một cấu trúc mang nhiều gen xếp theo đường thẳng.

1

- Tất cả các tế bào dinh dưỡng của bất kỳ một loại sinh vật nào đều chứa một lượng DNA rất ổn định, không phụ thuộc vào sự phân hóa chức năng hoặc trạng thái trao đổi chất. Ngược lại, số lượng RNA lại biến đổi tùy theo trạng thái sinh lý của tế bào. - Số lượng DNA tăng theo số lượng bội thể của tế bào. Ở tế bào sinh dục đơn bội (n) số lượng DNA là 1, thì tế bào dinh dưỡng lưỡng bội (2n) có số lượng DNA gấp đôi. - Tia tử ngoại (UV) có hiệu quả gây đột biến cao nhất ở bước sóng 260nm. Đây chính là bước sóng DNA hấp thu tia tử ngoại nhiều nhất. Tuy nhiên trong các số liệu trên, thành phần cấu tạo của NST ngoài DNA còn có các protein. Do đó cần có các chứng minh trực tiếp mới khẳng định vai trò vật chất di truyền của DNA. 2. Thí nghiệm biến nạp DNA (Transformation) Hiện tượng biến nạp do Griffith phát hiện vào năm 1928 ở vi khuẩn Diplococcus pneumoniae (gây sưng phổi ở động vật có vú). Vi khuẩn này có hai dạng: - Dạng S (gây bệnh): có vỏ bao tế bào bằng polysaccharid, ngăn cản bạch cầu phá vỡ tế bào. Dạng này tạo khuẩn lạc láng trên môi trường agar. - Dạng R (không gây bệnh) không có vỏ bao tế bào bằng polysaccharid, tạo khuẩn lạc nhăn. Thí nghiệm được tiến hành như sau: a. Tiêm vi khuẩn dạng S sống gây bệnh cho chuột, sau một thời gian nhiễm bệnh, chuột chết b. Tiêm vi khuẩn dạng R sống không gây bệnh cho chuột, chuột sống c. Tiêm vi khuẩn dạng S bị đun chết cho chuột, chuột chết d. Tiêm hỗn hợp vi khuẩn dạng S bị đun chết trộn với vi khuẩn R sống cho chuột, chuột chết. Trong xác chuột chết có vi khuẩn S và R.

2

Hình 1.1 Thí nghiệm biến nạp ở chuột

Hiện tượng trên cho thấy vi khuẩn S không thể tự sống lại được sau khi bị đun chết, nhưng các tế bào chết này đã truyền tính gây bệnh cho tế bào R. Hiện tượng này gọi là biến nạp. Đến 1944, ba nhà khoa học T. Avery, Mc Leod, Mc Carty đã tiến hành thí nghiệm xác định rõ tác nhân gây biến nạp. Nếu tế bào S bị xử lý bởi protease hoặc RNAase. thì hoạt tính biến nạp vẫn còn, cứng tỏ RNA và protein không phải là tác nhân gây bệnh. Nhưng nếu tế bào chết S bị xử lý bằng DNAase thì hoạt tính biến nạp không còn nữa, chứng tỏ DNA là nhân tố biến nạp. Kết quả thí nghiệm được tóm tắc như sau: DNA của S + tế bào R sống  chuột chết (có S, R )

3

Kết luận: hiện tượng biến nạp là một chứng minh sinh hóa xác nhận rằng DNA mang tín hiệu di truyền. Nhưng vai trò của DNA vẫn chưa được công nhận vì cho rằng trong các thí nghiệm vẫn còn một ít protein.

Hình 1.2 Vật chất di truyền của phage là DNA

3. Sự xâm nhập của DNA virus vào vi khuẩn Năm 1952, A. Hershey và M. Chase đã tiến hành thí nghiệm với bacteriophage T2 xâm nhập vi khuẩn E.coli. Phage T2 cấu tạo gồm vỏ protein bên ngoài và ruột DNA bên trong. Thí nghiệm này nhằm xác định xem phage nhiễm vi khuẩn đã bơm chất nào vào tế bào vi khuẩn: chỉ DNA, chỉ protein hay cả hai. Vì DNA chứa nhiều phosphor, không có lưu huỳnh; còn protein chứa lưu huỳnh nhưng không chứa phosphor nên có thể phân biệt giữa DNA và protein nhờ đồng vị phóng xạ. Phage được nuôi trên vi khuẩn mọc trên môi trường chứa các đồng vị phóng xạ P32 và S35. S35 xâm nhập vào protein và P32 xâm nhập vào DNA của phage

4

Thí nghiệm: phage T2 nhiễm phóng xạ được tách ra và đem nhiễm vào các vi khuẩn không nhiễm phóng xạ, chúng sẽ gắn lên mặt ngoài của tế bào vi khuẩn. Cho phage nhiễm trong một khoảng thời gian đủ để bám vào vách tế bào vi khuẩn và bơm chất nào đó vào tế bào vi khuẩn. Dung dịch được lắc mạnh và ly tâm để tách rời tế bào vi khuẩn khỏi phần phage bám bên ngoài vách tế bào. Phân tích phần trong tế bào vi khuẩn thấy chứa nhiều P32 (70%) và rất ít S35, phần bên ngoài tế bào vi khuẩn chứa nhiều S35 và rất ít P32. Thế hệ mới của phage chứa khoảng 30% P32 ban đầu Thí nghiệm này đã được chứng minh trực tiếp rằng DNA của phage T2 đã xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và sinh sản để tạo ra thế hệ phage mới mang tính di truyền có khả năng đến nhiễm vào các vi khuẩn khác.

Hinh 1.3 Sư xâm nhâp DNA cua virus vao vi khuân

II. Thành phần và cấu tạo hóa học của acid nucleic
DNA và RNA là những hợp chất cao phân tử. Các đơn phân là các nucleotide. Mỗi nucleotide gồm ba thành phần - H3PO4

5

- Đường desoxyribose (DNA ), ribose ( RNA) - Nitrogenous base DNA + Purin + Pyrimidin (a) Adenin (A) Guanin (G) Cytosin (C) Timin (T) RNA Adenin (A) Guanin (G) Cytosin (C) Uracin (U)

(b)

(c)

Hình 1.4 Thành phần đường và base của nucleotide (a) Base purin va pyrimidin (b) Đương ribose va deoxyribose (c) Sư khac nhau giưa Thymine va Uracil

Trong nucleotide, base purin sẽ gắn với C1 của đường ỏ N9. Nếu là pyrimidin thì sẽ gắn với C1 của đường ở N3. C5 của đường gắn với nhóm phosphate.

6

Trong mạch, 2 nucleotide nối với nhau nhờ mối liên kết giữa nhóm 3 -OH của đường với nhóm -OH của H3PO4, cùng nhau mất đi một phân tử nước.

Nếu phân tử chỉ gồm đường và nitrogenous base gọi là nucleoside. 1. DNA 1.1. Cấu tạo hóa học của DNA

Hình 1.5 Sự bắt cặp bổ sung của các base của hai mạch đơn

Trên cơ sở các nghiên cứu của mình, Chargaff (1951) đã đưa ra kết luận: + Số lượng A = T, G = C

7

+ Tỉ số A +T G+X

đặc trưng cho mỗi loài sinh vật.

Các base căn bản của acid nucleic bắt cặp bổ sung Cũng trong thời gian này, Wilkins và Franklin (người Anh) nghiên cứu, phân tích tán xạ bằng tia rơnghen, kết luận: + Các purin và pyrimidin có cấu trúc phẳng, mặt phẳng của chúng được xếp vuông góc với trục dài của mạch polynucleotide cái này xếp chồng lên cái kia, khoảng cách trung tâm giữa hai mặt phẳng kề nhau là 3,4Ao + Mạch polynucleotide xoắn thành lò xo quanh trục giữa, mỗi bước xoắn là 34Ao (ứng với 10 nu) + Việc so sánh nồng độ DNA đo được với các số liệu tính toán trên cơ sở sắp không gian của các nguyên tử cho thấy DNA có nhiều hơn một mạch polynucleotide. Năm 1951, J. Watson và F. Crick: tổng hợp các số liệu phân tích hóa học và tán xạ của tia X, để xây dựng nên mô hình cấu trúc phân tử DNA. Theo mô hình này, phân tử DNA có những đặc trưng chủ yếu trong cấu trúc không gian như sau:

Hình 1.6. Mối liên kết hydro giữa A-T và G-C

8

1. Phân tử DNA gồm hai chuỗi polynucleotide xoắn song song ngược chiều quanh một trục chung. 2. Các gốc base quay vào phía trong của vòng xoắn, còn các gốc H3PO4, pentose quay ra ngoài tạo phần mặt của hình trụ. Các mặt phẳng của phân tử đường nằm về phía phải của các base. Còn các base thì xếp trên những mặt phẳng song song với nhau và thẳng góc với trục phân tử. Khoảng cách giữa các cặp base là 3,4 Ao. Chúng lệch nhau một góc 360 nên cứ 10 gốc (10 nucleotide) tạo nên một vòng quay.

Hình 1.7 Chuỗi xoắn kép DNA

3. Chiều cao của mỗi vòng xoắn là 34 Ao, gồm 10 bậc thang do 10 cặp base tạo nên. Đường kính của vòng xoắn là 20 Ao.

9

4. Hai chuỗi polynucleotide gắn với nhau qua liên kết hydro được hình thành giữa các cặp base đứng đối diện nhau theo nguyên tắc bổ sung cặp đôi nghiêm ngặt: A luôn luôn liên kết với T bằng 2 mối liên kết hydro, G liên kết với X bằng 3 mối liên kết hydro. Do đó trong phân tử DNA tổng số base loại pirimidin luôn bằng tổng số các base loại purin (quy luật Chargaff). + Khoảng cách giữa hai mạch polynucleotide luôn xác định, không thay đổi. Khoảng cách này bằng kích thước của một base loại purin cộng với kích thước của một base loại pirimidin. + A luôn luôn đi với T là vì giữa 2 base này chỉ có khả năng hình thành nên hai liên kết hydrro ở các vị trí N6 - O6 và N1 - N1. G luôn luôn đi với X vì giữa 2 base này có thể tạo ra 3 liên kết hydro ở các vị trí N6 - O6, N1 -N1 và N2 - O2. Vì vậy mà A chỉ liên kết với T và G chỉ liên kết với C. 5. Tính chất bổ sung giữa các cặp base dẫn đến tính chất bổ sung giữa hai chuỗi polynucleotide của DNA. Do đó biết thành phần, trật tự sắp xếp của các nucleotide trên chuỗi này sẽ suy ra thành phần, trật tự sắp xếp của các nucleotide trên chuỗi kia. Đặc điểm quan trọng nhất của mô hình là đối song song (antiparallel). Để các bazơ tương ứng đối diện nhau, hai mạch cần phải bố trí: đầu của sợi này đối diện với đuôi của sợi kia. Mô hình Watson-Crick ra đời từ năm 1953 và trong vòng 25 năm tiếp theo nó được công nhận và sử dụng rộng rãi. Mãi đến những năm 70, nhờ dùng các phân tích chính xác nhiều dạng DNA đã được phát hiện, dạng thường gặp là dạng B theo mô hình của Watson-Crick, đây là cấu trúc phổ biến cho hầu hết sinh vật. Mỗi dạng DNA là một dòng họ các phân tử có kích thước dao động quanh các trị số trung bình Hai chỉ số được dùng để đánh giá DNA - Chỉ số h: là chiều cao giữa hai nu kề nhau. - Chỉ số n: số nucleotide của một vòng xoắn Ngoài DNA dạng B, còn nhiều dạng xoắn phải khác (A, C, D ...) chúng phân biệt với DNA dạng B về khoảng cách giữa các base cũng như độ nghiêng của chúng so với trục và sự phân bố trên chuỗi kép.

10

Gần đây, người ta còn phát hiện ra một dạng DNA có bộ khung zigzag và đóng xoắn theo chiều trái, gọi là DNA xoắn trái hay DNA Z, trên mỗi vòng xoắn có tới 12 cặp base. Giải thích sự tồn tại của DNA Z có nhiều quan niệm khác nhau: Theo Watson, chỉ trong những điều kiện đặc biệt, như nồng độ muối cao thì các vùng chứa trình tự ...GCGCGC... chuyển sang cấu hình Z, ngược lại ở nồng độ muối thấp chúng quay trở lại dạng B. Điều đó chứng tỏ DNA Z có thể đóng vai trò giảm sức căng cục bộ trong phân tử DNA siêu xoắn hoặc có thể tương tác đặc thù với các protein điều hòa. Tuy nhiên A. Rich cho rằng DNA Z xảy ra trong tự nhiên mà bằng chứng là có mặt trong ruồi giấm bình thường. Có thể là vùng DNA Z nằm xen kẻ với vùng DNA B và chúng có thể xoay hình dáng thành dạng B khi xảy ra các biến đổi hóa học nào đó làm cho DNA Z trở nên không ổn định. Rich còn gợi ý rằng những gen nằm ở các vùng bị xoay như thế thì có thể tháo xoắn sau đó và bắt đầu phiên mã. Nhờ vậy mà protein có thể được tổng hợp. Mặc dù đây mới chỉ là giả thiết song khám phá này đã cung cấp một công cụ tiềm năng cho nghiên cứu về hoạt động của các gen và DNA.Việc phát hiện các dạng DNA cho thấy DNA trong tế bào không đơn điệu. tùy trạng thái sinh lý mà DNA ở dạng này hoặc dạng khác.

Hình 1.8 DNA dạng xoắn kép Z a. Mô hình dạng B của Watson-Crick, là dạng xoắn phải với trục đều b. Mô hình dạng Z, là dạng xoắn trái với trục không đều

1.2. DNA cuộn lại trong tế bào Hầu hết trong cơ thể sinh vật, DNA có chiều dài dài hơn rất nhiều lần so với chiều dài của tế bào.

11

Ví dụ: phage T2 có chiều dài tế bào khoảng 0,16 µm, trong khi chiêu dài ADN của chúng khoảng 50 µm.

Hình 1.9 Các dạng thẳng, vòng tròn và xiêu xoắn của DNA

Do đó DNA ở trong tế bào phải cuộn xoắn. Sự cuộn xoắn này rất tinh vi vì trong quá trình tồn tại, các gen phải hoạt động, như vậy nó phải là một chất có hoạt tính thường xuyên Người ta thấy DNA có thể ở 3 dạng cấu trúc: - Dạng siêu xoắn: mạch kép vặn xoắn lại thành hình số 8. Đây là dang tự nhiên ở vi khuẩn.

12

- Dạng vòng tròn: sợi DNA căng tròn có được do DNA siêu xoắn bị cắt đứt 1 trong hai mạch kép. - Dạng thẳng: khi DNA bị cắt đứt cả hai mạch. Mô hình về bộ gen của E .coli Ở E. coli, chiều dài DNA được rút ngắn đáng kể, sự cuộn lại được thực hiện nhờ vào các RNA nối. Khi các RNA nối bị cắt thì các DNA bung dài ra, thuận lợi cho sự sao chép DNA. Nếu mạch DNA bị cắt, DNA được tháo xoắn, căng ra thuận lợi cho sự tổng hợp protein.

Hình 1.10 Mô hình cấu trúc nhiễm sắc thể (bộ gen) của E. coli (Theo Pettijohn và Hecht, 1974)

13

Hình 1.11 Sự tháo xoắn DNA trong tế bào vi khuẩn

2. RNA Ở các sinh vật như: thực khuẩn thể, virus của động vật, virus của thực vật... thì vật liệu di truyền là RNA. Ở các sinh vật bậc cao có RNA là bản sao mã của DNA. RNA có cấu tạo từ các đơn phân là các ribonucleotide. Giống với nucleotide, mỗi ribonucleotide gồm ba thành phần: đường ribose, H3PO4, bazơnitric (T được thay bằng U). Trong tế bào có ba loại RNA: 2.1. RNA riboxom (ribosomal RNA-rRNA) rRNA cùng với protein cấu tạo nên ribosome. rRNA chiếm tỷ lệ cao trong tế bào có thể đến 75% của tổng RNA. Ở các ribosome khác nhau có các rRNA khác nhau, chúng được đặc trưng bởi hằng số lắng S: - Eukaryote : ribosome có hệ số lắng khi ly tâm là 80S, gồm hai đơn vị: + Đơn vị lớn ( 60S) có rRNA 28S; 5,8S; 5S + Đơn vị nhỏ (40S) có rRNA 18S - Prokaryote và lục lạp, ty thể có hệ số lắng khi ly tâm là 70S, gồm 2 đơn vị: + Đơn vị lớn (50S): có loại rRNA 23S; 5S + Đơn vị nhỏ (30S): có rRNA 16S

14

RNA ribosom có cấu trúc bậc I (mạch thẳng) và cấu trúc bậc hai. Trong ribosome, các rRNA tồn tại ở dạng cấu trúc bậc hai. RNA ribosom có cấu tạo là một sợi xoắn có nhiều vùng liên kết đôi theo nguyên tắc bổ sung A liên kết với U, G liên kết với X và có khi G liên kết với U. Trong tế bào rRNA chiếm tỷ lệ cao có thể lên đến 75-80% tổng số RNA

Hình 1.12 rRNA cấu tạo nên ribosom

2.2. RNA vận chuyển (Transfer RNA - tRNA) Mỗi tRNA gắn với một phân tử amino acid, mang đến ribosome để tham gia tổng hợp protein. Mỗi tRNA đặc hiệu cho một loại amino acid. Có hơn 20 loại tRNA khác nhau tương ứng với hơn 20 loại amino acid. Trong thực tế, người ta thấy số lượng tRNA lớn hơn rất nhiều so với số lượng amino acid vì một amino acid có nhiều bộ ba mã hóa. Đồng thời cùng một bộ ba mã hóa, vẫn có thể có nhiều tRNA do hiện tượng biến đổi của các nucleotide trong tRNA tạo nên các loại tRNA mới và trong quá trình tổng hợp tRNA, sau khi hình thành chuỗi polynucleotide còn chịu sự tác động của các yếu tố của môi trường nội và ngoại bào làm các nucleotide bị biến đổi, tạo ra các tRNA mới. Các tRNA cùng tham gia vận chuyển một acid amin là các izoaceptor. Số lượng izoaceptor thay đổi tùy acid amin.

15

Cấu trúc bậc I của tRNA: tRNA vận chuyển có phân tử lượng nhỏ: 25.000-30.000, gồm 75-90 nucleotide, có hằng số lắng 4S. Trong thành phần cấu trúc của tRNA có khoảng 10% các nucleotide hiếm với khoảng 30 loại khác nhau. Mọi cấu trúc của tRNA đều có 2 đầu 5' và 3' giống nhau: đầu 5' luôn chứa G với gốc P tự do, còn đầu 3' luôn có 3 nucleotide là CCA 3'-OH. Nhóm 3'-OH của A có thể liên kết với acid amin để tạo phức hợp tRNA-aminoacyl. Chuỗi polynucleotide cuộn lại có những đoạn tạo mạch xoắn kép, hình thành cấu trúc bậc hai của tRNA.

Hình 1.13 Cấu trúc của tRNA

Enzyme aminoacyl tRNA synthetase gắn amino acid với tRNA tương ứng. Mỗi enzyme đặc hiệu cho một loại amino acid riêng biệt và xúc tác phản ứng gắn với tRNA của nó nhờ năng lượng ATP tạo ra aminoacyl tRNA. Phức hợp aminoacyl tRNA đến ribosome gắn với mRNA bằng nhờ các bộ ba đối mã (anticodon) trên tRNA bắt cặp bổ sung với các bộ ba mã hóa (codon) trên mRNA.

16

Các tRNA có một số đặc tính cấu trúc chung: chiều dài khoảng 7393 nucleotide, cấu trúc gồm một mach cuộn lại như hình lá chẻ ba nhờ bắt cặp bên trong phân tử. Đầu mút 3’ có trình tự kết thúc là CCA, amino acid luôn gắn vào đầu này. Đầu 5 chứa gốc phosphate của G. Mỗi tRNA có có 4-5 vùng với chức năng khác nhau: - Vòng DHU: có chứa nucleotide dihydrouridin, vùng này có chức năng nhận biết aminoacyl tRNA synthetase - Vòng anticodon: đọc mã trên mRNA theo nguyên tắc kết cặp anticodon – codon. - Vòng phụ: có thể không có ở một số RNA. - Vòng TφC: có chứa nucleotide pseudouridin, vùng này có chức năng nhận biết ribosom để vào đúng vị trí tiếp nhận aminoacyl tRNA (vị trí A) - Đấu 3’ –CCA: vị trí gắn với acid amin. tRNA chiểm khoảng 15% tổng số RNA của tế bào 2.3. RNA thông tin (messenger RNA – mRNA) RNA thông tin làm nhiệm vụ truyền đạt thông tin di truyền từ DNA đến protein. mRNA chiểm khoảng 5% tổng số RNA tế bào. Cấu trúc của mRNA: 5 m GxpYp vùng 5’ không mã hóa X, Y có thể là A hoặc G DNA polymerase khởi sự phiên mã ở đoạn nằm ngay trước vùng mã hóa được gọi là đoạn 5’ không mã hóa (5’-non coding). Do đó mRNA có đoạn đầu mang các tín hiệu cho ribosome nhận biết để gắn vào dịch mã. Ở đuôi 3’ sau dấu kết thúc có đoạn 3’ không mã hóa là nới gắn poly-A. Các mRNA của prokaryote có nữa thời gian (half life) tồn tại ngắn trung bình 2 phút. Các mRNA của Eukaryote có nữa thời gian tồn tại khoảng 30 phút - 24 giờ.
’ 7

AUG vùng mã hóa

UAG vùng 3’

3’

không mã hóa

17

Vò trí gaén Rb

Vò trí gaén Rb Maõ khôûi ñaàu AUG

Vò trí gaén Rb Maõ khôûi ñaàu AUG Maõ khôûi ñaàu AUG

5’ 3’

Vuøng khoâng maõ hoùa

UAA maõ keát thuùc

UAA maõ keát thuùc

UAA maõ keát thuùc

P1

P2

P3

Hình 1.14 mRNA ở Prokaryote
Vuøng khoâng maõ hoùa 5’ G Maõ keát thuùc UAA A-A-A--3’ AUG 5’ CAP Vò trí gaén Rb Vuøng khoâng maõ hoùa

P P P

Hình 1.15 mRNA ở eukaryote

2.4. Ribozym và self- splicing Vào 1981, phát minh về vai trò xúc tác của một số phân tử RNA đã làm đảo lộn quan điểm về chất này. Các phân tử rRNA của các loài nguyên sinh động vật, lúc đầu được tổng hợp với một số lượng lớn tiền chất, từ số các rRNA này sẽ có một được tạo ra bằng cách tự cắt nối (self - splicing). Quá trình cắt nối này có thể xảy ra ở in vitro trong sự vắng mặt của protein. Điều đó cho thấy rằng các trình tự intron tự nó có hoạt tính xúc tác tương tự enzyme. Phản ứng self-splicing trong đó trình tự intron tự xúc tác quá trình tự cắt rời khỏi phân tử rRNA ở loài Tetrahymena qua 2 bước: + phản ứng được bắt đầu khi nucleotide G gắn vào trình tự intron, đồng thời cắt mạch RNA.

18

+ Đầu 3’ của RNA mới vừa được tạo ra gắn vào đầu bên kia của intron hoàn thành phản ứng nối liền

Hình 1.16 Hoạt động cắt intron và nối exon trên mRNA

Trình tự intron dài 400 nucleotide đã được tổng hợp trong ống nghiệm và nó cuộn lại tạo phức hợp bề mặt có hoạt tính tương tự enzyme trong các phản ứng với các RNA khác. Mặc dù splicing phần lớn không được thực hiện tự động như ở Tetrahymena nhưng hiện tượng này cũng được phát hiện ở những sinh vật khác, cả ở nấm và vi khuẩn. Các RNA có khả năng tự xúc tác được gọi là ribozyme. Phát hiện này có ý nghĩa quan trọng trong việc tìm hiểu cơ chế và nguồn gốc sự sống.

19

Hình 1.17 Phản ứng self-splicing của RNA

III Các tính chất của DNA
1. Biến tính (denaturation) và hồi tính (renaturation) Hai mạch đơn của phân tử AND gắn với nhau nhờ các liên kết hydro.Khi đun nóng DNA từ từ, vượt quá nhiệt độ sinh lý (khoảng 8095oC), các liên kết hydro giữa 2 mạch bị đứt và chúng tách rời nhau. Trước tiên các mối liên kết A-T, khi nhiệt độ > 90 oC các liên kết G -C bị đứt. Đó là hiện tượng biến tính của DNA. Nhiệt độ mà ở đó 2 mạch DNA tách rời nhau được gọi là điểm chảy melting poin) của DNA: Tm. Nhiệt độ này đặc trưng cho mỗi loại DNA, phụ

20

thuộc vào số lượng các liên kết hydro. DNA có tỷ lệ G-C cao sẽ có điểm chảy cao. DNA có 60% G-C thì điểm chảy là 95oC.

Hình 1.18 Sự biến tính và hồi tính của DNA

Ngoài nhiệt độ, người ta còn dùng chất formanide (NH 2 -CH = 0) làm biến chất DNA ở 40oC Các DNA bị biến chất được hạ nhiệt độ từ từ, ở 60o -700C các nucleotide sẽ gắn lại với nhau để tạo nên DNA mạch kép. Hiện tượng này gọi là hồi tính.

21

Có thể biết được DNA bị biến tính hoặc chưa nhờ vào sự gia tăng hấp thụ tia cực tím khi bị biến tính và sự giảm hấp thu tia cực tím khi hồi tính. Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn, điều này xảy ra do “hiệu ứng siêu sắc” (hyperchromic effect), hoặc dựa vào sự thay đổi độ lắng tụ trong ống nghiệm khi ly tâm. 2. Lai acid nucleic Sử dụng đặc tính biến tính rồi hồi tính có thể tiến hành lai DNA với DNA, DNA với RNA, RNA với RNA. Nguyên tắc: lấy DNA A làm biến tính thành mạch đơn, trộn với DNA B cũng bị biến tính thành mạch đơn. Dung dịch được hạ nhiệt độ từ từ để xảy ra hồi tính. Đây là kiểu lai lỏng hay lai trong dung dịch. Quá trình hồi tính xảy ra, sợi A kết với A, B kết với B, đồng thời có sợi A kết với B tạo thành phân tử lai. Muốn lai được với nhau, giữa 2 loại DNA phải có những đoạn có trình tự bổ sung nhau. Có thể dùng đồng vị phóng xạ đánh dấu để phát hiện đoạn lai. Hiện nay còn sử dụng phương pháp lai trên pha rắn, được sử dụng rộng nhất: + Phương pháp Southern blot, dùng cho DNA + Phương pháp Northern blot dùng cho RNA + Phương pháp dot (điểm) và slot (khe) blot dùng cho RNA và DNA - Lai tại chỗ (in situ hybridization) là kiểu lai phân tử trong đó trình tự acid nucleic cần tìm (trình tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trong mô. Lai tai chỗ cho phép nghiên cứu NST, khuẩn lạc hay mô tế bào mà không cần tách chiết chúng. Dùng phương pháp lai DNA: + Có thể xác định mối quan hệ họ hàng giữa các loài. DNA người và DNA chuột chỉ lai được 25%. + Có thể tiến hành lai mRNA với DNA để xác định vị trí gen trên DNA tạo ra mRNA tương ứng. Phương pháp lai acid nucleic giúp hiểu chi tiết hơn về bộ gen, nó là cơ sở của phương pháp chẩn đoán mới dùng acid nucleic đang đuợc sử dụng rộng rãi.

22

Hình 1.19 Phát hiện các DNA lai với mẫu dò

IV. Những cấu trúc chứa DNA trong tế bào
1. Những đoạn DNA chứa thông tin di truyền Đại phân tử DNA là do polynucleotide tạo thành, được chia làm nhiều đoạn. Mỗi đoạn là một đơn vị chức năng, gọi là gen Gen được định nghĩa trong di truyền học: + Mendel là người đầu tiên nêu lên khái niệm “nhân tố di truyền” + J. Morgan cụ thể hóa khái niệm về gen: gen nằm trên nhiễm sắc thể chiếm một locus nhất định. Gen là đơn vị chức năng xác định một tính trạng. + Sau khi học thuyết trung tâm ra đời: gen là đoạn DNA trên nhiễm sắc thể không những mã hóa cho các loại protein mà cả các loại RNA. + Cuối những năm 70, sau khi phát hiện ra gen gián đoạn: gen là một đoạn DNA đảm bảo cho việc tạo ra một polypeptid nó bao gồm cả vùng trước và sau vùng mã hóa cho protein và cả những đoạn không mã hóa xen giữa các đoạn mã hóa. Hiện nay có thể định nghiã tổng quát như sau: gen là đơn vị chức năng cơ sở của bộ máy di truyền chiếm một locus nhất định trên NST và xác định một tính trạng nhất định. Các gen là những đoạn vật chất di truyền mã hóa cho những sản phẩm riêng lẻ như các RNA được sử dụng trực tiếp cho

23

tổng hợp các enzym, các protein cấu trúc hay các mạch polypeptid để gắn lại tạo ra các protein có hoạt tính sinh học. Toàn bộ những gen khác nhau của cơ thể, gọi là Idiotype. Ở Eukaryote nó bao gồm các gen trên nhiễm sắc thể (chromotype) và các gen ngoài nhân (plasmotype). Ở prokaryote, nó bao gồm bộ gen và plasmid. 2. Virus chứa DNA và virus chứa RNA Virus gây bệnh đốm thuốc lá (mosaic tobacco virus - MTV) là virus chứa RNA sợi đơn. Nó là một hạt hình que dài 300 nm, có đường kính 18 nm. Bên ngoài có một vỏ chứa 2130 phân tử và một vòng xoắn RNA ở bên trong. Chiều cao vòng xoắn: 23Ao, khối lượng phân tử = 2.106 đvC.

Hình 1.20 Virus khảm thuốc lá a. Ảnh virus khảm thuốc lá chụp bằng kính hiển vi điện tử ở độ phóng đại 37.428X b. RNA điều khiển sự hình thành tính trạng vỏ của virus

Một số virus chứa DNA sợi đôi như các thực khuẩn thể T2, T4, T6 chứa DNA mạch đôi thẳng, dài. Có chứa 2.105 đôi nucleotide, khối lượng

24

phân tử: 130.10 đvC. Khi lực thẩm thấu của môi trường thay đổi đột ngột, phân tử DNA này thoát ra khỏi vỏ protein, người ta chụp ảnh được ảnh DNA của tjực khuẩn thể T2 với chiều dài 0,05 mm (50µm), phân tử này xếp gọn ở phần đầu của thực khuẩn thể. Tất cả thực khuẩn thể T số chẵn chứa DNA với mạch polynucleotide giống nhau, nên khi trộn lẫn các DNA mạch đơn đã bị biến tính của chúng với nhau thì các mạch đơn này có thể tạo thành phân tử lai. Phân tử DNA của T3, T7 không thể hình thành phân tử DNA lai với DNA của T số chẵn. Còn virus ΦX174 có chứa DNA sợi đơn gồm 5400 nucleotide với khoảng 9 gen. 3. Nhiễm sắc thể chính và plasmid của vi khuẩn DNA của vi khuẩn làm thành thể nhân, tiếp xúc trực tiếp với tế bào chất, không có màng nhân làm giới hạn. DNA của thể nhân là DNA mạch vòng, xoắn kép Ví dụ: DNA E.coli có đường kính 350 µm, gồm 4.106 đôi nucleotide và chứa khoảng 500 gen xếp nối tiếp nhau thành chuỗi dài chi phối tất cả các hoạt động chức năng của sự sống. Plasmid cũng là phân tử DNA mạch kép, dạng vòng ở bên cạnh thể nhân. Khối lượng phân tử trung bình khoảng 1% DNA của thể nhân. Các plasmid có thể gắn tạm thời hoặc vĩnh viễn ở trên NST chính của vi khuẩn. Có thể tham gia sự tự nhân đôi và tham gia tiếp hợp khác như là một phần của NST chính. 4. Nhiễm sắc thể Eukaryota. 4.1 Các trình tự lặp lại và đơn độc DNA được cắt thành từng đoạn nhỏ, cho biến tính, sau đó hồi tinh thì các đoạn có trình tự bổ sung dễ tái tổ hợp với nhau hơn các đoạn khác. Nhờ vậy có thể nhận biết được các trình tự lặp lại. Dựa vào đó phân DNA thành ba loại: + DNA đơn độc (tái hợp rất chậm) + DNA lặp lại trung bình (tái hợp nhanh vừa) + DNA lặp lại cao (tái hợp rất nhanh)

25

Mặc dù DNA mang thông tin mã hóa cho các protein nhưng trong thực tế chỉ có khoảng 10% trong số 3 tỷ cặp nucleotide trong genome của người thực sự làm chức năng này. Căn cứ vào đặc điểm cấu trúc và phân, chia DNA thành các loại sau: - DNA đơn độc (Single copy DNA) Đây là loại phổ biến nhất, chiếm khoảng 75% genome. Các đoạn DNA này chỉ thấy 1 lần (hoặc vài lần) trong genome. Một phần nhỏ của DNA loại này là các gen mã hóa cho protein. Hẫu hết các DNA đơn độc là các intron hoặc là các đoạn nằm xen giữa các gen. - DNA lặp lại (repetitive DNA) Chiểm 25% còn lại của genome, đây là các đoạn DNA được lặp đi lặp lại hàng ngàn lần trong genome. DNA lặp lại gồm 2 loại: + DNA vệ tinh (satellite DNA): loại DNA tập trung ở 1 số vùng nhất định trên NST, ở đó chúng xếp đuôi nhau, cái này tiếp cái kia. Loại này chiếm 10% bộ gen. + DNA lặp lại rãi rác: loại DNA này chiếm khoảng 15% genome, gồm 2 loại: Các yếu tố rãi rác có kích thước ngắn SINEs (short interspersed repetitive elements): kích thước từ 90-500 bp. Trong nhóm này có loại DNA lặp lại tên Alu với kích thước khoảng 300 bp, mang đoạn DNA có thể bị enzyme hạn chế Alu I cắt (đây là enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn Arthrobacter luteus). Đoạn lặp Alu là 1 họ bao gồm các đoạn DNA có độ giống nhau cao, phân bố rãi rác khắp hệ gen với khoảng 300.000 bản sao, chiếm khoảng 2-3% toàn bộ DNA của người, chúng được xem như là các yếu tố vận động. Ở 2 đầu mỗi đoạn Alu có các đoạn lặp cùng chiều ngắn khoảng 7-10 bp. Bên trong đoạn Alu có các đoạn lặp dài khoảng 40 bp. Điểm đặc biệt của các đoạn lặp DNA này là có thể tạo ra bản sao của mình và có thể cài vào các phần khác của bộ gen. Hiện tượng này đôi khi có thể làm gián đoạn một gen mã hóa cho protein nào đó và gây ra tình trạng bệnh lý di truyền. Vai trò của các trình tự Alu đến nay chưa rõ. Một điều đáng kinh ngạc là có sự tương đồng (homologus) từ 80-100% giữa phần 3' của Alu với đầu mút 5' và 3' của RNA 7SL, là phần tương tác với các tín hiệu peptid trước khi vận chuyển ra tế bào chất. Việc xác định trình tự nucleotide của

26

Alu cho thấy có ít nhất 6 nhóm phụ và tất cả đều bắt nguồn từ DNA mã hóa cho RNA 7SL. Các yếu tố rãi rác có kích thước dài LINEs (long interspersed repetitive elements): bao gồm các họ LINE 1 (hay Kpn 1) và THE 1. Các trình tự LINE có chiều dài khoảng 6000-7000 bp với gần 5.000 bản sao nguyên vẹn và 100.000 bản sao từng phần rãi rác khắp bộ gen người. Chúng là những trình tự lặp lại không mã hóa dài nhất và thường ở vùng giàu AT. Các bản phiên mã trình tự LINE gắn với protein tạo thành phức hợp ribonucleoprotein. Ở một dòng tế bào người bị ung thư (teratocarcinome), người ta quan sát thấy có các ribonucleoprotein này. Sự xen đoạn LINE vào các vị trí khác nhau có thể gây hậu quả nhất định, như trong một trường hợp bệnh máu không đông A (hemophilia). 4.2. Nhiễm sắc thể của Eukaryota Nhiễm sắc thể chứa một phân tử DNA thẳng, mạch kép. NST Eukaryote gồm DNA và protein, trong số đó histon là protein cốt lõi trong việc cuộn lại và điều hòa hoạt tính của DNA. Sự hình thành NST kỳ giữa từ chuỗi xoắn kép DNA qua hệ thống các bậc cấu trúc sau: + Nucleosome là đơn vị cấu trúc của NST được tạo nên do sợi DNA dài quấn quanh các protein histon thành sợi 11nm. Đơn vị này là phức hợp gồm 146 cặp nucleotide của DNA quấn quanh 8 phân tử histon: 2H2A, 2H2B, 2H3 ,2H4. Các nucleosome kề nhau được nối qua một phân tử histon trung gian H1. + Sợi chromatin dày 30nm: các nucleosome xếp sít nhau tạo thành phức hợp nucleoprotein. + Vùng xếp cuộn dày 300 nm do sợi chromatin sau nhiều lần xoắn uốn khúc tạo nên. + Chất dị nhiễm sắc 700 nm + Kỳ giữa 1400nm.

27

Hình 1.21 DNA quấn quanh bởi protein histon

28

Hình 1.22 Phức hợp nucleoprotein cuộn lại thành NST

4.3. Trình tự CEN: trình tự lặp lại cao CEN là của các tâm động. 4.4. Trình tự TEL: thuộc các telomer (đầu mút của NST) với nhiều vai trò khác nhau: bảo vệ đầu mút NST khỏi bị cắt bởi nuclease, giữ chiều dài của NST khi sao chép, gắn với màng nhân và kìm hãm sự biểu hiện của các gen ở đầu mút. Các trình tự TEL có tính bảo tồn cao trong tiến hóa. Chúng có số lần lặp lại cao, giàu A và C.

29

Câu hỏi ôn tập
1. Nêu chứng minh gián tiếp cho thấy DNA là vật chất di truyền. 2. Trình bày thí nghiệm biến nạp qua đó chứng minh DNA là vật chất di truyền. 3, Các đặc điểm của mô hình cấu trúc của Watson và Crick (1953). 4. Mô tả các dạng tồn tại của DNA trong tế bào. 5. Mô hình vầ cấu trúc bộ gene của E. coli. 6. Cấu trúc và chức năng các loại RNA trong tế bào Eukaryote. 7. DNA và RNA khác nhau ở những cấu phần nào 8. Hãy nêu các tính chất của phân tử DNA. 9. Các trình tự lặp lại ở DNA Eukaryote 10. Trình bày các mức độ kết cuộn của DNA để hình thành nhiễm sắc thể.

Tài liệu tham khảo
Trịnh Văn Bảo, Phan Thị Hoan, Trần Thị Thanh Hương, Trần Thị liên, Trần Đức Phấn, Phạm Đức Phùng, Nguyễn Văn Rực, Nguyễn Thị Trang. 2002. Các nguyên lý sinh học. NXB Y học Hà Nội. Phạm Thành Hổ (2000). Di truyền học. NXB Giáo Dục. Nguyễn Bá Lộc (2004). Acid nucleic và sinh tổng hợp protein. Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (1998). Cơ sở di truyền học. NXB Giáo Dục. Hoàng Trọng Phán (1995). Di truyền học phân tử. Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế. Anthony J. F. Griffiths, Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin, William M. Gelbart, David T. Suzuki, Jeffrey H. Miller. 2004. An introduction to genetics analysis. W.H. Freeman Publishers. Harlt D.L., Jones E.W. (1998). Genetics - Principle and analysis. Jone and Bartlett Publshers. Toronto, Canada. Stansfield W.D. 1991. Schaum’s outline of theory and problems of genetics. McGraw-Hill, Inc., New York.

30

Chương 2

Sao chép DNA
Mục tiêu của chương
Giới thiệu về sao chép DNA, nguyên tắc của sao chép và các nhân tố tham gia vào quá trình sao chép DNA, các hệ thống sửa sai DNA nhằm duy trì tính chính xác của thông tin di truyền qua các thế hệ.

Số tiết: 3 Nội dung I. Sự bền vững của DNA với thời gian và qua nhiều thế hệ
1. DNA bị biến đổi ngay cả không sao chép

Hình 2.1 Sự mất amin của các base (desamination)

DNA là những phân tử rất dài, nhưng mảnh (đường kính: 20 A o), lại thường xuyên chịu tác động môi trường bên trong và bên ngoài tế bào nên dễ có những đứt gãy, biến đổi ngay cả khi không có sao chép.

31

Người ta tính ra rằng DNA của tế bào người mỗi ngày mất 5000 purin do quá trình mất purin (depurination): dưới tác dụng của nhiệt liên kết N-glycosil bị thủy phân. Quá trình biến đổi làm mất amin (desamination): biến cytosin thành uracin. Mỗi ngày tế bào người có khoảng 100 biến đổi như vậy. Con người cũng thường xuyên chịu tác động của tia tử ngoại làm tạo ra các dimer thymine.

Hình 2.2 Sự hình thành dimer thymine dưới tác dụng của tia tử ngoại

2. Trình tự nucleotid được duy trì với mức chính xác rất cao qua nhiều thế hệ Dùng các nucleotid và các enzyme DNA polymerse để tổng hợp DNA in vitro. Sai sót trong trường hợp này là 10-5. Như vậy sao chép trong ống nghiệm có mức chính xác cao, nhưng đối chiếu lên các sinh vật thì mức sai sót này hãy còn quá lớn.

32

Bằng cách đánh giá tần số các đột biến mới xuất hiện trong quần thể lớn và theo dõi biến đổi enzyme nào đó trong nuôi cấy mô tế bào, người ta tính được rằng trong cơ thể sinh vật sai sót trong khi sao chép in vivo là 1.10-9. Đánh giá tốc độ biến đổi trong tiến hóa cũng khẳng định mức chính xác rất cao trong sao chép in vitro. 3. Các hệ thống bảo vệ DNA Trong tế bào có một loạt hệ thống để bảo vệ DNA: - Các sinh vật tiền nhân và nhân thực đều chứa các enzyme có nhiệm vụ methyl hóa ở những điểm nhất định. Các enzyme cắt hạn chế của mỗi dòng vi khuẩn không cắt DNA của chúng vì đã được methyl hóa ở những điểm cần thiết, còn DNA ngoại lai vì không được methyl hóa ở những điểm nhất định nên bị cắt. Tế bào còn có các hệ thống sửa sai (repair system): + Sửa sai bắng cách cắt bỏ rồi tổng hợp sợi mới Các enzyme DNA polymerase I, II, III đều có hoạt tính polymerase hóa, còn có hoạt tính exonuclease theo hướng 5-3.

Hình 2.3 Sửa sai bằng cắt bỏ và tổng hợp lại đoạn bị hỏng

33

+ Sửa sai nhờ cơ chế tái tổ hợp Ngay cả khi không có sao chép vẫn có hệ thống bảo vệ: do DNA có hai mạch, khi sai hỏng trên một mạch, có thể dựa vào mạch còn lại để tổng hợp đoạn sai hỏng. Một số enzyme đặc hiệu phát hiện sự bắt cặp sai, như trong trường hợp mất purin. Có khoảng 50 enzyme chuyên phát hiện và sửa các sai hỏng trên phân tử DNA.

Hình 2.4. Sửa sai nhờ enzyme

4. Sửa sai do phục quang hồi Dưới tác dụng của tia tử ngoại, làm các timin đứng gần nhau sẽ gắn lại tạo thành dimertimin. Khi trở lại ánh sáng, ánh sáng sẽ kích thích một enzyme cắt bỏ dimerthymin tạo timin bình thường. Hiện tượng ánh sáng kích thích một enzyme cắt bỏ dimerthymin gọi là quang phục hồi.

34

5. Hệ thống SOS Ở tế bào vi khuẩn hoặc tế bào eukaryote bị sai hỏng nặng do chiếu tia UV, tia X hoặc do tác dụng của các hóa chất gây đột biến, hệ thống sửa sai khẩn cấp được khởi động, tăng cường sửa sai. Ở E.coli, hệ thống này có liên quan với 2 protein được mã hóa bởi gene LexA và RecA. Protein LexA là một chất ức chế, nó gắn vào hộp SOS, chồng lấp các promotor của các gene SOS, ngăn cản sự mã nhóm các gen của hệ thống SOS. Một vài sản phẩm của DNA bị tổn thương sẽ làm hoạt hóa protease recA. Protein recA bị hoạt hóa sẽ cắt bỏ protein lexA, cho phép các gen của hệ thống SOS phiên mã. Phẩn ứng của hệ thống SOS xảy ra trong thời gian ngắn nhưng phức tạp. Nó bao gồm các quá trình làm tăng hoạt tính tái tổ hợp, thay đổi trong khởi sự sao chép, ức chế nuclease và kích thích phục hồi sao chép và chuyển sai hỏng thành sửa sai úp sấp (error-prone replication). Tế bào bây giờ sẽ xảy ra sự sao chép nhanh hơn bình thường. + Nếu sửa sai kịp, tế bào ổn định, sinh trưởng trở lại + Nếu không sửa sai kịp thì tế bào phải chấp nhận hoặc chết hoặc bị đột biến

Hình 2.5 Sửa chữa do quang phục hồi

35

II. Cơ chế phân tử của sao chép DNA
1. Nguyên tắc chung - DNA sao chép theo khuôn. Ưu điểm: + Với phân tử lớn như vậy thì việc tổng hợp theo khuôn sẽ chính xác hơn + Tiết kiệm được ezyme + Đạt hiệu quả nhanh - Sao chép theo nguyên tắc bán bảo tồn (semi-conservative) phân tử DNA mới được tổng hợp gồm một mạch cũ làm khuôn và một mạch mới tổng hợp - Quá trình tổng hợp DNA xảy ra đòi hỏi phải có “ mỗi “ (primer) - Quá trình tổng hợp xảy ra theo chiều 5 - 3.

Hình 2.6 Sao chép DNA theo nguyên tắc bán bảo toàn

36

2. Thí nghiệm tổng hợp nhân tạo DNA Kornberg (1956) thực hiện phản ứng tổng hợp DNA in vitro. Trong quá trình tổng hợp ông sử dụng DNA polymerase I, 4 loại desoxynucleotid triphosphate (ATP, GTP, CTP, TTP), Mg2+ làm xúc tác. Ngoài ra còn có ít DNA làm khuôn mẫu. 3. Thí nghiệm chứng minh có sự tự nhân đôi theo nguyên tắc bán bảo tồn Meselson, Stahl (1958) đã chứng minh kiểu sao chép bán bảo tồn. Nuôi E.coli nhiều thế hệ trên môi trường có nguồn nitơ đồng vị nặng N 15. Như vậy tất cả DNA của vi khuẩn đều mang đồng vị nặng N15 thay cho N14 bình thường. Sau đó tế bào được chuyển sang môi trường chỉ chứa N14 nhẹ, mẫu các tế bào được lấy ra theo những khoảng thời gian đều đặn và chiết tách DNA. Bằng phương pháp ly tâm trên thang nồng độ CsCl, các loại DNA nặng, nhẹ và lai được tách ra.

Hình 2.7 Thí nghiệm của Meselson và Stahl

37

Kết quả cho thấy DNA nặng ban đầu (thế hệ 0) chứa N15, sau một lần phân chia cho thế hệ I với DNA lai có tỷ trọng nằm giữa DNA nặng N 15 và DNA nhẹ N14. Nói cách khác sau một lần sao chép phân tử DNA mới chứa một nữa mang N15 và một nữa N14. Ở thế hệ II một nữa số phân tử DNA là lai, nữa còn lại là DNA nhẹ N14. Thí nghiệm này khẳng định giả thuyết của Watson và Crick là đúng tức 2 mạch DNA mẹ tách ra, mỗi cái làm khuôn để tổng hợp nên mạch mới bổ sung. 4. Diễn biến sao chép DNA ở nhiễm sắc thể E.coli Quá trình sao chép DNA ở E.Coli diễn ra qua hai giai đoạn: 4.1. Giai đoạn khởi sự (initiation)

Hình 2.8 Sao chép DNA ở vi khuẩn E.coli

38

+ Mở xoắn: Ở E.coli quá trình bắt đầu khi một protein B đặc hiệu nhận biết điểm khởi sự sao chép (replication orgine) ori và gắn vào trình tự base đặc biệt đó. Tiếp theo enzyme gyrase (một loại topoisomerase) cắt DNA làm tháo xoắn ở 2 phía của protein B. Trong khi 2 phân tử enzyme gyrase chuyển động ngược chiều nhau so với điểm ori thì 2 phân tử của enzyme helicase tham gia tách mạch tạo chẻ ba sao chép. Helicase sử dụng năng lượng ATP làm đứt các liên kết hydro giữa 2 base bắt cặp với nhau. + Các protein làm căng mạch SSB (single-strand binding protein) gắn vào các mạch đơn DNA làm chúng tách nhau, thẳng ra và ngăn không cho chập lại hoặc xoắn để việc sao chép được dễ dàng. + Tổng hợp mồi (primer) dặc trưng cho quá trình kéo dài chuỗi là DNA polymerase chỉ hoạt động khi đã có mồi, nên trước khi tổng hợp chuỗi thì phải có qua trình tổng hợp mồi. Mồi là một đoạn khoảng 9 -10 nu, có thể là DNA hoặc ARN. 4.2. Giai đoạn nối dài (elongation) Do tính chất đối song song nên khi tách ra thành 2 mạch đơn khuôn thì một mạch có đầu 3’, mạch kia có đầu 5’ nên để đảm bảo hướng sao chép của DNA theo chiều 5’ -3’ thì sự polymer hóa dựa vào 2 mạch khuôn DNA diễn ra khác nhau. Mạch khuôn có đầu 3’ được DNA polymerase III gắn vào và tổng hợp ngay mạch bổ sung 5’-3’ hướng vào chẻ ba sao chép. Mạch khuôn này được gọi là mạch khuôn trước, còn mạch mới được tổng hợp gọi là mạch trước (leading strand). Ở mạch có đầu 5’ (mạch khuôn sau) việc tổng hợp phức tạp hơn và thực hiện từ chẻ ba sao chép hướng ra ngoài để đảm bảo đúng hướng 5’-3’. Khi mạch kép tách ra ở gần chẻ ba sao chép , enzyme primase gắn mồi (primer) ARN khoảng 10 nucleotid có trình tự bổ sung với mạch khuôn. DNA-polymerase III nối theo mồi ARN, theo hướng ngược với chẻ ba sao chép, tổng hợp các đoạn ngắn 1000-2000 nucleotid, gọi là các đoạn Okazaki (người phát hiện là Reiji Okazaki). DNA polymerase nối dài đoạn Okazaki đến khi gặp ARN mồi phía trước thì dừng lại, rồi lùi ra sau tiếp tục tổng hợp từ ARN mồi mới được tạo nên gần chẻ ba sao chép. Tiếp theo DNA-

39

polymerase I nhờ hoạt tính exonuclease 5’-3’ cắt bỏ mồi ARN, lắp các nucleotid của DNA vào chỗ trống và thực hiện polymer hóa hướng 5 ’-3’. Đoạn DNA ngắn 10 nucleotid này còn hở 2 đầu, chỗ hở được nối nhờ enzyme ligase của DNA mạch được tổng hợp từ chẻ ba sao chép hướng ra ngoài được tổng hợp chậm hơn nên gọi là mạch sau (lagging strand). Quá trình sao chép DNA ở E.coli diễn ra với tốc độ rất nhanh, có thể đạt đến 50.000 nucleotid/phút.

III. Sao chép DNA trong tế bào
1. Sao chép ở nhiễm sắc thể Prokaryote Để theo dõi sao chép DNA đồng vị phóng xạ Thymidin (tiền chất đặc hiệu cho DNA) được sử dụng. Quá trình sao chép xuất phát từ một điểm ori (điểm xuất phát sao chép) và triển khai ra cả 2 phía. Khi DNA vòng tròn đang sao chép, quan sát thấy dạng DNA hình con mắt. Chẻ ba sao chép lan dần cuối cùng tạo ra 2 phân tử DNA lai: một mạch có mang dấu phóng xạ (thymidin-H3). Có trường hợp sao chép chỉ xảy ra về một phía. E.coli chỉ có một điểm xuất phát sao chép ori nên cả phân tử DNA thành một đơn vị sao chép thống nhất được gọi là replicon. Bộ gen của sinh vật tiền nhân thường chỉ có một replicon.

Hình 2.9 Sao chép DNA từ một điểm về 2 phía và về một phía

40

2. Sao chép nhiễm sắc thể ở tế bào eukaryote Tế bào nhân thực có số lượng DNA lớn hơn nhiều so với tế bào tiền nhân, tạo nên nhiều nhiễm sắc thể mà mỗi cái gồm một sợi DNA thẳng kết hợp với protein. Do đó sao chép DNA của tế bào nhân thực phức tạp hơn và tốc độ chậm hơn (khoảng 50 nucleotid/giây).

Hình 2.10 Sao chép của nhiều replicon

41

Điểm khác căn bản là DNA của tế bào nhân thực có nhiều replicon Ví dụ: Saccharomyces cerevisiae có tới 500 replicon, tức có 500 điểm xuất phát sao chép. Quá trình sao chép cũng bắt đầu từ ori rồi lan về 2 phía. Tế bào có cơ chế kiểm soát nghiêm ngặt quá trình sao chép, điểm ori nào đã sao chép qua một lần rồi thì không lặp lại trước khi toàn bộ DNA được sao chép hoàn toàn. Ở các eukaryote có 5 loại DNA polymerase được ký hiệu là pol α, pol β, pol γ, pol δ, pol ε. Các loại DNA polymerase này không đồng nhất về phân tử lượng và một số đặc tính hóa học. Pol γ phân bố trong ty thể và tham gia tái bản DNA ở ty thể, các DNA polymerase còn lại ở trong nhân. Trong nhân, DNA polymerase δ và DNA polymerase ε là 2 enzyme chính tham gia tổng hợp trên sợi khuôn dẫn đầu và sợi chậm. Pol β và tiểu đơn vị bé của pol δ có hoạt tính đọc sửa.

Câu hỏi ôn tập
1. Hãy trình bày thí nghiệm chứng minh sao chép DNA theo nguyên tắc bán bảo toàn 2. Sao chép DNA trên 2 mạch khuôn xảy ra như thế nào? 3. Các cơ chế nào đã đảm bảo sự ổn định rất cao của thông tin di truyền 4. Hãy nêu các nhân tố tham gia vào sao chép DNA. 5. Trình bày diễn biến sao chép DNA ở nhiễm sắc thể E.coli 6. Mục đích của cơ chế sao chép từ một phân tử DNA cho ra nhiều bản sao

Tài liệu tham khảo
Phạm Thành Hổ (2000). Di truyền học. NXB Giáo Dục. Nguyễn Bá lộc (2004). Acid nucleic và sinh tổng hợp protein. Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (1998). Cơ sở di truyền học. NXB Giáo Dục. Hoàng Trọng Phán (1995). Di truyền học phân tử. Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế.

42

Anthony J. F. Griffiths, Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin, William M. Gelbart, David T. Suzuki, Jeffrey H. Miller. 2004. An introduction to genetics analysis. W.H. Freeman Publishers. Harlt D.L., Jones E.W. (1998). Genetics - Principle and analysis. Jone and Bartlett Publshers. Toronto, Canada. Stansfield W.D. 1991. Schaum’s outline of theory and problems of genetics. McGraw-Hill, Inc., New York.

43

Chương 3

Cơ sở tế bào học của tính di truyền
Mục tiêu của chương
Giới thiệu các cấu trúc trong tế bào có khả năng tự tái sinh, chu trình tế bào, các hình thức phân bào, các phương thức sinh sản.

Số tiết: 3 Nội dung I. Các cấu trúc tế bào và khả năng tự tái sinh
Tế bào của những sinh vật ở mức tiến hóa thấp như vi khuẩn, vi khuẩn lam chưa có nhân hoàn chỉnh nên gọi là tế bào tiền nhân và những sinh vật này gọi là những sinh vật tiền nhân (Prokaryote). Các tế bào có nhân hình thành rõ ràng được gọi là tế bào nhân thực, có ở các sinh vật nhân thực (Eukaryote). Sự khác nhau giữa tế bào Prokaryote và Eukaryote lớn hơn sự khác nhau giữa tế bào động vật và thực vật. Các tế bào Prokaryote không có phần lớn các bào quan và màng nhân, có vùng tương tự nhân gọi là nucleoid. Ngoài ra bộ gen gồm DNA không kèm histon. Điểm nổi bậc để phân biệt tế bào Eukaryote là có nhân (nucleus) điển hình với màng nhân bao quanh. Bên trong tế bào có hệ thống màng phức tạp và các bào quan như lưới nội sinh chất, bộ golgi, lysosome, ty thể, lục lạp. Nhiễm sắc thể của Eukaryote thẳng, phức tạp được cấu tạo từ DNA và protein. 1. Các cấu trúc có khả năng tự tái sinh Các tế bào Prokaryote có vùng nhân chứa DNA được tái tạo và phân đều về các tế bào con khi sinh sản. Các tế bào Eukaryote có nhiều bào quan nhưng chỉ có nhân, ty thể, lục lạp có chứa DNA và nhờ khả năng tự tái sinh nên tham gia vào các cơ chế di truyền.

44

Nhân chứa thông tin di truyền giữ vai trò chủ yếu trong sinh sản, chiếm khoảng 10% thể tích và hầu như toàn bộ DNA của tế bào (95%). Nó được giới hạn bởi màng nhân do 2 lớp màng xếp đồng tâm, bên trong có 2 cấu trúc chủ yếu là hạch nhân (nucleolus) như một nhân nhỏ trong nhân và chất nhiễm sắc (chromatin) là dạng tháo xoắn của nhiễm sắc thể (chromosome). Sự phân chia đều NST về các tế bào con đảm bảo sự chia đều thông tin di truyền cho thế hệ sau. 2. Nhiễm sắc thể 2.1. Hình thái NST

Hình 3.1. Nhiễm sắc thể với vùng tâm động

Khi nhuộm tế bào đang phân chia bằng một số màu base, có thể nhìn thấy dưới kính hiển vi thường các cấu trúc hình que nhuộm màu đậm, nên được gọi là NST (chromosome). Mỗi NST có hình dạng đặc trưng, rõ nhất ở kỳ giữa của nguyên phân. Tâm động là điểm thắt eo chia NST thành 2 vai với chiều dài khác nhau, vai ngắn hơn là vai p và vai dài hơn là vai q. Dựa vào vị trí của tâm động có thể phân biệt hình thái các NST: - Tâm giữa (metacentric): 2 vai bằng nhau - Tâm đầu (acrocentric): 2 vai không bằng nhau - Tâm mút (telocentric): tâm động nằm gần cuối

45

Ở các tế bào sinh dưỡng (soma), mỗi NST có một cặp giống nhau về hình thái, được gọi là các NST tương đồng (homologous). Bộ NST có cặp gọi là lưỡng bội và khi mỗi NST chỉ có một chiếc gọi là đơn bội.

Hình 3.2 Sơ đồ các kiểu nhiễm sắc thể ở kì giữa và kì sau

2.2. Kiểu nhân và nhiễm sắc đồ: Tất cả các tế bào của một loài nói chung có số lượng NST đặc trưng cho loài đó. Mỗi loại NST có hình dáng đặc trưng. Sự mô tả hình thái của NST gọi là kiểu nhân (Karyotype). Kiểu nhân có thể biểu hiện ở dạng nhiễm sắc đồ (Idiogram) khi các NST được xếp theo thứ tự bắt đầu từ dài nhất đến ngắn nhất.

46

Sau này kỹ thuật nhuộm màu (màu giemsa hay quinacrin) hoàn chỉnh làm rõ hơn các vệt đặc trưng, hình thái của mỗi NST được xác định chi tiết hơn. Dựa vào nhiễm sắc đồ nhuộm màu, có thể tìm thấy các đoạn tương đồng trên các NST cùng loại của các loài có họ hàng gần nhau. Ví dụ so sánh nhiễm sắc đồ của người và vượn cho thấy có mối quan hệ họ hàng rất gần và NST thứ hai của người do sự nối lại của 2 NST khác nhau ở vượn người.

Hình 3.3 Cặp nhiễm sắc thể tương đồng

2.3. Chất nhiễm sắc Vào những năm 1930, khi quan sát bằng kính hiển vi quang học ở gian kỳ nhận thấy trên NST có vùng nhuộm màu đậm được gọi là chất dị nhiễm sắc (heterochromatin) phân biệt với phần còn lại nhuộm màu nhạt là chất nguyên nhiễm sắc (euchromatin). Chất nguyên nhiễm sắc là chất nhiễm sắc ở trạng thái dãn xoắn, còn chất dị nhiễm sắc là chất nhiễm sắc biểu hiện dạng cuộn xoắn cao. DNA chất nguyên nhiễm sắc ở trạng thái hoạt động, còn ở chất dị nhiễm sắc thì DNA không phiên mã được và thường sao chép muộn hơn.

47

Hình 3.4 Sự phân hóa các phần trên nhiễm sắc thể

3. Các nhiễm sắc thể đặc biệt Bằng các kỹ thuật tế bào học hiện đại, căn cứ các mặt chức năng, cấu trúc, hình thái và đặc thù trong hoạt động, người ta đã phân biệt các loại NST khác nhau: - Nhiễm sắc thể thường (NST A: autosome): giống nhau ở cả 2 giới đực, cái. - Nhiễm sắc thể giới tính (sex chromosome) khác nhau giữa giới đực và cái - Nhiễm sắc thể B (nhiễm sắc thể phụ): được phát hiện ở một số loài thực vật như ngô, mạch đen ngoài các NST A bình thường. Các NST B ít gặp hơn trong các giống đã được chọn lọc của các loài nói trên Ở ngô có 20 NST A, ở một số cây còn có thêm NST B với số lượng biến động từ 1-20 hoặc nhiều hơn. Những cây có NST B thì yếu hơn và kém hữu thụ hơn các cây khác. Ở mạch đen, những cây có hơn 9 NST B thường không có khả năng sống. NST B có hiệu quả di truyền rất thấp. NST B cũng có nhiều ở sâu bọ, giun dẹp nhưng bé và không có hiệu quả di truyền rõ rệt. - NST khổng lồ (polytene chromosome): có trong một số cơ quan, tế bào tuyến nước bọt, tuyến Manpighi, màng ruột một số côn trùng bộ 2 cánh (Diptera): Drosophilidae, Chironomidae.

48

Năm 1981, E. Balbiani phát hiện NST khổng lồ ở tuyến nước bọt ấu trùng Chironomus, chúng có số lượng sợi nhiễm sắc nhiều gấp hàng ngàn lần so với NST thường, có thể chứa tới 1500-1600 sợi nhiễm sắc. Nguyên nhân của hiện tượng này là do cơ chế nội nguyên phân (endomitosis). NST tự nhân đôi bình thường, nhưng không phân ly, nhân tế bào không phân chia, tạo NST có dạng chùm nhiều sợi, bề ngang của NST tăng lên. Chiều dài của NST khổng lồ có thể tới 250-300 µm (gấp 100-200 lần NST thường) do các NST thể này không đóng xoắn. Dọc theo chiều dài của NST khổng lồphân hóa thành những khoanh bắt màu xẫm, nhạt không đồng nhất như các đĩa sáng, tối xen nhau. Người ta cho rằng các đĩa xẫm màu là nơi tích lũy nhiều DNA, được tạo ra do độ xoắn định khu dày đặc hoặc do tập trung nhiều hạt nhiễm sắc.

Hinh 3.5. Nhiêm săc thê không lô cua ruôi giâm

Ở ruồi giấm, NST khổng lồ ở tuyến nước bọt được hình thành do DNA tự nhân đôi 10 lần, tạo ra 210 = 1024 sợi dính liền nhau suốt dọc theo chiều dài. - NST chổi đèn (lambrush chromosome): NST này có thể dài đến 800µm, có ở tiền kì của giảm phân trong tế bào trứng của động vật có xương sống nhất là ở giai đoạn Diplotene của trứng có nhiều noãn hoàng (trứng gà, chim hoặc bò sát).

49

a.

c.

b.

Hinh 3.6 Nhiêm săc thê không lô ruôi giâm (a) Nhiêm săc thê không lô cua ruôi giâm tao tâm săc (chromocenter) (b) Bô nhiêm săc thê cơ ban trong tê bao đang phân chia vơi cac nhanh đươc biêu hiên băng cac mau khac nhau (c) Anh chup nhiêm săc thê không lô

Hinh 3.7 Nhiêm săc thê chôi đen

50

Đặc điểm của NST kiểu chổi đèn là từ trục của NST có nhiều vòng DNA, cạnh các vòng DNA này là những loại ARN được tổng hợp từ các vòng DNA mở xoắn.

II. Chu trình tế bào và phân bào ở Eukaryote
1. Chu trình tế bào

Hình 3.8 Chu trình tế bào

Các tế bào của sinh vật Eukaryote trải qua nhiều giai đoạn nối tiếp nhau và kết thúc bằng sự phân chia tạo ra tế bào mới. Toàn bộ quá trình từ tế bào đến tế bào thế hệ kế tiếp được gọi là chu trình tế bào, gồm 4 giai

51

đoạn: M, G1, S và G2. Sự phân chia tế bào chỉ chiếm một phần của chu trình tế bào - M (Mitose) là giai đoạn nguyên phân - Giai đoạn G1 (Gap): kéo dài từ sau khi tế bào phân chia đến bắt đầu sao chép vật chất di truyền. Sự tích lũy vật chất nội bào đến một lúc nào đó đạt điểm tới hạn thì tế bào bắt đầu tổng hợp DNA - S (Synthesis) là giai đoạn tổng hợp DNA. Cuối giai đoạn này số lượng DNA tăng gấp đôi - G2 là giai đoạn được nối tiếp sau S đến bắt đầu phân chia tế bào. Khoảng thời gian gồm G1, S và G2 tế bào không phân chia và được gọi chung là gián kỳ hay kỳ trung gian (interphase). Trong kỳ này tế bào thực hiện các hoạt động sống chủ yếu khác và sao chép bộ máy di truyền. 2. Nguyên phân (Mitosis) Sự phân bào ở sinh vật nhân thực gồm 2 quá trình: chia nhân (mitosis) và chia tế bào chất (cytokinesis) Nguyên phân được chia thành 4 kì: a. Kì trước (Prophase) Các trung thể (centriole) chuyển động về 2 cực của nhân, các NST co lại thành sợi. Mỗi NST gồm 2 sợi chromatid gắn nhau nhờ tâm động (centromere). Các sợi vô sắc tỏa ra từ tâm động và trung thể. Màng nhân và hạch nhân biến mất dần. Các tế bào thực vật khác với tế bào động vật là không có trung thể và thoi vô sắc. b. Kì giữa (Metaphase) Tâm động của mỗi NST đôi gắn với thoi vô sắc và xếp ở mặt phẳng xích đạo của tế bào. Kỳ giữa chấm dứt khi mỗi tâm động của mỗi chromatid chị em bắt đầu tách ra. Như vậy tâm động là điểm chia cuối cùng của NST. Điều này có ý nghĩa rất quan trọng, nhờ đó chất di truyền được chia đều và đồng bộ cho các tế bào con. c. Kì sau (Anaphase) Hai NST đơn tách nhau, mỗi cái chuyển động về một cực tế bào. Các sợi vô sắc co ngắn lại kéo các NST. Sự phân chia tế bào chất thường bắt đầu ở kì này.

52

d. Kì cuối (Telophase) Các NST di chuyển về các cực, màng nhân và hạch nhân lại hình thành, sự chia tế bào chất thực hiện xong, các NST dãn ra và mãnh dần. Sự phân chia tế bào chất: thường kèm theo ngay sau giảm phân. Ở tế bào động vật sự chia tế bào chất bắt đầu bằng nếp nhăn phân cách (cleavage furrow) bao vòng tế bào và mọc sâu dẫn đến chia tế bào thành hai. Ở tế bào thực vật, phiến tế bào (cell plate) hình thành ở trung tâm tế bào chất và lan rộng dần đến cắt tế bào thành hai. Nguyên phân tạo ra 2 tế bào con có số lượng và chất lượng NST như tế bào mẹ.

Hình 3.9 Phân bào nguyên nhiễm

3. Giảm phân (meiosis): là quá trình phân bào chuyên biệt trong đó số lượng NST giảm một nữa nhưng đủ bộ, xảy ra ở tế bào sinh dục. Giảm phân trải qua 2 lần phân chia nối tiếp nhau:

53

Hình 3.10 Phân bào giảm nhiễm

Giảm nhiễm I: a. Kì trước I (Prophase I) Các sự kiện xảy ra giống kì trước của nguyên phân chỉ khác căn bản ở chỗ các NST tương đồng cùng chuyển động với nhau và nằm kề sóng đôi

54

nhau trong quá trình bứt cặp hay tiếp hợp (synapsis). Các sợi nhiễm sắc chi em được gắn nhẹ nhau nhờ một cặp protein trục (protein axe). Các protein trục của 2 NST tương đồng nối nhau bởi cầu protein để tạo nên phức hợp bắt cặp (synaptonemal complex). Cặp NST tương đồng lúc này tạo thành đôi gọi là lưỡng trị (bivalent). Các NST sau khi tiếp hợp xong bắt đầu tách ra, có thể quan sát thấy các đoạn đan chéo nhau gọi là hình chéo (chiasma). Các hình chéo giữa các chromatid có thể xảy ra trao đổi chéo dính nhau.

Hình 3.11 Các quá trình xảy ra trong kỳ đầu I phân bào giảm nhiễm

b. Kì giữa I (Metaphase I) Hai NST của một cặp tương đồng gắn với cùng một sợi của thoi vô sắc trên mặt phẳng xích đạo của tế bào. Các tâm động không tách ra. c. Kì sau I (Anaphase I) Hai NST của mỗi cặp tiếp hợp chuyển động về 2 cực đối nhau. d. Kì cuối I (telophase I)

55

Hai nhân mới được hình thành, mỗi cái với nữa bộ NST (n) có ở tế bào mẹ. Các nhân con có số lượng NST bằng nhau nhưng kiểu gen không tương tự nhau. Tiếp theo là thời kì gián kì rất ngắn, trong kì này không xảy ra sao chép vật chất di truyền. Giảm nhiễm II: e. Kì trước II (Prophase II): Các NST co lại f. Kì giữa II (Prophase II): Các NST xếp trên mặt phẳng xích đạo, thường các chromatid đã tách nhau một phần g. Kì sau II (Anaphase II): Các tâm động phân chia, các chromatid đẩy nhau về các cực. h. Kì cuối II (Telophase II): 4 tế bào đơn bội chứa các NST đơn được tạo thành. Như vậy giảm nhiễm I tạo 2 tế bào đơn bội chứa NST đôi, mỗi tế bào đó lại chia lần nữa trong giảm nhiễm II để tạo ra 4 tế bào đơn bội chứa các NST đơn. - Phân bào giảm phân có ý nghĩa rất quan trọng + Đảm bảo số lượng NST trong sinh sản hữu tính không thay đổi. + Đảm bảo cho sự tạo thành của các tế bào sinh dục khác nhau. +Tạo NST có thành phần mới do tái tổ hợp giữa các NST bố mẹ. So sánh nguyên phân và giảm phân Giống nhau - Sao chép DNA trước khi vào phân bào - Đều phân thành 4 kỳ - Sự phân đều mỗi loại NST về các tế bào con - Màng nhân và nhân con biến mất cho đến gần cuối - Hình thành thoi vô sắc

56

Khác nhau So sánh các đặc tính chủ yếu của nguyên phân và giảm phân Nguyên phân (Mitose) 1. Xảy ra ở tế bào soma 2. Một lần phân bào: 2 tế bào con Giảm phân (Meiose) 1. Xảy ra ở tế bào sinh dục 2. Hai lần phân chia tạo 4 tế bào con

3. Số NST giữ nguyên: 1 tế bào 2n 3. Số NST giảm đi một nữa: 1 tế  2 tế bào 2n bào 2n  4 tế bào n 4. Một lần sao chép DNA , một lần 4. Một lần sao chép DNA , 2 lần chia chia 5. Thường các NST tương đồng 5. Các NST tương đồng bắt cặp ở không bắt cặp kỳ trước I 6. Thường không có trao đổi chéo 7. Tâm động chia ở kỳ sau 6. nhất 1 trao đổi chéo cho 1 cặp tương đồng 7. Tâm động không chia ở kỳ sau I mà chia ở kỳ sau II

8. Duy trì sự giống nhau: tế bào con 8. Tạo sự đa dạng trong các sản có kiểu gen giống kiểu gen tế bào phẩm của giảm phân 9. Giảm phân luôn luôn xảy ra ở tế mẹ 9. Tế bào chia nguyên phân có thể là bào lưỡng bội (2n) hoặc đa bội (>2n) lưỡng bội (2n) hay đơn bội (n) Sự khác nhau thể hiện ở nhiều chi tiết. Đáng lưu ý là trong kỳ trước I của giảm phân, các NST tương đồng bắt cặp rồi sau đó đẩy nhau ra đi về các cực. Nhờ đó mỗi tế bào con trong giảm phân chỉ nhân 1 NST của cặp tương đồng. Sự kiên này tương đương với việc tâm động giữa 2 chromatid chị em cùng đi với nhau trong nguyên phân và khi tâm động chia thì mỗi tế bào con chỉ nhận 1 chromatid. Cơ chế thực hiện tuy có khác nhau nhưng giống nhau ở chỗ chia đều một cách đồng bộ các NST về các tế bào con.

57

Hình 3.12 So sánh nguyên phân và giảm phân

Sự biến đổi trong quá trình phân bào

58

- Hình thành NST khổng lồ: vào kì trước, sau khi DNA tự nhân đôi, hình thành các nhiễm sắc tử, nhưng sau đó chúng không tách rời nhau. - Nội nguyên phân: ở tiền kì, màng nhân không tiêu biến, quá trình phân chia sẽ xảy ra ở bên trong màng nhân. Kết quả tạo ra nhân mới có bộ NST tăng gấp đôi. - Hình thành thể đa bội: Sau khi NST tự nhân đôi, màng nhân tiêu biến nhưng thoi vô sắc không xuất hiện, tạo ra những tế bào có số lượng NST tăng gấp bội. - Tế bào 2 nhân: sau khi phân chia nhân, tế bào chất không phân chia hình thành tế bào mới có hai nhân. Trong giảm phân cũng xảy ra những biến đổi: do sự tiếp hợp và phân ly không bình thường của các NST, có thể làm phát sinh các giao tử thừa hoặc thiếu NST. Có trường hợp thoi vô sắc không xuất hiện, sẽ tạo thành các giao tử không giảm nhiễm.

III. Các kiểu sinh sản
1.Sinh sản vô tính Sinh sản vô tính là kiểu sinh sản từ một tế bào hoặc một nhóm tế bào mẹ chỉ qua nguyên phân để tạo ra các cơ thể con. Kiểu sinh sản này giữ nguyên các đặc tính di truyền của cá thể mẹ ban đầu ở cơ thể con. Nguyên phân là cơ sở của sự tăng trưởng ở các sinh vật đa bào và sinh sản vô tính ở các sinh vật nói chung. Sinh sản vô tính có ở cả sinh vật đơn bội và lưỡng bội, là cơ chế ổn định bộ gen qua nhiều thế hệ. Sự tăng số lượng tế bào của sinh vật đa bào nhờ nguyên phân. Ở người hợp tử sau nhiều lần nguyên phân hình thành nên cơ thể gồm nhiều tỉ tế bào. Nhờ đó, trừ tế bào sinh dục các tế bào của cơ thể đều có bộ NST như nhau, tương ứng có lượng thông tin di truyền giống nhau. Sinh sản vô tính được ứng dụng rộng rãi trong nhân giống và nuôi cấy mô tế bào thực vật và động vật. 2. Sinh sản hữu tính Sinh sản hữu tính là kiểu sinh sản trong đó có sự kết hợp các tế bào sinh dục của 2 cá thể khác nhau. Sinh sản hữu tính tạo sự đa dạng di truyền

59

làm nguồn nguyên liệu cho tiến hóa. Một trong những xu hướng tiến hóa của sinh giới là sinh sản hữu tính. Sự đa dạng của các kiểu sinh sản hữu tính thể hiện một phần ở các kiểu xác định giới tính. Sự tiến hóa tạo ra nhiều cơ chế để duy trì sự đa dạng. * Hướng tiến hóa trong sinh sản hữu tính Theo sự phân hóa tế bào, có 3 hướng tiến hóa: + Hình thái các giao tử: theo hình thái giao tử, sinh vật tiến hóa từ chỗ giao tử đực và giao tử cái đều có hình thái và chức năng giống nhau (đẳng giao) đến chỗ khác nhau: giao tử đực nhỏ có khả năng di động, giao tử cái lớn chứa các chất dinh dưỡng (dị giao và noãn giao) + Theo sự phân hóa của các tế bào trong cơ thể: từ chỗ tế bào nào trong cơ thể cũng có khả năng làm nhiệm vụ sinh sản đến chỗ phân hóa thành tế bào sinh sục và tế bào sinh dưỡng. + Phân hóa giới tính: ở đa số thực vật và động vật bậc thấp, cơ quan sinh dục đực, cái ở ngay trên một cơ thể, gọi là sinh vật lưỡng tính. Ở một số thực vật và động vật bậc cao, mỗi cơ thể chỉ mang một cơ quan sinh dục (hoặc đực hoặc cái) gọi là sinh vật đơn tính. Theo hình thức thụ tinh Ở các động vật bậc thấp đặc biệt là động vật thủy sinh, tinh trùng được thụ tinh với trứng ở ngoài môi trường nên hiệu quả thụ tinh thấp. Hình thức thụ tinh này được gọi là thụ tinh ngoài. Ví dụ: ruột túi, cá ... chúng phóng tinh vào nước để thụ tinh, lưỡng cư (ếch nhái) con đực rưới tinh trùng lên trứng của con cái. Hình thức thụ tinh cao hơn là thụ tinh trong. Phần lớn cấc loài ở cạn, con đực đưa tinh trùng vào ống sinh dục cái nhờ cơ quan giao cấu, nhờ vậy hiệu suất thụ tinh cao hơn. Theo hình thức bảo vệ trứng Các loài động vật bậc thấp đẻ trứng ở nước và ít có khả năng bảo vệ trứng như cá, lưỡng cư. Các loài bò sát như rắn đẻ trứng có vỏ để bảo vệ bào thai. Các loài chim có bản năng bảo vệ trứng tốt hơn, làm tổ, đẻ trứng, ấp trứng và chăm sóc chim non. Các loài có vú, trứng không đẻ ra ngoài, bào thai phát triển trong tử cung mẹ, phôi thai được bảo vệ chu đáo chống những tác hại của ngoại cảnh, sau khi đẻ, con được mẹ cho bú tới khi có khả năng tự kiếm ăn.

60

3. Các hình thức sinh sản đặc biệt - Lưỡng tính sinh Phần lớn các loài thực vật và những động vật lưỡng tính, trên một cơ thể có cả cơ quan sinh dục đực và cơ quan sinh dục cái. Quá trình thụ tinh, thụ phấn có thể là tự thụ tinh, tự thụ phấn hay thụ tinh, thụ phấn chéo. Ví dụ sán dây, trong ruột người bị mắc sán dây chỉ có một con sán. Cơ thể sán dây có nhiều đốt, mỗi đốt có cả cơ quan sinh dục đực và cơ quan sinh dục cái. Các đốt ở gần đầu, cơ quan sinh dục đực phát triển mạnh, các đốt ở cuối cơ quan sinh dục cái phát triển mạnh. Khi thụ tinh, các đốt ở gần đầu áp vào các đốt ở gần cuối cơ thể để thụ tinh cho các đốt đó nhờ cơ quan giao cấu. Đa số động vật lưỡng tính không tự thụ tinh được mà hai cá thể khác nhau giao hợp chéo cho nhau như ở sán lá, giun đất. Đa số các loài thực vật là các loài lưỡng tính. Các loài lưỡng tính này thường thụ phấn chéo nhưng cũng có một số loài có cấu tạo thích nghi với tự thụ phấn. - Đơn tính sinh Đơn tính sinh (còn gọi là trinh sản) là hình thức sinh sản trong đó trứng không thụ tinh vẫn phát triển thành cơ thể sinh vật. Đơn tính sinh khác với sinh sản vô tính vì trứng ở đây vẫn được hình thành từ quá trình giảm phân của tế bào sinh dục. Về mặt di truyền, người ta phân ra 2 loại đơn tính sinh: là đơn tính sinh đơn bội trong đó cơ thể đơn tính sinh trưởng thành giữ nguyên bộ NST 1n ở trứng không thụ tinh; loại đơn tính sinh lưỡng bội cơ sự tạo bộ NST 2n nhưng bộ gen này đều lấy từ một nguồn từ mẹ (các gen thường đồng hợp tử). Liên quan đến giới tính, phân biệt 3 loại đơn tính sinh: + Đơn tính sinh nam Kiểu đơn tính sinh này gặp ở nhiều loài ong nên còn gọi là đơn tính sinh kiểu ong + Đơn tính sinh nữ Ở nhiều vùng, một số loài động vật chỉ có con cái không có con đực như một số loài ốc, tôm, cua ... chúng vẫn đẻ trứng và nở toàn cá thể cái. Có nhiều cơ chế để tạo tế bào 2n của cơ thể mới trong đơn tính sinh:

61

Tế bào sinh dục cái khi giảm phân tế bào chất không phân chia tạo tế bào 2n NST, nở ra cơ thể cái. Tế bào sinh dục cái giảm phân bính thường nhưng thể cực II lại hòa hợp với noãn bào tạo tế bào 2n NST, nở ra cơ thể cái. + Đơn tính sinh chu kỳ Nhiều loài sinh vật có mùa sinh sản hữu tính, có mùa sinh sản vô tính. Ví dụ: luân trùng Rotatoria về mùa xuân, từ những trứng nằm suốt mùa đông sẽ nở ra những con cái sinh sản đơn tính sinh nữ, trứng không thụ tinh của nó sẽ nở ra con cái. Về sau, đến thời kỳ sinh sản hữu tính, một thế hệ sẽ thay đổi lối sinh sản đẻ trứng nhỏ hơn, nở ra con đực (đơn tính sinh nam), con đực sẽ giao phối với những con cái thế hệ mẹ. Những con cái đó sẽ đẻ ra những trứng thụ tinh có khả năng sống qua mùa đông, trứng có 2n NST, đến mùa xuân sẽ nở ra con cái tiếp tục sinh sản đơn tính sinh như trên. + Đơn tính sinh nhân tạo Trứng của các loài không sinh sản đơn tính có thể dùng phương pháp nhân tạo để cho trứng phát triển mà không cần thụ tinh. Trứng ếch có thể kích thích bằng châm kim, trứng của cầu gai có thể kích thích bằng cách lắc hoặc bằng chất hóa học như thay đổi độ đậm muối của nước. Các loài sinh sản đơn tính nhân tạo thường yếu, nhỏ hơn bình thường và không phát triển đầy đủ. + Đơn tính sinh ở người Ở người đã gặp trường hợp trứng không thụ tinh mà phân chia thành 50 phôi bào. Buồng trứng có thể có các u nang, bên trong chứa một số bộ phận của cơ thể phát triển không đầy đủ và sắp xếp lộn xộn như tóc, răng, tay, mắt, chân ... những u này gọi là u quái. Người ta cho rằng nang đó sinh ra bởi sự phát triển bất thường của trứng không thụ tinh. - Mẫu sinh: Mẫu sinh là hiện tượng sinh sản dựa trên sự phát triển của trứng được thụ tinh nhưng sau đó nhân tinh trùng bị mất hoạt tính và bị loại bỏ, chỉ có nhân của trứng tham gia vào quá trình phát triển tạo cơ thể mới. Hiện tượng này gặp ở một số loài cá, ví dụ cá diếc bạc mẫu sinh tự nhiên tạo các cá diếc bạc cái. Để sinh sản cá diếc bạc cái phải giao phối với cá chép đực hoặc cá diếc

62

vàng đực hoặc một số cá đực khác. Tinh trùng chỉ có chức năng hoạt hóa trứng, sau đó nhân tinh trùng thoái hóa và tiêu biến. Mẫu sinh nhân tạo được sử dụng trong chọn giống. - Phụ sinh: Phụ sinh là hình thức sinh sản dựa trên sự phát triển của trứng được thụ tinh nhưng sau đó nhân trứng bị thoái hóa, chỉ có nhân tinh trùng tham gia vào quá trình phát triển tạo cơ thể mới. Phụ sinh nhân tạo được ứng dụng để tạo ra những giống tằm cao sản. 4. Chu trình sống hay vòng đời Nhiều sinh vật có sự thay đổi thế hệ đơn bội và lưỡng bội nối tiếp nhau thành chu kì gọi là chu trình sống. Vòng đời điển hình của Eukaryote điển hình gồm: thụ tinh có hợp tế bào chất và hợp nhân, sinh sản vô tính của tế bào 2n nhờ nguyên phân, giảm phân có giảm nhiễm và tái tổ hợp, các tế bào n sinh sản vô tính hoặc kết hợp với nhau thụ tinh. Sự đa dạng các chu trình sống ở các nhóm phân loại khác nhau có thể do thời gian kéo dài khác nhau của các pha đơn bội và lưỡng bội. Các nhóm chính thường gặp trong nghiên cứu di truyền: a. Các Eukaryote đơn bào: như chu trình sống của vi tảo như Chlamydomonas reinhardi. Điểm đặc biệt là các giai đoạn đơn bội và lưỡng bội có thể tồn tại một thời gian dài. b. Các động vật bậc cao: cơ thể động vật bậc cao là lưỡng bội. Trong quá trình sinh sán phân bào giảm nhiễm tạo ra giao tử đơn bội, sự hợp nhất của chúng tạo thành hợp tử. Các giao tử là những tế bào đơn bội được chuyên hóa cho sinh sản hữu tính. Ở con đực, quá trình sinh tinh (spermatogenesis) tạo ra 4 tinh tử. Ở con cái, quá trình sinh trứng (oogenesis) chỉ sinh ra một tế bào trứng trưởng thành, các thể phân cực không có hoạt động chức năng. c. Chu trình sống của thực vật bậc cao. Chu trình sống của cây bắp được coi là điển hình của thực vật bậc cao. Phân bào giảm nhiễm ở thực vật tạo ra các tế bào đơn bội gọi là bào tử giai đoạn I, mà chúng thường phân chia nguyên nhiễm tạo tạo cây đa bào đơn bội (giai đoạn II). Các thực vật đơn bội này sản sinh ra các giao tử bằng chia nguyên nhiễm (giai đoạn III). Hai giao tử khác nhau tạo hợp tử lưỡng bội

63

(giai đoạn IV), hợp tử phát triển thành cây đa bào lưỡng bội (giai đoạn V) và chu trình khép kín. Phần lớn các thực vật đa bào có 5 giai đoạn trong chu trình sống của chúng. Nói chung, giai đoạn đơn bội chiếm ưu thế ở thực vật bậc thấp và giai đoạn lưỡng bội chiếm ưu thế ở các thực vật bậc cao. Khả năng các giao tử được sản sinh ra do một cây, kết hợp với nhau tạo thế hệ con có sức sống và hữu thụ là đặc tính chung của nhiều họ cây có hoa. Các hoa hoàn chỉnh của một số thực vật đồng chu mở ra cho đến khi hạt phấn chín và tự thụ phấn. Tự thụ phấn là bắt buộc ở đại mạch, đậu, đậu nành, thuốc lá, cà chua, lúa mì lúa nước và nhiều cây trồng khác. Ở một số loài khác, tự thụ phấn và thụ phấn chéo xảy ra với các mức dao động khác nhau. Ví dụ: cây bông vải thường hơn 10% thụ phấn chéo. Trong khi đó, một số thực vật đồng chu có sự phát triển các cơ chế di truyền ngăn trở sự tự thụ phấn, tức ngăn trở sự tạo thánh hợp tử của các giao tử giống nhau về kiểu gen, gây nên thụ phấn chéo bắt buộc. Sự tự bất dung hợp ở các loài đồng chu là cơ chế tăng cường thụ phấn chéo.

Câu hỏi ôn tập
1. Sự khác nhau giữa nhiễm sắc thể và nhiễm sắc tử 2. Sự khác nhau giữa chromatid chị em và chromatid không chị em, giữa nhiễm sắc thể tương đồng và nhiễm sắc thể không tương đồng 3, Trong suốt chu trình tế bào, sự sao chép nhiễm sắc thể xảy ra khi nào. Ý nghĩa của nó. 4. So sánh nguyên phân và giảm phân. 5. Ý nghĩa của các sự kiện diễn ra ở kỳ đầu của lần giảm phân thứ nhất. 6. Trình bày các hình thức sinh sản đặc biệt.

Tài liệu tham khảo
Trịnh Văn Bảo, Phan Thị Hoan, Trần Thị Thanh Hương, Trần Thị liên, Trần Đức Phấn, Phạm Đức Phùng, Nguyễn Văn Rực, Nguyễn Thị Trang. 2002. Các nguyên lý sinh học. NXB Y học Hà Nội. Phạm Thành Hổ (2000). Di truyền học. NXB Giáo Dục.

64

Nguyễn Bá lộc (2004). Acid nucleic và sinh tổng hợp protein. Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (1998). Cơ sở di truyền học. NXB Giáo Dục. Hoàng Trọng Phán (1995). Di truyền học phân tử. Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế. Anthony J. F. Griffiths, Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin, William M. Gelbart, David T. Suzuki, Jeffrey H. Miller. 2004. An introduction to genetics analysis. W.H. Freeman Publishers. Harlt D.L., Jones E.W. (1998). Genetics - Principle and analysis. Jone and Bartlett Publshers. Toronto, Canada. Stansfield W.D. 1991. Schaum’s outline of theory and problems of genetics. McGraw-Hill, Inc., New York.

65

Chương 4

Các quy luật di truyền của Mendel
Mục tiêu của chương
Giới thiệu quy luật Mendel về sự di truyền, sự phân ly kiểu hình trong trường hợp tính trội hoàn toàn và trội không hoàn toàn và một số tính trạng di truyền kiểu Mendel.

Số tiết: 3 Nội dung I. Phương pháp thí nghiệm của Mendel
1. Tính trạng hay dấu hiệu (character) Thông thường, khi quan sát ở các sinh vật khác nhau sẽ có những nét mà nhờ đó chúng ta dễ dàng nhận biết ta gọi nó là tính trạng (hay dấu hiệu) + Có những tính trạng thuộc về hình thái: màu mắt , màu tóc, màu da...

Hinh 4.1 Bay căp tinh trang ơ đâu Ha lan đươc Mendel chon đê nghiên cưu

+ Có những tính trạng thuộc về sinh lý, sinh hóa như: khả năng thực hiện của một phản ứng, khả năng thực thiện chuyển hóa ...

66

+ Có những tính trạng thuộc về tính chất: tính tình Mendel chọn ra 7 cặp tính trạng chất lượng có biểu hiện rõ ràng để nghiên cứu. Hiện nay đã biết 7 cặp tính trạng mà Mendel nghiên cứu chỉ nằm trên 4 cặp NST của cây đậu Hà lan. Các gen xác định tính trạng màu nhân hạt và vỏ hạt, hình dạng quả và vị trí hoa thuộc 2 nhóm liên kết gen, nhưng chúng nằm cách xa nhau nên kết quả thu được như trường hợp không liên kết.

Hinh 4.2 Con lai thu đươc nhơ lai căp bố mẹ với các tinh trang tương phan

67

2. Cách tiến hành thí nghiệm: - Vật liệu thuần chủng và biết rõ nguồn gốc. Mendel cho các cây thí nghiệm tự thụ phấn trong 2-3 đời. - Theo dõi từng cặp tính trạng qua nhiều thế hệ nối tiếp nhau. Trong đó có những tính trạng được đánh giá ngay nhưng cũng có những tính trạng theo dõi tiếp ở thế hệ sau. - Đánh giá khách quan và tính số lượng chính xác. Mendel quan sát tất cả các hạt và con lai xuất hiện, thống kê số lượng và tính tỷ lệ từng loại - Dùng ký hiệu và công thức toán học để biểu diễn kết quả thí nghiệm. Mendel đã tìm ra phương pháp đơn giản để biểu diễn các dạng bằng công thức số học.

Hinh 4.3 Đối tương thi nghiêm cua Mendel (a) Cây co hoa trăng (b) Hat phân đươc tao thanh trong bao phân (c) Ngăn can sư tư thu phân, băng căt bo bao phân ơ cây me va cho thu phân vơi bao phân cua cây bô

Đến đầu thế kỉ 20, sự truyền thụ các tính trạng di truyền được phát biểu thành 3 quy luật Mendel: quy luật tính trội, quy luật phân ly tính trạng và quy luật phân li độc lập. Quy luật thứ nhất và thứ hai phát biểu theo cách này thiếu chính xác vì: + Phải có các điều kiện như thuần chủng và trội hoàn toàn. + Đúng một phần cho di truyền tương đương và trội không hoàn toàn.

68

+ Không dùng được cho phân li giao tử và sinh vật đơn bội. Sau này đa số các nhà di truyền phát biểu lại thành 2 quy luật: + Quy luật thứ nhất: quy luật phân li hay quy luật giao tử thuần khiết + Quy luật thứ hai: quy luật phân li độc lập.

II. Lai một tính trạng-Quy luật giao tử thuần khiết.
Lai một tính là phép lai mà chỉ theo dõi một cặp tính trạng 1.Thí nghiệm : P lai đậu Hà Lan hạt vàng với hạt lục F1: F2: 100% đậu hạt vàng. 3 vàng : 1 lục

Hình 4.4 Sơ đồ mô tả phép lai một tính

Tính trạng hạt vàng được biểu hiện ở thế hệ F1 được gọi là tính trạng trội (dominant) và gen quy định nó được kí hiệu bằng chữ A, tính trạng hạt lục gọi là lặn (recessive) và gen quy định nó được kí hiệu bằng chữ a. Để dễ dàng theo dõi F2, nhà di truyền học người Anh R.C Punnett đưa ra khung kẻ ô được gọi là khung Punnett đến nay vẫn được sử dụng.

69

2. Giải thích của Mendel: Ông cho rằng mỗi tính trạng do một cặp nhân tố kiểm tra và mỗi cá thể có 2 nhân tố đó: một nhận từ cha và một nhận từ mẹ. Mendel dùng khái niệm nhân tố di truyền để chỉ các nhân tố này, giao tử chỉ chứa một nhân tố và con lai sẽ tạo ra 2 loại giao tử. Để chứng minh điều này, ông đem lai phân tích (Test cross) F1 F1 : Aa x aa  1Aa : 1aa Hiện nay gen được hiểu là nhân tố di truyền xác định các tính trạng của sinh vật như hình dạng, màu sắc... Khái niệm alelle được nêu ra để chỉ các trạng thái khác nhau của một gen. Các thể có 2 alelle giống nhau như AA và aa được gọi là đồng hợp tử (homozygote), còn cá thể mang hai alelle khác nhau gọi là dị hợp tử (heterozygote). - Kiểu gen: tập hợp các nhân tố di truyền của cơ thể - Kiểu hình: biểu hiện ra bên ngoài của tính trạng, nó là kết quả của sự tương tác giữa kiểu gen với môi trường bên ngoài. 3.Tính trội không hoàn toàn và sự di truyền tương đương. Ở cây hoa mom cho, khi lai cây co hoa đo vơi cây co hoa trăng co kết quả: P: hoa đỏ x hoa trắng AA aa F1: Aa (hoa hồng) F2: 1 AA : 2Aa : 1 aa 1 đỏ : 2 hồng : 1 trắng Ở trường hợp đồng trội, con lai F1 biểu hiện các tính trạng giống cả bố và mẹ. Trong trường hợp này tính trội không hoàn toàn và tỉ lệ phân ly kiểu gen bằng tỉ lệ phân ly kiểu hình. Phép lai giữa hạt đậu lăng có vết khoang thuần chủng với hạt có nhiều đốm thuần chủng sinh ra con lai dị hợp tử có cả các đốm và vết khoang. Bởi vì mỗi kiểu gen đều tự nó biểu hiện ra kiểu hình, tỷ lệ ở F 2 là 1:2:1.

70

Hinh 4.5 Sơ đồ phép lai một tinh với tinh trội không hoan toan ơ hoa mom cho

Hinh 4.6 Sơ đồ phép lai một tinh với tinh trội không hoan toan ơ vo hat đâu lăng

71

Sự di truyền tương đương: khi 2 alelle có giá trị như nhau. Ở nhóm máu ABO của người, IA và IB đều có biểu hiện như nhau.

Hinh 4.4 Các allele nhom máu IA và IB là đồng trội bởi vì tế bào hồng cầu chứa dị hợp tử IAIB chứa cả 2 dạng đường trên bề mặt của chúng 4. Cơ sở tế bào học Theo dõi sự truyền đạt alelle qua các thế hệ NST trong phân bào giảm nhiễm rồi các giao tử được thụ tinh thấy có sự trùng hợp. 5. Thí nghiệm chứng minh trực tiếp sự phân ly ở mức giao tử Kết quả lai phân tích cho tỉ lệ 1:1 chứng tỏ có sự phân li khi tạo thành giao tử. Những kết quả này gián tiếp vì ta chỉ quan sát kết quả ở cá thể lưỡng bội. Để chứng minh trực tiếp sự phân li khi tạo thành giao tử, cho lai bắp tẻ với bắp nếp rồi xem tỷ lệ phân li ở phấn hoa. Gen Wx (quy định bắp tẻ) tạo tinh bột sẽ cho màu xanh khi phản ứng với iod, còn gen wx (bắp nếp) cho màu hồng nâu. Lấy phấn hoa của cây lai

72

Wxwx thử iod và quan sát dưới kính hiển vi thấy tỷ lệ hạt nhân xanh và hồng nâu là 1:1. Kết quả này chứng tỏ các quy luật của Mendel có cơ sở khoa học là sự phân li khi tạo thành giao tử. 6. Quy luật thứ nhất (quy luật giao tử thuần khiết): trong cơ thể các gen tồn tại theo từng đôi, khi tạo thành giao tử từng đôi gen phân li nhau và mỗi gen đi vào một giao tử. Sau khi 2 giao tử phối hợp nhau các gen tương ứng lại hợp thành từng đôi trong hợp tử. Quy luật này áp dụng cho các sinh vật lưỡng bội (2n NST). Đối với các sinh vật đơn bội thì tỷ lệ phân li giống như lai phân tích.

III. Lai hai tính và nhiều tính
1. Lai hai tính - Quy luật phân ly độc lập và tổ hợp tự do Lai 2 tính là lai với 2 cặp tính trạng Thí nghiệm : P: F1: hạt vàng trơn x AABB vàng trơn AaBb AaBb F1 x F1: vàng trơn × vàng trơn AaBb F2: 4AaBb : 2 AaBB : 2Aabb : 2 AABb: 2aaBb : 1AABB : 1 Aabb: 1aaBB: 1aabb ( 9 kiểu gen) Kiểu hình: 9A -B- : 3A-bb : 3aaB- : 1aabb 9 vàng trơn : 3 vàng nhăn : 3 lục trơn : 1 lục nhăn Xét tỉ lệ: vàng / lục = 12 /4 =3/1 trơn / nhăn = 12/ 4 =3/1 Kết quả thí nghiệm cho thấy thế hệ F1 cũng đồng nhất và biểu hiện các tính trạng trội vàng trơn. Sang F2 tỉ lệ phân li kiểu hình là: 9 vàng trơn : 3 vàng nhăn : 3 lục trơn : 1 lục nhăn. Xét riêng từng cặp tính trạng, tỉ lệ phân li theo kiểu hình cũng là 3:1. Điều đó cho thấy sự di truyền từng cặp hạt lục nhăn aabb

73

tính trạng độc lập nhau. Sự độc lập này có thể chứng minh bằng toán học và xác suất của 2 sự kiện độc lập với nhau cùng trùng hợp bằng tích xác suất của 2 sự kiện đó. Tỉ lệ phân li của cặp vàng - lục là 3/4 vàng : 1/4 lục và của cặp trơn - nhăn là 3/4 trơn : 1/4 nhăn. Tổ hợp của tính trạng trơn vàng sẽ có xác suất là: 3/4 × 3/4 = 9/16, trơn xanh: 3/4 × 1/4 = 3/16, vàng nhăn: 3/4 × 1/4 = 3/16, lục nhăn: 1/4 × 1/4 = 1/16

Hình 4.5 Sơ đồ mô tả phép lai hai cặp tính trạng

74

Quy luật thứ hai của Mendel: (quy luật phân ly độc lập và tổ hợp tự do): Các gen của từng cặp trong phân bào giảm nhiễm phân ly nhau độc lập với các thành viên của các cặp gen khác và chúng hợp lại trong các giao tử đang được hình thành một cách ngẫu nhiên. 2. Lai với nhiều cặp tính trạng Công thức chung của lai nhiều tính: Số cặp gen dị hợp tử F1 1 2 3 ... n 2n 4n 3n 2n số loại giao tử 2 22 = 4 23 = 8 số loại tố hợp ở F2 4 42 = 16 43 = 64 số kiểu gen F2 3 32 = 9 33 = 27 Số kiểu hình F2 2 22 = 4 23 =8

Có thể lai với 3 cặp tính trạng hoặc nhiều hơn. P: G: F1: F1 × F1: AaBbDd AABBDD ABD x x abd AaBbDd AaBbDd aabbdd

G: ABD, AbD, ABd, aBD, Abd, abD, aBd,abd. F2: Sự phân ly kiểu hình theo tỷ lệ: 27 A-B-D- : 9A-B-dd : 9A-bbD- : 9aaB-D-: 9A-bbdd : 3aaB-dd : 3aabbD- : 1aabbdd 3. Một số tính trạng Mendel ở người: Rất nhiều tính trạng của người có sự di truyền theo các quy luật Mendel. Một số tính trạng thường gặp: khớp ngón cái ngược ra phía sau được hay không, tóc mọc thành đỉnh nhọn ở trán, nhiều tàn nhan, lúm đồng tiền trên gò má, bạch tạng, dái tai người có thể thòng hay liền (dái tai thòng là trội). Có 2 gen trội ảnh hưởng đến khả năng cuốn lưỡi, một gen tạo khả năng cuốn lưỡi tròn và gen trội thứ hai cho phép gập ngược.

75

* Đặc điểm của bệnh di truyền gen trội trên NST thường Các bệnh di truyền gen trội trên NST thường được gặp với tần số 1/200 cá thể. Ví dụ: tất thừa ngón sau trục (postaxial polydactyly) với biểu hiện thừa ngón cạnh ngón út. Tật này di truyền kiểu trội trên NST thường. Trong đó gen A quy định thừa ngón, a quy định ngón bình thường. Đặc điểm quan trọng của các bệnh di truyền do gen trội trên NST thường: - Cả 2 giới đều có tỷ lệ mắc bệnh ngang nhau. - Không có sự gián đoạn giữa các thế hệ. - Người mang gen bệnh ở trạng thái dị hợp kết hôn với người bình thường sẽ truyền cho con của họ với xác suất là 1/2. * Đặc điểm của bệnh di truyền gen lặn trên NST thường Ví dụ: Bệnh bạch tạng là một bệnh di truyền gen lặn gây ra do đột biến gen mã hóa enzyme chuyển hóa tyrosine. Sự thiếu hụt enzyme này làm đình trệ quá trình chuyển hóa để tổng hợp sắc tố melanin. Người mắc bệnh sẽ có rất ít sắc tố ở da, tóc và mắt. Vì melanin cũng cần cho sự phát triển của các sợi thần kinh thị giác nên người mắc bệnh bạch tạng cũng có thể bị tật rung giật nhãn cầu, lác mắt giảm thị lực. Đặc điểm chính của bệnh di truyền do gen lặn trên NST thường: - Bệnh thường được thấy ở một hoặc một số anh chị em ruột nhưng lại không có ở thế hệ bố mẹ. - Một cặp vợ chồng mang gen bệnh sẽ có trung bình 1/4 con cái mang mắc bệnh. - Nam và nữ đều có khả năng mắc bệnh như nhau. - Hôn nhân giữa những người có quan hệ họ hàng được gặp nhiều trong phả hệ của loại bệnh di truyền này. Nhiều bệnh di truyền gen trội thật ra có biểu hiện ở những người đồng hợp tử nặng hơn so với những người dị hợp tử. Ví dụ: ở bệnh loạn sản sụn bẩm sinh (achondroplasia) là bệnh di truyền gen trội trên NST thường với biểu hiện lùn. Những người dị hợp tử gần như có một cuộc sống bình thường với tuổi thọ trung bình ít hơn người bình thường

76

khoảng 10 năm. Tuy nhiên những người đồng hợp có biểu hiện nặng hơn và thường chết ở tuổi thiếu niên do suy hô hấp. Có thể phân biệt bệnh di truyền gen trội và gen lặn dựa trên biểu hiện lâm sàng của người dị hợp tử: bệnh di truyền trội có biểu hiện trên lâm sàng, trong khi đó bệnh di truyền lặn luôn luôn bình thường trên lâm sàng. Một điểm cần lưu ý là thuật ngữ trội và lặn trong cách nói được dùng để chỉ kiểu di truyền chứ không phải để nói về gen. Xét trường hợp bệnh hồng cầu hình liềm, người đồng hợp tử đột biến này có biểu hiện bệnh, người dị hợp tử bình thường về mặt lâm sàng nhưng có nguy cơ bị nhồi máu lách rất cao. Rõ ràng là bệnh hồng cầu hình liềm có đặc điểm của một bệnh di truyền gen lặn nhưng đặc điểm của người dị hợp làm bệnh này có tính chất của một bệnh di truyền trội. 4. Các quy luật chung của tính di truyền Các quy luật di truyền Mendel gọi là các quy luật truyền đạt tính trạng từ thế hệ này sang thế hệ khác. Từ đó người ta rút ra được các quy luật của tính di truyền cho các sinh vật nhân thực bậc cao: - Tính di truyền có tính gián đoạn do những nguyên tố riêng biệt đảm bảo (các gen). - Mỗi tính trạng được xác định bởi các nhân tố di truyền riêng biệt là các gen gen. các gen này truyền cho thế hệ sau qua tế bào sinh dục - Các gen được duy trì ở dạng thuần khiết qua nhiều thế hệ, không bị biến đổi và cũng không bị mất đi. - Cả hai giới đều tham gia như nhau vào việc truyền đạt các dấu hiệu di truyền. - Các gen có cặp ở trong tế bào cơ thể, đơn độc trong tế bào sinh dục. Ở các con lai một có nguồn gốc từ bố, một có nguồn gốc từ mẹ, có thể là trội hoặc lặn. Việc tìm ra các quy luật Mendel không những có ý nghĩa lý thuyết mà có nhiều ứng dụng trong việc lai tạo giống.

Câu hỏi ôn tập
1. Đặc điểm của phương pháp thí nghiệm của Mendel là gì?

77

2. Mối quan hệ giữa nguyên phân, giảm phân và quy luật phân ly độc lập của Mendel. 3. Nêu thí nghiệm chứng minh trực tiếp sự phân ly ở mức giao tử. 4. Ý nghĩa của sự phân ly ở mức giao tử. 5. Khi có hiện tượng trội không hoàn toàn và di truyền tương đương thì tỷ lệ phân ly kiểu gen và kiểu hình như thế nào?

Tài liệu tham khảo
Phạm Thành Hổ (2000). Di truyền học. NXB Giáo Dục. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (1998). Cơ sở di truyền học. NXB Giáo Dục. Hoàng Trọng Phán (1995). Di truyền học phân tử. Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế. Anthony J. F. Griffiths, Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin, William M. Gelbart, David T. Suzuki, Jeffrey H. Miller. 2004. An introduction to genetics analysis. W.H. Freeman Publishers. Harlt D.L., Jones E.W. (1998). Genetics - Principle and analysis. Jone and Bartlett Publshers. Toronto, Canada. Stansfield W.D. 1991. Schaum’s outline of theory and problems of genetics. McGraw-Hill, Inc., New York.

78

Chương 5

Tương tac gen
Mục tiêu của chương
Giới thiệu vê tương tac gen allele, tương tac giưa cac gene không allele, nhưng phưc tap trong biêu hiện gen va tac đông cua môi trương đên sư hinh thanh kiêu hinh.

Số tiết: 3 Nội dung I. Sự tương tác gen giữa các gen alen
1. Hiện tượng gây chết Sự tương tác giữa các alen trong trường hợp lai một tính đó là trường hợp gen gây chết. Đây là trường hợp làm biến đổi tỉ lệ theo định luật Mendel đơn giản nhất. Vi du: Ở chuôt , Ay: lông vàng (trội) a: đen hoặc sôcôla (lặn) Khi người ta lai chuột vàng × vàng F1: thu được hai loại chuột: 2 lông vàng : 1 lông khác (sô cô la), đồng thời trong các lứa chuột đẻ ra thì số con của nó ít hơn 1/4 so với các tổ hợp lai khác. Các nhận xét này được đưa đến giả thiết là chuột lông vàng có kiểu gen dị hợp tử Aya khi chúng lai với nhau làm xuất hiện chuột AyAy không có sức sống và chúng bị chết ở giai đoạn sớm của phôi. Người ta làm thí nghiệm giải phẫu chuột cái lông vàng đang mang thai trong tổ hợp lai giữa lông vàng × vàng đều xác định hiện tượng trên. Đó là trong dạ con của chuột mẹ có một số bào thai lông vàng không phát triển vì một số bộ phận trong cỏ thể mang đặc điểm dị hình. Như thế chuột đồng hợp tử AyAy không có sức sống do alen Ay là alen gây chết không cho đồng hợp tử sống được. Tác động của alen Ay về màu lông là trội so với alen a vì cơ thể dị hợp tử Aya có màu lông vàng. Nhưng về mặt sức sống thì

79

Ay lại lặn so với a vì tổ hợp Aya vẫn sống bình thường do alen a lấn át sự gây chết của Ay. Đây là ví dụ về gen có tác động này trội nhưng tác động kia là lặn so với alen tương ứng.

Hình 5.1 Hiện tượng gen gây chết ở chuột

Hinh 5.2 Kêt qua phep lai giưa cac chuôt di hơp tư lông vang. Không phai tât ca cac chuôt ơ thê hê sau đêu sông sot

80

Hình 5.3 Sự tương tác giữa các alen của cùng một gen ở chuột lang
agouti (1 allen dạng hoang dại và nhiều allen đột biến) a. Chuột lưng đen, bụng vàng (trên - trái), bụng đen (trên - phải) và chuột lang agouti (dưới). b. Kiểu gen và kiểu hình tương ứng của các allele của gen agouti. c. Lai giữa các dòng thuần tạo ra một dãy có thể có 3 allele theo một thứ tự trội. Cho các cá thể F1 giao phối với nhau cho ra thế hệ F2 có tỷ lệ kiểu hình là 3:1. điều này cho thấy A, at và a là các allele khác nhau của cùng một gen

81

Trường hợp này còn gặp một số đối tượng khác như cá chép Khi lai cá chép kính với nhau F1 : 1/4 AA chết : 2/4 Aa : 1/4 aa : 2 chép kính : 1 chép vảy

Ở người bệnh thiếu máu hồng cầu liềm do đột biến: Người có kiểu gen SS: thiếu máu nặng chết trước khi trưởng thành. SA: sức khỏe bình thường nhưng đôi khi có triệu chứng thiếu máu nhẹ.

Hình 5.4 Bệnh hồng cầu lưỡi liềm ở người

2. Sự tương tác giữa các alen của cùng một gen Giữa các alen của cùng một gen có mối quan hệ trội và lặn. Trong mối tương tác gen này người ta phát hiện ra hiện tượng một gen có nhiều hơn 2 alen. Ví dụ: - Sự di truyền nhóm máu A,B,O do 3 alen IA, IB, Io. Nhóm máu của đại gia súc có hơn 100 alen. - Sự di truyền màu mắt ruồi giấm do 1 gen gồm 1 dãy 12 alen quy định, alen cuối cùng mắt trắng (w) và tính trội giảm dần theo hướng sau:

82

W+ > Wsat > Wco > WW > Wap3 > Wch > We > Wbl > Wap > Wi > Wt > W Tương ứng: đỏ dại - đỏ satsuma - san hô (coral) - rượu nho (wine) trái đào (apricot) - cheri - son (eosin) - máu (blood) - trái đào (apricot) - ngà voi (ivory) - trắng đục (tinged) - trắng (white) Sự biểu hiện tính trạng màu mắt do sự tương tác giữa hai alen với nhau: W+Wbl: hoang dại WcoWbl: đỏ san hô - Dãy alen trong việc xác định nhóm máu ở người Các alen làm xuất hiện nhiều nhóm máu đặc trưng ở người, liên quan với đặc điểm kháng nguyên của thể máu, quy định sự xuất hiện kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh máu. Sự phát hiện ra nhóm máu là do Landsteiner, ông thấy trong một số trường hợp nhất định, khi truyền hồng cầu người này vào huyết thanh người khác có hiện tượng ngưng kết các thể máu. Khi truyền máu, hiện tượng này có thể gây chết. Người ta đã xác định trong hồng cầu có 2 kháng nguyên A và B, còn trong huyết thanh có 2 kháng thể làm ngưng kết chúng. Quần thể người được phân ra theo đặc tính của máu thành 4 nhóm: nhóm A có kháng nguyên A và kháng thể kháng B, nhóm B có kháng nguyên B và kháng thể kháng A, nhóm AB có cả 2 kháng nguyên không có kháng thể, nhóm O không có kháng nguyên và có cả 2 kháng thể. Phản ứng của 4 nhóm máu với huyết thanh có kháng thể kháng B và kháng thể kháng A như sau: hồng cầu nhóm máu AB ngưng kết với huyết thanh có kháng thể kháng B và kháng thể kháng A. Hồng cầu nhóm A chỉ bị ngưng kết bởi huyết thanh nhóm B. hồng cầu nhóm B chỉ bị ngưng kết bởi huyết thanh nhóm máu A. Hồng cầu nhóm O không bị ngưng kết trong cả 2 trường hợp. Phân tích quá trình di truyền các nhóm máu ở người đã chứng minh rằng 4 nhóm máu được quy định do sự di truyền của 3 alen (I A, IB, Io). Nhóm máu AB là thể dị hợp có kiểu gen IAIB, nhóm A: IAIA, IAIO, nhóm B: IBIB, IBIO, nhóm O: IOIO.

II. Sự tương tác giữa các gen không alen
1. Tương tác át chế - Tỉ lệ 13:3

83

Ở gà 2 kiểu gen CCII và ccii đều xác định màu lông trắng. Màu trắng ở kiểu gen CCII là do gen C tạo màu bị gen I át đi, còn kiểu gen ccii cho kiểu hình trắng là do gen tạo màu ở trạng thái đồng hợp lặn P: gà trắng × CCII F1 F2 ccii CcIi (gà trắng) 9 C-I- : 3 C-ii : 3ccI- : 1 ccii gà trắng

13 trắng: 3 màu - Tỉ lệ 12:3:1 Alen trội A kìm hãm sự biểu hiện của B ở locus khác. B chỉ biểu hiện ở aa. Aabb có kiểu hình khác Thi nghiệm: Lai bi qua mau xanh co kiêu gen AABB với bi qua trăng co kiêu gen aabb thi bi F1 AaBb co mau trăng. Lai F1 với nhau cho F2 tỷ lệ 12 trăng : 3 vang : 1 xanh P Bi qua trăng F1: F2: × Bi qua trăng AaBb (qua trăng) 9 A-B- : 3A-bb : 3 aaB- : 1 aabb 12 qua trăng : 3 qua vang : 1 qua xanh

Hình 5.5 Tương tác át chế Ưc chê trôi tao ra ty lê kiêu hinh 12:3:1 (a) va ty lê 13:3 (b)

84

- Tỷ lệ 9 : 3 : 4 Kiểu gen aa cản trở sự biểu hiện của các alen locus B, gọi là át chế lặn đối với locus B Thí nghiệm: P: F1: F2: Chuột đen × AAbb Chuột trắng aaBB AaBb (xám nâu) 9 A-B- : 3 A-bb : 3 aaB : 1aabb 9 xám nâu : 3 đen : 4 trắng

Hinh 5.6 Tương tac at chê do đông hơp tư gen lăn

2. Tương tác bổ sung - Tỉ lệ 9 : 3 : 3 : 1 Ví dụ sự di truyền hình dạng mào gà P: gà mào hoa hồng × AAbb hạt đậu aaBB

85

F1: F2:

AaBb (mào quả óc chó) 9 A-B- : 3 A-bb : 3 aaB- : 1 aabb

9 mào quả óc chó : 3 hoa hồng : 3 hạt đậu : 1 mào đơn

Hình 5.7 Hình dạng mào gà

- Tỉ lệ 9 : 6 : 1 Ở bí đỏ, 2 cặp alen xác định hình dạng quả: tròn, dẹt và dài P: tròn AAbb F1 × aaBB AaBb (dẹt) tròn

F2 9 A-B- : 3 A-bb : 3 aaB- : 1 aabb 9 dẹt : 6 tròn : 1 dài

86

Hinh 5.8 Sư hinh thanh cac dang qua ơ bi

- Tỉ lê 9 : 7

Hình 5.9 Sự hình thành màu hoa ở đậu thơm Lathyrus odoratus

Thí nghiệm ở đậu thơm Lathyrus odoratus A-B-: hoa đỏ

87

A-bb, aaB- : hoa trắng P Đậu thơm hoa trắng × hoa trắng AAbb F1: F2: 9 đỏ 3. Tương tác đa gen a. Tương tác cộng gộp Các tính trạng chịu sự chi phối của nhiều gen được gọi là sự di truyền đa gen. Mỗi gen đều có kiểu hình ở mức độ nhất định, nhiều gen đơn này có tác dụng cộng gộp theo một hướng. Các cá thể có biểu hiện kiểu hình dao động khác nhau do nhận nhiều hay ít gen, có thể xếp chúng theo mức độ biểu hiện thành một dãy liên tục gọi là số lượng. Tính trạng do nhiều gen xác định, nên biểu hiện kiểu hình của chúng dễ bị biến đổi do tác động của môi trường. b. Tỷ lệ phân ly ở F2 Năm 1908 nhà di truyền học Thụy Điển Nilson - Ehler khi nghiên cứu ở lúa mì: Thế hệ F1 A1a1A2a2 có màu đỏ hồng do mang 2 alen trội A1 và A2, ở F2: A1A1A2A2 -----------> Đỏ đậm a1a1a2a2 trắng aaBB AaBb (hoa đỏ) 9 A-B- : 3A-bb : 3 aaB- : 1aabb : 7 trắng

Ở F2 giữa màu đỏ đậm và màu trắng có các mức màu trung gian: đỏ (3A), đỏ hồng (2A) và hồng (A) Chiều dài trái bắp và màu lông xám ở chuột cũng là những ví dụ về sự di truyền đa gen. Ở người nhiều tính trạng có sự di truyền số lượng như tính trạng màu da, chiều cao... Sự di truyền màu da có thể liên quan đến 3 cặp gen, giữa dạng đen sậm A1A1A2A2A3A3 và dạng trắng a1a1a2a2a3a3 có các màu da đen trung gian. Tỷ lệ phân ly giữa da màu và da trắng là 63 : 1.

88

4. Tính đa hiệu của gen: Ngay từ thời Mendel, ông đã nhận thấy 1 gen có thể tác động đến nhiều tính trạng. Ví dụ: ở đậu Hà lan, gen ảnh hưởng đến màu hoa đồng thời ảnh hưởng cả màu vỏ hạt, như hoa đỏ hạt xám, còn hoa trắng hạt trắng. Hiện tượng 1 gen ảnh hưởng đến nhiều tính trạng gọi là tính đa hiệu của gen. Hội chứng Marfan: bệnh di truyền gen trội trên NST thường với biểu hiện ở mắt, xương và hệ tim mạch. Gen gây ra hội chứng Marfan ở trên nhánh dài của NST 15, mã hóa cho fibrilin (thành phần mô liên kết). Bệnh xuất phát từ tình trạng tổ chức mô liên kết bị kéo dãn không bình thường gây nhiều hậu quả khác nhau. Người bệnh có tay chân dài, khuôn mặt hẹp. Ở người, sai hỏng gen của bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm gây ra hàng loạt chứng bệnh khác. Khoảng 25% các bệnh di truyền sai hỏng cấu trúc tim bẩm sinh có thể dẫn đến biến dạng cơ xương (9%), hệ thần kinh trung ương bất thường (4%), sai hỏng đường tiết niệu hay thận (5%) và tiêu hóa (4%). Thực tế bất kỳ gen nào cũng có tính đa hiệu vì một gen không ít thì nhiều đều có ảnh hưởng đến gen khác. Những gen có hoạt động sớm trong quá trình phát triển cá thể sẽ có tác động nhiều hơn và lâu hơn.

III. Những phức tạp trong biểu hiện cuả gen
1. Gen biến đổi (Modifier gene) các gen xác định có tính trạng hay không có tính trạng được gọi là các gen căn bản hay gen nền. Gen biến đổi là những gen không có biểu hiện kiểu hình riêng của nó nhưng lại có ảnh hưởng đến sự biểu hiện kiểu hình của những gen căn bản khác. Ví dụ: Ở bò, lông đều do gen trội S, có đốm do gen lặn s quy định. Bò có đốm hay không có đốm là do các gen căn bản xác định. Nhưng ở bò có đốm, đốm ít hay nhiều là do tác động của các gen biến đổi. Số đốm ở lông chó cũng có sự biểu hiện tương tự: đốm nhiều hay ít là do tác động của gen biến đổi.

89

Hinh 5.10 Biêu hiên cua gen biên đôi trong hinh thanh 10 loai cho đôm

2. Các tính trạng bị giới hạn bởi giới tính Có những tính trạng mà gen của chúng chỉ biểu hiện ở một giới được gọi là gen bị giới hạn bởi giới tính. Ở đại gia súc có sừng số lượng sũa và lượng mỡ trong sữa được biểu hiện ở giống cái. Các con bò đực mang các gen xác định lượng sữa và độ mỡ trong sữa không có biểu hiện nhưng các gen này được truyền cho bò cái con. Do đó trong chọn giống bò sữa phải tuyển các bò đực mang các gen tạo sữa tốt để đem lai. Ở gà trống cũng vậy, chúng mang các gen đẻ trứng nhiều hay ít, lớn hay nhỏ nhưng không có biểu hiện. 3. Các tính trạng có sự biểu hiện phụ thuộc vào giới tính Có những tính trạng mà sự biểu hiện trội hay lặn phu thuôc vao giới tính.

90

Ví dụ: ở đại gia súc có sừng, gen có sừng: H

Gen không sừng: h

Kiểu gen HH tạo sừng ở cả con đực lẫn con cái, kiểu gen hh không có sừng ở cả 2 giới. Kiểu gen dị hợp tử Hh nếu ở con đực sẽ có sừng (H là trội), nếu ở con cái lại không có sừng (H lặn). Ở dê, tính trạng có râu xồm hay không cũng thuộc loại có biểu hiện phụ thuộc giới tính, con đực dị hợp tử có râu xồm, dê cái dị hợp tử không râu. Ở người hói đầu do gen B (ballness) xác định. Kiểu gen Bb có biểu hiện trội ở đàn ông, nhưng biểu hiện lặn ở nữ. Điều này giải thích vì sao ít có phụ nữ hói đầu.

Hinh 5.11 Tinh hoi đâu co sư biêu hiên phu thuôc vao giơi tinh

Ngón tay áp út của bàn tay người có thể dài hơn hay ngắn hơn ngón trỏ. Người ta cho rằng sự giảm chiều dài ngón trỏ do một gen trội ở nam và lặn ở nữ.

IV Độ thấm (penetrance) và độ biểu hiện (expression)
1. Độ thấm (độ thâm nhập) Độ thấm là khái niệm để chỉ mức độ tham gia của alen vào kiểu hình.

91

Ví dụ: người có Kiểu gen IAIo có nhóm máu A thì IA có độ thấm 100%, còn IO thì 0% vì không thâm nhập vào kiểu hình. Trường hợp người có nhóm máu AB thì cả IA lẫn IB đều có độ thấm 100%. Nhiều gen có độ thấm khác nhau tùy lứa tuổi. Những người mang gen epiloia (bệnh di truyền) có người chết sớm, có người sống và có thể sinh con. Các gen không thấm vẫn có thể truyền cho đời sau như các gen có độ thấm hoàn toàn. Ví dụ: Bệnh Alzheimer làm rối loạn trí nhớ, mất định hướng không gian và thời gian, có biểu hiện ở người già sau 60 tuổi. Hiện nay đã xác định được bệnh do môt gen trôi trên NST thư 14 cua ngươi.. Đây la trương hợp đặc biệt cho thấy môt gen cua ngươi co đô thấm sau 60 năm hoặc lâu hơn. Nhiều nhân vật nổi tiếng mắc bệnh Alzheimer như cựu tổng thống Mỹ R. Reagan. Bệnh Huntington là bệnh gây ra do rối loạn thần kinh với biểu hiện mất trí (dementia) và gia tăng các vận động không kiểm soát được của các chi dẫn đến hiện tượng múa vờn (chorea) nên đôi khi bệnh còn được gọi là bệnh múa vờn Huntington. Triệu chứng của bệnh thường không biểu hiện trước 30 tuổi. Tỷ lệ thấm thường được đánh giá dựa trên việc xem xét một số lượng lớn gia đình và xác định tỷ lệ người bắt buộc mang gen và những ngươi đồng hợp tử vê gen bệnh co biêu hiện bệnh. Khi tỷ lệ nhưng ngươi này ít hơn 100% ta nói là có tính thấm giảm hay tính thấm không hoàn toàn (incomplate penetrance). 2. Độ hiện hay độ biểu hiện Độ biểu hiện được dùng để chỉ mức độ nhiều ít của tính trạng khi đã thấm hoàn toàn. Ví dụ: sự cảm nhận vị đắng của chất phenylthiocarbamide (PTC) hay không cảm nhận ở người do 1 gen xác định. Tuy nhiên những người cảm nhận vị đắng có độ hiện khác nhau: có người cảm nhận vị đắng ở nồng độ 1.300 mg/l hoặc cao hơn, trong khi cá biệt có những người cảm nhận vị đắng ở nồng độ rất thấp là 0,16 mg/l, nhiều người khác cảm nhận vị đáng ở các nồng độ trung gian.

92

Nhiều tính trạng ở người có độ hiện ổn định suốt dời như nhóm máu, màu mắt... - Biểu hiện đa dạng (Variable Expression) Một tình trạng phức tạp khác là sự biểu hiện đa dạng của bệnh. Bệnh có thể có tính thấm hoàn toàn nhưng mức độ nghiệm trọng của bệnh có sự thay đổi rất lớn. Ví dụ: Bệnh u xơ thần kinh (neurofibromatosis) type I (còn gọi là bệnh Von Recklinghausen). Bố hoặc mẹ có thể có bệnh rất nhẹ, nhẹ đến nỗi họ không nghĩ là mình mắc bệnh. Nhưng họ có thể truyền gen bệnh cho con và đôi khi chúng có biểu hiện bệnh rất nặng. Biểu hiện của bệnh là bệnh nhân có các chấm cà phê - sữa trên bụng và các u xơ thần kinh bì hay các u xơ thần kinh ở phía lưng. Cả 2 khái niệm độ thấm và độ biểu hiện được nhà di truyền học người Nga Timofeev - Resopski nêu ra vào năm 1925 để đánh giá mức độ thể hiện ra kiểu hình của các gen. Ngoài ra, sự biểu hiện của kiểu gen ra kiểu hình còn phụ thuộc vào mức phản ứng.

V. Tác động của môi trường
Kiểu gen còn chịu nhiều tác động khác nhau của môi trường bên trong và ngoài cơ thể 1. Tác động của môi trường bên ngoài a. Nhiệt độ Tác động căn bản của nhiều gen chủ yếu là kiểm soát tốc độ phản ứng sinh hóa thông qua enzyme là những chất được các gen xác định về mặt di truyền. Giữa nhiệt độ và tốc độ phản ứng có sự liên quan chặt chẽ. Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự biểu hiện kiểu hình trong nhiều trường hợp. Ví dụ: sự biểu hiện tính trạng lông đen ở chóp mũi, tai và chân của giống thỏ Himalaya ở nhiệt độ thấp khi phát triển bộ lông. Nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến độ thấm và độ hiện. b. Dinh dưỡng

93

Trong một số trường hợp chế độ dinh dưỡng ảnh hưởng đến biểu hiện kiểu hình. Ví dụ sự biểu hiện mỡ vàng của thỏ do 2 yếu tố: sự hiện diện của gen đồng hợp tử lặn yy và lượng thực vật xanh (xanthophyll) trong thức ăn. Nếu thiếu thực vật xanh trong thức ăn, mỡ vàng không xuất hiện. Bệnh phenylketonuria (PKU) được gặp ở người da trắng với tỷ lệ 1/10.000 lần sinh. Các đột biến ở locus mã hóa cho enzyme chuyển hóa phenylalanine hydroxylase làm cho người mang kiểu gen đồng hợp không thể chuyển hóa amino acid phenylalanine. Trong khi những trẻ sơ sinh mắc bệnh phenylketon niệu có biểu hiện bình thường sau sinh thì sự khiếm khuyết chuyển hóa sẽ làm tích lũy dần phenylalanine và các sản phẩm chuyển hóa độc khác dẫn đến tổn thương hệ thần kinh trung ương và gây ra biểu hiện chậm phát triển trí tuệ trầm trọng. Như vậy kiểu gen PKU sẽ gây ra kiểu hình bệnh lý nghiêm trọng. Tuy nhiên nếu trẻ mang kiểu gen bệnh được phát hiện sớm qua sàng lọc trước sinh, biểu hiện của bệnh có thể tránh bằng chế độ ăn nghèo phenylalanine. Như vậy, mặc dầu trẻ mang kiểu gen PKU nhưng nhờ chế độ ăn phù hợp đã tránh được tình trạng chậm trí. c. Ảnh hưởng của cơ thể mẹ Sau khi trứng đã được thụ tinh, cơ thể mẹ có thể ảnh hưởng đến sự phát triển. Ví dụ máu người mẹ có kiểu gen rh- (nhân tố rhesus âm), nếu đứa con thứ nhất có Rh+ sinh ra sẽ không sao, nhưng đứa con thứ hai có thể bị chết. 2. Tác động của môi trường bên trong Quá trình phát triển cá thể trải qua nhiều bước trung gian phức tạp. Ngay trong cơ thể có nhiều tác động giữa các cấu trúc khác nhau và với kiểu gen như các tương tác: gen với gen, gen với NST, NST - nhân, nhân - tế bào chất, tế bào - mô... ở đây chỉ nêu vài tác động có tính chất chung tổng quát: a. Tuổi Nhiều tính trạng và bệnh di truyền ở người có biểu hiện trong một độ tuổi nhất định. Bệnh alcaptonuria (nước tiểu có acid homogentisic bị đen khi có O2) biểu hiện ngay lúc mới sinh ra. Bệnh vảy cá biểu hiện trong 4 tháng đầu. Bệnh tiểu đường và chứng co giật Huntington biểu hiện ở nhiều độ tuổi khác nhau. Bệnh Alzheimer biểu hiện sau 60 tuổi. b. Giới tính

94

Giới tính có nhiều ảnh hưởng đến sự biểu hiện của gen như giới hạn sự biểu hiện hay tính trội lặn phụ thuộc vào giưói tính. Ngoài ra có những gen liên kết với giới tính. Có thể hormone sinh dục tác động đến biểu hiện của các gen. Như vậy môi trường bên trong và ngoài cơ thể có nhiều ảnh hưởng phức tạp khác nhau lên sự biểu hiện kiểu hình của các gen. Nhiều bệnh ở người như tim mạch, huyết áp... trước đây không coi là các bệnh di truyền. Quan điểm mới hiện nay cho rằng đó là những bệnh di truyền mà biểu hiện phụ thuộc môi trường. Trên thực tế các gen liên quan đến bệnh này được truyền thụ trong các gia đình có bệnh.

Câu hỏi ôn tập
1. Phân biệt gen alen và gen không alen 2. Nêu sự khác nhau giữa át chế gen trội và át chế gen lặn 3. Xác định bản chất di truyền của sự xác định các dạng mào gà. 4.. Khi nghiên cứu hiện tượng di truyền, các nhà di truyền học đã phát hiện tỷ lệ 9 : 6 : 1 trong thế hệ con. Hãy giải thích kết quả di truyền này. Có thể kiểm tra giả thuyết này như thế nào. 5. Phân biệt đa gen và đa hiệu của gen.

Tài liệu tham khảo
Phạm Thành Hổ (2000). Di truyền học. NXB Giáo Dục. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (1998). Cơ sở di truyền học. NXB Giáo Dục. Hoàng Trọng Phán (1995). Di truyền học phân tử. Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế. Anthony J. F. Griffiths, Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin, William M. Gelbart, David T. Suzuki, Jeffrey H. Miller. 2004. An introduction to genetics analysis. W.H. Freeman Publishers. Harlt D.L., Jones E.W. (1998). Genetics - Principle and analysis. Jone and Bartlett Publshers. Toronto, Canada.

95

Stansfield W.D. 1991. Schaum’s outline of theory and problems of genetics. McGraw-Hill, Inc., New York.

96

Chương 6

Học thuyết di truyền nhiễm sắc thể

Mục tiêu của chương
Giới thiệu sự di truyền liên kết với giới tính, một số ví dụ về các gen liên kết với nhiễm sắc thể giới tính và ứng dụng của chúng. Các gen trên cùng một nhiễm sắc thể di truyền cùng nhau theo quy luật liên kết.

Số tiết: 5 Nội dung I. Sự xác định giới tính và sự di truyền liên kết với giới tính
1. Tỉ lệ phân li giới tính Quan sát nhiều loài sinh vật chúng ta thấy có hiện tượng đực cái. Nhiều số liệu cho thấy tỉ lệ giới tính là 1♂ : 1♀. Tỉ lệ này trùng với tỉ lệ phân li đơn tính khi lai phân tích Aa × aa hoặc Aa × AA. Như vậy giới tính có sự phân ly như một dấu hiệu Mendel. Sự phân li này cho thấy một giới tính đồng hợp tử, còn giới tính kia di hợp tử. Việc phát hiện ra các nhiễm sắc thể giới tính X và Y cho thấy bộ nhiễm sắc thể của cá thể đực và cái chỉ khác nhau ở một cặp nhiễm sắc thể giới tính, còn các nhiễm sắc thể thường đều giống nhau. Ví dụ bộ nhiễm sắc thể nhiễm sắc thể của ruồi giấm có 8 nhiễm sắc thể : ruồi cái: 6A + XX và ruồi đực: 6A + XY Sự kết hợp giữa đực và cái dẫn đến tỉ lệ phân chia 1 cái : 1 đực. Tuy nhiên tỉ lệ này còn phụ thuộc vào lứa tuổi. Thực tế ở người, trong mỗi gia đình tỉ lệ có dao động, tỉ lệ trên đúng khi thống kê với số lượng lớn. 2. Các gen liên kết với giới tính Các gen nằm trên nhiễm sắc thể giới tính sẽ có sự di truyền khác hơn so với các gen nằm trên nhiễm sắc thể thường. Thực tế cho thấy nhiễm sắc thể Y hầu như không chứa gen.

96

2.1. Lai thuận nghịch: - Lấy ruồi cái mắt đỏ lai với ruồi đực mắt trắng: P: G: F1: G: F2: cái mắt đỏ X X XW XWXw XW , Xw XW XW : XW X w : XW Y : Xw Y
W W

×

đực mắt trắng XwY Xw , Y XWY XW , Y

Kiểu hình: 3 đỏ : 1 trắng (đực) Tỷ lệ phân li trong trường hợp này không khác lắm so với quy luật Mendel - Lấy ruồi cái mắt trắng lai với ruồi đực mắt đỏ: P: G: F1: G: F2: cái mắt trắng XwXw Xw XWXw XW , Xw XW Xw : Xw X w : × đực mắt đỏ XWY XW , Y XwY Xw , Y XW Y : Xw Y

1♀ mđỏ : 1♀ mtrắng : 1♂ mđỏ : 1♂ mtrắng Ở thế hệ thứ nhất có sự di truyền chéo, tỉ lệ phân li ở F2 là 1: 1: 1: 1 Như vậy đối với các gen nằm trên nhiễm sắc thể giới tính chọn đực hay cái mang dấu hiệu nào để lai là có ý nghĩa

97

Hình 6.1 Lai thuận nghịch ruồi dấm mắt đỏ với ruồi mắt trắng

3. Các tính trạng liên kết với giới tính trong di truyền học người - Các gen liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X Một số bệnh di truyền ở người như bệnh máu không đông hay mù màu đỏ đều là các tính trạng do các gen liên kết với nhiễm sắc thể giới tính. Sự di truyền chéo thể hiện rõ: ông ngoại bị bệnh truyền gen mầm bệnh cho mẹ, mẹ truyền bệnh cho con trai. Cho đến nay có ít nhất 50 bệnh và 200 dấu hiệu di truyền gắn với nhiễm sắc thể X của người đã được biết.

98

- Các nhiễm sắc thể X và Y có những phần tương đồng chung. Trong những phần này chứa các gen xác định những tính trạng di truyền theo cách như nhau ở cả nam và nữ, như: + Bệnh da khô sắc tố: Bệnh nhân siêu nhạy cảm với tia cực tím, dưới ảnh hưởng của các tia này trên phần hở của cơ thể xuất hiện những vết sắc tố thoạt đầu ở dạng tàn nhang, về sau ở các dạng u nhú lớn hơn (nốt ruồi) và cuối cùng là các u. Đối với 2/3 số người mắc bệnh thì bệnh da khô sắc tố kết thúc nguy hiểm vào lúc bước vào thời kỳ chín sinh dục. + Hội chứng Oguti: một bệnh hay gặp ở Nhật, biểu hiện ở viêm màng lưới sắc tố mắt và phát triển dị hình ở võng mạc. * Phần không tương đồng của nhiễm sắc thể Y có gen xác định nam tính và một số hội chứng: + Màng giữa ngón

Hình 6.2 Tật màng giữa ngón

+ Tai rậm lông

Hình 6.3 Tính trạng mọc lông ở vành tai đàn ông

99

* Phần không tương đồng của X có các hội chứng: + Bệnh máu khó đông (hemophilia): bệnh có thể được phát triển do kết quả không đủ chất globulin chống chảy máu. Bệnh máu khó đông đã được mô tả trong phả hệ các gia đình hoàng tộc châu Âu là một trường hợp điển hình, bắt đầu từ nữ hoàng Victoria, sau này gặp ở các hoàng tử Tây Ban Nha, Đức, Nga. + Bệnh không có gamma-globulin làm giảm sút rõ rệt sức đề kháng đối với các bệnh truyền nhiễm khác nhau. + Bệnh đái tháo nhạt: người bệnh bị giảm chức năng của tuyến yên, dẫn đến cơ thể bị mất nước rõ rệt. Trẻ em mắc bệnh này sinh trưởng chậm, rối loạn tâm thần, suy nhược cơ thể đôi khi chết. + Bệnh mù màu: rối loạn về khả năng nhìn màu sắc. Hiện tượng rối loạn thị giác này dựa trên cơ sở tác động của nhiều gen. Hiện tượng mù về màu đỏ xanh gọi là chứng mù màu đỏ. + Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne: bệnh do gen lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X. Bệnh xuất hiện từ lúc còn ít tuổi, dần dần dẫn đến tần phế và chết ở tuổi dưới 20. Do đó đàn ông bị loạn dưỡng cơ Duchenne không có con, còn phụ nữ dị hợp về gen này lại hoàn toàn bình thường * Các bệnh di truyền do gen trội liên kết với nhiễm sắc thể X có số lượng ít hơn và có ý nghĩa về mặt lâm sàng không bằng trường hợp di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể X, ngoại trừ trường hợp hội chứng nhiễm sắc thể X dễ gãy. Một số bệnh di truyền do gen trội liên kết với nhiễm sắc thể X: + Bệnh còi xương do giảm phosphat máu là bệnh mà thận bị suy giảm khả năng tái hấp thu phosphat, dẫn đến việc cốt hóa bất thường làm xương bị cong và bị biến dạng. Đây là bệnh di truyền gen trội liên kết nhiễm sắc thể X nên người nữ có khả năng mắc bệnh cao hơn người nam. + Hội chứng nhiễm sắc thể X dễ gãy: là hội chứng di truyền kiểu trội liên kết nhiễm sắc thể X, thể hiện sự chậm trí của người bệnh. Hội chứng được gặp với tỷ lệ 1/4.000 ở nam và 1/8.000 ở nữ. Ở người nữ, mức độ chậm trí có xu hướng nhẹ hơn và thay đổi mức độ biểu hiện nhiều hơn ở người nam.

100

4. Gen nam giới và gen nữ giới ở người 4.1. Gen xác định nam giới Gen nam tính SRY (Sex determining region Y) được phát hiện vào năm 1990 trong một số trường hợp ngoại lệ không tuân theo nguyên tắc XX là nữ và XY là nam. Đã tìm thấy người nam bình thường có XX (nhưng bất thụ) có SRY trên một trong 2 nhiễm sắc thể X và người nữ bình thường mang XY nhưng mất SRY trên nhiễm sắc thể Y.

Hình 6.4 Sự phân hóa di truyền các đoạn của X và Y

Gen SRY còn gọi là nhân tố xác định tinh hoàn TDF (Testis determining factor) nằm trên một đoạn của vai ngắn của nhiễm sắc thể Y ở người. Có giả thuyết cho rằng gen này sản sinh ra protein gắn ADN hoạt hóa một hay nhiều gen khác trong hệ thống các nhân tố hoạt hóa các gen điều khiển sự phát triển của tinh hoàn. Khi thiếu sự hiện diện của TDF mô sinh dục sẽ phát triển thành noãn hoàng. TDF có tính bảo tồn các ở động vật có vú, chúng có nhiều điểm giống nhau giữa các loài. 4.2. Gen xác định nữ giới Gen xác định nữ giới DSS (Dosage sensitive sex reversal) được phát hiện vào năm 1994 do G. Carmerino (Ý). Ở những người nam (XY) nhưng có cơ quan sinh dục nữ có gen SRY trên nhiễm sắc thể Y, đặc trưng bởi sự lặp lại 1 đoạn vai ngắn nhiễm sắc thể X. Sự bất thường này rất hiếm

101

(khoảng 1/20.000 người). Sự cố nhiễm sắc thể này không liên quan đến giảm phân. Những người mang gen này bất thụ. Trong số 8 người bệnh nghiên cứu, 3 người có Y bình thường và một có X với vai ngắn gấp đôi, còn 5 người có một X nguyên trạng và một Y có vai ngắn của X ghép thêm vào. Trong 2 trường hợp có sự hiện diện của 2 đoạn vai ngắn của X. Các nghiên cứu tiếp cho thấy đoạn vai ngắn của X gắn vào càng dài, giới tính càng lệch về tạo phái nữ. Gen DSS đã được tách ra. 5. Nhiễm sắc thể X bất hoạt ở người Trong phôi người, một nhiễm sắc thể X bắt nguồn từ mẹ hay cha trong mỗi tế bào soma sẽ bất hoạt ngẫu nhiên. Tất cả thế hệ tế bào con đều được truyền nhiễm sắc thể X bất hoạt. Thường thì nhiễm sắc thể X có cấu trúc không bình thường bất hoạt, trừ một số ngoại lệ liên quan đến các đột biến liên kết giới tính. Khi nhuộm màu nhân tế bào của người nữ, nhiễm sắc thể X bất hoạt thể hiện ở dạng tròn, được gọi là thể Barr. Trung tâm bất hoạt nằm ở vai dài q, gần tâm động. 6.Ví dụ ứng dụng sự di truyền các gen liên kết với giới tính - Ở gà: B: lông vằn, b: lông trắng, nằm trên X. P: G: F1: ♀ lông vằn × ♂ lông trắng ZBY ZB, Y ZBZb ♂ lông vằn : : × Zb ZbY ♀ lông trắng ZbZb

Ứng dụng vào nông nghiệp, giúp phân đàn ngay khi lúc gà mới nở: muốn nuôi lấy trứng, chọn gà mái; muốn phát triển sản lượng, nuôi gà trống

102

Hình 6.5 Ứng dụng của di truyền liên kết với nhiễm sắc thể giới tính trong phân đan gà

- Ở tằm: L: màu sẫm, l: màu sáng P: F1 cái ZLW ♀ màu sẫm ZLZl ♂ màu sẫm : x đực ZlZl ♂ màu sáng ZlW ♀ màu sáng

Hình 6.6 Ứng dụng di truyền liên kết với nhiễm sắc thể giới tính trong phân loại trứng tằm

Tằm đực cho nhiều tơ hơn tằm cái: 20-30%. Dựa vào tính chất liên kết với giới tính người ta có thể phân biệt được 2 loại tằm đực và cái ngay

103

từ giai đoạn trứng dựa vào màu sắc trứng: trứng màu sáng phát triển thành tằm cái, trứng màu sẫm phát triển thành tằm đực. Ý nghĩa: Dựa vào các dấu hiệu có thể phân biệt giới tính động vật ngay từ khi sinh vật còn bé. Trong công tác chọn giống gia súc thì vấn đề phân biệt giới tính ngay từ đầu có thể phân vùng hợp lý cho việc chăn nuôi. Một số thực vật có hiện tượng di truyền liên kết với giới tính : chà là. 6. Hiện tượng không chia ly của nhiễm sắc thể Ở thí nghiệm: ruồi cái mắt trắng x đực mắt đỏ F1 thu được cái mắt đỏ , đực mắt trắng Calvin Bridges đã phát hiện trường hợp ngoại lệ trong kết quả lai giữa ruồi cái mắt trắng với ruồi đực mắt đỏ: trong 2000 ruồi F1 thì xuất hiện 1 con cái mắt trắng và 1 con đực mắt đỏ. Quan sát tế bào học cho thấy ruồi cái có cặp nhiễm sắc thể XX đi cùng nhau do không chia ly (nondisjunction) trong giảm phân nên ruồi cái có kiểu gen XwXwY biểu hiện mắt trắng, ruồi đực XWO có mắt đỏ. P: G: F1 : XwXw Mắt trắng XwXw, O XWXwXw : XwXwY : XW, Y XWO : OY chết (thường chết) × XWY Mắt đỏ

Siêu cái mắt đỏ : cái mắt trắng : đực đỏ :

Từ kết quả này của Bridges cho thấy sự xác định giới tính ở ruồi giấm không do nhiễm sắc thể Y mà do tỉ số X/A quyết định Nếu X /A = 0,5 trở xuống : ruồi đực. X/A = 1,0 trở lên : ruồi cái X/A = 0,5 - 1,0 : giới tính trung gian

104

Hinh 6.7 Sư hinh thanh thê hê sau do sư không phân ly cua căp nhiêm săc thê giơi tinh

Hinh 6.8 Sư không phân ly cua nhiêm săc thê (a) Sư không phân ly nhiêm săc thê ơ con cai XX (b) Sư không phân ly nhiêm săc thê ơ con cai XXY

Giới tính của ruồi giấm

Cấu trúc nhiễm sắc thể

Tỷ lệ X/A

105

Siêu cái Ruồi cái bình thường + Tứ bội + Tam bội + Lưỡng bội + Đơn bội Giới tính trung gian Đực bình thường Siêu đực

AAXXX AAAAXXXX AAAXXX AAXX AX AAAXX AAXY AAAXY

1,5 1,0 1,0 1,0 1,0 0,67 0,5 0,33

7. Xác định giới tính do số bội thể Ở côn trùng bộ Hymenoptera (ong , kiến): đực (n), cái (2n), ong thợ (2n) Ong đực được phát triển trinh sinh từ trứng không được thụ tinh có bộ nhiễm sắc thể đơn bội (n). Trong kiểu xác định giới tính này không có nhiễm sắc thể giới tính. Còn giới tính cái thì xác định do những alen giới tính khác nhau phối hợp, ong thợ và ong chúa đều là ong cái. Sự khác nhau giữa ong thợ và ong chúa là do ngay từ những ngày đầu mới nở, thức ăn của ong thợ bị thiếu một số vitamin nên bất thụ. Ong thợ làm nhiệm vụ bảo vệ tổ. Ong đực được phát triển từ trứng không thụ tinh nên tế bào sinh dục là đơn bội, cơ thể phục hồi lại nhiễm sắc thể lưỡng bội nên có kích thước và sức sống bình thường. 8. Xác định giới tính do điều kiện môi trường Ở một số loài, sự xác định giới tính do điều kiện môi trường quyết định. Ở loài biển Bonellia viridis, các ấu trùng xuất hiện sau khi được thụ tinh sống tự do một thời gian rồi hoặc bám xuống đáy thành con cái hoặc bám vào con cái rồi chiu vào tử cung thành con đực và thụ tinh. Cả đực và cái đều có kiểu gen như nhau.

106

Ở cây Arisaema japonica, yếu tố quyết định giới tính là trọng lượng củ: những củ to nhất và chứa nhiều chất dinh dưỡng nhất sinh ra cây có hoa cái, trong khi đó các củ gầy chỉ cho cây có hoa đực.

II. Sự di truyền liên kết
Ở trong cơ thể sinh vật, số lượng gen rất nhiều nhưng số lượng nhiễm sắc thể lại ít nên nhiều gen cùng nằm trên nhiễm sắc thể. Khi 2 hay nhiều gen nằm trên một nhiễm sắc thể, chúng sẽ cùng di truyền với nhau gọi là sự di truyền liên kết. Các gen liên kết có xu hướng cùng di chuyển với nhau trong quá trình hình thành giao tử. 1. Hiện tượng liên kết Bateson và Punnet năm 1906 đã phát hiện ra hiện tượng liên kết khi thực hiện phép lai ở Đậu thơm (Lathyrus odoratus) với hai tính trạng: R : hoa đỏ thẩm Ro: hạt phấn dài F1 : r : hoa đỏ ro: hạt phấn tròn

P : hoa đỏ thẩm hạt phấn dài × hoa đỏ hạt phấn tròn 100% hoa đỏ thẩm hạt phấn dài. 182 đỏ, hạt phấn tròn; 30 đỏ, hạt phấn dài 23 đỏ thẩm, hạt phấn tròn; F2 : 192 hoa đỏ thẩm hạt phấn dài;

Hinh 6.9 Kiêu hinh ruôi hoang dai va ruôi đôt biên

107

2. Liên kết hoàn toàn B : thân xám Vg : Cánh dài Thí nghiệm : P : ruồi giấm mình xám cánh dài × ruồi giấm thân đen cánh cụt BVg BVg G: F1 : Lai phân tích ruồi đực F1 : BVg bvg đực xám dài G: FB : 50% xám dài BVg bvg : 50 % đen cụt bvg BVg bvg bvg × bvg bvg cái đen cụt bvg BVg BVg bvg (100% xám dài) × bvg bvg bvg b : thân đen vg : cánh cụt

Tỷ lệ phân li 1:1 giống với lai một tính, hai gen b và vg đi cùng nhau như 1 gen. Một hiện tượng cho đến nay chưa rõ cơ chế là ở ruồi giấm đực không xảy ra tái tổ hợp di truyền, nên có sự liên kết hoàn toàn của các gen trên một nhiễm sắc thể. 3. Hiện tượng di truyền liên kết không hoàn toàn Dùng ruồi giấm cái F1 của thí nghiệm trên lai phân tích: F1 : Thân xám, cánh dài BVg bvg G: BVg bvg bVg Bvg bvg 100% 41,5% 41,5% 8,5% 8,5% × thân đen, cánh cụt × bvg bvg

108

FB :

BVg bvg

bvg bvg

Bvg bvg

bVg bvg

41,5% xám dài : 4,5% đen cụt : 8,5% xám cụt : 8,5% đen cụt. Kết luận: đã có hiện tượng hoán vị gen giữa gen quy định thân xám cánh dài với gen quy định thân đen cánh cụt trong quá trình phân bào 4. Các nhóm liên kết (Gene linkage) Các gen cùng nằm trên một nhiễm sắc thể, cùng di truyền với nhau được xếp vào một nhóm gọi là nhóm liên kết gen. Số nhóm liên kết gen tối đa bằng số cặp nhiễm sắc thể. Ví dụ: Ruồi giấm 2n = 8, số nhóm liên kết gen tối đa = 4 Bắp : 2n =20, có 10 nhóm liên kết gen

III. Hiện tượng tái tổ hợp
1. Tái tổ hợp và trao đổi chéo Khi các gen liên kết không hoàn toàn, xuất hiện các dạng giao tử mới không giống cha mẹ do có sự sắp xếp lai các gen. Hiện tượng này gọi là tái tổ hợp (recombination) và các dạng mới xuất hiện gọi là dạng tái tổ hợp (recombinant). Để đánh giá mức độ liên kết, dùng khái niệm tần số tái tổ hợp. % tái tổ hợp = Số cá thể tái tổ hợp / tổng số cá thể × 100% Nhiều thí nghiệm cho thấy tần số tái tổ hợp giữa 2 gen là một số tương đối ổn định từ lần lai này qua lần lai khác, không phụ thuộc vào cách sắp xếp. Hai alen trội cùng một phía trên nhiễm sắc thể gọi là vị trí cis(AB/ab), 2 alen trội nằm trên 2 nhiễm sắc thể gọi là vị trí trans (Ab/aB). Hiện tượng tái tổ hợp có được nhờ quá trình trao đổi chéo (crossing over). Trong đó 2 nhiễm sắc thể tương đồng hoán vị nhau hay đổi chéo nhau ở những điểm nhất định. Nhiễm sắc thể tương đồng tiếp hợp nhau và trao đổi chéo xảy ra giữa các chromatid không chị em. Các giao tử từ các chromatid không có trao đổi chéo (kiểu cha mẹ) được gọi là giao tử kiểu cha mẹ. Các giao tử từ 2 chromatid khác có xảy ra trao đổi chéo gọi là giao tử tái tổ hợp.

109

Hình 6.10 Trao đổi chéo giữa các chromatid

Hình 6.11 Sự tạo thành các dạng tái tổ hợp

110

2. Cở sở tế bào học của trao đổi chéo Năm 1931, các thí nghiệm chứng minh cơ sở tế bào học của tái tổ hợp di truyền do Stern tiến hành ở Drosophila melanogaster và do Creighton và Mc Clintok tiến hành ở ngô. Cả 2 thí nghiệm đều dùng "dấu chuẩn" về hình dạng trên một trên hai nhiễm sắc thể tương đồng có thể nhìn thấy được khi quan sát tế bào học. Hai nhiễm sắc thể tương đồng được phân biệt với nhau về hình thái này, mang các alen tương ứng khác nhau về mặt di truyền của một số cặp gen. Tái tổ hợp di truyền sẽ tạo ra các kiểu hình độc đáo kèm theo các thay đổi tế bào học dễ quan sát và dự đoán được. Thí nghiệm lai ở ngô với các gen có biểu hiện rõ ràng nằm trên cặp nhiễm sắc thể số 9 có dấu đặc biệt nhiễm sắc thể có 1 đầu có gù lớn và phần sau dài ra, nhiễm sắc thể kia ngắn hơn không có gù. Các gen được sử dụng: C+ : có màu , c: không màu W+ : bắp tẻ (tinh bột), w: bắp nếp (hồ bột) Cho lai bắp có màu, tẻ với bắp không màu , nếp. Kết quả thu được 4 dạng: có màu, nếp; không màu, tẻ; có màu, tẻ; không màu, nếp.

Hinh 6.12 Trao đôi cheo ơ nhiêm săc thê sô 9 cua băp đươc quan sat dưa trên "dâu chuân"

111

Dựa vào kết quả lai, đối chiếu với các quan sát nhiễm sắc thể về mặt hình thái: thu được dạng nhiễm sắc thể có gù nhưng ngắn, còn dạng kia không gù, dài và 2 dạng giống bố mẹ: có gù, dài và không gù, ngắn. Chứng tỏ đã có xảy ra trao đổi chéo của các đoạn nhiễm sắc thể. Stern đã dùng nhiễm sắc thể X ở một đầu mút có dính một đoạn nhiễm sắc thể Y. Các nhiễm sắc thể khác có độ dài tương tự, với tâm động. Hai cặp gen được dùng là carnation (car: lặn, mắt đỏ nhạt) - hoang dại (+, trội, mắt đỏ) và Bar (B: trội, mắt hình thỏi) và hoang dại (+, mắt bình thường). Ruồi cái mẹ dị hợp tử ở cả 2 gen, có kiểu hình mắt đỏ dạng thỏi (car B) với ruồi đực mắt đỏ nhạt, dạng thường (car +). Thế hệ con nhận được cả 4 loại kiểu hình tương ứng với các dấu hiệu hình thái trên nhiễm sắc thể: ngoài 2 kiểu có ở cha mẹ còn có 2 kiểu hình tái tổ hợp là mắt đỏ nhạt, hình thỏi (car B) và mắt đỏ, dạng thường (car++).
+

Hình 6.9 Sự trao đổi các đoạn nhiễm sắc thể tạo các dạng tái tổ hợp Hinh 6.13 Trao đôi cheo ơ ruôi dâm đươc quan sat dưa trên "dâu chuân"

3. Trao đổi chéo ở trong giai đoạn 4 sợi

112

Hình 6.14 Sơ đồ trao đổi chéo đơn và trao đổi chéo kép

113

Trao đổi chéo ở giai đoạn 4 cromatid, tức trao đổi chéo xảy ra sau khi nhiễm sắc thể đã tự nhân đôi (còn gọi là giai đoạn 4 sợi). Về nguyên tắc có thể cho rằng trao đổi chéo có thể xảy ra cả khi nhiễm sắc thể chưa tự nhân đôi (giai đoạn 2 sợi) Phân tích bộ bốn có thể giải quyết vấn đề này. Phân tích bộ bốn là phép phân tích di truyền học nghiên cứu bốn sản phẩm trực tiếp của giảm phân khi tế bào lưỡng bội dị hợp về một gen hay nhiều gen liên kết phân chia giảm phân. Năm 1925, C. Bridge và I. Anderson đã chứng minh trao đổi chéo các cromatid ở ruồi giấm. Tác giả sử dụng dòng ruồi có nhiễm sắc thể X mang thêm đoạn nhiễm sắc thể Y (X,XY) dị hợp về các gen của nhiễm sắc thể X: f (forked) - lông phân nhánh, g (garnet) - mắt đỏ rực. Khi cho lai con cái này với con đực bình thường thì chúng truyền trực tiếp 2 nhiễm sắc thể X cho thế hệ sau và chỉ một nửa thế hệ con của chúng sống sót. Khi ấy một phần cá thể con ở đời sau từ phép lai này là đồng hợp theo các gen của nhiễm sắc thể X. Các thể đồng hợp này chỉ có thể xuất hiện do trao đổi chéo ở giai đoạn 4 sợi trong đoạn gen - tâm động. 4. Trao đổi chéo nhiều lần Trao đổi chéo giữa 2 chromatid có thể xảy ra nhiều lần: 2, 3, 4 lần ... Nếu 2 trao đổi chéo xảy ra trên cùng 2 chromatid ở đoạn giữa 2 gen đánh dấu thì sản phẩm cuối cùng đều có kiểu cha mẹ, nên không phát hiện được. Kiểu trao đổi chéo này chỉ có thể phát hiện được khi sử dụng thêm một gen đánh dấu thứ ba nằm giữa 2 gen này. Nếu xác suất trao đổi chéo giữa A và C và giữa B và C tương ứng với x và y, thì xác suất xảy ra trao đổi chéo đôi là: 0,2 × 0,1 = 0,02 (2%) 5. Nhiễu (Interference) và trùng hợp (Coincidence) Thường thì sự trao đổi chéo ở một chỗ làm giảm xác suất trao đổi chéo thứ hai gần kề nó. Đó là hiện tượng nhiễu. Để đánh giá kết quả người ta dùng hệ số trùng hợp.

114

% trao đổi chéo đôi quan sát được Hệ số trùng hợp = % trao đổi chéo đôi theo lý thuyết Sự trùng hợp + nhiều = 100% = 1 Ví dụ: Biết khoảng cách A-B = 10 đơn vị (10%) và B-C = 20 đơn vị (20%), nếu không có nhiễu thì tần số trao đổi chéo đôi theo lý thuyết là 0,1 × 0,2 = 0,02 hay 2%. Giả sử quan sát được tần số trao đổi chéo đôi là 1,6%. Sự trùng hợp = 1,6/2,0 = 0,8. Điều này cho thấy trao đổi chéo đôi chỉ xảy ra có 80% và sự nhiễu 1,0 - 0,8 = 0,2 (hay 20%)

IV. Xác định vị trí gen và bản đồ di truyền
1.Xác định vi trí gen Morgan cho rằng những gen đứng gần nhau thì liên kết chặt, còn các gen đứng xa nhau thì liên kết yếu. Những gen đứng gần nhau liên kết chặt nên ít xảy ra trao đổi chéo, tần số tái tổ hợp nhỏ, còn các gen đứng xa nhau thì mức liên kết yếu nên tần số tái tổ hợp lớn hơn. Nếu cho rằng các phần của nhiễm sắc thể có khả năng trao đổi chéo như nhau thì tần số tái tổ hợp phản ánh khoảng cách tương đối giữa các gen và tỷ lệ nghịch với mức liên kết gen. Số phần trăm tái tổ hợp được dùng làm số đo khoảng cách giữa 2 gen trên bản đồ di truyền. Một đơn vị bản đồ được coi là đơn vị đo khoảng cách giữa 2 cặp gen khi trong 100 sản phẩm của giảm phân có một dạng tái tổ hợp 1% tái tổ hợp = 1 đơn vị bản đồ, đơn vị này được gọi là centiMorgan (cM). Mỗi cM bằng khoảng 1000 kb hay 106 bp. Như vậy biết được tần số tái tổ hợp giữa các gen có thể xác định vị trí của chúng trên nhiễm sắc thể. Muốn xác định vị trí của một gen bất kỳ phải tiến hành lai và qua 2 bước: - Căn cứ tỷ lệ phân ly để xác định nhóm liên kết gen - Dựa vào tần số tái tổ hợp so với 2 gen khác để xếp vị trí trên nhiễm sắc thể. A B

115

+ Nếu: C nằm giữa AB: C nằm ngoài phía A: C nằm ngoài phía B: AC + CB = AB CB - CA = AB CA - CB = AB

So sánh cụ thể tần sô tái tổ hợp giữa C-A, C-B, A-B xác định được vị trí của C. 2. Bản đồ di truyền của nhiễm sắc thể và bản đồ di truyền tế bào Nhờ xác định được vị trí gen, bản đồ di truyền nhiễm sắc thể của nhiều đối tượng như ruồi dấm, cà chua, bắp,... đã được xây dựng.

Hinh 6.15 Ban đô di truyên nhiêm săc sô 12 cua ca chua

116

Năm 1943, nhiễm sắc thể khổng lồ ở tuyến nước bọt ruồi dấm được phát hiện. Quan sát kính hiển vi có thể nhìn thấy các vệt nhuộm màu đặc trưng (khoảng 5.000 vệt của nhiễm sắc thể khổng lồ sau khi nhuộm. Nhiều dạng đột biến thường là đột biến nhiễm sắc thể gây nên những biến đổi hình thái quan sát rõ rệt trên nhiễm sắc thể khổng lồ. Điều này được sử dụng để lập bản đồ di truyền tế bào (cytogenetic map) mà không theo tần số tái tổ hợp do lai. Sự đối chiếu giữa bản đồ di truyền nhiễm sắc thể và bản đồ di truyền tế bào cho thấy có sự giống nhau về trình tự sắp xếp gen theo đường thẳng, tuy khoảng cách có khác nhau (do hiện tượng nhiễu). Điều này khẳng định thêm gen nằm trên nhiễm sắc thể.

Hinh 6.16 Ban đô di truyên nhiêm săc sô 10 cua băp

117

Hinh 6.17 Thê di hơp mât đoan nhiêm săc thê cua ruôi dâm đươc sư dung đê lâp ban đô di truyên

Hinh 6.18 Ban đô di truyên cua E.coli

118

* Đặc điểm chính của học thuyết di truyền nhiễm sắc thể - Các gen nằm trên nhiễm sắc thể sản xuất theo đường thẳng tạo thành các nhóm liên kết có số lượng bằng số cặp nhiễm sắc thể - Các gen cùng nằm trên một nhiễm sắc thể có sự di truyền liên kết và mức liên kết phụ thuộc vào khoảng cách giữa các gen - Giữa các nhiễm sắc thể tương đồng có thể xảy ra trao đổi chéo dẫn đến tái tổ hợp các gen. Tái tổ hợp là một nguồn biến dị quan trọng cung cấp nguyên liệu cho quá trình chọn lọc tự nhiên và chọn lọc nhân tạo. - Sự liên kết các gen và sự tái tổ hợp giữa chúng do trao đổi chéo là những hiện tượng sinh học trong đó biểu hiện sự thống nhất giữa tính biến dị và tính di truyền.

V. Nhiễm sắc thể người và bản đồ nhiễm sắc thể người
1. Nhiễm sắc thể người Năm 1956, J. H. Tjio và A. Levan mới xác định được chính xác số lượng nhiễm sắc thể của người là: 2n = 46. Sau đó nhờ kĩ thuật nhuộm màu bằng giemsa và quan sát hiển vi huỳnh quang mới phát hiện các vệt đặc trưng để xây dựng nên nhiễm sắc đồ. Sử dụng máu làm tiêu bản quan sát nhiễm sắc thể: Nuôi cấy tế bào bạch cầu máu ngoại vi của người bình thường và người mắc bệnh đã được áp dụng trong khoảng năm gần đây. Nhưng phương pháp này được ứng dụng rộng rãi nhất sau khi phát hiện được hợp chất polysacchyrid-protid lấy từ hạt cô ve dùng làm chất gây ngưng kết không đặc hiệu hồng cầu. Người ta dùng chất phytohemaglutinin này cùng với dung dịch nhược trương đã cho phép thu được kết quả của sự phân chia tế bào máu ngoại vi rất tốt. Phương pháp này đã được nhóm nghiên cứu của Moorhead sửa đổi và áp dụng. Cơ sở của phương pháp này là người ta trộn lẫn huyết thanh có lẫn bạch cầu vào môi trường dinh dưỡng với một tỷ lệ nhất định rồi cho thêm vào hỗn hợp đó chất phytohemaglutinin, sau đó cho vào lọ trung tính rồi nuôi cấy. Ngoài chất phytohemaglutinin chiết từ đậu cô ve còn nhiều chất khác cũng có tác dụng ngưng kết hồng cầu. Trong quá trình nuôi cấy bạch cầu cũng có thể tiến hành quan sát sự chuyển hóa các loại tế bào bạch cầu. Sự phân chia tế bào bạch cầu làm cơ sở cho nghiên cứu đặc điểm tế bào bạch cầu trong máu. Trên cơ sở nghiên cứu

119

tế bào máu bình thường và bệnh lý, có thể phát hiện ra trạng thái bệnh lý của tế bào bạch cầu ở người và động vật. 2. Kỹ thuật lai tế bào soma Đến giữa những năm 1960 chỉ mới xác định được một cách đáng tin cậy 3 nhóm liên kết (mỗi nhóm có 2 gen) trên nhiễm sắc thể thường và 4 gen trên nhiễm sắc thể X ở người, theo thống kê từ các phả hệ, nhưng chưa biết ở nhiễm sắc thể nào. Vào năm 1967, Mc Weiss và H. Green sử dụng kỹ thuật lai tế bào soma (somatic cell hybridisation) đã lần đầu tiên xác định được gen TK mã hóa cho enzyme thymidin kinase nằm trên nhiễm sắc thể 17. Các dòng tế bào soma của người và các động vật có vú, khi nuôi chung với sự hiện diện của virus Sendai có thể dung hợp hay lai với nhau. Các tế bào dung hợp này trong quá trình phân bào tiếp theo sẽ mất dần một số nhiễm sắc thể của tế bào cha mẹ. Ví dụ, tế bào người dung hợp với tế bào chuột, khi các tế bào phân chia, các nhiễm sắc thể của người bị mất nhanh. Sau khoảng 30 thế hệ tế bào, ở dòng tế bào lai giữa chuột nhắt và người còn lại toàn bộ nhiễm sắc thể của chuột và còn khoảng 7 nhiễm sắc thể của người ở một số tế bào chỉ còn 1-2 nhiễm sắc thể người. Sự xác định vị trí của một gen trên một nhiễm sắc thể nhất định được căn cứ vào sự tồn tại hay mất đi của gen đó khi đối chiếu với sự hiện diện hay văng mặt nhiễm sắc thể đó trong dòng tế bào. Kỹ thuật này đã giúp vượt qua khó khăn khi thống kê theo phả hệ và nhờ nó mà gần trăm gen được xác định vị trí trên 23 nhóm liên kết gen. Trong trường hợp gen TK, dòng tế bào chuột TK- được lai với tế bào người TK+. Sự dung hợp tạo tế bào lai chuột-người. Mặc dù phần lớn nhiễm sắc thể người bị loại mất nhanh trong các dòng tế bào lai, nhưng một số dòng còn một ít nhiễm sắc thể người. Khi các dòng tế bào này được nuôi trên các môi trường có chất aminopterin, các tế bào TK - sai hỏng hoạt tính thymidin kinase, không mọc được do mất khả năng chuyển hóa thymidine thành thymidylic acid cần cho tổng hợp ADN. Do vậy chỉ có tế bào lai có nhiễm sắc thể 17 này của người mới tạo được dòng ổn định. Chứng tỏ gen TK+ phải nằm trên nhiễm sắc thể này. Chứng cứ xác nhận thêm được thực

120

hiện bằng cách chọn các dòng trên môi trường có thêm chất bromodeoxyuridin riboside (BUDR) là chất đồng đẳng với nitrogenous base được chuyển hóa bởi thymidin kinase (TK+) gắn vào ADN làm tế bào chết. Hậu quả, nuôi trên môi trường có BUDR là các dòng tế bào sống được không có gen TK+ và tương ứng với điều đó, chúng không có nhiễm sắc thể 17 của người. Dựa vào phương pháp này, người ta lập bản đồ nhiễm sắc thể người trên cơ sở sự có mặt của một sản phẩm do một gen nào đó thì tương ứng với sự có mặt nhiễm sắc thể trong tế bào. - Điều kiện để thực hiện được việc lập bản đồ nhiễm sắc thể người nhờ phương pháp này + Tính trạng nghiên cứu được mã hóa bởi một gen trên nhiễm sắc thể của người, mà nó được phân biệt rõ ràng với tính trạng tương ứng của chuột. Ví dụ: Dòng tế bào người chứa Lactatdehydrgenase A đột biến, enzyme này phải được phân biệt với protein được mã hóa bởi một gen tương ứng của chuột (LDHA của người và chuột được phân biệt bằng phương pháp điện di). + Khả năng có thể xác định được nhiễm sắc thể của người còn lại ở dòng tế bào Ví dụ: gen LDHA của người được phát hiện trong các dòng tế bào lai mà trong đó chỉ còn lại độc nhất một nhiễm sắc thể. Đó là nhiễm sắc thể số 2. Chứng tỏ LDHA nằm trên nhiễm sắc thể số 2. Phần lớn các gen được xác định theo phương pháp trên liên quan đến các enzyme, mà việc phát hiện chúng căn cứ theo phản ứng do chúng xúc tác. Về sau một số thủ thuật khác được sử dụng như dùng các "mất đoạn" để xác định vị trí gen. - Xác định nhóm liên kết của các gen bệnh Dựa vào các nhóm liên kết gen đã được xác định bằng lai tế bào soma, nhiều gen bệnh được gắn vào các nhiễm sắc thể. Việc xác định này căn cứ theo nhiều phả hệ của các gia đình có các bệnh di truyền. Gần đây (1993) vài bệnh di truyền được xác định bằng cách sử dụng gen dự tuyển (canđiate gene approach). Một trong các ví dụ là các đột biến của gen fibrillin gây hội chứng Marfan. Gen gây hội chứng Marfan được lập

121

bản đồ ở nhóm liên kết 15, ngay giưa vai dài của nhiễm sắc thể. Gen mã hóa cho fibrillin cũng có vị trí tương tự khi sử dụng phương pháp FISH (fluorescent in situ hybridization - phát hiện bằng huỳnh quang khi lai tại chỗ).

Câu hỏi ôn tập
1. Cơ chế xác định giới tính ở người và động vật. 2. Đặc điểm của sự di truyền liên kết với giới tính. 3. Cơ sở của sự hình thành các nhiễm sắc thể tái tổ hợp. 4. Nêu ứng dụng của sự di truyền liên kết với giới tính. 5. Chứng minh trao đổi chéo xảy ra ở giai đoạn 4 chromatid. 6. Cơ sở tế bào học của trao đổi chéo. 7. So sánh quy luật di truyền liên kết hoàn toàn và quy luật hoán vị gen. 8. Di truyền học Morgan đã bổ sung cho di truyền học Mendel như thế nào?

Tài liệu tham khảo
Trịnh Văn Bảo, Phan Thị Hoan, Trần Thị Thanh Hương, Trần Thị liên, Trần Đức Phấn, Phạm Đức Phùng, Nguyễn Văn Rực, Nguyễn Thị Trang. 2002. Các nguyên lý sinh học. NXB Y học Hà Nội. Phạm Thành Hổ (2000). Di truyền học. NXB Giáo Dục. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (1998). Cơ sở di truyền học. NXB Giáo Dục. Hoàng Trọng Phán (1995). Di truyền học phân tử. Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế. Anthony J. F. Griffiths, Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin, William M. Gelbart, David T. Suzuki, Jeffrey H. Miller. 2004. An introduction to genetics analysis. W.H. Freeman Publishers. Harlt D.L., Jones E.W. (1998). Genetics - Principle and analysis. Jone and Bartlett Publshers. Toronto, Canada. Stansfield W.D. 1991. Schaum’s outline of theory and problems of genetics. McGraw-Hill, Inc., New York.

122

Chương 7

Di truyền học Vi khuân
Mục tiêu của chương
Giới thiệu cac hiện tương di truyền ơ vi khuẩn, sư chuyên vi va cơ sơ di truyền tinh khang thuôc cua cac vi khuẩn gây bệnh.

Số tiết: 3 Nội dung I. Ưu thế và các đặc điểm của đối tượng vi sinh vật
1. Thời gian thế hệ ngắn, tốc độ sinh sản nhanh Trong điều kiện thuận lợi, tế bào E.coli có thể phân chia 1 lần trong 20 phút, còn bacteriophage trong thời gian 30-40 phút có thể tạo ra hàng trăm cá thể, nấm men có thể chia tế bào trong 2 giờ. Đặc điểm nghiên cứu di truyền học là theo dõi qua nhiều thế hệ nên các đối tượng vi sinh vật giúp rút ngắn đáng kể thời gian thí nghiệm. Nếu so sánh thời gian thế hệ của ruồi giấm (2 tuần), của chuột (2 tháng), của người (20 năm) thì các vi sinh vật ưu thế hơn hắn. 2. Có sự tăng vọt số lượng cá thể Trong điều kiện đủ dinh dưỡng các vi sinh vật sinh sản nhanh tạo quần thể có số lượng cá thể đủ lớn, có thể có số lượng 1010 -10 12 tế bào.. Tế bào E.coli có đường kính 1 µm nếu đủ dinh dưỡng thì trong 44 giờ có thể tạo sinh khối bằng quả đất. Ruồi dấm là đối tượng thuận lợi cho nghiên cứu di truyền học quần thể, nhưng cũng chỉ đạt 105 - 106 cá thể. Nhờ số lượng cá thể lớn có thể phát hiện được các sự kiện di truyền hiếm hoi với tần số 10 -810-11. Như vậy số lượng cá thể lớn sẽ giúp nâng cao năng suất phân giải di truyền tức khả năng phát hiện các đột biến và tái tổ hợp có tần số xuất hiện rất nhỏ.

123 123

Ngoài ra việc nuôi cấy vi sinh vật không cồng kềnh, ít tốn diện tích, môi trường nuôi cấy dễ kiểm soát theo các công thức chặt chẽ. 3. Có cấu tạo bộ máy di truyền đơn giản Ở vi sinh vật có cấu tạo bộ máy di truyền là DNA trần, dễ tiến hành thí nghiệm trực tiếp trên DNA cũng như dễ chiết tách, tinh sạch, số locus cũng ít hơn so với các sinh vật khác. Các vi nấm và vi tảo có thể tồn tại ở dạng đơn bội (n) với thời gian dài trong chu trình sống nên các gen lặn có thể được biểu hiện ra ở kiểu hình. Ngoài ra các vi sinh vật kể trên còn có trạng thái lưỡng bội (2n) nên cũng dễ dàng thực hiện phân tích tái tổ hợp. Các tính trạng ở vi sinh vật đơn giản. Đối với các tính trạng sinh hóa hay tính đề kháng dễ sử dụng môi trường chọn lọc để phát hiện. 4. Dễ nghiên cứu bằng các kỹ thuật vật lý và hóa học Đa số các vi sinh vật có cấu tạo đơn bào nên quần thể của chúng có độ đồng nhất cao hơn so với các sinh vật có bộ máy đa bào bắt nguồn từ nhiều loại mô khác nhau. Cấu tạo tế bào vi sinh vật đơn giản, dễ chết tách tinh sạch DNA Có thể nuôi vi sinh vật đồng nhất tức đa số các tế bào ở những giai đoạn phát triển gần giống nhau. Ví dụ: nấm men nuôi trên môi trường có bổ sung acetat, tất cả các tế bào nấm men đều tạo bào tử. Tảo Chlorella khi nuôi trong tối 18-19 giờ, tất cả chúng đều thực hiện phân chia giảm nhiễm.

II. Đặc điểm của di truyền vi sinh vật
- Khuẩn lạc (dòng tế bào) là 1 cụm tế bào có nguồn gốc từ 1 tế bào ban đầu - Chủng: dòng tế bào mang 1 đặc điểm di truyền nào đó. Các đột biến ở vi sinh vật thường được phát hiện theo sự biến đổi các tính trạng sau: - Hình thái: kích thước, hình dạng tế bào hay khuẩn lạc, có màng nhân hay không...

124 124

- Sinh hóa: sự hiện diện của các sắc tố, màu sắc đặc trưng... - Nuôi cấy: kiểu hô hấp, kiểu dinh dưỡng, nhu cấu đòi các nhân tố tăng trưởng... - Tính đề kháng: kháng thuốc, kháng phage, chịu nhiệt... - Miễn nhiễm: phản ứng kháng nguyên, kháng thể... Các đột biến có thể xuất hiện ngẫu nhiên hay do gây tạo nhờ các tác nhân gây đột biến. Mỗi gen có tần số đột biến đặc trưng. Đặc điểm của tái tổ hợp ở vi khuẩn: Các sinh vật Prokaryote như vi khuẩn, virus có quá trình sinh sản tương đương sinh sản hữu tính gọi là quá trình sinh sản cận hữu tính (parasexuality), quá trình này có các đặc điểm: - Sự truyền thông tin một chiều từ tế bào thể cho sang tế bào thể nhận. - Sự tạo thành hợp tử một phần (merozygote). Tế bào thể cho (donor) chuyển một đoạn của bộ gen sang tế bào thể nhận (recipient), nên chỉ lưỡng bội một phần, còn các phần khác đơn bội. - Bộ gen thường chỉ là DNA trần, nên chỉ có một nhóm liên kết gen và tái tổ hợp thực chất là lai phân tử.

III. Sinh học của vi khuẩn
1. Cấu tạo tế bào và sinh sản: Tế bào E.coli có chiều dài khoảng 2 µm. Bên ngoài có vách tế bào, kề trong là màng sinh chất. Mezosome là cấu trúc xếp lại của màng sinh chất có thể liên quan đến phân bào chất di truyền tạo nên nucleotid. Các tiêm mao giúp cho sự vận động của tế bào. Thông tin của tế bào vi khuẩn nằm trên một phân tử DNA mạch kép vòng tròn đơn được gọi là genophore, hay "NST". Gần đây đã phát hiện thấy rằng ít nhất ở một số vi khuẩn DNA tạo thành phức hợp với protein có tính base để hình thành sợi nhiễm sắc như histon ở NST Eukaryote. Ngoài ra ở một số vi khuẩn còn có thêm plasmid là phân tử DNA vòng tròn nhỏ có khả năng sao chép độc lập.

125 125

Phân tử DNA gắn trực tiếp vào màng sinh chất. Sự sao chép DNA tạo ra 2 bản sao gắn chung nhau trên màng sinh chất. Khi tế bào kéo dài ra các bản sao DNA tách xa nhau do phần màng giữa chúng lớn dần ra. Kiểu sinh sản vô tính này được gọi là ngắt đôi (Binary fission). Tế bào vi khuẩn chia nhanh hơn rất nhiều so với tế bào Eukaryote. Quá trình sao chép DNA được bắt đầu từ điểm xuất phát Ori kéo dài về 2 phiasong song với quá trình kéo dài màng sinh chất, nơi có điểm gắn vào của DNA bộ gen, mọc dài tách 2 phân tử DNA về 2 tế bào con.

Hình 7.1 tế bào vi khuẩn E. coli

126 126

Hình 7.2 Tế bào vi khuẩn phân chia theo trực phân.

2. Đặc điểm nuôi cấy Tế bào vi khuẩn có thể nuôi trên môi trường lỏng có bổ sung các muối vô cơ thiết yếu. Mật độ có thể đạt 109 tế bào/ml. Có thể nuôi vi khuẩn trong môi trường rắn có agar trong các hộp petri để từng tế bào mọc thành khuẩn lạc dễ quan sát.

IV. Biến nạp ( Transformation)
1. Hiện tượng và điều kiện - Định nghĩa: biến nạp là hiện tượng truyền thông tin di truyền bằng DNA.

127 127

Hinh 7.3 Biên nap cua vi khuân

Trong biến nạp DNA trần từ một tế bào vi khuẩn thể cho này được truyền sang tế bào vi khuẩn thể nhận khác. Khi tế bào vi khuẩn bị vỡ do làm tan, DNA vòng tròn của chúng thoát ra môi trường thành các đoạn thẳng với chiều dài khác nhau có khả năng gây biến nạp cho các tế bào thể nhận khác. Hiện tượng biến nạp được nghiên cứu nhiều ở các đối tượng: Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Haemophilus parainfluenzae - Điều kiện thực hiện biến nạp: Hiệu quả của biến nạp phụ thuộc vào 3 yếu tố: + Tính dung nạp của tế bào thể nhận. Những tế bào dung nạp trên bề mặt có các nhân tố dung nạp. Người ta có thể tạo khả năng dung nạp của tế bào thể nhận bằng một số xử lý. Ví dụ: Streptococcus pneumoniae: 30 - 80 điểm nhận Haemophilus influenzae: 4-8 điểm nhận + DNA thực hiện biến nạp của thể cho phải ở dạng mạch kép, nếu DNA bị biến tính ở dạng mạch đơn riêng lẻ không cho hiệu quả biến nạp. Thường DNA biến nạp là một đoạn nhỏ. Ở vi khuẩn E.coli đoạn DNA biến nạp khoảng 1/250 - 1/500 genom của vi khuẩn. Đoạn từ tế bào cho xâm nhập vào tế bào nhận được gọi là đoạn ngoại lai (exogenote), DNA nguyên vẹn của tế bào nhậ được gọi là đoạn nội tại (endogenote). Tế bào vi khuẩn nhận đoạn ngoại lai sẽ lưỡng bội ở một phần bộ gen được gọi là hợp tử từng phần (merozygote). Tuy nhiên, đoạn ngoại lai mạch đơn không bền vững và bị phân hủy nếu không được gắn vào bộ gen thể nhận. Quá trình trao đổi thông tin di truyền bằng chuyển chỉ một phần vật liệu di truyền từ tế bào này sang tế bào khác được gọi là sự giao nạp từng phần (meromixis). 2. Cơ chế biến nạp 2.1. Xâm nhập của DNA Ở giai đoạn này, DNA có thể gắn với điểm nhận của màng tế bào.Quá trình gắn này có thể là thuận nghịch, nó có thể gắn vào rồi nhả ra.

128 128

Sợi DNA mạch kép của dòng vi khuẩn S sau khi chui qua màng tế bào của dòng vi khuẩn R thì một mạch của S sẽ bị nuclease của tế bào cắt, còn lại một mạch nguyên.

129 129

Hinh 7.4 Cơ chê biên nap tư nhiên

2.2. Bắt cặp DNA của thể nhận R sẽ biến tính tách rời 2 mạch ở một đoạn để bắt cặp với đoạn DNA thể cho S vừa chui vào. Đoạn DNA của R ở đoạn có DNA của S bắt cặp sẽ bị cắt đứt và đẩy ra. Trong quá trình bắt cặp, có những đoạn không tương đồng thì sẽ hình thành nên những vòng lồi, những đoạn đó gọi là Heteroduplex. Còn các đoạn bắt cặp tương đồng gọi là Homoduplex. 2.3. Sao chép Sau khi bắt cặp sẽ tạo phân tử DNA có đoạn lai R-S, tiến hành sao chép để tạo ra hai sợi kép: một sợi kép R-R và một sợi kép khác có mang đoạn DNA thể nhận S-S.

130 130

Hình 7.5 Sơ đồ các giai đoạn biến nạp

V. Tải nạp (Transduction)
1. Phage là nhân tố chuyển gen Thí nghiệm được tiến hành trong ống hình chữ U. Giữa hai ống của hình chữ U được ngăn cách bằng màng lọc vi khuẩn, màng có lỗ nhỏ vi khuẩn không qua được nhưng phage qua được. Nhánh A của ống chứa vi khuẩn có khả năng tổng hợp tryptophan (trp+), còn nhánh B nuôi các vi khuẩn khác mất khả năng tổng hợp tryptophan (trp-). Sau khi nuôi một thời gian, ở nhánh B xuất hiện vi khuẩn có khả năng tổng hợp tryptophan. Nếu dùng màng ngăn không cho virus lọt qua thì không thấy hiện tượng này. Qua nhiều lần thí nghiệm, việc tải gen trp+ từ nhánh A sang nhánh B được chứng minh.

131 131

Hình 7.6 Thí nghiệm chứng minh hiện tượng tải nạp

2. cơ chế Quá trình xâm nhiễm của phage vào vi khuẩn xảy ra như sau: Tải nạp chuyển gen từ vi khuẩn A sang B nhờ phage Đầu tiên các phage bám trên bề mặt vi khuẩn. Sau 4’, phage bơm DNA của nó vào tế bào. Sau đó chúng sinh sản và khoảng 1/2 giờ sau thì chúng làm tan các tế bào vi khuẩn và giải phóng các phage mới. Khi DNA của phage xâm nhập vào tế bào vi khuẩn A, chúng cắt DNA của vi khuẩn A thành nhiều đoạn đồng thời DNA của phage được sao chép ra nhiều phân tử con và các vỏ phage cũng được tạo thành. Sau đó các vỏ lắp ruột DNA vào, phá vỡ tế bào vi khuẩn ra ngoài và tiếp tục xâm nhiễm vào các tế bào vi khuẩn khác. Trong quá trình lắp ráp khoảng 1-2% phage vô tình mang đoạn DNA của vi khuẩn có chứa gen. Phage mang gen vi khuẩn A xâm nhiễm vi khuẩn B, quá trình tái tổ hợp xảy ra làm gen vi khuẩn A gắn vào bộ gen vi khuẩn B.

132 132

Hinh 7.7 Chuyên gen tư vi khuân cho sang vi khuân nhân nhơ phage

3. Phân biệt các dạng tải nạp - Tải nạp chung (general transduction): phage mang bất kỳ gen nào của vi khuẩn A sang vi khuẩn B. Tải nạp chung có đặc điểm: + Bất kỳ gen nào của vi khuẩn cũng đều được tải nạp + Tải nạp do gói nhầm DNA của tế bào chủ khi phage trưởng thành + Các thể tái hợp đơn bội được tạo ra - Tải nạp chuyên biệt (Special transduction) hay tải nạp hạn chế: là quá trình tải nạp chỉ chuyển một vài gen nhất định, nó có 4 đặc điểm: + Những gen được chuyển nằm sát chỗ phage gắn vào + Chỉ prophage kiểu λ thực hiện + Do kết quả sự cắt sai của prophage khi tách khỏi NST của tế bào chủ Ví dụ: phage λ (kí sinh trên E.coli) chỉ chuyển gen gal (đồng hóa đường galactose) từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác. Điểm gắn của phage λ vào bộ gen của vi khuẩn nằm giữa 2 gen gal (galactose) và bio (tổng hợp biotin). Đầu của phage chỉ có thể chứa một lượng DNA giới hạn, nên khi prophage tách ra từ DNA của vi khuẩn nó chỉ tải nạp được gen gal hoặc bio. Sự cắt sai của phage λ rất hiếm nên tải nạp hạn chế có tần số thấp.

133 133

Hình 7.8 Tải nạp chuyên biệt

VI. Giao nạp (Conjugation)
- Định nghĩa: giao nạp là hiện tượng truyền vật chất di truyền từ tế bào thể cho sang thể nhận qua cầu tế bào chất

134 134

Hình 7.9 Sơ đô lai vi khuân

1. Chứng minh có lai ở vi khuẩn Vào năm 1946, J. Lederberg và E. Tatum sử dụng các dòng đột biến khuyết dưỡng khác nhau: -Dòng A: có kiểu gen met-bio-thr+leu+thi+ (có khả năng tổng hợp threonin, leucine, thiamin không có khả năng tổng hợp methionin và biotin) - Dòng B: có kiểu gen met+bio+thr-leu-thi- (có khả năng tổng hợp methionin, biotion nhưng không có khả năng tổng hợp threonin, leucine, thiamin) Từng dòng riêng rẻ khi cấy lên môi trường tối thiểu thì không có khả năng mọc lên khuẩn lạc. Trộn chung hai dòng này trong ống nghiệm, cấy lên môi trường tối thiểu. Các khuẩn lạc mọc trên môi trường tối thiểu, chứng tỏ có các dạng lai, chúng mọc được nhờ sự bù đắp cho nhau nhu cầu dinh dưỡng. Các dạng lai có kiểu gen met+bio+thr+leu+thi+. 2. Sự phân hóa giới tính ở vi khuẩn 1953, Hayes đã phát hiện ra ở vi khuẩn có các dạng khác nhau tương tự giống đực và cái ở sinh vật bậc cao. Các dạng đó được kí hiệu là tế bào F +

135 135

và tế bào F- . F+ tương tự giống đực ở sinh vật bặc cao, nó truyền sạng F-. Tần số lai F+ với F- khoảng 10-6. Khi F+ tiếp xúc với F- một thời gian, F- biến thành F+ do nó nhận được một phần tử di truyền là episome. Episome F+ là phần tử di truyền ngoài NST, có thể tồn tại hoặc ở dạng DNA vòng tròn tự sao chép hoặc gắn vào phân tử DNA của tế bào chủ. Episome F+ được gọi là nhân tố giới tính. Về sau dạng Hfr (high frequency ò recombination) được phát hiện, dạng này có tần số lai với F- cao hơn F+ có thể đến 104 lần.

Hình 7.10 Sơ đô câu tao cua plasmid

Plasmid được định nghĩa là phân tử DNA vòng tròn nhỏ có khả năng sao chép độc lập với tế bào chủ và không có khả năng gắn vào NST tế bào chủ. Plasmid có thể mang một số gen khác nhau. Hiện nay plasmid được dùng cho cả 2 nghĩa là episome và plasmid. Plasmid có thể tồn tại độc lập hoặc gắn vào bộ gen vi khuẩn. Bản chất di truyền của các dòng F-, F+ và Hfr được xác định do các plasmid như sau: F- không chứa plasmid F+ chứa plasmid ở dạng độc lập Hfr có plasmid gắn vào bộ gen

136 136

Hinh 7.11. Sư găn cua plasmid vao nhiêm săc thê vi khuân tao vi khuân Hfr

- Tai tô hơp giưa môt trinh tư IS trên plasmid va trinh tư IS cung loai trên nhiêm săc thê cua vi khuẩn tao ra nhiêm săc thê Hfr - Tai tô hơp xay ra giưa IS bât ky trên plasmid với IS bât ky tương ưng trên nhiêm săc thê cua vi khuẩn tao ra nhiều chung Hfr khac nhau 3. Các nhân tố F' và tính nạp (Sexduction)

137 137

Sự cắt rời nhân tố F từ NST của dòng Hfr nhiều khi không chính xác và lúc này một đoạn bộ gen của vi khuẩn thay thế cho một phần của F. Trong trường hợp này nhân tố F' được hình thành và nó có thể chuyển gen của vi khuẩn một cách độc lập với các tính trạng của tế bào thể cho. Hiện tượng này còn gọi là tính nạp, nghĩa là sự chuyển gen kèm theo nhân tố giới tính. Nhờ tính nạp mà có thể nhận được những thể lưỡng bội từng phần (merodiploid) theo các gen được gắn vào F+. 4. Cơ chế tái tổ hợp Khi có sự tiếp xúc giữa hai loại tế bào khác dấu như Hrf và F - hoặc F+ và F-. Dòng tế bào mang nhân tố F+ được coi là tế bào đực có khả năng tạo protein pilin, từ protein này tạo ống giao nạp gọi là pilus. Sự co lại của pilus nối 2 tế bào làm chúng gần nhau. Tế bào F- được coi là tế bào cái, sau khi giao nạp tế bào F- trở thành tế bào F+. Việc chuyển gen chỉ thực hiện khi plasmid gắn vào bộ gen của vi khuẩn. Trong quá trình chuyển vật chất di truyền sang F- thì DNA của tế bào chủ sao chép và mạch mới có Ori đi đầu và F đi cuối. Quá trình chuyển DNA từ F+ sang F- có thể bị ngắt quãng. Các gen a, b, c được chuyển một chiều từ Hfr sang F-. Dòng Hfr có tần số lai cao hơn nhiều vì plasmid đã nằm sẵn trong bộ gen. Còn F+ phải qua giai đoạn plasmid gắn vào bộ gen rồi mới chuyển gen.

138 138

Hinh 7.12 Thi nghiêm giao nap đê lâp ban đô do ngăt quang ơ cac khoang thơi gian khac nhau.

Sự truyền DNA từ tế bào thể cho sang tế bào thể nhân Trong điều kiện thí nghiệm ở 370C, nguyên bộ gen của tế bào E.coli được chuyển sang tế bào nhận trong vòng 90 phút. Thường sự giao nạp bị ngắt quãng giữa chừng do cầu pilus bị gãy, lúc đó tế bào F- vẫn là tế bào F-. Bằng cách ngắt quãng quá trình giao nạp mà bản đồ di truyền của E.coli được xây dựng nên có dạng vòng tròn.

VII. Cơ sở di truyền tính kháng thuốc của các vi khuẩn gây bệnh ở người. Ý nghĩa của các transposon vi khuẩn

139 139

Các transposon ở vi khuẩn là những yếu tố làm thay đổi vị trí gen, kiểm soát tính kháng thuốc đối với thuốc kháng sinh và các thuốc chống vi khuẩn khác. Chúng có thể dễ dàng truyền từ tế bào này sang tế bào khác. Ngay sau đó, người ta đã xác định là các gen kháng thuốc thường có trong plasmid. Các plasmid có thể được truyền từ tế bào mẹ sang tế bào con khi tế bào vừa phân chia. Trong điều kiện thực nghiệm cho thấy 100% quần thể tế bào nhạy cảm thuốc đều có thể trở thành kháng thuốc sau thời gian 1 giờ được trộn với vi khuẩn kháng thuốc. Các gen kháng thuốc có thể được truyền từ plasmid cho NST vi khuẩn, cho virus và cả cho vi khuẩn các loài khác. Mọi plasmid R đều có tối thiểu 2 thành phần: - Một đoạn mang gen về truyền AD tiếp hợp (tương tự như transposon của plasmid F) - Một đoạn mang gen kháng thuốc Đoạn thứ nhất gọi là yếu tố làm vật truyền tính kháng (RTF Resistance transfer vector). Đoạn thứ hai mang gen kháng được gọi là yếu tố kháng R (R - determinant). Ở một số plasmid R, yếu tố kháng R được cài giữa các đoạn xen IS. Trong nhiều trường hợp chúng làm cho yếu tố kháng vận động từ plasmid R này sang plasmid R khác. Các đoạn IS thúc đẩy sự tiến hóa nhanh của các plasmid vi khuẩn ngày càng mang nhiều yếu tố kháng thuốc. Không phải những plasmid này chỉ được truyền đi trong phạm vi một loài vi khuẩn. Mà chúng còn được truyền qua các loài và cả các dòng di truyền khác nhau của vi khuẩn. Ví dụ: plasmid R của E.coli đã được phát hiện ở một số giống như proteus, Samonella, Haemophilus, Pastugella... Tất cả các loài này đều là loài gây bệnh. Ngày nay người ta thấy tần số tăng lên rõ rệt của các vi khuẩn mang plasmid R với yếu tố kháng R có sức kháng ghê gớm với các thuốc kháng sinh: penicylin, tetracylin, streptomycin và kanamycin. Các nghiên cứu ở Nhật Bản cho biết trong vòng 10 năm trở lại đây, quần thể vi khuẩn tự nhiên (trong cống, rãnh, hồ, ao bị ô nhiễm) tăng hẳn lên, từ tần số thấp là dưới 1% plasmid R có sự kháng thuốc lên đến tần số cao là 50-80%.

140 140

Các kết quả nêu trên cho thấy, cần hạn chế và lưu ý chỉ sử dụng kháng sinh khi có nhiễm trùng và không nên lạm dụng đối với các trường hợp nhẹ. Nếu không hạn chế thì trong tươpng lai thuốc sẽ giảm hiệu quả hoặc không còn hiệu quả. Tính kháng thuốc ngày nay đã được phát hiện trong nhiều loại gen gây bệnh như gen thương hàn, viêm dạ dày, ruột, dịch hạch, sốt cao, viêm màng não, lậu ...

Câu hỏi ôn tập 1. Phân biệt các nòi vi khuẩn F+, F- và Hfr ở E. coli
2. Trình bày cơ chế biến nạp 3. Phân biệt tải nạp chung và tải nạp đặc hiệu. 4. So sánh biến nạp và tải nạp. 5. Thể tái tổ hợp các gen khác nhau theo thời gian xảy ra trong giao nạp như thế nào? 6. Đặc điểm của tái tổ hợp ở vi khuẩn.

7. Tế bào F- hình thành tế bào F+ và tế bào Hfr như thế nào? Tài liệu Tham khảo
Phạm Thành Hổ. 2000. Di truyền học. NXB Giáo Dục. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (1998). Cơ sở di truyền học. NXB Giáo dục. Hoàng Trọng Phán. 1995. Di truyền học phân tử. Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế Anthony J. F. Griffiths, Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin, William M. Gelbart, David T. Suzuki, Jeffrey H. Miller. 2004. An introduction to genetics analysis. W.H. Freeman Publishers. Cann AJ. 2001. Priciple of molecular virolory. Academic Press. London, UK. Flint SJ, Enquist LW, Krug RM, Racaniello VR, Skalka AM. 2000. Principles of Virology. Molecular Biology, Pathogenesis, and Control. ASM Press, Washington DC. Printed in the United States of America.

141 141

Harlt D.L., Jones E.W. 1998. Genetics - Principle and analysis. Jone and Bartlett Publshers, Toronto, Canada. Hartwell et al. 2003. Genetics: From genes to genomes, Second editor. The McGraw-Hill Companies. Old RW & Primrose SB. 1989. Principles of gene manipulation. Blackwell Scientific Publication. Stansfield W.D. 1991. Schaum’s outline of theory and problems of genetics. McGraw-Hill, Companies, Inc., United States of America. Watson D.J, Baker T.A., Bell S.P., Gann A., Levine M., Losick R. 2004. Molecular biology of the gene. Benjamine Cummings, San Francisco, United States of America.

142 142

Chương 8

Di truyền học Virus
Mục tiêu của chương
Giới thiệu sự di truyền của thực khuẩn thể, nghiên cứu sự sắp xếp các gen, các đặc tính của virus và, trên cơ sở bản chất của genome của virus đã xác định kiểu sao chép.

Số tiết: 3 Nội dung I. Di truyền học thể thực khuẩn (Bacteriophage hay phage)
1. Sự hình thành vết tan và các thể đột biến phage Phage được phát hiện dễ dàng vì trong chu trình tan, một tế bào bị nhiễm phage vỡ ra và giải phóng các hạt phage vào môi trường (Hình 8.1). Sự tạo thành các đốm đã được quan sát. Một số lớn tế bào vi khuẩn (khoảng 108 tế bào) được trãi lên trên môi trường đặc. Sau một thời gian sinh trưởng, tạo một lớp tế bào vi khuẩn màu trắng đục. Nếu phage có mặt ở thời điểm vi khuẩn được trãi lên môi trường, nó sẽ nhiễm vào tế bào vi khuẩn. Sau đó tế bào nhiễm phage bị làm tan và giải phóng nhiều phage mới. Thế hệ sau này của phage lại nhiễm vào vi khuẩn gần đó, và tham gia vào chu trình tan khác, các vi khuẩn này bị vỡ giải phóng ra nhiều phage, chúng có thể nhiễm vào các vi khuẩn khác ở vùng lân cận. Chu trình xâm nhiễm của phage được tiếp tục và sau nhiều giờ, phage phá huỷ tất cả các tế bào vi khuẩn của một vùng, tạo đốm (plage) trong suốt khác với lớp tế bào vi khuẩn màu trắng đục.

142

Tế bào không bị xâm nhiễm

Phân hủy tế bào chủ

Phage hấp phụ lên tế bào chủ
Phage tự do

Phage lắp ghép bên trong tế bào chủ

Chu trình sinh tan
Nucleic acid của phage Phage protein

Vật chất di truền tế bào chủ bị phá hủy

Nucleic acid của phage xâm nhập vào tế bào

Protein của phage được tổng hợp, acid nucleic được nhân lên, vật chất di truyền tế bào chủ bị phá hủy

Hình 8.1. Chu trình sinh tan của bacteriophage

Hình 8.2. Sự xâm nhập của phage vào tế bào vật chủ theo cả 2 dạng bố mẹ đồng thời. r+: đốm nhỏ, r-: đốm lớn, h+: đốm mờ, h-: đốm trong

143

Phage chỉ có thể được nhân lên chỉ khi sinh trưởng trong tế bào vi khuẩn, vì vậy làm cạn nguồn dinh dưỡng trong môi trường sinh trưởng, làm hạn chế sự nhân lên của phage và kích thước của đốm. Vì mỗi đốm là kết quả của sự nhiễm một hạt phage ban đầu, có thể đếm được số lượng các đốm riêng biệt có trên môi trường (Hình 8.2). Kiểu gene của các thể đột biến phage có thể được xác định nhờ nghiên cứu các đốm. Trong một số trường hợp, sự xuất hiện của các đốm là đầy đủ. Chẳng hạn, đột biến phage làm giảm số lượng phage thế hệ sau từ những tế bào bị nhiễm thường tạo đốm nhỏ hơn. Các đốm lớn có thể được tạo ra bởi các đột biến gây ra sự tan sớm các tế bào bị nhiễm, nên mỗi đốm đó tiếp tục nhiễm nhanh hơn. Kiểu đột biến khác của phage có thể được xác định bởi phage có khả năng hoặc không có khả năng tạo đốm trên những chủng vi khuẩn đặc biệt. 2. Tái tổ hợp di truyền trong một chu kỳ sinh tan (Lytic cycle) 2.1. Chu trình tan (Lytic cycle)

Hinh 8.3 Sư kêt hơp đâu va đuôi đê tao phage hoan chinh

144

Các bacteriophage làm chết tế bào chủ gọi là độc, chúng sinh sản theo chu trình tan. Chu trình bắt đầu khi sợi đuôi của phage gắn vào điểm nhận bề bề ngoài của E.coli. Ống đuôi co lại tạo lỗ thủng xuyên vách tế bào và bơm DNA của nó vào. Capside của phage còn lại bên ngoài tế bào. Sau khi bị nhiễm ở các tế bào E.coli có quá trình phiên mã và dịch mã các gen của virus. Phage T4 có khoảng 100 gen và phần lớn đã được biết rõ. Một trong những enzyme được tạo ra đầu tiên cắt DNA của tế bào chủ. DNA của phage được phiên mã đầu tiên nhờ DNA polymerase của tế bào chủ tạo ra mARN sớm. Các mARN muộn hơn có thể được tổng hợp bởi ARN polymerase của phage hoặc ARN polymerase của vi khuẩn bị biến đổi để phiên mã các gen của phage. Các mARN muộn được dịch mã tạo các loại protein enzyme điều hòa và cấu trúc. Các protein điều hòa của phage kiểm soát sự phiên mã nối tiếp của các gen. Khi DNA của tế bào chủ bị phân hủy, bộ gen của phage kiểm soát toàn bộ hoạt động của tế bào để tạo ra các cấu phần của nó. DNA của phage được sao chép ra hàng trăm bản sao. Các protein của capsid được tổng hợp thành 3 phần riêng: đầu, ống đuôi và các sợi đuôi. Chúng tự ráp với nhau thành các virion con. Phage hoàn tất chu trình khi enzyme lysozyme được tạo ra để tiêu hóa vách tế bào vi khuẩn. Tế bào vi khuẩn bị vỡ, 100-200 virion thoát ra và chúng có thể lặp lại chu trình mới. Toàn bộ chu trình từ lúc phage tiếp xúc đến tan diễn ra trong khoảng 20-30 phút ở 370C. Trong thời gian đó số lượng phage T4 tăng hơn cả 100 lần, trong khi đó số lượng tế bào E.coli mọc nhanh nhất cũng chỉ tăng gấp đôi. Phần lớn các phage độc theo chu trình vừa nêu trên. Tuy nhiên có một số ngoại lệ như phage sợi M13 của E.coli hầu như không bao giờ làm chết hoặc làm tan tế bào. Các tế bào vi khuẩn và các phage kí sinh có sự đồng tiến hóa. Các tế bào vi khuẩn có các cơ chế bảo vệ như biến đổi màng tế bào để phage không bám vào được hoặc các enzyme cắt hạn chế cắt DNA của phage. Phage cũng biến đổi để xâm nhập được vào tế bào vi khuẩn. Các phage tuy có kích thước nhỏ bé phải nhìn dưới kính hiển vi điện tử mới thấy được. Nhưng các tính trạng của phage được quan sát dựa theo các vết tan hoặc biên độ chủ. Cho hai dòng phage T4 có kiểu gene khác nhau nhiễm vào một tế bào vi khuẩn E.coli, một vài phage thế hệ sau sẽ thực hiện 145

tái tổ hợp di truyền. Allele r- tan nhanh, kết quả tạo ra đốm lớn, allele hnhiễm vào các tế bào chủ, kết quả tạo đốm trong. Phép lai như sau: r-h+ × r+hKết quả thu được bốn kiểu đốm. Hai kiểu đốm đục, lớn và đốm trong, nhỏ tương ứng với kiểu hình của phage bố mẹ. Hai kiểu hình khác, đốm trong lớn, đốm mờ nhỏ là dạng tái tổ hợp tương ứng kiểu gene r-h- và r+h+. Khi nhiều vi khuẩn bị nhiễm số dạng tái tổ hợp thuận nghịch thường được tìm thấy trong số các phage ở thế hệ sau. Trong thí nghiệm, mỗi kiểu gene trong số bốn kiểu gene trên sinh ra kiểu hình khác nhau về dạng đốm (Hình 8.2). Số lượng kiểu gene có thể xác định được bằng kiểm tra các đốm tạo thành. Tần số tái tổ hợp, được biểu diễn dưới dạng phần trăm, được xác định như sau: Tần số tái tổ hợp = S äú phagetaïitäø håüp × 100 Täøngäú s phage

3. Sự sắp xếp của các gene trong nhiễm sắc thể phage Tần số tái tổ hợp có thể được sử dụng để xác định khoảng cách của bản đồ ở Eukaryote. Các thí nghiệm lập bản đồ cho thấy đột biến ở T4 được lập bản đồ thành 3 cụm riêng biệt. Cả ba cụm này có liên kết với một cụm khác. George Streisinger và cộng sự (1964) đã chứng minh bản đồ di truyền của phage T4 có dạng vòng tròn. Trong mỗi phép lai, lập ba đến bốn marker di truyền lần lượt với mỗi nhóm và tiến hành qua toàn bộ genome của T4. Nhiều gene khác đã được xác định và lập bản đồ đầy đủ trên phân tử vòng tròn (Hình 8.3). Những vùng ở vòng tròn bên trong là 3 cụm của marker T4 đã được xác định và lập bản đồ di truyền. Vòng ngoài có mặt của nhiều bộ marker lớn tạo thành toàn bộ vòng tròn của bản đồ di truyền. Bản đồ di truyền phage T4 cho thấy gene của phage T4 tạo cụm mở rộng theo chức năng của chúng. Chẳng hạn có cụm lớn các gene dùng cho sao chép DNA ở vị trí phần tư bên trên phía phải và có cụm gene tổng hợp các cấu phần tạo nên đầu của phage ở phía dưới của vòng tròn. Phân tử DNA của phage T4 là phân tử sợi đơn dạng thẳng, mỗi đầu tận cùng của DNA phage T4 được nhân lên hoặc lặp đoạn ở đầu cuối (terminal redundant). Do vậy, mỗi phân tử DNA có kích thước tăng thêm 2%. Khi DNA được sao chép trong tế bào, sự tái tổ hợp giữa các phần ở đầu 146

tận cùng của bộ gen T4 với những trình tự tương đồng của bộ gen T4 khác, kết quả tạo ra sản phẩm DNA có kích thước lớn hơn khả năng chứa của phần đầu. Những phân tử chứa lặp đoạn được tạo thành vì sự tái tổ hợp trong bộ gen của phage T4 xảy ra thường xuyên, trung bình có khoảng 20% sự kiện tái tổ hợp xảy ra trên một nhiễm sắc thể. Khi phân tử DNA được gói vào phần đầu, nó được cắt bằng enzyme chỉ còn chứa khoảng 102% của chiều dài bộ gen phage T4, vì có chứa đoạn lặp lại của phần đầu.

Màng Sợi đuôi Trao đổi nucleotide Tổng hợp DNA, tái bản và thay đổi Nhóm gen liên kết xác định nguồn gốc Đĩa gốc của đuôi

Đầu, cổ, nếp gấp cổ Đĩa gốc của đuôi Đầu

Hình 8.4. Bản đồ di truyền của T4 với các marker

4. Lập bản đồ cấu trúc tinh vi vùng rII của phage T4 Các nghiên cứu chi tiết về các đột biến rII của phage T4 làm sáng tỏ hơn về cấu trúc gene. Phage T4 ở dạng hoang dại r+ có khả năng nhiễm đồng thời hai nòi E.coli B và K. Các đột biến rII chỉ nhiễm nòi B nhưng không nhiễm nòi K. Seymour Benzer (1955) đã nhận được 2400 đột biến rII có nguồn gốc độc lập với nhau. Ông đã cho lai các đột biến với nhau và căn cứ vào sự xuất hiện các dạng tái tổ hợp hoang dại r+ mà lập bản đồ các điểm đột biến. Mỗi đột biến có thể tái tổ hợp với các đột biến khác. Đột biến mất đoạn ngăn cản sự tái tổ hợp với hai hoặc nhiều đột biến điểm ở các vị trí khác nhau của gene. Mỗi mất đoạn làm mất một phần bộ gene của phage 147

bao gồm cả vùng rII. Sử dụng đột biến mất đoạn là phương pháp đơn giản để lập bản đồ của hàng ngàn đột biến. Bản đồ mất đoạn (Deletion mapping) dựa trên sự có hoặc không có dạng tái tổ hợp. Trong bất kỳ phép lai nào giữa một đột biến điểm chưa biết và một đột biến mất đoạn, sự xuất hiện của dạng hoang dại cho thấy đột biến điểm nằm ngoài vùng mất đoạn. Ngược lại, nếu đột biến điểm xuất hiện trong vùng mất đoạn, không xuất hiện dạng tái tổ hợp kiểu hoang dại ở thế hệ sau.
rII A cistron rII B cistron

Khoảng cách từ A1 đến B được xác định bằng mất đoạn các khoảng 1272 qua 638

Khoảng cách từ 1 đến 47 được xác định bằng mất đoạn khoảng 1364 qua 1519

Hình 8.5 Đột biến mất đoạn được sử dụng để chia locus rII của bacteriophage T4 thành 7 vùng và 47 tiểu vùng nhỏ

Nhiều phép lai đã được thực hiện để lập bản đồ đột biến chi tiết gene rII. Khoảng cách từ A1 đến A6 và B được trình bày ở hình 8.4. Một đột biến đặc biệt đã được kiểm tra định vị ở vùng A4. Đột biến này không tái tổ hợp tạo dạng kiểu dại trong phép lai với các đột biến mất đoạn lớn như r1272, r1241, rJ3 và rPT1 nhưng nó có thể tái tổ hợp tạo dạng kiểu dại trong phép lai với rPB242, rA105 và r638. Các đột biến được tạo ra bởi cùng một khuôn, kết quả lai với các đột biến mất đoạn lớn sẽ được xếp vào vùng A4. Bản đồ di truyền trong vùng A4 có thể được tạo ra bởi một bộ các đột biến 148

mất đoạn được trình bày ở phần dưới của hình 8.5. Xác định 7 tiểu vùng ở trong A4 (từ a qua g).

rII A cistron

rII B cistron

Vùng xác định đột biến mất đoạn từ A1 đến A6 và B trong gen rII

Đột biến ở trong vùng b sẽ tạo ra dạng tái tổ hợp hoang dại với tất cả các mất đoạn mà trong đó vùng b của dạng hoang dại có mặt

Mất đoạn vùng xác định a đến g của vùng A4

Hình 8.6 Xác định vùng rII liên quan với các marker di truyền dạng thẳng của bản đồ di truyền phage T4

Ví dụ, một đột biến trong vùng A4 kết quả tái tổ hợp tạo dạng kiểu dại với đột biến mất đoạn r1368, nhưng lại không thể thực hiện được với đột biến r221 sẽ được sắp vào tiểu vùng c. Ở mức độ chi tiết hơn, các đột biến trong một tiểu vùng được sắp xếp nhờ lai giữa chúng với nhau. Ở phage T4, các điểm đột biến ở rất gần nhau, được tách nhau nhờ tái tổ hợp. 1% tái tổ hợp tương ứng với khoảng cách khoảng 100 bp. Vì vậy, bất kỳ hai đột biến không thể tái tổ hợp được với nhau có thể được xếp vào cùng vị trí trong gene. Bản đồ di truyền cho số lớn các đột biến rII có nguồn gốc độc lập được mô tả ở hình 8.6. Nghiên cứu đột biến ở vùng rII và lập bản đồ di truyền có vai trò quan trọng, qua đó có thể rút ra các kết luận sau: + Sự trao đổi di truyền có thể xảy ra trong gene và có thể giữa các nucleotide ở gần nhau. 149

+ Các đột biến không được tạo ra ở cùng tần số với tất cả các điểm trong gene, chúng phân bố không đều nhau. Chẳng hạn, 2400 đột biến rII đã được xác định chỉ ở 304 điểm. Một trong những điểm này có thể có đến 474 đột biến (Hình 8.6). Nhũng điểm có tần số đột biến cao như thế được gọi là các điểm nóng (hotspot mutation). Ở những điểm khác, đột biến được phục hồi một lần hoặc vài lần.
Mỗi hộp thể hiện sự xuất hiện ngẫu nhiên của các đột biến tại vị trí đó

"Điểm nóng" đột biến

Nhiều đột biến xuất hiện ở một điểm tạo thành một "điểm nóng"

Hình 8.6 Bản đồ di truyền locus rII của phage T4

Kết quả phân tích vùng rII rất quan trọng, giúp cho chúng ta phân biết được 3 khái niệm về gene. Phổ biến nhất, gene liên quan với một đơn vị chức năng. Điều này tương ứng với một đoạn DNA mã hóa cho một phân tử protein. Benzer đưa ra thuật ngữ cistron để chỉ chức năng này, thuật ngữ cistron thỉnh thoảng vẫn được sử dụng. Đơn vị chức năng được xác định qua thử nghiệm bổ sung (complementation test), xác định được 2 đột biến có allele với nhau không. Trước thí nghiệm của ông rII được coi là một locus. Thí nghiệm cho thấy các đột biến xếp thành hai nhóm rIIA và rIIB. Lai các đột biến rIIA × 150

rIIB sẽ có r+, nhưng lai rIIA × rIIA và rIIB × rIIB thì thu được kiểu hình đột biến r. Ngoài nghĩa là đơn vị chức năng, gene còn là đơn vị tái tổ hợp (recon) và đơn vị đột biến (muton). Cả hai đơn vị này, đều tương ứng với những nucleotide riêng lẽ trong gene. 5. Tính tiềm tan (Lysogeny) và phage λ Chu trình tiềm tan bắt đầu khi phân tử DNA của phage λ gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn và tiến hành sao chép như một phần nhiễm sắc thể vi khuẩn. Các hạt phage không được tạo thành. Phân tử DNA của phage được gắn vào bộ gen của vi khuẩn được gọi là prophage, tế bào vi khuẩn sống sót được gọi là tế bào tiềm tan (lysogen). Một chủng tiềm tan cho phage λ được ký hiệu theo tên của phage. Ví dụ chủng E. coli K12(λ) là chủng K12 trở thành tế bào tiềm tan của phage λ.
Phage

Phage DNA

Phage tấn công tế bào chủ và bơm DNA vào

NST vi khuẩn

Một số prophage tồn tại trên NST vi khuẩn, khởi đầu cho chu trình sinh tan Nhiều tế bào phân chia tạo ra khuẩn lạc vi khuẩn có chứa prophage

Tế bào bị phân giải, giải phóng phage

Chu trình sinh tan

Tái tạo vòng DNA phage

DNA và protein của phage được tổng hợp và lắp ghép tạo thành phage mới

Tế bào vi khuẩn phân chia bình thường, sao Prophage chép prophage và truyền cho thế hệ sau DNA của phage tích hợp vào NST vi khuẩn tạo thành dạng prophage

Chu trình tiềm tan

Hình 8.7 Chu trình tan và tiềm tan ở phage λ

Phân tử DNA của phage λ có đầu các đầu cuối chứa 12 nucleotide không kết cặp, mà ở dạng sợi đơn tạo đầu dính (cohesive end) bổ sung. Khi vào tế bào, đầu cuối bổ sung gắn lại tạo phân tử vòng tròn. Sự tạo vòng tròn xảy ra sớm ở cả chu trình tan và chu trình tiềm tan (Hình 8.7). Có khoảng 75% tế bào vi khuẩn bị nhiễm phage, phân tử DNA vòng tròn sao chép và 151

chu trình tan xảy ra tiếp theo. Còn khoảng 25% tế bào bị nhiễm, phân tử DNA vòng tròn của phage λ và phân tử DNA vòng tròn của E. coli tương tác và xảy ra tái tổ hợp điểm chuyên biệt (site-specific recombination) và DNA của phage gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn. Vị trí của tái tổ hợp điểm chuyên biệt ở DNA của vi khuẩn và phage được gọi là điểm gắn vào của vi khuẩn và phage (bacterial and phage attachment sites). Mỗi điểm gắn có chứa 3 đoạn: ở đoạn trung tâm có cùng trình tự nucleotide ở cả 2 vị trí gắn và là vùng mà sự tái tổ hợp thực sự xảy ra. Điểm gắn vào của phage được ký hiệu bởi POP’ (P: phage) và điểm gắn vào ở vi khuẩn được biểu diễn bằng BOB’ (B: bacteria). So sánh bản đồ di truyền của phage và prophage POP’ nằm gần vùng trung tâm của phân tử DNA dạng thẳng. Một protein của phage, integrase, xúc tác cho tái tổ hợp điểm chuyên biệt. Enzyme integrase nhận ra điểm gắn vào của phage và vi khuẩn, gây ra sự trao đổi vật lý, kết quả là phân tử DNA của phage gắn vào phân tử DNA của vi khuẩn. Kết quả của sự tái tổ hợp làm bản đồ di truyền của prophage khác với bản đồ di truyền của phage. Bản đồ di truyền prophage là sự chuyển đổi vòng tròn bản đồ di truyền phage tự do. Prophage được chèn vào nhiễm sắc thể của E. coli giữa gene gal và gene bio. Sự chèn vào của phage λ làm tăng khoảng cách giữa gene gal và gene bio. Khoảng cách giữa gene gal và gene bio ở tế bào tiềm tan với phage λ là khoảng hai phút so với một phút ở tế bào không tiềm tan.

Hình 8.8 Mô hình gắn của phage λ vào NST của E.coli

152

Khi tế bào tiềm tan, các gene của phage trở thành một phần nhiễm sắc thể của vi khuẩn vì vậy có thể làm kiểu hình của vi khuẩn bị thay đổi. Nhưng hầu hết các gene của phage ở prophage đều được giữ ở trạng thái bất hoạt nhờ protein repressor - sản phẩm của gene ở phage. Protein repressor được bắt đầu tổng hợp nhờ sự nhiễm vào của phage và nó được tiếp tục tổng hợp nhờ prophage. Gene mã hóa cho repressor thường chỉ là gene của prophage được biểu hiện ở chu trình tiềm tan. Nếu tế bào tiềm tan bị nhiễm bởi phage giống với prophage, sự có mặt của repressor trong prophage ngăn cản sự biểu hiện các gene của phage nhiễm vào. Tính kháng với những phage giống với prophage được gọi là tính miễn nhiễm (immunity). Đây là tiêu chuẩn để xác định tế bào vi khuẩn chứa phage đặc biệt. Chẳng hạn phage λ không tạo đốm trên vi khuẩn chứa prophage λ. Trong tế bào tiềm tan, sự sao chép không giải phóng các phage mới. Tuy nhiên, các prophage đôi khi trở nên có hoạt tính, trải qua chu trình tan, tạo ra số lượng lớn phage ở thế hệ sau. Hiện tượng này được gọi là sự cảm ứng prophage (prophage induction), nó được bắt đầu bằng sự hư hại DNA của vi khuẩn. Đôi khi prophage có thể tách ra khỏi DNA của vi khuẩn một cách ngẫu nhiên nhưng thường nó được gây ra do các tác nhân của môi trường như hóa chất hoặc chiếu xạ. Khả năng bị cảm ứng là một thuận lợi cho phage bởi vì DNA của phage có thể thoát khỏi tế bào bị hư hại. Cơ chế sinh hóa của sự cảm ứng là phức tạp nhưng sự thoát ra của phage xảy ra dễ dàng. Sự cắt ra của phage là sự tái tổ hợp điểm chuyên biệt khác, ngược với quá trình gắn vào. Sự cắt này yêu cầu enzyme của phage, integrase thêm protein của phage là excisionase. Nghiên cứu di truyền của sự gắn vật lý cho thấy escisionase gắn với integrase và sau đó nhận ra điểm gắn vào của prophage BOP’ và POB’, gắn với các điểm này. Integrase cắt ở trình tự O và tạo ra lại BOB’ và POP’. Quá trình tách diễn ra ngược lại với sự gắn vào.

II. Đặc tính của các virus
1. Tính đa dạng về cấu trúc và thành phần di truyền Virus có bộ gene rất đa dạng. Bộ máy di truyền của virus có thể là DNA mạch kép (double strand - dsDNA), DNA mạch đơn (single strand ssDNA), RNA mạch kép (dsRNA) hay RNA mạch đơn (ssRNA). Bộ gene RNA của virus là một phân tử hoặc một đoạn, sợi đơn phân cực mạch (+) hoặc mạch (-), có thể ở dạng vòng tròn hay dạng thẳng. Virus nhỏ nhất có nhất có khoảng 4 gene, virus lớn có khoảng vài trăm gene. Bộ gene của 153

virus cấu trúc đa dạng nhưng đều đảm bảo yêu cầu chung là phải sao chép được trong tế bào chủ tạo ra cả genome cho lắp ráp virion thế hệ sau và các mRNA phải tổng hợp protein của virus. 2. Tính đặc thù về vật chủ (Host specificity) Mỗi kiểu virus có thể nhiễm và kí sinh chỉ ở một biên độ giới hạn của tế bào được gọi là biên độ chủ (host range). Các virus nhận biết tế bào chủ theo nguyên tắc “ống khóa và chìa khóa” các protein bên ngoài của virion lấp vừa các điểm nhận trên bề mặt tế bào. Một số virus có biên độ chủ rộng đủ để xâm nhập vào vài loài. Chẳng hạn, các virus bệnh dại có thể nhiễm nhiều loài có vú gồm gậm nhấm, chó và người. Biên độ có thể rất hẹp như nhiều phage chỉ nhiễm vi khuẩn E. coli.

III. Tái bản của các virus
Bản chất genome của virus xác định kiểu sao chép. Virus được phân loại dựa trên các đặc điểm: - Phân loại theo bệnh: chia ra virus gây bệnh ở người, động vật và cây trồng … Vấn đề chủ yếu đối với hệ thống phân loại này là nhiều loại virus khác nhau lại gây ra cùng một triệu chứng. Chẳng hạn, sự nhiễm trùng hô hấp với sốt có thể được gây ra do nhiều virus khác nhau. - Phân loại theo hình thái: phân loại virus cơ bản dựa trên cấu trúc của hạt virus. Kiểu phân loại này có hạn chế trong phân biệt giữa các virus có hình thái tương tự nhưng gây ra triệu chứng bệnh khác nhau. - Phân loại theo chức năng: trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu được tiến hành dựa trên phương thức sao chép của virus. Cần xác định thành phần và cấu trúc genome của virus và từ đó xác định cách sao chép. Kiểu tế bào bị nhiễm bởi virus có ảnh hưởng quan trọng đối với quá trình sao chép. Đối với virus của prokaryote, sự sao chép phản ánh mối quan hệ mở rộng đơn giản của các tế bào chủ. Đối với virus của tế bào eukaryote, vấn đề phức tạp hơn. Khả năng mã hoá của genome buộc virus chọn một phương thức sao chép. Phương thức sao chép của virus phụ thuộc vào bản chất vật liệu di truyền của chúng. Về phương diện này, virus được chia thành 7 nhóm: Nhóm I: Virus chứa DNA sợi đôi. Nhóm này được chia nhỏ thành hai loại: 154

+ Sao chép là chỉ của nhân. Sự sao chép của các virus này phụ thuộc tương đối vào các yếu tố của tế bào. + Sao chép xảy ra trong tế bào chất. Những virus này có liên quan với các yếu tố cần thiết cho phiên mã và sao chép genome của chúng và vì vậy phụ thuộc nhiều vào bộ máy tế bào. Nhóm II: virus chứa DNA sợi đơn. Sự sao chép xảy ra trong nhân liên quan sự tạo thành qua trung gian sợi kép được xem như là khuôn cho tổng hợp lại DNA sợi đơn thế hệ sau. Nhóm III: virus chứa RNA sợi kép. Những virus này có bộ gene được chia đoạn. Những đoạn này được phiên mã riêng để tạo ra các monocistronic mRNA. Nhóm IV: Virus chứa RNA sợi đơn mạch (+), có thể chia nhỏ thành 2 nhóm: + Virus với polycistronic mRNA. RNA genome tạo ra mRNA, phân tử này dịch mã tạo sản phẩm là một polyprotein, thường được phân cắt để tạo các protein trưởng thành. + Virus phiên mã phức tạp. Cách dịch mã (như Togavirus) hoặc các RNA của subgenome (Tobamovirus) cần thiết để tạo RNA của bộ gene. Nhóm V: Virus chứa RNA sợi đơn mạch (-), genome của virus này được chia thành 2 nhóm: - Genome không chia đoạn (Mononegvirales). Bước đầu tiên trong sao chép là phiên mã RNA sợi (-) của genome nhờ RNA polymerase phụ thuộc RNA của hạt virus để tạo ra monocistronic mRNA, được xem là khuôn cho sao chép genome. - Genome được chia đoạn (Orthomyxoviridae). Sao chép xảy ra trong nhân với monocistronic mRNA cho mỗi gene của virus được tạo ra nhờ enzyme transcriptase từ genome đầy đủ của virus. Nhóm VI: Virus chứa mRNA sợi đơn mạch (+) qua trung gian DNA. Bộ gene của retrovirus là mRNA mạch (+) nhưng ở dạng lưỡng bội. Chúng không trực tiếp tạo ra mRNA mà phiên mã ngược tạo DNA. Nhóm VII: DNA sợi đôi qua trung gian RNA. Virus nhóm này dựa vào enzyme phiên mã ngược, những khác với retrovirus, quá trình này xảy ra bên trong hạt virus trong suốt quá trình trưởng thành.

155

Sợi RNA (-) virus bị phân cắt
5' C Tổng hợp mRNA 3' Tái bản 5' 3' 3' 5' 5' 3' 5' 3' C

Phân tử duy nhất
C C Tổng hợp mRNA 5' sợi RNA (-) genome Tái bản 3' sợi (+) có chiều
dài đầy đủ

sợi RNA (-) 5' genome

Sợi RNA (+) virus Flavi và picornaviruses
5' C Tái bản 3' 5' C 5' C 5' 3' 5' C

Alphaviruses

Tái bản

sợi RNA (+) genome (mRNA)

5' sợi (-) có chiều
dài đầy đủ

5' C

Tổng hợp mRNA sợi RNA (+) genome (mRNA)

Ambisence RNA virus
5'C RNA genome

RNA virus sợi đôi
sợi (+) 5' sợi (-) 3' Tổng hợp mRNA

C 5'

Tổng hợp mRNA

C 5' mRNA 3' 5' C 5' Anti Tổng hợp -genome RNA mRNA mRNA

3'

C 5'

3'

C 5'

Sợi (+) có chiều dài đầy đủ (mRNA) Dịch mã Tái bản sợi (+) 5' sợi (-) 3'

Protein

RNA genome

C 5'

Hình 8.9 Sao chép RNA của virus

156

1. Các virus của vi khuẩn Có 3 pha bắt đầu cho xâm nhiễm của virus. - Bắt đầu nhiễm - Sao chép và biểu hiện genome của virus - Giải phóng các virion trưởng thành từ tế bào bị nhiễm Bacteriophage được thêm vào nuôi cấy vi khuẩn đang sinh trưởng mạnh và sau một vài phút nuôi cấy bị giảm, ngăn cản tương tác giữa các hạt phage và tế bào. Ngay sau khi làm giảm nuôi cấy, có giai đoạn khoảng 1015 phút không phát hiện thấy các hạt phage, đây là giai đoạn che khuất (eclipse period). Điều này xảy ra một thời gian sau khi nhiễm vào tế bào, liên quan với genome của chúng như là điều kiện trước tiên cho sao chép. Ở giai đoạn này không có sự nhiễm nữa vì vậy không thể phát hiện nhờ vết đốm. Giai đoạn muộn là thời gian trước khi hạt virus mới đầu tiên xuất hiện và khoảng 20-25 phút cho hầu hết các bacteriophage. Khoảng 40 phút sau khi tế bào bị nhiễm, đường cong về số lượng hạt virus tổng số và virus ngoại bào hợp nhau thành một vì lúc này, tế bào bị nhiễm làm tan và giải phóng các hạt phage ngoại bào. Các bacteriophage làm chết tế bào chủ gọi là độc (virulent) và chúng sinh sản theo chu trình tan Các virus ôn hoà (temperate virus) có thể sinh sản mà không là chết tế bào chủ. Chúng có hai khả năng sinh sản: chu trình tan và chu trình tiềm tan không làm chết tế bào chủ. Chu trình sống bắt đầu khi phage gắn vào bề mặt tế bào E. coli và bơm DNA vào trong gây nhiễm. DNA của phage sau khi vào tế bào tạo DNA vòng tròn và sẽ tham gia vào một trong hai chu trình. DNA của phage có thể hoặc tham gia vào chu trình tiềm tan của phageT4 hoặc gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn nhờ tái tổ hợp điểm chuyên biệt để bước vào chu trình tiềm tan. 2. Các virus thực vật Hầu hết virus thực vật có genome RNA, tuy nhiên 2 nhóm virus thực vật được nghiên cứu nhiều nhất có chứa genome DNA: Cauliflower mosaic virus (CaMV) và gemini virus. - Các virus RNA Phần lớn virus thực vật có bộ gene RNA sợi đơn mạch (+) và nhiều dạng có capsid hình que, các protein capsomer hình xoắn. 157

+ Tobacco mosaic virus (TMV) Genome TMV là RNA sợi đơn. Genome của chúng mã hoá ít nhất 4 chuỗi polypeptid. Protein 130 và 180 kDal được dịch mã trực tiếp từ cùng một codon bắt đầu trên RNA bộ gene. Hai protein khác, 30 kDal và protein vỏ được dịch mã từ đoạn RNA. Protein 130 và 180 kDal liên quan với sao chép virus, trong khi đó protein 30 kDal cần cho sự di chuyển của virus từ tế bào này đến tế bào khác. Vì vậy 3 loại protein này cần cho sự nhân lên của virus trong toàn bộ cây. - Các virus DNA Virus thực vật có bộ gene DNA rất hiếm, chỉ gồm 2 nhóm: + Cauliflower mosaic virus: CaMV được nghiên cứu nhiều nhất trong nhóm Caulimovirus. Đây là nhóm virus dạng cầu, chứa genome DNA vòng tròn, mạch kép, kích thước khoảng 8 kb. Caulimovirus gây ra một số bệnh làm thiệt hại kinh tế cấy trồng. Chúng có phổ vật chủ hạn chế, chỉ nhiễm cây 2 lá mầm. DNA của CaMV có cấu trúc không bình thường, có 3 điểm gián đoạn trên sợi kép, hai điểm trên một sợi và một điểm trên sợi còn lại với những vùng trình tự overlap. Ngoài ra DNA CaMV có ribonucleotide gắn với đầu cuối 5’ của điểm gián đoạn. Từ các nghiên cứu ở CaMV, Hull và Covey (1983), Pfeiffer và Hohn (1983) cho rằng sao chép CaMV liên quan với phiên mã ngược qua trung gian RNA của bộ gene. Chu trình sao chép giống với retrovirus và hepatitis B virus. + Gemini virus: Gemini virus là nhóm virus có phổ xâm nhiễm rộng, cả cây một lá mầm và 2 lá mầm.Virus sọc vằn lá ngô (maiz streak virus – MSV) là một gemini virus lây nhiễm qua lá, được truyền do côn trùng. Bộ gene của geminivirus chứa phân tử DNA vòng tròn sợi đơn. Sao chép DNA virus được nghĩ là xảy ra nhờ trung gian DNA và genome của virus sao chép cho nhiều bản sao trong nhân của những tế bào tăng sinh nhanh. Virus gây ra sự ức chế sinh trưởng và lá có sọc vàng của những cây ngô bị nhiễm. 3. Các virus động vật Chu trình sao chép của virus động vật có nhiều điểm tương tự với các virus khác với nhiều biến dạng đáng kể. Virus động vật thường có promoter mạnh, có thể áp dụng cho biểu hiện gene. Trong nhiều trường hợp, chúng có khả năng sao chép genome của chúng với số lượng lớn bản sao trong tế bào. 158

Một số virus động vật như retrovirus gắn DNA của chúng vào nhiễm sắc thể tế bào chủ như là một phần chu trình sao chép của chúng. - Các virus RNA như retrovirus, paramyxo virus … Retrovirus có phổ vật chủ rộng gồm chim, động vật có vú và những động vật khác. Sự nhiễm của retrovirus không dẫn đến làm chết tế bào. Biểu hiện gene của virus mạnh nhờ promoter mạnh. Retrovirus chứa genome RNA. Hạt virus chứa 2 bản sao RNA. Mỗi genome RNA có nhiều tính chất tương tự với mRNA eukaryote: có trình tự poly(A) khoảng 200 đơn vị ở đầu mút 3 và cấu trúc mũ ở đầu 5’. Virus xâm nhiễm vào tế bào kèm theo enzyme reverse transcriptase và intergrase. Enzyme reverse transcritase tham gia phản ứng tổng hợp cDNA, dẫn đến sự hình thành bản sao DNA mạch kép của RNA virus, được gọi là DNA provirus. DNA provirus được đóng vòng tròn nhờ protein intergrase và được xen vào genome tế bào chủ. Thường chỉ có một bản sao DNA provirus được gắn vào trong một tế bào chủ. Điểm gắn vào genome là ngẫu nhiên. Retrovirus là một tác nhân gây ung thư. Hầu hết chúng có cấu trúc genome chứa trình tự oncogene. Oncogene virus thường được tạo thành từ gene của tế bào và thường là kết quả của sự dung hợp gene tế bào với gene của virus. Kết quả là những virus gây ung thư như thế bị mất chức năng gene của virus. Chúng có thể sao chép trong lây nhiễm hỗn hợp với một helper virus cung cấp chức năng bị mất. - Các virus DNA: SV40, Bovine papilloma virus (BPV) … Hạt virus SV40 chứa DNA mạch kép, vòng tròn, khoảng 5,2 kb được gắn với 4 phân tử histon: H4, H2a, H2b và H3. SV40 có thể tham gia vào hai kiểu chu trình sống phụ thuộc vào tế bào chủ. Trong tế bào cho phép virus xâm nhiễm (permissive cell) thường là các dòng tế bào ổn định có nguồn gốc từ khỉ châu Phi, sự sao chép virus xảy ra như các trường hợp nhiễm bình thường. Trong tế bào không cho phép (non-permissive cell), thường là những dòng tế bào chuột, không có sự nhiễm làm tan tế bào vì virus không thể sao chép toàn bộ DNA của chúng. Ở những tế bào khỉ bị nhiễm và làm tan do SV40, có thể phân ra 3 giai đoạn. Trong suốt 8 giờ đầu tiên, hạt virus không vỏ và DNA của chúng di chuyển đến nhân tế bào chủ. 4 giờ tiếp theo là pha sớm (early phase), có sự tổng hợp mRNA sớm và protein sớm và có sự kích thích tổng hợp DNA của tế bào chủ. Trong pha muộn xảy ra ở 36 giờ tiếp theo, trong giai đoạn này có sự tổng hợp DNA của virus, mRNA muộn và protein muộn, lắp ráp virus và làm tan tế bào. 159

+ Bovine papilloma virus (BPV) BPV gây nên bệnh bướu (wart) ở trâu bò. BPV có genome DNA sợi kép, vòng tròn khoảng 7,9 kb. 4. Các virus gây ung thư, HIV/AIDS … Khoảng 15% ung thư ở người có cơ chế hình thành liên quan với virus. Chúng có các nhóm sau : + DNA virus: họ Apovavirus (Papilloma virus), họ HepDNAavirus (Hepative-B virus), họ Herpesvirus (Eptein-Barr virus) + RNA virus: họ Retrovirus (HIV-1, virus AIDS) Các virus gây ung thư có thể tác động do xen đoạn DNA của chúng vào bộ gene chủ. Ngoài ra có thể thực hiện : + Hoạt hoá bộ máy sao chép DNA của tế bào chủ. + Kìm hãm tác động của các tumour suppressor gene chủ yếu để hoạt hoá sao chép DNA Như vậy bằng nhiều cách khác nhau các virus khi xâm nhập tế bào có thể làm tế bào mất sự kiểm soát bình thường. AIDS là hội chứng do virus làm suy giảm miễn dịch ở người (HIV). Hạt virus là một khối cầu, bờ ngoài gồ ghề, gồm vỏ bên ngoài, trong là chất nền protein bao quanh lõi có mặt cắt dạng nón. Trong lõi có genome gồm 2 sợi RNA giống nhau gắn với enzyme DNA polymerase là reverse transcriptase. Trong quá trình nhiễm, virus HIV bám và nhiễm lõi của nó vào tế bào hệ thống miễn dịch của người. Tiếp theo chúng sử dụng enzyme reverse transcriptase để sao RNA genome của chúng thành phân tử DNA sợi kép trong tế bào chất của tế bào chủ. Phân tử xoắn kép này chuyển đến nhân, gắn vào nhiễm sắc thể tế bào chủ nhờ một enzyme khác. Khi đã gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ, genome của virus. Một khi đã gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ, genome của virus có thể thực hiện một trong 2 quá trình. Nó có thể trưng dụng bộ máy tổng hợp protein của tế bào chủ để có thể tạo ra hàng trăm hạt virus mới sinh sản bằng nảy chồi, tách khỏi màng tế bào và đôi khi làm chết tế bào chủ. Nó cũng có thể tiềm tàng trong nhiễm sắc thể của tế bào chủ, rồi sao chép và truyền genome virus sang 2 tế bào mới khi tế bào phân chia.

160

Glycoprotein

Màng bao Capsid

HIV xâm nhập vào tế bào
TẾ BÀO CHỦ RNA virus Enzyme sao mã ngược

Enzyme sao mã ngược a. Cấu trúc của HIV

Lai DNA-RNA RNA (2 sợi

phân biệt)

DNA Protein virus

DNA NST

Provirus

RNA NHÂN

b. Sự sinh sản của HIV

HIV mới

Hình 8.10 Chu trình sinh sản của virus HIV

Ngoài ra sinh học hiện đại còn phát hiện ra hai dạng sống đặc biệt là các viroid và prion - Viroid: là những phân tử RNA rất nhỏ (200-400 nucleotide), dạng que có mức độ cấu trúc bậc hai cao (Hình 8.11). Chúng không có capsid và vỏ bao (envelope) và chỉ chứa một phân tử acid nucleic đơn. Viroid gắn liền với bệnh thực vật. Viroid đầu tiên được phát hiện và nghiên cứu đầy đủ nhất là viroid ống thoi khoai tây (potato spindle tuber viroid-PSTVd). Viroid không mã hóa cho bất kì một protein nào và nó được sao chép nhờ RNA polymerase của tế bào chủ hoặc có thể nhờ một sản phẩm của một gene RNA polymerase phụ thuộc RNA trong một vài tế bào eukaryote. Chi tiết của sao chép đến nay người ta chưa rõ, dường như nó xảy ra nhờ cơ chế vòng tròn xoay có sự cắt (autocatalytic cleavage) và gắn (self-ligation) để tạo ra viroid trưởng thành.

161

Vùng kết thúc bên trái

Vùng gây bệnh

Vùng trung tâm có tính bảo thủ

Vùng biến dị

Vùng kết thúc bên phải

Hình 8.11 Các vùng chức năng của phân tử RNA viroid

Giữa các viroid khác nhau có các trình tự khác nhau, nó được sử dụng trong phân loại để chia viroid thành giống (genera) và loài (species). Tuy nhiên, tất cả viroid đều có đặc điểm chung là vùng trung tâm có tính chất bảo thủ liên quan với sao chép của chúng (Hình 8.12). Một nhóm các viroid có khả năng tạo thành cấu trúc « đầu búa » (hammerhead) làm cho chúng có tính chất enzyme của một ribozyme. Hoạt tính này được sử dụng để cắt cấu trúc nhiều đơn phân tạo ra trong quá trình sao chép. Các viroid khác sử dụng các enzyme chưa được biết trong tế bào chủ để thực hiện điều này. Một vài viroid gây bệnh trầm trọng và gây chết thực vật chủ. Các viroid khác gồm các loại từ không có biểu hiện bệnh bên ngoài đến có triệu chứng bệnh nhẹ.

Hình 8.12 Cấu trúc RNA viroid

- Prion: Một nhóm bệnh lây nhiễm hệ thần kinh kinh niên, phát triển nhanh chóng và gây chết được biết như là bệnh xốp não lây nhiễm (Transmissible spongiform encephalopathics - TSE). Tác nhân lây nhiễm liên quan đến TSE không phải là acid nucleic (Tikvah Alper, 1967). Các bệnh TSE ở người như là bệnh Kuru và Creutzfeldt-Jacob có thể gây nên do các phần tử protein gây nhiễm và Standley Prusiner (1982) gọi chúng là prion (proteinacious infectious particle). Bản chất của prion là chưa được chứng minh một cách chắc chắn. Chúng là một hiện tượng mới vượt ra ngoài hiểu biết thông thường. Tất cả các bệnh prion đều có bệnh lý giống nhau cơ bản, mặc dù giữa chúng có sự khác biệt có ý nghĩa ở những điều 162

kiện khác nhau. Các bệnh khác nhau được đặc trưng bởi sự lắng (deposition) của các protein bất thường trong các mô khác nhau như thận, lách, gan hoặc não ... Sự lắng các « amyloid » này bao gồm sự tích luỹ các protein khác nhau ở dạng tấm hoặc dạng cuộn rối tạo ra protein β amyloid. Chúng là kết quả từ những sai hỏng của bộ gene trong trao đổi chất do nhiều loại nhân tố chưa được biết.. Mặc dù cơ chế phân tử liên quan với sự chết của tế bào là chưa rõ ràng, nhưng tác động gây ra xốp nào do tạo lỗ ở mô não đã được quan sát thấy dưới kính hiển vi. Những lỗ này gây ra do sự mất tế bào thần kinh và gliosid. Phép chẩn đoán xác định TSE không chỉ tiến hành trên lâm sàng mà yêu cầu chứng minh sự lắng protein prion (prp) bằng nhuộm hoá học miễn nhiễm mô não người sau khi chết.

Câu hỏi và Bài tập
1. Hãy trình bày quá trình tái tổ hợp genome của bacteriophage. 2. Genome của vi khuẩn và virus tương tác vật lý theo cách nào? 3. Ý nghĩa của việc phân tích cấu trúc locus rII của phage T4. 4. Hãy nêu đặc điểm về chu trình sống của phage. 5. Virus thực vật có những nhóm nào? 6. Hãy trình bày phương thức sao chép của virus chứa RNA sợi đơn. 7. Đặc điểm chu trình sinh sản của virus HIV. 8. Hãy nêu tên các dạng sống chỉ có acid nucleic hoặc chỉ có protein. 9. Có bao nhiêu đốm tan của phage được tạo thành trên môi trường nuôi cấy từ một phage riêng lẽ ban đầu? 10. Bacteriophage có trật tự các gene là ABC att DEF. Hỏi trật tự của các gene này ở prophage như thế nào?

Tài liệu Tham khảo
Phạm Thành Hổ. 2000. Di truyền học. NXB Giáo Dục. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (1998). Cơ sở di truyền học. NXB Giáo dục. Hoàng Trọng Phán. 1995. Di truyền học phân tử. Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế

163

Anthony J. F. Griffiths, Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin, William M. Gelbart, David T. Suzuki, Jeffrey H. Miller. 2004. An introduction to genetics analysis. W.H. Freeman Publishers. Cann AJ. 2001. Priciple of molecular virolory. Academic Press. London, UK. Flint SJ, Enquist LW, Krug RM, Racaniello VR, Skalka AM. 2000. Principles of Virology. Molecular Biology, Pathogenesis, and Control. ASM Press, Washington DC. Printed in the United States of America. Harlt D.L., Jones E.W. 1998. Genetics - Principle and analysis. Jone and Bartlett Publshers, Toronto, Canada. Hartwell et al. 2003. Genetics: From genes to genomes, Second editor. The McGraw-Hill Companies. Old RW & Primrose SB. 1989. Principles of gene manipulation. Blackwell Scientific Publication. Stansfield W.D. 1991. Schaum’s outline of theory and problems of genetics. McGraw-Hill, Companies, Inc., United States of America. Watson D.J, Baker T.A., Bell S.P., Gann A., Levine M., Losick R. 2004. Molecular biology of the gene. Benjamine Cummings, San Francisco, United States of America.

164

Chương 9

Di truyền học Vi nấm và Vi tảo
Mục tiêu của chương
Phân tích di truyền ở một số vi tảo và vi nấm, chủ yếu tập trung nghiên cứu các đặc điểm của vi nấm, vi tảo như tính không dung hợp, phân tích bộ bốn, phân tích di truyền trong chu trình cận hữu tính, nhiễm sắc thể nhân tạo

Số tiết: 3 Nội dung I. Đại cương về nghiên cứu di truyền ở một số vi tảo thông dụng
Loài vi tảo được sử dụng sớm nhất và nghiên cứu di truyền chi tiết hơn cả là Chlamydomonas reinhardii. Ưu thế của đối tượng này là có thể tiến hành lai và phân tích bộ bốn không xếp theo thứ tự. Ở các loài này, các tế bào đơn bội có thể sinh sản vô tính một thời gian dài. Các tế bào đơn bội gồm 2 loại: mt (+) và mt (-), tế bào đơn bội của mỗi loại không kết hợp với nhau. Sự kết hợp hai tế bào khác kiểu bắt cặp mt (+) với mt (-) tạo ra hợp tử. Hợp tử qua giảm phân cho tỷ lệ phân ly của một gen là 2 tế bào mt (+) : 2 tế bào mt (-). Trong điều kiện thí nghiệm, có thể nuôi các tế bào Chlamydomonas reinhardii để nhận các tế bào đồng nhất (synchronous culture), khi thay đổi chu kì 12 giờ sáng 12 giờ tối đều đặn. Theo dõi tổng hợp DNA cho thấy DNA của lục lạp tổng hợp vào giờ thứ 5-6 ngoài sáng, còn DNA của nhân tổng hợp khoảng giờ thứ 16-18, sau đó chia tế bào đồng loạt. Một số đột biến kháng streptomycine đã được thu nhận và nhận thấy ở một số có sự di truyền trong nhân, số khác có sự di truyền ngoài nhân.

165

Cặp giao tử

Sự tạo cặp Dung hợp tế bào Tập hợp lại + Kết hợp nhân và NST Hợp tử Hình thành cặp (NH4+) Giảm phân Nảy chồi (NH4+ hay ánh sáng) Phát triển hợp tử (NH4 hay ánh sáng) Hợp tử trưởng thành Tỷ lệ 2:2 của yl+ và ylTỷ lệ 4:0 của sm-r và sm-s yl+ yl+
+

Dung hợp

Giảm phân

yl-

yl-

sm-r sm-r

sm-r sm-r

Sản phẩm đơn bội sau giảm phân

Hình 9.1 Gen nhân (yl) phân ly 2:2 trong quá trình tạo giao tử còn gen của lục lạp (sm) phân ly theo tỷ lệ 4:0

II. Phân tích di truyền ở vi nấm
1. Tính không dung hợp (incompatibility) ở vi nấm Khái niệm tính không dung hợp ở nấm được dùng để chỉ khả năng kết hợp với nhau giữa các dòng nấm trong sinh sản hữu tính. Cho đến nay gần 450 loài nấm đã được nghiên cứu về các kiểu không dung hợp. Sự không dung hợp được xác định về mặt di truyền. Theo kiểu dung hợp thì nấm được phân làm 2 loại: - Đồng tản (Homothallic) là khi có sự kết hợp với nhau giữa các tế bào (hay hệ sợi tơ-mycellium) giống nhau trong sinh sản hữu tính. Ví dụ, tế bào a kết hợp với tế bào a, hay α với α tạo dạng lưỡng bội 2n tương ứng aa hay αα. - Dị tản (Heterothallic) là kiểu khi có sự lai nhau giữa 2 loại tế bào khác nhau như a với α tạo dạng dị hợp tử lưỡng bội aα. Các nấm dị tản có thể chia thành: lưỡng cực (bipolar) và tứ cực (tetrapolar). Đại diện điển hình của nấm dị tản lưỡng cực (bipolar heterothallic) là nấm men Saccharomyces cerevisiae. Ở nấm men, sự hợp bào (cytogamy) và 166

hợp nhân (karyogamy) chỉ xảy ra giữa các tế bào (hay nang bào tử ascospora) có kiểu bắt cặp (matting type) khác nhau như a và α và các allele khác nhau của locus MAT. Do có sự tham gia của 2 allele nên gọi là lưỡng cực. Nấm mốc vàng bánh mì Neurospora crassa cũng thuộc kiểu không dung hợp này. Nấm rơm (Volvariella volvacea) và nấm mỡ (Agaricus bisporus) cũng thuộc loại này. Kiểu dị tản tứ cực (tetrapola heteropolic) đặc trưng cho nhiều loại nấm đảm Bacidiomycetes mà đại diện là Schizophyllum communae. Nấm bào ngư (Pleurotus) và nấm hương (Lentinus edodes) thuộc kiểu không dung hợp này. Sự xác định di truyền không dung hợp ở các loài nấm này do 2 gen A và B. Mỗi gen có 2 allele hoặc nhiều hơn, thường là A1, A2 và B1, B2. Sự kết hợp giữa các dòng đơn bội chỉ tạo dạng hữu thụ có kiểu gene A 1A2B1B2 tức bốn nhân tố khác nhau, do đó gọi là tứ cực. Sự đa dạng của các chu trình sống và các kiểu không dung hợp ở nấm có ảnh hưởng đến các phương pháp phân tích di truyền. Ở một số nấm sinh sản hữu tính thực hiện trên cơ sở dị hợp bào (heterogamy) như ở Neurospora crassa. Ở những loài khác trên cơ sở đồng hợp bào (isogamy). Song song với sinh sản hữu tính còn có chu trình cận hữu tính hoàn toàn hay không hoàn toàn phụ thuộc vào loại nấm. Chu trình sinh sản cận hữu tính là quá trình kết hợp và tái tổ hợp gene diễn ra trong nguyên phân chứ không phải giảm phân, không có sự thụ tinh như sinh sản hữu tính. 2. Phân tích bộ bốn và lập bản đồ ở vi nấm Nấm men có nhiều đặc trưng để trở thành mô hình lý tưởng cho nghiên cứu di truyền ở eukaryote. Nấm men là một eukaryote đơn bào, chu kỳ sống chỉ khoảng 90 phút, có thể thu đuợc nấm men với số lượng lớn khi nuôi trên môi trường đặc. Bộ gen của nấm men chứa khoảng 12 megabase với 6.000 gen phân bố trên 16 nhiễm sắc thể. Nấm men là eukaryote đầu tiên được giải mã bộ gen. Chu trình sống của nấm men gồm hai giai đoạn có thể chuyển đổi qua lại. Tế bào có thể tồn tại ở cả dạng lưỡng bội và cả dạng đơn bội. Trong cả hai trường hợp, tế bào mẹ tạo chồi giống hệt nó. Những tế bào lưỡng bội này có thể tiếp tục sinh trưởng bằng mọc chồi và có thể trãi qua giảm phân tạo 4 bào tử đơn bội (haploid) trong một nang (ascus) được gọi là tetrad. Bào tử đơn bội (haploid spore) của kiểu kết cặp khác nhau (a với α) sẽ qua 167

thụ tinh tạo thể lưỡng bội. Những bào tử của kiểu kết cặp giống nhau sẽ tiếp tục sinh trưởng bằng nẩy chồi. Nấm men được xem là E. coli của các tế bào eukaryote, có thể sử dụng nấm men để phân tích đột biến. Tế bào nấm men đơn bội được gây đột biến bằng tia X, sau đó sàng lọc các kiểu hình đột biến trên môi trường nuôi cấy. Đầu tiên nuôi cấy tế bào nấm men trên môi trường giàu dinh dưỡng để tất cả các tế bào phát triển. Đĩa nuôi cấy này sau đó được nhân lên qua đĩa sao chép chứa môi trường chọn lọc hoặc điều kiện sinh trưởng đặc biệt. Chẳng hạn, các đột biến nhạy cảm nhiệt độ có thể sinh trưởng trên các đĩa gốc nhưng lại không sinh trưởng trên các đĩa sao chép ở nhiệt độ giới hạn. So sánh các khuẩn lạc ở đĩa gốc với đĩa sao chép sẽ phát hiện được những đột biến nhạy cảm với nhiệt độ.
Nang chứa 4 bào tử túi dị hợp

Nảy chồi

Dinh dưỡng

Dinh dưỡng

Nảy chồi

Hình thành bào tử Vòng đời s.dưỡng (đơn bội) Nảy chồi Vòng đời s.dưỡng (đơn bội) Nảy chồi

Giảm phân

Thiếu nitrogen Kết hợp hình thành hợp tử Vòng đời s.dưỡng (đơn bội) Nảy chồi

Hình 9.2 Chu trình sống của nấm men. 168

Lớp nang khuẩn (Ascomycetes) có đặc điểm là khi các tế bào lưỡng bội phân chia giảm nhiễm sẽ tạo ra các bào tử nằm trong một vỏ bao được gọi là nang (ascus). Các cơ thể này có các đặc điểm thuận lợi cho phân tích di truyền: Các vi nấm có thể tồn tại ở dạng đơn bội, nên tất cả các gene có thể biểu hiện trực tiếp thành kiểu hình. Các vi nấm này có thể tạo ra số lượng cá thể lớn ở thế hệ sau nên có thể phát hiện các sự kiện di truyền hiếm và có thể ước lượng được tần số tái tổ hợp một cách chính xác. Tế bào nấm men có thể sống ở dạng sinh dưỡng đơn bội hay dị bội. Tín hiệu chuyển từ đơn bội sang dị bội xuất hiện theo dạng kết hợp và tín hiệu chuyển từ dị bội sang đơn bội là sự giảm phân trong quá trình hình thành bào tử.

Tế bào phân chia sau khi hình thành chromatid

Giảm phân I Giảm phân II Nguyên phân

Hình 9.3 Mốc vàng bánh mì (Neurospora crassa) là mô hình nghiên cứu phân li trong giảm phân Trong chu trình sống, chỉ có hợp tử là lưỡng bội, sẽ trải qua giảm phân ngay sau khi được tạo thành, tạo các bào tử đơn bội, bào tử nẩy mầm hình thành giai đoạn cây. Ở một số loài các bộ bốn tạo thành trải qua một lần phân chia nguyên nhiễm nữa để tạo ra từng cặp gồm hai bào tử giống hệt 169

nhau. Ở mốc vàng bánh mì (N. crassa), các bào tử xếp thảng hàng trong nang theo một trật tự xác định liên quan trực tiếp đến tiến trình của giảm phân (Hình 9.3). Hầu hết các loại nấm mốc khác, sản phẩm của giảm phân không sắp xếp theo một trật tự đặc biệt trong nang như mốc vàng bánh mì. - Lập bản đồ di truyền bằng phân tích bộ bốn Đối với trường hợp bộ bốn không theo thứ tự: Ví dụ: khi lai các tổ hợp của hai gene AB × ab. Sự thụ tinh cho nhân lưỡng bội AB/ab và nó chia giảm nhiễm ngay. Nếu không có trao đổi chéo xảy ra hoặc trao đổi chéo đôi xảy ra trên cùng hai chromatid thì sẽ có bộ bốn: 2 AB : 2ab, gọi là kiểu đôi cha mẹ (parental ditype – PD). Nếu trao đổi chéo xảy ra trên cả bốn chromatid của mỗi cặp nhiễm sắc thể kép, sẽ có 2AB : 2aB, gọi là bộ bốn kiểu đôi không cha mẹ (Nonparental ditype – NPD) hay còn gọi là kiểu đôi tái tổ hợp (Reconbinational ditypeRD) Trường hợp tạo ra mỗi nang bốn loại bào tử có kiểu gene khác nhau: 1AB : 1Ab : 1aB : 1ab được gọi là kiểu bốn (tetratype) Phân tích bộ bốn cho phép xác định hai gene liên kết. Khi hai gene không liên kết thì tần số bộ bốn kiểu đôi bố mẹ và kiểu đôi không bố mệ bằng nhau (PD = NPD). Ngược lại khi hai gene liên kết, kiểu PD có tần số lớn hơn kiểu NPD. Tần số tương đối của các kiểu bộ bốn khác nhau được sử dụng để xác định bản đồ khoảng cách giữa hai gene liên kết.

170

Parent ditype

Nonparent ditype

Tetratype
PD NPD T

Hình 9.4 Phân tích bộ bốn 3. Phân tích di truyền trong chu trình cận hữu tính (tái tổ hợp trong nguyên phân) Nhiều loại nấm có sợi dinh dưỡng kết hợp với nhau, làm cho các nhân đơn bội từ các dòng cùng ở chung trong tế bào chất. Các thể dị nhân (heterocaryon) được tạo nên có thể tồn tại lâu dài như ở N. crassa. Sự tạo thành các thể dị nhân được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu sự tương tác giữa các gene, giữa các allele và giữa các gene của nhân với tế bào chất. Trong một số trường hợp, sự so sánh các dị hợp tử và dị nhân cho thấy sự khác nhau trong tương tác giữa các allele, có lẽ do: 171

- Tỷ lệ số lượng nhân và tương ứng các allele trong thể dị nhân có thể khác nhau - Các allele của các gene ở một nhân không được ngăn cách như ở giữa các thể dị nhân. Các nhân ở thể dị nhân đôi khi hợp nhau tạo nên đoạn lưỡng bội. Hơn nữa trong quá trình chia nguyên phân tiếp theo, nhân lưỡng bội có thể chịu tác động của hai quá trình: đơn bội hoá hoặc tái tổ hợp nguyên phân. 3.1. Sự đơn bội hoá (Haploidisation) Sự đơn bội hoá có thể xảy ra ngẫu nhiên hoặc được gây tạo bởi chất nfluorphenylalanin. Nếu như các nhân trong nhiều nguyên phân bị 1 nhiễm sắc thể (2n – 1) thì nhân lệch bội vừa xuất hiện trở nên không ổn định và tiếp tục mất các nhiễm sắc thể khác của một bộ đơn bội, cho đến khi trở thành nhân đơn bội (n) ổn định. Trong quá trình đó nhiễm sắc thể bị mất độc lập nhau, các gene của cùng một nhiễm sắc thể có sự liên kết hoàn toàn. Dựa vào đặc điểm này có thể xác lập sự liên kết dựa vào gene đánh dấu trên mỗi nhiễm sắc thể. 3.2. Tái tổ hợp trong nguyên phân (Mitotic recombination) Tái tổ hợp trong nguyên phân là hiện tượng thường gặp ở nhiều sinh vật, khi xảy ra trao đổi chéo giữa các nhiễm sắc thể tương đồng trong nguyên phân. Trong trường hợp này khoảng cách của gene đánh dấu xa tâm động nhất, sự đồng hợp tử hoá thường xảy ra hơn cả (được coi là 100%) và sự phân bố các gene được tính theo công thức: D = Nab/Nb x 100% D: khoảng cách của gene đến tâm động Nb - tổng số các dạng phân li, đồng hợp tử theo b. Nab - số các dạng phân li đồng hợp cả a và b, nếu như b là gene đánh dấu xa tâm động nhất. Bản đồ liên kết gene được xây dựng bằng tái tổ hợp giảm phân và tái tổ hợp nguyên phân (trong chu trình cận hữu tính) có thứ tự gene xếp giống nhau ở Aspergillus nidulans. 172

III. Nấm men như là E. coli của các tế bào eukaryote
1. Các nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo (YAC) Để xây dựng nhiễm sắc thể nhân tạo có chức năng như một phần bộ gene của tế bào, để đảm bảo sự phân chia của nhiễm sắc thể cần có tâm động (centromere). Thứ hai, phần đầu mút của nhiễm sắc thể thẳng dài được giữ nguyên vẹn khi đưa vào tế bào, tránh được sự phân giải của nuclease nhờ đoạn trình tự DNA lặp lại đặc biệt và phức hợp protein bao đầu nhiễm sắc thể là telomer. Cuối cùng, DNA phải sao chép trước khi tế bào phân chia vì vậy để nhiễm sắc thể nhân tạo sao chép phải có ít nhất một điểm xuất phát sao chép.
Plasmid a. AMP Ori 2 LEU2 b. Ori 1 - Sao chép tự động - Mỗi tế bào có nhiều phiên bản Ori 2 LEU2 ARS CEN AMP Ori 2 LEU2 - Sao chép tự động - Mỗi tế bào có một phiên bản - Phân ly trong giảm nhiễm như là một nhiễm sắc thể - Không thể sao chép tự động - Điểm gắn vào ở vùng tương đồng là LEU2 - Mỗi tế bào có một phiên bản Đặc điểm

c.

Hình 9.5 Plasmid của nấm men a. YIp: không chứa ori và không thể sao chép tự động b. YEp: chứa điểm ori 1 và sao chép tự động c. YCp: chứa tâm động và phân ly trong quá trình giảm phân LEU2: gen nấm men, Ori 1: xuất phát sao chép của plasmid nấm men, Ori 2: xuất phát sao chép của vi khuẩn, AMP: gen kháng kháng sinh của vi khuẩn

173

Vào những năm 1980, các nhà di truyền học phân tử đã đưa ra 3 yếu tố chìa khóa cho một nhiễm sắc thể: centromere, telomer và điểm xuất phát sao chép và sử dụng vật liệu từ tế bào nấm men là plasmid để cấu tạo nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo. Cho đến nay, ở eukaryote chỉ tìm được một loại plasmid duy nhất đó là plasmid vòng tròn 2 µm dài khoảng 6300 cặp base có nhiều trong tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae. Sự cải tiến plasmid này qua nhiều bước tạo thành nhiễm sắc thể nhân tạo ở nấm men, gọi là YAC (yeast artificial chromosome), có chứa các trình tự nucleotide quan trọng: ARS (autonomously replicating sequence): trình tự sao chép tương tự ori ở plasmid. CEN (centromere): trình tự của tâm động, đảm bảo sự chia đôi và đi về 2 cực của tế bào như tâm động. 2 TEL (telomere): hai trình tự duy trì hai đầu mút nhiễm sắc thể thẳng mà không bị cắt, vẫn sao chép và phân chia

Chỉ cắt bằng EcoRI

Hình 9.6 NST nhân tạo của nấm men 2. Những hiểu biết mới về tổ chức của các nhiễm sắc thể của nấm men 174

Nấm men là cơ thể eukaryote đơn bào, bộ máy di truyền của nó giống với tế bào của cơ thể bậc cao. Các điểm xuất phát sao chép, tâm động và telomer được xác định là một đoạn DNA nhỏ, tự do. Tế bào nấm men đơn bội có 16 nhiễm sắc thể trong nhân, xếp thành dãy có chiều dài khoảng 235.000 đến hơn 2 triệu bp. Tất cả có cấu trúc theo cùng bản đồ chi tiết. Mỗi nhiễm sắc thể chứa một tâm động. Hai đầu nhiễm sắc thể chứa đoạn lặp lại dài theo sau trình tự telomer ngắn. Trên nhiễm sắc thể có chứa nhiều điểm xuất phát sao chép, ở cách nhau khoảng 30-40 kb. Nhiễm sắc thể nấm men cũng tạo thành các đơn vị là các nucleosome chứa lõi histon gồm H2A, H2B, H3 và H4. Điện di trên gel với trường dao động (pulse field gel electrophoresis), tách ra những nhiễm sắc thể nguyên vẹn và lập được karyotype phân tử của nhiễm sắc thể nấm men. Dựa vào karyotype có thể quan sát được các biến đổi chủ yếu trong cấu trúc nhiễm sắc thể. Qua karyotype cho thấy, nhiễm sắc thể số I dài khoảng 235 kb là nhiễm sắc thể nấm men nhỏ nhất. Nhiễm sắc thể số XII lớn nhất với kích thước khoảng 2060 – 3060 kb, sự khác nhau về kích thước của nhiễm sắc thể này do số lượng gen của rRNA lặp lại với số lượng khác nhau, thường dao động khoảng 100 – 200 bản sao ở những chủng khác nhau. Trình tự DNA của nấm men được giải mã 100% vào tháng 4/1996.
a. Đoạn gần cuối lặp lại Tâm động
Điểm khởi sự sao chép

b.

NST

30 - 40 kb

Đoạn cuối

Hình 9.7 Nhiễm sắc thể nấm men a. Các thành phần của NST. Mỗi sợi chứa 1 tâm động, nhiều điểm khởi sự sao chép, các đoạn gần cuối lặp lại và đoạn cuối của chuỗi DNA. b. Hệ gen của NST nấm men trên hình ảnh điện di.

175

Bản đồ di truyền của nấm men được xác định bằng phân tích bộ bốn. Một đơn vị chức năng của tần số tái tổ hợp trong giảm phân khoảng 4400 cM, trung bình khoảng 3 kb/cM. Khoảng cách di truyền tỷ lệ với khoảng cách vật lý. Bản đồ di truyền của nấm men dài khác thường so với bản đồ di truyền của các cơ thể nấm khác. Ví dụ: Neurospora crassa có cùng hàm lượng DNA như nấm men nhưng bản đồ di truyền chỉ dài khoảng 15% bản đồ di truyền của nấm men. Số lượng gene mã hoá protein của nấm men ít hơn khoảng 6 – 10 lần số lượng gene của người. Từ khi chương trình giải mã genome nấm men hoàn thành vào năm 1996, không thể nói chính xác có bao nhiêu gene mã hoá cho protein ở nấm men. Số lượng gene mã hoá protein của nấm men khoảng 6.000 – 6.500 gene ở nấm men. 3. Những hiểu biết mới về tái bản và phiên mã của bộ gen nấm men Nấm men có thể hoàn thành một chu trình sao chép và phân chia khoảng 1,4 giờ. Xuất phát cho sao chép DNA của nấm men gồm nhiều điểm giống với oriC của E. coli. Đó là vùng giàu AT được tách ra khi có một protein khởi động gắn vào điểm kề bên. Các điểm xuất phát sao chép dài hàng ngàn đến hàng chục ngàn nucleotide. Khác với prokaryote, mỗi nhiễm sắc thể eukaryote có nhiều điểm xuất phát sao chép để quá trình sao chép genome của eukaryote có kích thước lớn hơn nhiều xảy ra một cách nhanh chóng. Có khoảng 400 điểm xuất phát sao chép phân bố trên toàn bộ 16 nhiễm sắc thể của nấm men. Sự sao chép xảy ra trực tiếp trên nhiều điểm xuất phát sao chép. Sợi mạch kép được tạo thành ở mỗi điểm xuất phát sao chép kéo dài và nối với sợi kép được tạo thành ở một điểm khác. Khi sao chép trên 2 mạch đơn hoàn thành sẽ tạo ra 2 phân tử DNA con giống hệt nhau. Sự tổng hợp DNA chỉ xảy ra ở một giai đoạn trong chu trình tế bào, đó là pha S. Ở nấm nấm men có 3 protein cần cho lắp ráp của replisome. Đó là phức hợp DNA polymerase phối hợp hoạt động ở chẽ ba sao chép. Phức hợp nhận biết điểm xuất phát (Origin recognition complex – ORC) sẽ gắn vào trình tự xuất phát của nấm men như DnaA protein của E. coli. Những phức tương tự được tìm thấy ở tất cả các eukaryote. Sự có mặt của ORC làm bổ sung thêm 2 protein khác, Cdc6 và Cdt. Cả 2 protein này và ORC làm kích hoạt helicase và những thành phần khác của replisome. Sự gắn vào của helicase được xem là sự “xác nhận” (license) cho điểm xuất phát, giúp lắp ráp replisome và bắt đầu tổng hợp DNA. 176

Trong số các gene mã hoá protein, intron chỉ có khoảng 4-5% tất cả các gene của nấm men (276 gene chứa một intron đơn và 7 gene chứa 2 intron riêng rẽ), kích thước trung bình của intron khoảng 2000 nucleotide. Tần số thấp của intron ở nấm men có lẽ liên quan với tần số thấp của các gene giả (pseudogene) giống như intron, phổ biến ở eukaryote bậc cao. Gene giả chứa trình tự mã hoá, nhưng vì thiếu intron và promoter phiên mã nên trình tự mã hoá không được biểu hiện. Gene mã hoá protein không chỉ là những dạng gene chức năng. Genome của nấm men chứa số lớn gen tạo ra RNA không mã hoá, bao gồm các gene lặp lại mã hoá cho rRNA, 274 gene của tRNA, trong đó có 80 gene chứa nhóm intron đặc biệt, 71 RNA nhân nhỏ (smRNA) tham gia chức năng chế biến rRNA, 5 smRNA tham gia chế biến intron, một vài RNA chưa biết chức năng và 3 RNA như là các tiểu đơn vị chức năng của enzyme Rnase, endoribonuclease và telomer. 4. Những hiểu biết mới về ADN ty thể của nấm men DNA ty thể nấm men dài 4 lần hơn DNA ty thể của người và những động vật khác. Hai yếu tố trên DNA ty thể nấm men được cho là có kích thước lớn hơn so với các đối tượng khác: trình tự giữa các gen (intergenic) và intron. Trình tự dài, giàu A-T của vùng đệm “spacer” tách biệt với các gene của mtDNA. Hầu hết DNA của spacer đều được dịch mã và một số trong chúng được duy trì trên mRNA như đầu 5’ và 3’ kéo dài, không dịch mã. Yếu tố thứ hai là intron, chiếm khoảng 25% genome ty thể nấm men và nó được xem là tạo ra sự khác nhau về kích thước giữa mt DNA của nấm men và người.

177

RNA tái tổ hợp lớn

RNA tái tổ hợp nhỏ

Hình 9.8 DNA ty thể nấm men

Câu hỏi và Bài tập
1. Hãy trình bày quá trình sinh sản vô tính của tảo Chlamydomonas reihardii. 2. Hãy cho biết các kiểu dung hợp ở vi nấm. 3. Sự xác định giới tính ở vi nâm như thế nào? Cho ví dụ. 4. Các kiểu bộ bốn nào được tạo ra do dòng nấm men lưỡng bội có kiểu gene AB/ab, nếu A và B liên kết hoàn toàn? 5. Trong 100 chu trình giảm nhiễm của Neurospora theo cách bình thường có bao nhiêu bào tử được tạo thành? 6. Ý nghĩa của phân tích bộ bốn trong nghiên cứu di truyền. 7. Hãy trình bày cấu tạo nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men và ứng dụng của chúng. 8. Một chủng kháng kháng sinh của nấm men được phân lập, cho kết cặp với một chủng hoang dại nhạy cảm với kháng sinh tạo thể lưỡng bội. Sau khi sinh sản một vài thế hệ, chúng được kích thích để sinh bào tử. Kết quả thu được bộ bốn nguyên phân chứa 8 bào tử gồm 4 bào tử kháng kháng sinh và 4 bào tử nhạy cảm kháng sinh. Hãy kết luận về sự di truyền của tính kháng kháng sinh. 178

Tài liệu Tham khảo
Phạm Thành Hổ. 2000. Di truyền học. NXB Giáo Dục. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (1998). Cơ sở di truyền học. NXB Giáo dục. Hoàng Trọng Phán. 1995. Di truyền học phân tử. Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế Anthony J. F. Griffiths, Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin, William M. Gelbart, David T. Suzuki, Jeffrey H. Miller. 2004. An introduction to genetics analysis. W.H. Freeman Publishers. Cann AJ. 2001. Priciple of molecular virolory. Academic Press. London, UK. Flint SJ, Enquist LW, Krug RM, Racaniello VR, Skalka AM. 2000. Principles of Virology. Molecular Biology, Pathogenesis, and Control. ASM Press, Washington DC. Printed in the United States of America. Harlt D.L., Jones E.W. 1998. Genetics - Principle and analysis. Jone and Bartlett Publshers, Toronto, Canada. Hartwell et al. 2003. Genetics: From genes to genomes, Second editor. The McGraw-Hill Companies. Old RW & Primrose SB. 1989. Principles of gene manipulation. Blackwell Scientific Publication. Stansfield W.D. 1991. Schaum’s outline of theory and problems of genetics. McGraw-Hill, Companies, Inc., United States of America. Watson D.J, Baker T.A., Bell S.P., Gann A., Levine M., Losick R. 2004. Molecular biology of the gene. Benjamine Cummings, San Francisco, United States of America.

179

Chương 10

Di truyền Tế bào chất
Mục tiêu của chương
Giới thiệu DNA của các bào quan ty thể, lạp thể và sự di truyền do các gene trong tế bào chất quy đinh.

Số tiết: 3 Nội dung I. Sự di truyền tế bào chất

Hình 10.1 Cấu trúc tế bào

1. Sự di truyền của các gene lạp thể Trong sự thụ phấn của thực vật bậc cao, một tế bào trứng có kích thước lớn có nhiều tế bào chất phối hợp với nhân của hạt phấn không có tế bào chất ở chung quanh. Do đó hợp tử nhận được phần lớn tế bào chất của tế bào trứng. Nếu hai bố mẹ có thành phần nguyên liệu di truyền trong tế bào chất 180

khác nhau thì thế hệ con sẽ nhận được nhiều nguyên liệu di truyền trong tế bào chất của mẹ. Do đó sẽ xảy ra sự di truyền theo thế hệ mẹ. Hiện tượng di truyền lá đốm được phát hiện rất sớm ở Mirabilis jalapa (Correns, 1908), ở Pelargonium zonale (E.Bauner, 1909). Các cây có lá đốm có thể có nguyên cành với lá trắng không có chlorophylle.

Hình 10.2 Thể khảm đốm lá

Thí nghiệm: Tạp giao giữa cây Mirabilis jalapa có những cành khảm trắng xanh theo các phép lai như sau: - Thụ phấn cho hoa trên cành lá trắng bằng hạt phấn của hoa trên cành lá xanh lục, cho thế hệ con những cây giống cá thể mẹ có lá trắng không có chlorophylle. Các cây này chết vì không có khả năng quang hợp - Tạp giao hoa trên cành lá xanh lục bằng hạt phấn của hoa trên cành lá trắng, tất cả thế hệ con có lá màu xanh lục bình thường. - Nếu thụ phấn các hoa của cành lá đốm bởi phấn hoa của cây xanh lục thì ở đời con có các cá thể lá trắng, lá đốm và lá xanh lục. - Nếu thụ phấn cho hoa của cành lá xanh lục với phấn hoa cây lá đốm thì ở đời con gồm toàn cá thể lá xanh lục. * Giải thích: Trong trường hợp này người ta thấy những chất cơ sở hình thành lạp thể có ở trong tế bào trứng sẽ hình thành tiền lạp thể, sau đó hình 181

thành lục lạp. Hạt phấn không có chất cơ sở để hình thành lạp thể nên hạt phấn không thể truyền lục lạp được. Sự khác nhau giữa con cái và bố mẹ về một hoặc nhiều tính trạng khi tạp giao thuận nghịch chứng tỏ có sự tham gia của nguyên liệu di truyền ở trong tế bào chất. Sự di truyền theo hệ mẹ quy định sự thể hiện tính trạng phụ thuộc vào cá thể mẹ.

Hình 10.3 Sư di truyền các gene lạp thể

Ở thực vật Pelargonium zonale có trường hợp di truyền theo dòng cha. Nếu hoa của cây lá đốm được thụ phấn của cây lá xanh lục thì 30% cây lai có lá đốm, 70% lá xanh lục. Khi lai hoán đổi cha mẹ thì 70% cây lai lá đốm và 30% lá xanh lục.

182

2. Sự di truyền của các gene ty thể 2.1. Đặc điểm di truyền của các gene ty thể Theo Mendel, khi tạp giao những sinh vật lưỡng bội thì có sự phân ly tính trạng theo đúng định luật của Mendel vì những gene ở trong nhân đều nằm trên nhiễm sắc thể và trong giảm phân được phân chia cho các giao tử cùng với nhiễm sắc thể. Đối với những tính trạng ở trong tế bào chất không có một hệ thống phân chia nào đảm nhận nên không có sự phân ly theo một quy luật nhất định. Ở nấm men có một thể đột biến có thể hình thành những khuẩn lạc petite kích thước nhỏ hơn bình thường, đường kính chỉ bắng 1/2 - 1/2 khuẩn lạc bình thường. Các tế bào tạo nên khuẩn lạc petite có kích thước giống kích thước tế bào bình thường. Nguyên nhân tạo nên khuẩn lạc kích thước nhỏ là do các tế bào đột biến petite bị hỏng hệ thống hô hấp, tức là những enzyme oxy hóa trong ti thể là các cytochrom b, c, a, a3 và cytochrom oxydase bị phá hủy. Đây là những enzyme của màng trong ty thể. Khác với kiểu dại, các đột biến petite không thực hiện được phản ứng phosphoryl hóa để sản ra năng lượng, vì vậy tốc độ sinh trưởng và phân bào của chúng thấp hơn. Ở ty thể của nấm men (Saccharomyces cerevisiae) có 3 kiểu đột biến chủ yếu: petite, antR và mit-. Một ví dụ về ty thể là đột biến thiểu năng hô hấp ở nấm men. Vào những năm 1940, Boris Ephrussi và cs. đã mô tả các đột biến đặc biệt ở nấm men.Các đột biến này được gọi là petite, có khuẩn lạc nhỏ hơn nhiều so với khuẩn lạc hoang dại. Theo phương thức di truyền, các đột biến petite chia làm 3 loại khác nhau: - Petite phân ly (Segregation petites): khi lai với dạng hoang dại khuẩn lạc bình thường thì tỷ lệ phân ly trong các nang bào tử (ascospore) là 1 khuẩn lạc to: 1 petite. - Petite trung tính (Neutral petites): khi lai với khuẩn lạc to thì sự phân ly trong nang bào tử chỉ có dạng khuẩn lạc to bình thường, thể hiện sự di truyền theo một cha mẹ (Uniparental) - Petite ức chế (Suppressive petites): khi lai tạo các nang bào tử, một số mọc thành khuẩn lạc to bình thường, một số khác tạo khuẩn lạc petite. Tỷ lệ giữa khuẩn lạc to và nhỏ dao động nhưng có tính đặc hiệu của chủng, một số petite ức chế chỉ tạo thế hệ con khuẩn lạc petite. Qua các petite ức chế cho 183

thấy có sự di truyền ngoài nhân tế bào và một số có sự di truyền theo một cha mẹ. Khi lai nấm men 2 tế bào cha mẹ, hai tế bào cha mẹ kết hợp với nhau và góp tế bào chất như nhau vào tế bào con lưỡng bội. Sự di truyền của các petite trung tính và ức chế độc lập với kiểu bắt cặp thể hiện rõ sự di truyền ngoài nhân nên được gọi là petite tế bào chất. Qua nghiên cứu chúng có các đặc điểm kiểu hình như sau: - Chuỗi chuyền điện tử của ty thể bị sai hỏng ở các petite tế bào chất. Do sai hỏng này, chúng lên men để tạo ATP kém nên mọc chậm. - Không có sinh tổng hợp protein ở các petite tế bào chất. Các ty thể có hệ thống sinh tổng hợp riêng gồm tRNA, các ribosome khác với tế bào chất. - mtDNA ở các đột biến petite có biến đổi lớn. Ty thể của tất cả các Eukaryote có mtDNA riêng tuy số lượng nhỏ, nhưng khác với DNA của nhân tế bào. Ở các petite trung tính, mtDNA bị mất hoàn toàn, còn ở các petite ức chế có sự thay đổi đáng kể tỷ lệ base so với mtDNA của dạng khuẩn lạc to bình thường. Nhóm các đột biến thứ hai của nấm men là antR (antR mutants), có kiểu hình đề kháng với các kháng sinh khác nhau. Ví dụ: capR (chloramphenicol resistance) kháng chloramphenicol, eryR kháng erythromycine, spiR kháng spiromycine, parR kháng paranomycine và oliR kháng oligomycine. Các đột biến này khi lai (ví dụ eryR × eryS) cho tỷ lệ phân ly không theo quy luật Mendel, giống như các petite ức chế nhưng sự di truyền có khác. Khi các tế bào cha mẹ kết hợp, sản phẩm lưỡng bội là hợp tử hai cha mẹ cytohet (cytoplasmically heterozygote). Các diploid này có thể sinh sản vô tính bằng mọc chồi.Trong nguyên phân, quá trình phân ly tế bào chất và tái tổ hợp xảy ra và các tế bào con trở thành eryS hay eryR. Nhóm đột biến quan trọng thứ ba là mit- (mit- mutants) được phát hiện sau cùng nhờ kỹ thuật chọn lọc đặc biệt. Các đột biến này, tương tự các đột biến petite ở chỗ có khuẩn lạc nhỏ và các chức năng bất thường của chuỗi chuyền điện tử, nhưng điểm khác căn bản là sinh tổng hợp protein bình thường và có khả năng hồi biến. Như vậy, các kiểu đột biến mit- là đột biến điểm. Sự di truyền cuả kiểu đột biến mit- giống với kiểu antR, có sự phân ly tế bào chất và sự di truyền theo một cha mẹ trong giảm phân.

184

Trong thế hệ con của những tế bào thuộc khuẩn lạc bình thường, có khoảng vài phần trăm tế bào hình thành những khuẩn lạc petite. Những tế bào khuẩn lạc petite luôn luôn phát triển thành những khuẩn lạc petite. Điều đó chứng tỏ có sự thay đổi về cấu trúc di truyền. Ngoài đột biến xảy ra ở kiểu bào gene nói trên dẫn đến sinh ra những khuẩn lạc petite, còn có những khuẩn lạc petite do những gene ở trong nhân quy định.

Hình 10.4 Sự di truyền các gen của ty thể trong hình thành khuẩn lạc petite

Thí nghiệm: Tạp giao của một nòi nấm men kích thước khuẩn lạc bình thường với một nòi có kích thước khuẩn lạc petite, thế hệ con hình thành khuẩn lạc bình thường. Còn đối với những gene trong nhân (gene ade), thì sự 185

phân ly ở thế hệ con về những gene này cho tỷ lệ 1:1, do chúng nằm trên NST và được chia đều cho các tế bào con. Ở đây, nguyên liệu di truyền trong tế bào sẽ được trộn lẫn nhau trong hợp tử và khi tạo thành bào tử thì mỗi bào tử đều nhận được các gene ở trong ti thể như nhau, nên chúng đều có chức năng hô hấp bình thường. Thí nghiệm cho thấy sự di truyền khuẩn lạc không theo quy luật Mendel.

2.2. Hiện tượng bất dục bào chất đực Tính bất dục do nhiều nguyên nhân, bất dục đực (không tạo phấn hoa hay tạo phấn hoa không có khả năng thụ tinh) ở thực vật có các trường hợp sau: - Do gene nhân quy định, như gene ms ở cây ngô - Do ảnh hưởng của điều kiện môi trường như độ ẩm, quang chiếu, khả năng cung cấp chất dinh dưỡng không đáp ứng đúng nhu cầu sinh lý của cây Ví dụ: gene ms ở cây ngô - Do lai xa cũng đưa đến các cơ thể lai không có hạt phấn vì NST có nguồn gốc khác nhau không thể tiếp hợp nhau trong giảm phân. Những hiện tượng bất dục này đều có ý nghĩa hạn chế chỉ có bất dục bào chất đực là có vai trò quan trọng. Đó là trường hợp bất dục của hạt phấn bắt nguồn từ tế bào chất, còn nhân thì có thể có điều chỉnh được nhờ đó có thể dùng các cây bất dục bào chất đực để phát huy ưu thế lai ở các đối tượng ngô, cao lương, củ cải đường...

186

Hình 10.5 Sơ đồ thí nghiệm chứng minh sự di truyền theo hệ mẹ của bất thụ đực

Ví dụ: Xét mối quan hệ giữa kiểu gene, kiểu bào gene và kiểu hình của bắp được sử dụng trong lai một tính mà không cần khử đực ở cây mẹ ST T 1 2 3 4 Kiểu gene Rfrf Rfrf RfRf hoặc Rfrf RfRf hoặc Rfrf kiểu bào gene S (bất dục) N (hữu dục) N S kiểu hình phấn) hỏng tốt tốt tốt (hạt

187

Vậy hạt phấn của ngô chỉ bị mất hoạt tính khi có yếu tố bất dục trong tế bào chất mà lại thiếu thiếu gene phục hồi hữu dục (Rf) ở trong nhân, alen của gene này là rf là gene cũng cố tính bất dục. Cây được phục hồi hữu dục RfrfS cho tự thụ phấn thì ở đời sau sẽ có 1/4 rfrf có hạt phấn hỏng. Nếu lấy bắp của dạng rfrfS thụ phấn của rfrfN, thì phấn hoa của toàn bộ đời sau sẽ bị hỏng, cây này chỉ còn bắp mang nhị cái. Đó là cách dùng phương pháp di truyền để khử cờ ngô. Khi sản xuất hạt giống, những cây này muốn có hạt thì phải thụ phấn hữu dục của những cây bình thường. Nếu muốn dùng những hạt đó để sau này trồng lại thì cây bố phải có kiểu gene RfRf và kiểu bào gene N hoặc S. Trong sản xuất giống ngô có thể dùng tổ hợp dòng thuần dạng 1 làm cây mẹ và dạng 3 hoặc dạng 4 đồng hợp tử làm cây bố. Như thế sẽ đỡ mất công khử đực ở cây mẹ và hạt lai thu được từ cây mẹ sẽ có kiểu gene Rfrf, kiểu bào gene S. Kiểu gene này đảm bảo được sự thụ phấn bình thường lúc trồng trong sản xuất. Bất thụ đực tế bào chất ở ngô liên quan đến 2 plasmid dạng thẳng S1 và S2. Chúng ở trong ty thể cùng với mtADN. Một trong những tính chất khó hiểu của plasmid này là chúng có thể thực hiện tái tổ hợp với mtADN.

3. Hiệu quả dòng mẹ lên chiều xoắn vỏ ốc Trứng và phôi chịu ảnh hưởng của môi trường cơ thể mẹ nhiều hơn cơ thể bố. Ngay cả khi bị tách khỏi cơ thể mẹ từ một giai đoạn rất sớm, chúng cũng đã nhận được tế bào chất, các chất dinh dưỡng trong trứng từ mẹ và những ảnh hưởng đặc biệt lên hoạt động của gene. Những tiềm năng nhất định của trứng được xác định trước khi thụ tinh và trong một số trường hợp chúng đã chịu ảnh hưởng của môi trường mẹ bao quanh. Sự quyết định trước như vậy do các gene của mẹ hơn là các gene của con, được gọi là hiệu ứng mẹ. Sự tồn tại của hiệu ứng mẹ nói chung được chứng minh bằng phương pháp lai thuận nghịch, khi đó kết quả phép lai thuận nghịch sẽ khác nhau. Ví dụ về hiệu quả dòng mẹ: chiều xoắn của vỏ ốc Limnaea peregra. Chiều xoắn này được xác định bởi một cặp alen. D là xoắn phải, d là xoắn trái. Các phép lai cho thấy D là trội so với d và chiều xoắn luôn luôn được xác định bởi kiểu gene của mẹ. 188

Tiến hành phép lai thuận nghịch giữa đồng hợp tử DD xoắn phải và đồng hợp tử dd xoắn trái: Khi trứng bắt nguồn từ ốc xoắn phải thì F1 là Dd về kiểu gene và ốc có kiểu hình xoắn phải. Cho các con ốc này tự phối thì sinh ra thế hệ sau có tỉ lệ phân li về kiểu gene là 1DD : 2 Dd : 1 dd, tất cả các con ốc thậm chí cả con có kiểu gene dd đều có chiều xoắn phải. Nhưng khi mỗi con ốc của thế hệ này tự phối riêng biệt thì chỉ có những con có kiểu gene DD và Dd cho thế hệ sau xoắn phải, còn những con dd mặc dù có kiểu hình xoắn phải nhưng lại cho thế hệ sau xoắn trái. Ngược lại nếu dùng ốc dd xoắn trái làm mẹ thì F1 Dd đều xoắn trái giống mẹ. Cho các ốc con này tự phối thì tất cả ốc thế hệ sau có xoắn phải vì kiểu gene của mẹ chúng là Dd. Nếu cho mỗi con của thế hệ này tự phối thì kết quả nhận được như phép lai thuận trên, nghĩa là thế hệ sau có tỷ lệ phân ly 3 xoắn phải : 1 xoắn trái.

Hình 10.6 Hiệu quả dòng mẹ lên chiều xoắn vỏ ốc

189

Như vậy hiệu quả dòng mẹ chỉ kéo dài một thế hệ và trường hợp này không thể xem là di truyền qua tế bào chất bởi vì ở đây các đặc tính của tế bào chất đã được xác định trước bởi tác dụng của các gene trong nhân chứ không phải bởi các gene trong tế bào chất. Nói cách khác ở đây cơ chế di truyền nhiễm sắc thể làm biến đổi tế bào chất của trứng trước khi nó thụ tinh.

II. Lập bản đồ ở lạp thể và ty thể
1. Lập bản đồ gene của DNA lạp thể Các gene của lục lạp ở Chlamydomonas reinhardii Sự di truyền lục lạp được nghiên cứu chi tiết hơn cả ở vi tảo Chlamydomonas reinhardii. Tế bào của vi tảo này có một lục lạp lớn với đường kính trung bình 5 µm chứa 50 đến 80 bản sao của phân tử DNA vòng tròn dài 196 kb. Theo Sager (1975), ở chlamydomonas reinhardii có các đột biến trong nhóm liên kết gene của lục lạp. Các đột biến có biểu hiện kiểu hình như sau: - Mất khả năng quang hợp để mọc được ngoài ánh sáng và trong tối cần bổ sung đường khử là acetat - Nhạy cảm với nhiệt độ cao hoặc thấp - Tính đề kháng với thuốc kháng sinh hoặc có nhu cầu được cung cấp thuốc kháng sinh. Tất cả các đột biến trên có sự di truyền theo một cha mẹ, có kiểu bát cặp mt+ (có thể coi là dòng mẹ). Điều này liên quan đến sự hình thành lục lạp trong hợp tử, bằng cách nào đó, chỉ nhận DNA từ lục lạp mt+. Năm 1954, R. Sager đã nghiên cứu các đột biến kháng streptomycine ở C. reinhardii từ dạng hoang dại nhạy cảm sm-s. Một số đột biến sm-r có sự di truyền nhiễm sắc thể với sự phân ly 1 : 1. Tuy nhiên một số đột biến có sự di truyền khác thường như sau: sm-r mt+ × sm-s mt- → tất cả thế hệ con đều sm-r với tỷ lệ 1 mt+ : 1 mt-. sm-s mt+ × sm-r mt- → tất cả thế hệ con đều sm-s với tỷ lệ 1 mt+ : 1 mtNhư vậy ở đây khi có sự hoán đổi cha mẹ trong lai, thế hệ con đều có kiểu hình streptomycine của mt+. Sự truyền thụ tính trạng này được gọi là sự 190

di truyền theo một cha mẹ. Sager coi mt+ như dòng mẹ và trường hợp trên giống như di truyền theo dòng mẹ. Các kiểu bắt cặp mt có tỷ lệ phân ly của gene trong nhân là 1 : 1.

Hình 10.7 Bản đồ vòng tròn của cpDNA ở Chlamydomonas

Hình 10.8 Bản đồ DNA chloroplast của Marchantia polymorpha IRA và IRB là những trình tự đảo ngược (theo K. Umesono và H. Ozeki, 1987)

191

Trong tổ hợp lai mt+ sm-r × mt- sm-s có khoảng 0,1% thế hệ hợp tử con mang cả sm-r và sm-s. Các hợp tử như vậy gọi là hợp tử hai cha mẹ cytohet (cytoplasmically heterozygote). Tần số các cytohet có thể tăng lên 40-100% ở thế hệ hợp tử con nếu mt được chiếu tia tử ngoại trước khi lai.
+

Ở Chlamydomonas, các hợp tử 2 cha mẹ được dùng làm điểm xuất phát cho tất cả các nghiên cứu về sự phân ly và tái tổ hợp của các gene lục lạp. Trên cơ sơ nhiều tổ hợp lai, R. Sager đã nêu ra bản đồ vòng tròn của cpDNA với các gene tương ứng.

2. Lập bản đồ gene của DNA ty thể * Lập bản đồ bộ gene ty thể của nấm men Có c ác phương pháp khác nhau xây dựng bản đồ bộ gene ty thể: - Lập bản đồ tái tổ hợp (recombination mapping): Ở nấm men sự phân li tế bào chất và tái tổ hợp xảy ra trong quá trình mọc chồi ở cytohet lưỡng bội. Sự phân li và tái tổ hợp có thể phát hiện trực tiếp ở các dạng lưỡng bội mọc chồi hay quan sát sản phẩm giảm phân khi chồi được kích thích tạo bào tử. Ví dụ khi lai eryRspiR × erySspS có thể nhận được các kiểu bộ bốn với số lượng như sau: eryRspiR erySspiS erySspiR eryRspiS 63 bộ bốn 48 bộ bốn 7 bộ bốn 1 bộ bốn

Các kiểu gene erySspiR và eryRspiS là các dạng tái tổ hợp. - Lập bản đồ bằng phân tích petite: Một số kỹ thuật lập bản đồ có hiệu quả dựa trên sự phối hợp cả 3 loại đột biến petite, ant R và mit-. Phần lớn các tiếp cận này dựa vào sự mất đoạn của mtDNA của các đột biến petite. Sự kết hợp các kiểu phân tích di truyền đặc biệt với kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã dẫn đến xây dựng bản đồ di truyền hoàn chỉnh của mtDNA. - Lập bản đồ bằng phân tích restriction enzyme: các restriction enzyme là công cụ hữu hiệu mới để phân tích di truyền. Nó được sử dụng không 192

những để phân tích mtDNA của nấm men, mà cả mtDNA của bất kỳ sinh vật nào miễn chiết tách và tinh sạch được DNA di truyền. * Bản đồ mtDNA của nấm men và người Việc xây dựng bản đồ mtDNA hoàn chỉnh của nấm men và người là những thành tựu đáng kể của nghiên cứu di truyền tế bào chất. - Một số trình tự có codon khởi sự và codon kết thúc ở cuối nhưng chưa biết chức năng - mtDNA của người rất ít dư thừa

Hình10.9 Bản đồ mtDNA của người (Theo Larson N.G và Clayton D.A, 1995)

III. Di truyền học phân tử các bào quan
1. Các bộ gene lạp thể (cpDNA) Là bào quan có khả năng tự tái sinh ở tế bào thực vật. Sự phân chia của các bào quan này về về các tế bào con trong phân bào là không đều như sự phân chia của nhiễm sắc thể trong nguyên phân và giảm phân. Chúng có số 193

lượng lớn và phân chia ngẫu nhiên về các tế bào con nên mỗi tế bào có thể chứa nhiều hoặc ít lục lạp. DNA của lục lạp được ký hiệu là cpDNA (Chloroplast DNA). Bộ gene này ở dạng DNA vòng tròn, thường dài hơn DNA của ty thể 8-9 lần. Trong lục lạp còn tìm thấy bộ máy sinh tổng hợp protein khác rất nhiều với hệ thống trong tế bào chất của Eukaryota nhưng giống với bộ máy sinh tổng hợp protein của Prokaryota. Mặc dù sự di truyền của lục lạp được phát hiện rất sớm, nhưng trong một thời gian dài sự hiểu biết chi tiết về các gene của lục lạp không có bước tiến đáng kể. Các nghiên cứu phân tử đã góp phần chủ yếu cho sự phân tích chi tiết các gene ở các bào quan. Ngoài các nghiên cứu ở Mirabilis jalapa và Chlamydomonas, bản đồ chi tiết cpDNA của thực vật Marchantia polymorpha đã được xây dựng. CpADN điển hình dài khoảng 120-200 kb tùy loài thực vật. Ở Marchantia, kích thước phân tử là 121 kb. Trên cpDNA của Marchantia có tất cả 136 gene gồm 4 loại mã hóa tổng hợp rRNA, 31 loại mã hóa tổng hợp tRNA và khoảng 90 gene tổng hợp protein. Trong số 90 gene mã hóa tổng hợp protein, có 20 gene mã hóa tổng hợp enzyme cho quang hợp và chuỗi chuyền điện tử. Các gene mã hóa cho các chức năng dịch mã chiếm khoảng một nữa bộ gene của lục lạp và bao gồm các protein và các RNA cần thiết cho dịch mã bên trong lục lạp. Thực tế DNA của lục lạp, ty thể và nhân tế bào có sự phối hợp chặt chẽ trong việc tạo ra các tiểu phần của những protein được sử dụng bên trong lục lạp. Ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/ oxygenase là enzyme dồi dào nhất của lục lạp. Nó xúc tác 2 phản ứng cạnh tranh nhau, cố định CO2 và bước đầu tiên của quang hô hấp (photorespiration) với sự tạo ra glycolate. Enzyme gồm 8 tiểu phần lớn LS (large unit) giống nhau và 8 tiểu phần nhỏ giống nhau được mã hóa tương ứng bởi các gene của lục lạp và nhân tế bào. Tiểu phần lớn LS mang trung tâm xúc tác, còn vai trò của các tiểu phần nhỏ chưa rõ. Gene LS nằm trên cpDNA của một số thực vật như bắp, Chlamydomonas reinhardii, thuốc lá, Euglena... Trong tất cả các trường hợp, gene LS hiện diện 1 bản sao cho 1 DNA của lục lạp. Ngược lại, các gene của tiểu phần nhỏ được tìm thấy ở các trình tự DNA của nhân tế bào với số bản sao ít. 194

2. Các bộ gene ty thể (mtDNA) Bào quan ti thể có ở tất cả các tế bào của Eukaryote. Bộ gene của ti thể được ký hiệu là mtDNA (Mitochodrial DNA). mtDNA mã hóa cho sự tổng hợp nhiều thành phần của ti thể như hệ thống 2 loại rRNA, 22-25 loại tRNA và nhiều loại protein có trong thành phần màng bên trong ti thể. Trong khi đó, phần lớn protein của ribosom của ti thể thì do các gene ở trong nhân xác định. Bộ gene của ti thể có hai chức năng chủ yếu: - Mã hóa cho một số protein tham gia chuỗi chuyền điện tử - Mã hóa cho hệ thống sinh tổng hợp protein gồm một số protein, tất cả các tRNA và cả 2 loại rRNA. Tuy nhiên trong cả hai trường hợp, những cấu phần còn lại của hệ thống được mã hóa do các gene nhân và được dịch mã ở bào tương (cytosol) rồi chuyển vào ti thể. Như vậy, việc nghiên cứu các gene của ti thể cho thấy tế bào Eukaryote không lục lạp có ít nhất 2 hệ thống sinh tổng hợp protein độc lập tương đối nhưng luôn hợp tác chặt chẽ với nhau. Ở các Eukaryote có lục lạp thì 3 hệ thống sinh tổng hợp protein độc lập tương đối nhưng hợp tác với nhau. Cả 2 bào quan ty thể và lục lạp tham gia trực tiếp vào chuyển hóa năng lượng của tế bào. Di truyền tế bào chất là hiện tượng di truyền do các gene nằm trên nhiễm sắc thể ở ngoài nhân quy định.

Câu hỏi ôn tập
1. Hãy nêu các kiểu đột biến của ty thể. 2. Trình bày chứng minh thực nghiệm về di truyền lạp thể. 3. So sánh sự giống nhau và khác nhau của mtDNA và cpDNA. 4. Nếu có hạt bắp từ dòng bất thu đực, làm sao xác định sự bất thụ do gene trong nhân hay ngoài nhân? 5. Nêu các đặc điểm riêng của di truyền ngoài nhiễm sắc thể và nêu các sai khác cơ bản so với di truyền của gene nhân. 6. Hãy phân biệt hiệu quả dòng mẹ với sự di truyền ngoài nhân. 195

7. Hãy phân biệt các loại đột biến petite ở nấm men. 8. Cho 2 dòng bắp bất dục đực: một dòng bất dục bào chất, một dòng bất dục do gene nhân di truyền theo Mendel. Hãy trình bày phương pháp xác định hai dòng bất dục trên. 9. Một con ốc loài Limnaea peregra có vỏ xoắn trái qua tự phối cho tất cả thế hệ sau xoắn phải. Hãy xác định genotype của con ốc này. Nếu thế hệ sau cho tự phối riêng rẽ, hỏi chiều xoắn vỏ của các con ốc thế hệ này như thế nào? 10. Tỷ lệ tiến hóa DNA của ty thể được tính bằng sự biến đổi 1 nucleotid của 1 ty thêr trong thời gian 1.500 đến 3.000 năm. DNA ty thể người có khoảng 16.500 nucleotid. Hỏi tỷ lệ biến đổi của 1 nucleotid trong 106 năm là bao nhiêu?

Tài liệu Tham khảo
Phạm Thành Hổ (2000). Di truyền học. NXB Giáo Dục. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (1998). Cơ sở di truyền học. NXB Giáo dục. Phan Cự Nhân, Nguyễn Minh Công, Đặng Hữu Lanh. 1999. Di truyền học. NXB Giáo dục Hoàng Trọng Phán (1995). Di truyền học phân tử. Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế Anthony J. F. Griffiths, Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin, William M. Gelbart, David T. Suzuki, Jeffrey H. Miller. 2004. An introduction to genetics analysis. W.H. Freeman Publishers. Harlt D.L., Jones E.W. (1998). Genetics - Principle and analysis. Jone and Bartlett Publshers, Toronto, Canada. Stansfield W.D. 1991. Schaum’s outline of theory and problems of genetics. McGraw-Hill, Companies, Inc., United States of America. Watson D.J, Baker T.A., Bell S.P., Gann A., Levine M., Losick R. 2004. Molecular biology of the gene. Benjamin Cummings, San Francisco, United States of America.

196

Chương 11

Sự điều hòa biểu hiện của gene
Mục tiêu của chương
Giới thiệu về các quá trình điều hòa trong cơ thể sinh vật. Sự điều hòa của gen được thực hiện ở các mức khác nhau. Hoạt động theo kiểu operon đặc trưng cho điều hòa ở Prokaryote. Ở Eukaryote có các cơ chế điều hòa phức tạp.

Số tiết: 3 Nội dung I. Các nguyên lý điều hòa và mức độ kiểm soát phiên mã
Không phải tất cả các gene đều có biểu hiện liên tục. Mức độ biểu hiện của gene khác nhau giữa các tế bào hoặc khác nhau theo giai đoạn trong chu trình tế bào. Chẳng hạn gene mã hóa cho hemoglobin được biểu hiện ở mức độ cao chỉ ở trong tế bào tiền thể (precursor) của tế bào máu. Hoạt tính của gene khác nhau theo chức năng tế bào. Ở động vật có xương sống như chuột, chứa khoảng 200 loại tế bào được phân hóa chức năng khác nhau. Tất cả các tế bào đều chứa cùng thông tin di truyền, những tế bào khác nhau chỉ ở những gene hoạt động. Trong nhiều trường hợp, hoạt tính của gene được điều hòa ở mức độ phiên mã, cả qua những tín hiệu bắt đầu bên trong tế bào và cả phản ứng với những điều kiện bên ngoài. Tuy nhiên thông tin di truyền được điều hòa theo những cách khác nhau. Các bước điều khiển hoạt động gene bao gồm: - Cấu trúc lại DNA, trong đó những thay đổi biểu hiện gene phụ thuộc vào vị trí trình tự DNA trong genome. - Điều hòa phiên mã trong tổng hợp bản phiên mã RNA bằng sự điều khiển sự mở đầu và sự kết thúc - Quá trình chế biến RNA hoặc điều hòa qua quá trình cắt nối trên RNA (RNA splicing) - Điều hòa dịch mã quá trình tổng hợp chuỗi polypeptid 197

Hình 11.1 Mô hình điều hòa âm tính (negative regulation) và điều hòa dương tính (positive regulation). A. Trong điều hòa âm tính, protein ức chế bám vào phân tử DNA, ngăn cản phiên mã B. Trong điều hòa dương tính, sự bám vào của protein hoạt hóa phiên mã, kích thích phiên mã.

198

- Sự bền vững của mRNA Có sự khác nhau đáng kể trong sự điều hòa biểu hiện của các gene ở eukaryote và prokaryote. Prokaryote là những cơ thể đơn bào sống tự do, sinh trưởng và phân chia trong điều kiện thích hợp và được cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng. Do đó hoạt động của các gene được điều hòa do nhu cầu của tế bào khi cần thiết. Khác với prokaryote, eukaryote là những cơ thể đa bào. Trong cơ thể đang phát triển, một tế bào không chỉ sinh trưởng và phân chia mà tế bào thế hệ sau trải qua những thay đổi quan trọng về hình thái và hóa sinh và duy trì trạng thái biến đổi của nó. Hơn nữa trong quá trình phát triển phôi, tế bào eukaryote ít chịu ảnh hưởng của môi trường hơn so với vi khuẩn. Cuối cùng, ở cơ thể trưởng thành, sự sinh trưởng và phân chia tế bào của hầu hết các loại tế bào bị ngừng, mỗi tế bào chỉ phải duy trì các tính chất riêng biệt của nó.

II. Điều hòa hoạt động gene ở prokaryote
Ở vi khuẩn và phage, hoạt tính đóng mở gene thường được điều khiển qua phiên mã tổng hợp các mRNA xảy ra khi sản phẩm của gene được cần đến. Cơ chế phân tử cho mỗi mô hình điều hòa hoàn toàn khác nhau, nhưng thường theo một trong hai kiểu chính: điều hòa âm tính và điều hòa dương tính (Hình 11.1). Trong hệ thống điều hòa âm tính (Hình 11.1A) một protein ức chế có mặt trong tế bào, ngăn cản sự phiên mã. Trong hệ thống cảm ứng được điều hòa âm tính, protein ức chế hoạt động làm ngăn cản phiên mã. Nhân tố cảm ứng kìm hãm chất ức chế, cho phép bắt đầu phiên mã. Trong hệ thống ức chế, protein aporepressor gắn với co-repressor tạo ra chất ức chế có hoạt tính, làm ngăn cản phiên mã. Ngược lại trong hệ thống điều hòa dương tính (Hình 11.1B), sự tổng hợp mRNA xảy ra nều protein điều hòa gắn vào một vùng của gene làm hoạt hóa phiên mã. Những protein này được xem là những nhân tố hoạt hóa phiên mã. Điều hòa âm tính và dương tính không loại trừ lẫn nhau. Một vài hệ thống là cả điều hòa âm tính và dương tính, sử dụng cả 2 hệ thống điều hòa để phản ứng với các điều kiện khác nhau trong tế bào. Điều hòa âm tính là phổ biến cho prokaryote, trong khi điều hòa dương tính lại phổ biến cho eukaryote. 199

1. Cấu trúc của operon Mô hình operon của điều hòa phiên mã Cơ chế điều hòa di truyền của hệ thống lac (lac system) được giải thích bằng mô hình operon của Francois Jacob và Jacque Monod (1960) (Hình 11.2). Hệ thống sử dụng lactose gồm 2 loại thành phần: gene cấu trúc mã hóa protein cần thiết cho sự vận chuyển và chuyển hóa lactose và các yếu tố điều hòa (gene ức chế lacI, promotor lac P và operator lacO). Sản phẩm gene cấu trúc được mã hóa bởi một phân tử mRNA đa gene (polycistronic). Gene Z mã hóa cho enzyme β- galactosidase (thủy phân đường lactose thành galactose và glucose), gene Y mã hóa cho enzyme permease (cần cho vận chuyển lactose qua màng), gene A mã hóa cho enzyme transacetylase (vai trò chuyển hóa lactose chưa rõ). Đột biến promotor (lacP-) làm mất khả năng tổng hợp mRNA. Sản phẩm của gene lacI là chất ức chế, nó bám vào trình tự các base của DNA cấu tạo operator. Chất ức chế bám vào operator, ngăn cản sự khởi đầu phiên mã mRNA nhờ RNA polymerase. Chất cảm ứng (lactose) kích thích sự sinh tổng hợp mRNA bằng cách kết hợp và làm bất hoạt chất ức chế. Sự có mặt của chất cảm ứng làm chất ức chế không gắn vào operator, promotor cho phép khởi đầu tổng hợp mRNA. Khi môi trường có lactose, lactose được chuyển vào tế bào nhờ permease. Khi vào trong tế bào một số lactose (liên kết β -1,4) được chuyển thành allolactose (liên kết β-1,6) nhờ β-galactosidase. Allolactose là chất cảm ứng, nó gắn vào protein kìm hãm, gây biến đổi cấu hình tạo phức hợp allolactose-repressor. Phức hợp này mất khả năng gắn vào operator. Lúc này operon mở ra, RNA polymerase bắt đầu phiên mã từ gene cấu trúc. Khi môi trường không có lactose, protein ức chế có hoạt tính gắn vào operator, làm sự phiên mã của tất cả các gene cấu trúc của operon lac bị dừng. Sự điều hòa của operon yêu cầu promotor nằm chồng lên một phần hoặc kề sát bên promotor của gene cấu trúc, vì nó gắn với chất ức chế ngăn cản phiên mã.

200

Hình 11.2. A Bản đồ của operon lac B. Sơ đồ của operon lac ở trạng thái bị kìm hãm C. Sơ đồ của operon lac ở trạng thái được kích thích

201

2. Điều hòa dương tính operon lactose Chức năng của β-galactosidase trong chuyển hóa lactose để tạo ra glucose bằng cách cắt lactose (một sản phẩm cắt khác là galactose cũng có thể được chuyển thành glucose nhờ enzyme của operon galactose). Nếu cả glucose và lactose có mặt trong môi trường sinh trưởng, không cần hoạt động của operon lac. Trong môi trường có glucose, enzyme β-galactosidase không được tạo thành cho đến khi glucose trong môi trường được sử sụng hết. Sự có mặt của glucose làm mRNA không được tổng hợp, do đó không có sự tổng hợp β-galactosidase, vì sự thêm vào nhân tố cảm ứng làm bất hoạt chất kìm hãm. Một yếu tố khác cần cho sự bắt đầu tổng hợp mRNA, hoạt tính của yếu tố này được điều hòa bởi nồng độ glucose. Glucose có ảnh hưởng ức chế gián tiếp lên sự biểu hiện của operon lac. Những phân tử nhỏ adenosine monophosphate vòng (cAMP) phân bố rộng rãi trong mô động vật và trong các cơ thể eukaryote đa bào, có vai trò quan trọng làm chất trung gian hoạt động hormone. Chất này cũng có trong tế bào E. coli và nhiều tế bào vi khuẩn khác với chức năng khác nhau. cAMP được tổng hợp bởi enzyme adenyl cyclase, và nồng độ của cAMP được điều hòa gián tiếp qua trao đổi chất glucose. Khi vi khuẩn sinh trưởng ở môi trường chứa glucose, hàm lượng cAMP rất thấp. Trong môi trường chứa glycerol hoặc các nguồn carbon không thể đi vào con đường hóa sinh được sử dụng để trao đổi chất glucose (con đường glycolytic) hoặc khi vi khuẩn bị đói nguồn năng lượng, nồng độ cAMP cao. Hàm lượng glucose giúp điều hòa nồng độ cAMP trong tế bào và cAMP lại điều hòa hoạt tính của operon lac.

Hình 11.3 Cấu trúc của cAMP

202

E. coli chứa protein nhận cAMP hay CRP (cyclic AMP receptor protein) còn được gọi là protein hoạt hóa dị hóa CAP (catabolite activator protein), được mã hóa bởi gene crp. Đột biến ở gene crp và gene adenyl cyclase làm ngăn cản sự tổng hợp của mRNA lac. Điều này cho thấy chức năng của CRP và cAMP cần thiết cho tổng hợp mRNA lac. CRP và cAMP gắn vào một vị trí khác tạo phức hợp cAMP-CRP được biểu hiện. Phức hợp này là một yếu tố điều hòa hoạt hóa ở hệ thống lac.
Tổng hợp của mRNA lac không Repressor không Phức hợp cAMP-CRP

Có Phiên mã không

Hình 11.4 Bốn trạng thái điều hòa của operon lac

Nhu cầu về cAMP-CRP phụ thuộc vào hệ thống ức chế lac, vì đột biến crp và adenyl cyclase không thể tạo mRNA lac ngay cả khi có mặt đột biến ở gene điều hòa (lacI-) và gene chỉ huy (lacO-). Sở dĩ như vậy là vì phức hợp cAMP-CRP phải gắn vào trình tự base trên DNA ở vùng promotor để xảy ra phiên mã (Hình 11.4). Khác với chất ức chế trong điều hòa âm tính, phức hợp cAMP-CRP là chất điều hòa dương tính. Các thí nghiệm ở điều kiện in vitro cho thấy: mRNA lac được tổng hợp chỉ khi có cAMP vòng và không có chất ức chế. Khi vắng mặt phức hợp cAMP-CRP, RNA polymerase chỉ bám lỏng lẽo vào promotor. Vì vậy hiếm khi dẫn đến phiên mã vì không có sự tương 203

tác đúng giữa RNA polymerase và promotor. Nhưng RNA polymerase được kích thích gắn vào promotor khi cAMP-CRP được gắn vào DNA. Những kết quả này giải thích chức năng lactose và glucose cùng nhau tham gia điều hòa phiên mã operon lac như thế nào. 3. Điều hòa âm tính operon tryptophan

Hình 11.5 Điều hòa của operon trp ở E. coli A. Protein aporepressor không bám được vào operator, phiên mã xảy ra. B. Khi có đủ tryptophan, phức hợp aporepressor và tryptophan làm chất ức chế hoạt động gắn được vào operator, sự phiên mã bị kìm hãm.

204

Operon tryptophan (trp) của E.coli chứa các gene cấu trúc mã hóa cho các enzyme tông hợp amino acid tryptophan. Operon này được điều hòa theo cách sau: khi tryptophan có mặt đầy đủ trong môi trường sinh trưởng, sự phiên mã của operon bị ức chế. Khi sự cung cấp tryptophan bị thiếu, sự phiên mã xảy ra. Sự điều hòa của operon lactose tương tự với operon lactose, vì sự tổng hợp mRNA được điều hòa âm tính nhờ chất ức chế. Tuy nhiên, khác với điều hòa ở operon lac, tryptophan hoạt động như chất đồng kìm hãm, kích thích chất ức chế gắn vào operator ngừng sự tổng hợp. Operon tryptophan hoạt động theo kiểu ức chế, điều hòa âm tính. Tryptophan được tổng hợp qua 5 giai đoạn, mỗi giai đoạn có sự xúc tác của một enzyme đặc biệt. Các gene mã hóa cho các enzyme này nằm kề nhau trên nhiễm sắc thể của E.coli.. Đó là các gene trpE, trpD, trpC, trpB, trpA. Các enzyme được dịch mã từ một phân tử mRNA đa gene. Vùng mã hóa gene E được dịch mã trước tiên. Phía trước trpE về đầu 5' có promotor, operator và 2 vùng xếp lần lượt là leader (trpL) và đoạn kìm hãm phiên mã attenuator (trpa, không phải là trpA). Gene ức chế trpR nằm xa operon, tổng hợp protein aporepressor, là chất kìm hãm mà riêng nó không có hoạt tính. Khi tryptophan dư thừa, nó kết hợp với aporepressor tạo chất kìm hãm có hoạt tính, gắn vào operator của operon tryptophan làm dừng phiên mã các gene cấu trúc. Khi nồng độ tryptophan thấp, nó tách khỏi phức hợp kìm hãm và aporepressor mất hoạt tính. Lúc này operator mở ra, RNA polymerase dịch mã 5 gene cấu trúc để tổng hợp 5 enzyme tạo tryptophan. (Hình 11.5.). 4. Phiên mã dở (Attenuation) Kiểu điều hòa thứ hai được phát hiện ở operon tryptophan được gọi là attenuation. Nó dùng sử dịch mã để điều khiển sự phiên mã. Khi có mặt tryptophan nội bào, ngay cả với nồng độ thấp, sự dịch mã một phần vùng leader của mRNA ngay khi vừa được tổng hợp, kết quả làm dừng sự phiên mã trước khi gene cấu trúc đầu tiên của operon được sao chép. Attenuation là kết quả sự tương tác giữa các trình tự DNA trong vùng leader của bản phiên mã trp. Ở tế bào kiểu dại, sự phiên mã operon trp thường được bắt đầu. Tuy nhiên khi có mắt một lượng nhỏ tryptophan, hầu hết phân tử mRNA kết thúc ở vùng 28 base đặc biệt ở trong trình tự leader. Kết quả của sự kết thúc sớm này tạo phân tử mRNA chứa 140 nucleotide chấm dứt một đoạn ngắn của các gene mã hóa cho các enzyme trp. Vùng 28 205

base xảy ra sự kết thúc được gọi attenuator. Trình tự base của vùng này thường có các tính chất điểm kết thúc, gồm dạng đoạn và vòng (stem-loop) trên mRNA theo sau là trình tự của 8 uridine. Trình tự leader có các đặc điểm: - Một vùng có codon AUG và phía sau là codon kết thúc UGA, mã hóa cho một polypeptide chứa 14 amino acid được gọi là leader polypeptide. - Hai codon tryptophan ở vị trí 10 và 11 trên mRNA của leader polypeptide. Trình tự lặp lại ngắn này có ý nghĩa trọng điều hòa. - Bốn đoạn của RNA leader là vùng 1, 2, 3 và 4 tạo thành do khả năng kết cặp của các base với nhau. Các base ở vùng 1 kết cặp với vùng 2, vùng 3 kết cặp với vùng 4 (Hình 11.6).

Hình 11.6 A. Sơ đồ phiên mã của leader trp B. Chi tiết cấu trúc của 2 codon trp ở vòng 1-2

206

Khi sự kết cặp xảy ra ở dạng này, sự phiên mã kết thúc ở đoạn đi qua uridine phía trước nucleotide 140. Kiểu kết cặp này xảy ra ở mRNA leader được tinh sạch. - Một kiểu kết cặp biến đổi có thể xảy ra, trong đó các base vùng 2 kết cặp với vùng 3 nhờ các cặp base ở 2 vùng này gần như bổ sung nhau (Hình 11.6B). Qua mô hình kết cặp base biến đổi này (3-4 hoặc 2-3), sự tổ chức trình tự mRNA có thể điều hòa phiên mã qua dịch mã của leader polypeptide (Hình 11.7). Khi vùng leader được phiên mã, sự dịch mã leader polypeptid cũng bắt đầu. Vì có 2 codon trptophan trong trình tự mã hóa, nên sự dịch mã nhạy cảm với số lượng tRNAtrp đưa vào. Nếu môi trường cung cấp đầy đủ tryptophan, ribosome trượt qua codon tryptophan và đi vào vùng 2 (Hình 11.7B). Sự có mặt của ribosome loại bỏ khả năng kết cặp của vùng khoảng 10 base ở mỗi phía của codon đang dịch mã. Sự có mặt của ribosome ở vùng 2 ngăn cản nó kết cặp với vùng 3. Trong trường hợp này vùng 3 kết cặp với vùng 4, tạo ra điểm kết thúc phiên mã. Sự phiên mã kết thúc khi qua các uridine nằm phía sau vùng 4.

trp codons

A

B
Kết thúc phiên mã

C

Sự kết cặp trong RNA ở nồng độ thấp của tryptophan

RNA polymerase

Phiên mã tiếp tục

Sự kết cặp trong mRNA

Sự kết cặp trong RNA ở nồng độ cao của tryptophan

Hình 11.7 Phiên mã dở (attenuation) của operon trp ở E. coli A. Ở mRNA tự do có sự kết cặp base giữa 1-2 và 3-4 B. Ở nồng độ cao của tryptophan, ribosome tiến đến vùng 2 và sự kết cặp 3-4 làm kết thúc phiên mã C. Ở nồng độ tryptophan thấp, ribosome ở vùng codon trp cho phép kết cặp 2-3 và phiên mã không bị kết thúc sau khi qua vùng 4

207

Khi số lượng tRNAtrp không đủ, sự dịch mã leader polypeptide bị dừng lại đột ngột ở các codon tryptophan. Sự dùng lại này ngăn cản ribosome tiến vào vùng 2, vì vậy vùng 2 được tự do sẽ kết cặp với vùng 3 làm cản trở sự hình thành cấu trúc kết thúc. Vì vậy phân tử trp mRNA hoàn chỉnh được tạo thành, chứa cả trình tự mã hóa cho gene cấu trúc. Tóm lại, attenuation là cơ chế điều hòa tinh tế trên cơ sở điều hòa âm tính: Khi tRNAtrp đến đủ cung cấp cho sự dịch mã leader polypeptide, sự phiên mã bị dừng, các trp enzyme không được tổng hợp. Khi nồng độ tRNAtrp quá thấp, sự phiên mã xảy ra cho đến hết, các trp enzyme được tạo nên. Nhiều operon chịu trách nhiệm tổng hợp các amino acid khác (như operon leucine, isoleucine, phenylalanine, histidine) cũng được điều hòa nhờ attenuator với chức năng tạo ra vùng kết cặp biến đổi ở bản phiên mã. Ở operon histidine vùng mã hóa của leader polypeptide chứa 7 codon histidine kế nhau. Ở operon phenylalanine vùng mã hóa cho leader polypeptide chứa 7 codon phenylalanin chia 3 nhóm. Điều hòa kiểu attenuation không thể xảy ra ở eukaryote vì ở eukaryote sự phiên mã và dịch mã không xảy ra đồng thời. Sự phiên mã xảy ra trong nhân, còn sự dịch mã xảy ra ở tế bào chất. Điều hòa ở operon lac và operon trp là ví dụ về một trong số các cơ chế quan trọng điều hòa hoạt động gene ở mức phiên mã của prokaryote.

III. Điều hòa biểu hiện gene ở eukaryote
Điều hòa hoạt động gene ở eukaryote phức tạp hơn nhiều so với prokaryote. Liên quan đến điều hòa, giữa prokaryote và eukaryote có một số điểm khác biệt: - Ở eukaryote thường chỉ có một chuỗi polypeptide đơn được dịch mã từ một phân tử mRNA hoàn chỉnh. mRNA đa gene (polycistronic) chỉ có ở prokaryote, không có ở eukaryote. - DNA của eukaryote gắn với protein histone tạo sợi chromatin, và gắn với protein phi histone. Chỉ có một đoạn nhỏ DNA để trần. Ở prokaryote, một vài protein có mặt trên nhiễm sắc thể bị gấp nếp, còn lại hầu hết DNA trần. 208

- Một đoạn DNA quan trọng của eukaryote chứa trình tự nucleotide lặp lại trung bình hoặc lặp lại cao. Một vài trình tự lặp lại được xếp nối tiếp thành các bản sao tiếp nối nhau, một vài trình tự khác lại không xếp nối tiếp. Vi khuẩn chứa đoạn DNA lặp lại nhỏ khác các gene của rRNA và tRNA nhân đoạn và một vài yếu tố di động. Một đoạn lớn DNA của eukaryote không được dịch mã. Hầu hết trình tự nucleotide không được mã hóa thành protein. Các eukaryote đơn bào, chẳng hạn nấm men là trường hợp ngoại lệ đối với tính chất này. Một vài gene eukaryote được biểu hiện và điều hòa nhờ cơ chế cấu trúc lại những đoạn DNA nhất định theo một phương thức được điều khiển và để tăng số lượng các gene đặc biệt này khi cần thiết. Các gene eukaryote là gián đoạn được phân thành các exon và intron. Các intron được cắt bỏ trong quá trình chế biến bản phiên mã RNA trước khi bắt đầu dịch mã. Ở eukaryote, mRNA được tổng hợp trong nhân và được chuyển qua màng nhân, vào tế bào chất mới được sử dụng. Tế bào vi khuẩn không có nhân được tách biệt với tế bào chất. 1. Sự biến đổi DNA Một số gene của eukaryote được điều hòa bằng sự biến đổi DNA. Chẳng hạn, những trình tự nhất định có thể được khuyếch đại hoặc cấu trúc lại trong genome hoặc các base có thể bị biến đổi về mặt hóa học. Một vài biến đổi được phục hồi, những biến đổi khác lại bền vững. Tuy nhiên những thay đổi bền vững này thường xảy ra ở tế bào sinh dưỡng, vì vậy chúng không được truyền lại cho thế hệ sau qua dòng giao tử. 2. Các promoter Tương tự vi khuẩn, các promoter của eukaryote cũng nằm phía trước điểm xuất phát trên mRNA và có những trình tự được bảo tồn trong tiến hóa. Hộp TATA định hướng cho mRNA bắt đầu phiên mã nằm ở phía trước điểm bắt đầu phiên mã khoảng 30 bp ở động vật có vú và 60 đến 120 bp ở nấm men. Hộp TATA hoạt động có hiệu quả cùng với 2 trình tự tương ứng ở phía trước khoảng 40 bp là CCAAT và 110 bp là trình tự giàu GC. Sự 209

thay đổi hộp TATA làm giảm tốc độ phiên mã. Hiệu quả của tốc độ phiên mã được đo bằng sự thay đổi của từng base trong promoter * Sự cấu trúc lại DNA theo chương trình (programmed DNA rearrangement) Sự cấu trúc lại trình tự DNA trong genome là cơ chế bất thường nhưng quan trọng, nhờ đó một số gene được điều hòa. 3. Những trình tự tăng cường phiên mã (Enhancer) Các thụ thể của hormone và những protein hoạt hóa phiên mã khắc gắn với trình tự DNA đặc biệt được biết là enhancer. Trình tự enhancer khá ngắn (thường chỉ 20 cặp base) được tìm thấy ở các vị trí khác nhau quanh gene được điều hòa. Hầu hết các enhancer nằm ở phía dưới điểm bắt đầu phiên mã (đôi khi cách xa nhiều kb). Những enhancer khác là các intron nằm trong vùng mã hóa và một vài enhancer thậm chí nằm ở đầu 3' của gene. Enhancer là thành phần nhạy cảm của tổ chức gene ở eukaryote vì chúng cho phép gene phiên mã chỉ khi nào có nhân tố hoạt hóa phiên mã đúng. Một vài enhancer phản ứng với các phân tử bên ngoài tế bào, chẳng hạn hormone steroid tạo phức hợp receptor-hormone. Những enhancer khác phản ứng với các phân tử được tạo thành ở bên trong tế bào (chẳng hạn trong suốt quá trình phát triển). Những enhancer này cho phép các gene dưới sự điều khiển của nó tham gia vào biệt hóa tế bào (diffrentiation) hoặc được biểu hiện theo cách đặc biệt ở trong mô. Nhiều gene ở dưới sự kiểm soát của các enhancer khác nhau, vì vậy chúng có thể phản ứng với nhiều tín hiệu phân tử khác nhau cả bên trong và bên ngoài.

Hình 11.8 Sơ đồ tổ chức các gene điển hình ở Eukaryote bậc cao

Qua sơ đồ ở hình 11.8 cho thấy nhiều yếu tố di truyền được tìm thấy ở trong gene của eukaryote điển hình. Phức hợp phiên mã bám vào promotor 210

bắt đầu tổng hợp mRNA. Vùng mã hóa của gene (exon) bị gián đoạn bởi một hoặc nhiều trình tự gián đoạn (intron), các trình tự này sẽ bị loại bỏ trong quá trình chế biến RNA. Sự phiên mã được điều hòa bởi các yếu tố enhancer, các yếu tố này phản ứng với các phân tử khác nhau có vai trò là tín hiệu cảm ứng. Enhancer có mặt ở cả phía trên và phía dưới promoter. Một vài enhancer có nhiều bản sao. Nhiều enhancer kích thích phiên mã bằng cách hình thành vòng DNA (DNA looping), liên quan đến sự tương tác giữa các vùng cách xa nhau có liên quan dọc sợi DNA. Các nhân tố cần thiết cho phiên mã bao gồm protein hoạt hóa phiên mã, nó tương tác với ít nhất một yếu tố protein có trong một hoặc nhiều phức hợp protein lớn, nhiều yếu tố. Yếu tố protein trong phức hợp này được biết như là yếu tố phiên mã chung (general transcription factors), vì chúng gắn liền với sự phiên mã của nhiều gene khác nhau. Nhân tố phiên mã chung ở eukaryote có tính bảo tồn cao trong tiến hóa. Một trong số các phức hợp này là TFIID, gồm protein gắn với hộp TATA (TATA-boxbinding protein) TBP gắn với promotor trong vùng TATA box. Ngoài TBP, phức hợp TFIID cũng gồm một số protein khác được gọi là những nhân tố gắn liền với TBP (TBP-associated factor) = TAFs. Chúng hoạt động như các chất trung gian qua đó ảnh hưởng của nhân tố hoạt hóa phiên mã được truyền đi. Sự phiên mã cũng yêu cầu một holoenzyme là RNA polymerase, chứa pol III tổ hợp ít nhất với 9 yếu tố protein khác. Ở nấm men, nhứng yếu tố này chứa nhân tố phiên mã TFIIB, TFIIF và TFIIH cũng như những protein khác. 4. Trình tự bất hoạt gene (gene silencing) Trình tự bất hoạt gene có thể nằm trước hoặc sau gene được điều hòa khoảng vài trăm cặp base. Chúng làm ngừng quá trình phiên mã bằng cách biến đổi histon và DNA. 5. Promoter chọn lọc (alternative promoter) Một vài gene eukaryote có hai hoặc nhiều promoter hoạt động trong những tế bào khác nhau. Những promoter khác nhau này dẫn đến những bản phiên mã khác nhau chứa cùng vùng mã hóa protein. Ví dụ ở Drosophila, gene mã hóa cho alcohol dehydrogenase, cấu tạo của nó trong genome có ba 211

vùng mã hóa protein bị gián đoạn bởi hai intron. Sự phiên mã ở ấu trùng sử dụng một promoter khác với sự phiên mã ở ruồi trưởng thành. Bản phiên mã ở ruồi giấm trưởng thành có trình tự dẫn đầu 5' dài hơn. Nhưng hầu hết trình tự này bị loại bỏ trong splicing. Promoter biến đổi làm sự điều hòa phiên mã có thể không phụ thuộc vào ấu trùng hay ruồi giấm trưởng thành. 6. Splicing chọn lọc Cùng promoter được sử dụng để phiên mã một gene, ở các loại tế bào khác nhau có thể tạo sản phẩm có số lượng khác nhau hoặc tạo ra những protein khác nhau. Điều này là do cùng một bản phiên mã có thể có quá trình chế biến ở các loại tế bào là khác nhau.

Hình 11.9 Sản phẩm các phân tử mRNA amylase khác nhau do quá trình splicing khác nhau xảy ra ở tế bào tuyến nước bọt và tế bào gan của chuột

Sự tổng hợp α-amylase ở chuột, những phân tử mRNA khác nhau được tạo ra từ cùng một gene vì những phần intron khác nhau bị loại bỏ trong quá trình chế biến RNA. Tuyến nước bọt của chuột tạo nhiều enzyme hơn gan mặc dù cùng một trình tự mã hóa được phiên mã. Ở mỗi loại tế bào, cùng 212

một bản phiên mã sơ cấp (primary transcript) được tổng hợp, nhưng có hai quá trình chế biến khác nhau (Hình 11.9). Trình tự mã hóa bắt đầu 50 bp bên trong exon 2 được tạo thành nhờ nối với exon 3 và những exon tiếp theo. Ở tuyến nước bọt bản phiên mã sơ cấp được chế biến để exon S nối với exon 2 (exon L bị loại đi như là intron 1 và 2). Ở gan exon L nối với exon 2, exon S bị loại đi cùng với intron 1. Exon S và exon L trở thành những trình tự 5' biến đổi của amylase mRNA và mRNA này được dịch mã ở những tỷ lệ khác nhau.

Câu hỏi và Bài tập
1. Sự biểu hiện gene ở prokaryote và eukaryote có đặc điểm gì? 2. Hãy nêu các kiểu điều hòa chủ yếu. 3. Trình bày cơ chế hoạt động của operon lactose. 4. Operon là gì? Nêu ý nghĩa của operon đối với sự biểu hiện của gene. 5. Gene mã hóa cho chất ức chế (repressor) của operon vi khuẩn có cần thiết phải ở gần gene cấu trúc không? Tại sao? 6. So sánh điều hòa âm tính và điều hòa dương tính của phiên mã. Cho ví dụ. 7. Khi có mặt glucose trong tế bào E. coli, nồng độ cAMP-CRP như thế nào? Sự gắn của cAMP-CRP vào DNA có ảnh hưởng đến sự gắn của repressor không? 8. Nêu ý nghĩa của hiện tượng phiên mã dở (attenuation). 9. Phân biệt giữa repressor và aporepressor và cho ví dụ. 10. Thế nào là splicing chọn lọc? Cho ví dụ minh họa.

Tài liệu tham khảo
Phạm Thành Hổ (2000). Di truyền học. NXB Giáo Dục. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (1998). Cơ sở di truyền học. NXB Giáo Dục. Hoàng Trọng Phán (1995). Di truyền học phân tử. Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế.

213

Anthony J. F. Griffiths, Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin, William M. Gelbart, David T. Suzuki, Jeffrey H. Miller. 2004. An introduction to genetics analysis. W.H. Freeman Publishers. Harlt D.L., Jones E.W. (1998). Genetics - Principle and analysis. Jone and Bartlett Publshers. Toronto, Canada. Stansfield W.D. 1991. Schaum’s outline of theory and problems of genetics. McGraw-Hill, Inc., New York.

214

Chương 12.

Đột biến gene, tái tổ hợp và các yếu tố di truyền di động
Mục tiêu của chương
Giới thiệu các kiểu đột biến gen, cơ chế phát sinh và hậu quả của chúng. Cơ chế sữa chữa các đột biến đã làm giảm tỷ lệ đột biến, duy trì tính ổn định của vật liệu di truyền. Ngoài đột biến gene, yếu tố di truyền vận động cũng là nhân tố làm tăng tần số đột biến

Số tiết: 3 Nội dung I. Đột biến gene
Đột biến gene là những biến đổi xảy ra bên trong cấu trúc gene. Mỗi đột biến gene dẫn đến sự thay đổi trình tự nucleotide tạo ra các allele khác nhau. Đột biến gene có thể xảy ra do biến đổi của trình tự nucleotide trong gene. Đột biến gene không phát hiện được khi quan sát tế bào học. Trong tự nhiên, tất cả các gene đều có đột biến được gọi là đột biến tự nhiên hay ngẫu phát (spontaneous mutation). Các đột biến tự nhiên thường xuất hiện rất ít. 1. Các kiểu đột biến gene Đột biến gene hay đột biến điểm: là các biến đổi rất nhỏ trên một đoạn DNA, thường liên quan đến một cặp base đơn của DNA hoặc một số ít cặp base kề nhau. Đột biến điểm làm thay đổi gene kiểu dại (wild-type gene),. Thực tế đột biến điểm hầu như làm giảm hoặc làm mất chức năng của gene hơn là làm tăng cường chức năng của gene. Về nguồn gốc, đột biến điểm được phân ra làm đột biến ngẫu nhiên (spontaneous) và đột biến cảm ứng (induced). Đột biến cảm ứng: là dạng đột biến xuất hiện với tần số đột biến tăng lên khi xử lý có mục đích bằng tác nhân đột biến hoặc tác nhân môi trường đã được biết. Đột biến ngẫu nhiên là đột biến xuất hiện khi không có sự xử 215

lý của tác nhân đột biến. Đột biến ngẫu nhiên được tính là tỉ lệ cơ sở của đột biến và được dùng để ước chừng nguồn biến dị di truyền tự nhiên trong quần thể. Tần số đột biến ngẫu nhiên thấp nằm trong khoảng 10 -5 - 10-8, vì vậy đột biến cảm ứng là nguồn đột biến quan trọng cho phân tích di truyền. Tác nhân đột biến được sử dụng phổ biến là nguồn chiếu xạ năng lượng cao (high-energy radiation) hoặc các hóa chất đặc biệt. Các dạng đột biến điểm: có hai dạng đột biến điểm chính trong phân tử DNA: + Đột biến thay thế cặp base (base substitution) + Đột biến thêm bớt cặp base (base insertion - base delection) Các đột biến này có thể phát sinh do ảnh hưởng của môi trường như ảnh hưởng của các tác nhân gây đột biến. 1.1. Đột biến thay thế cặp base Kiểu đột biến đơn giản nhất là thay thế một base, trong đó một cặp nucleotide trong gene được thay thế bằng một cặp nucleotide khác. Ví dụ: A được thay thế bằng G trong sợi DNA. Sự thay thế này tạo ra sự cặp base G-T. Ở lần sao chép tiếp theo tạo ra cặp G-C trong một phân tử DNA con và cặp A-T ở phân tử DNA con kia. Tương tự, đột biến thay thế A bằng T trên một sợi, tạo ra sự kết cặp tạm thời T-T. Kết quả sao chép tạo ra T-A trên một phân tử DNA con và A-T trên phân tử DNA con kia. Trong trường hợp hợp này, cặp base T-A là đột biến và cặp A-T không đột biến. Nếu sợi gốc DNA không đột biến có trình tự 5'-GAC-3', trên sợi đột biến có trình tự 5'-GTC-3' và sợi kia không đột biến có trình tự 5'-GAC-3'. Đột biến thay thế cặp base được chia làm hai loại: + Đột biến đồng hoán (transition mutations): Nếu một đột biến mà bazơ pyrimidine được thay thế bằng một pyrimidine và một purine thay bằng một purine. Đột biến đồng hoán có thể là: T → C hoặc C → T (Pyrimidine → pyrimidine) A → G hoặc G → A 216

(purine → purine) Đột biến đảo hoán (Transversion): Đột biến làm thay một pyrimidine thành một purine hay một purine được thay thế bằng một pyrimidine. Các đột biến đảo hoán: T → A, T → G, C → A hoặc C → G (Pyrimidine → purine) A → T, A → C. G → T hoặc G → C (Purine → pyrimidine) Như vậy có thể có 4 thay thế kiểu đột biến đồng hoán và có đến 8 thay thế kiểu đột biến đảo hoán. Nếu các thay thế này xảy ra với ngẫu nhiên xác suất như nhau, sẽ có tỷ lệ đột biến: 1 đồng hoán : 2 đảo hoán. Tuy nhiên trong thực tế, đột biến thay thế base có xu hướng nghiêng về đột biến đồng hoán, cho nên trong số các đột biến thay thế base tự phát thì tỷ lệ xảy ra đột biến là: 2 đồng hoán : 1 đảo hoán 1.2. Đột biến thêm hoặc bớt base (base-pair addition/deletion), còn gọi là indel mutation (insertion-deletion). Trường hợp đơn giản nhất của đột biến này là thêm hoặc mất một cặp base đơn. Đôi khi đột biến làm thêm hoặc mất đồng thời nhiều cặp base. Hậu quả của đột biến điểm đến cấu trúc và sự biểu hiện của gene Đột biến điểm xuất hiện trong vùng mã hóa chuỗi polypeptide của gene (a polypetide-coding part of a gene), chẳng hạn đột biến thay thế base đơn có thể gây nhiều hậu quả, nhưng tất cả đều có tác động lên mã di truyền theo 2 hướng: làm thoái hóa mã di truyền hoặc xuất hiện mã kết thúc quá trình dịch mã. Có các dạng: Đột biến đồng nghĩa (synonymous mutations): đột biến thay đổi một codon mã hóa acid amine thành codon mới mã hóa cho cùng acid amin đó. Đột biến đồng nghĩa cũng có thể xem là đột biến im lặng (silent mutations) Đột biến nhầm nghĩa (missense mutations), đôi khi còn gọi là đột biến không đồng nghĩa (nonsynonymous mutations): codon mã hóa cho một acid amin này bị thay đổi thành codon mã hóa cho một acid amin khác. Đột biến vô nghĩa (nonsense mutations): codon mã hóa cho một acid amin bị thay đổi thành codon kết thúc dịch mã (translation termination/stop codon). 217

Bảng 12.1 Đột biến điểm ở mức độ phân tử Kiểu đột biến Kết quả và ví dụ Purine được thay thế bằng một purine khác, pyrimidine được thay thế bằng một pyrimidine khác: A.T → G.C, G.C → A.T, C.G → T.A, T.A → C.G Transversion Purrin được thay thế bằng một pyrimidine hoặc một pyrimidine được thay thế bằng một purine: A.T→ C.G, A.T→ T.A, G.C→T.A, G.C→C.G T.A→G.C, T.A → A.T, C.G→ A.T, C.G→G.C Insertion-deletion Thêm vào hoặc mất đi một hoặc một số cặp base của DNA (thêm/mất base được gạch dưới) AAGACTCCT → AAGAGCTCCT AAGACTCCT → AAACTCCT

Ở mức độ DNA

Transition

Ở mức độ protein

Codon đặc biệt mã hoá cho cùng một acid amin: AGG → CGG Arg Arg Codon tạo thành mã hoá cho amino acid khác Mã hoá cho acid amin có cùng bản chất hoá học: AAA → AGA Lys (kiềm) Arg (kiềm)

Synonymous mutation Missense mutation Loại bảo thủ

Loại không bảo thủ

Mã hoá cho amino acid khác về bản chất hoá học: UUU → UCU Phenylalanin kỵ nước Serine Phân cực CAG → UAG Gln Stop

Nonsense mutation Frameshift mutation

Codon kết thúc chuỗi: Thêm vào một cặp base:

AAG ACT CCT → AAG AGC TCC T... Mất một cặp base: AAG ACT CCT → AAA CTC CT...

218

Mức độ ảnh hưởng của đột biến nhầm nghĩa và vô nghĩa lên chuỗi polypeptide khác nhau tùy trường hợp. Nếu đột biến nhầm nghĩa thay thế một acid amin này bằng một acid amin khác tương tự về mặt hóa học, được xem là đột biến thay thế bảo thủ (conservative substitution). Sự thay đổi này hầu như ít ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng protein. Ngược lại, nếu thay thế bằng một acid amin khác về phương diện hóa học gọi là nonconservative substitution, hầu hết đều gây ra sự thay đổi lớn ở cấu trúc và chức năng protein. Đột biến vô nghĩa sẽ dẫn đến sự kết thúc dịch mã sớm. Vì vậy chúng gây ra hậu quả tương ứng trên chức năng protein. Nếu đột biến vô nghĩa xảy ra càng ở gần đầu 3' của khung đọc mã, kết quả ít ảnh hưởng đến protein. Tuy nhiên nhiều đột biến vô nghĩa ở vùng này vẫn tạo ra các sản phẩm hoàn toàn bị mất hoạt tính.

Gen kiểu dại

Đột biến thay thế base

Đột biến dịch khung

Protein điều hòa không thể bám

Điểm đột biến trong trình tự không mã hóa

Hình 12.1 Hậu quả của đột biến điểm trong gene. Codon 1-4 nằm trong vùng mã hóa của gene

219

Giống với đột biến vô nghĩa, đột biến thêm bớt base gây hậu quả trên trình tự polypetide kể từ điểm bị đột biến (Hình 12.1). Trình tự trên mRNA được đọc theo từng khung gồm ba base (codon) một lúc. Mất hoặc thêm base sẽ làm thay đổi khung đọc trong quá trình dịch mã từ điểm bị đột biến cho đến kết thúc theo khung mới. Vì vậy loại đột biến này được gọi là đột biến dịch khung (frameshift mutations). Đột biến này tạo ra trình tự acid amin kể từ điểm bị đột biến cho đến kết thúc khác với trình tự acid amin gốc. Đột biến dịch khung gây ra sự mất hoàn toán cấu trúc và chức năng của protein bình thường. Trường hợp đột biến xảy ra ở trình tự điều hòa và các trình tự không mã hóa khác (Hình 12.1). Những phần đó của gene không trực tiếp mã hóa cho protein mà chứa nhiều điểm bám DNA chủ yếu cho protein xen vào, đó là những trình tự không nhạy cảm cho sự biểu hiện của gene hoặc cho hoạt tính của gene. Ở mức độ DNA, những điểm mất đi (docking) gồm những điểm mà RNA polymerase và những nhân tố gắn kết của nó bám vào, cũng như những điểm mà protein điều hòa phiên mã đặc trưng gắn vào. Ở mức độ RNA, những docking quan trọng thêm vào gồm điểm bám của ribosom (ribosome-binding site) trên mRNA vi khuẩn, những điểm nối đầu 5' và 3' để gắn các exon ở eukaryote và các điểm có vai trò cho điều hòa dịch mã và định vị mRNA đến vùng đặc biệt trong tế bào. Nhìn chung hậu quả chức năng của bất kì đột biến điểm nào ở vùng như thế đều phụ thuộc vào việc làm gián đoạn (hoặc tạo ra) một điểm bám. Đột biến làm gián đoạn ở những điểm đó có khả năng làm thay đổi phần biểu hiện của gene dựa vào sự thay đổi số lượng sản phẩm được biểu hiện ở một thời điểm nhất định hoặc ở một mô nhất định. hay bằng sự thay đổi phản ứng với những tín hiệu (cue) của môi trường nhất định. Ngược lại, đột biến ở một vài điểm bám có thể hoàn toàn phá hủy một giai đoạn càn cho sự biểu hiện bình thường của gene, như điểm bám của mRNA polymerase hoặc là nhân tố splicing. Vì vậy nó làm bất hoạt sản phẩm của gene hoặc ngăn cản sự hình thành sản phẩm. Cần phân biệt giữa những thay đổi xảy ra của một đột biến gene đó là sự thay đổi trình tự DNA của gene với sự thay đổi ở mức độ kiểu hình. Nhiều đột biến điểm trong triình tự không mã hóa làm ít thay đổi hoặc không thay đổi trên kiểu hình như đột biến giữa điểm bám DNA cho protein điều hòa hoặc thay đổi những điểm khác trong gene làm thay đổi chức năng của chúng. 220

2. Cơ chế gây đột biến điểm Khi kiểm tra dãy đột biến được gây tạo bới các tác nhân đột biến khác nhau cho thấy mỗi tác nhân đột biến được đặc trưng bởi một đặc tính đột biến khác nhau hay "preference" về cả một dạng đột biến nhất định và một điểm đột biến nhất định, được gọi là điểm dễ xảy ra đột biến (mutational hot spots). Đặc tính đột biến như thế được chú ý lần đầu tiên ở locus rII của bacteriophage T4. Tác nhân đột biến hoạt động ít nhất qua ba cơ chế khác nhau: chúng có thể làm thay thế một base trong DNA; làm biến đổi một base gây kết cặp nhầm với một base khác; làm sai hỏng một base, dẫn đến không thể kết cặp với bất kỳ base nào trong điều kiện bình thường. Đột biến thay thế base: một vài hợp chất hóa học tương tự nitrogen base bình thường của DNA, đôi khi chúng có thể gắn vào DNA thay cho base bình thường. Những chất như thế được gọi là các chất tương đương với base (base analogs). Các chất tương đương này kết cặp không như sự kết cặp của các base bình thường. Vì vậy chúng có thể gây ra đột biến do gắn vào một nucleotide không đúng trong quá trình sao chép. Để hiểu hoạt động của các chất tương đương base, trước hết cần phải xem xét khuynh hướng tự nhiên của các base đối với sự hình thành các dạng khác nhau. Mỗi base trong phân tử DNA có thể xuất hiện ở một trong số nhiều dạng được gọi là tautomers, chúng là các đồng phân khác nhau ở vị trí vị trí nguyên tử và những liên kết giữa các nguyên tử. Dạng keto của mỗi base thường có trong DNA (Hình 12.2), trong khi dạng imino và enol của base là hiếm. Tautomer imino hoặc enol có thể kết cặp sai với base tạo một kết cặp nhầm (mispair). Khả năng kết cặp nhầm như thế gây ra đột biến trong quá trình sao chép được chú ý đầu tiên bởi Watson và Crick khi các tác giả này nghiên cứu công thức về mô hình cấu trúc DNA. Sự kết cặp nhầm có thể sinh ra ngẫu nhiên, nhưng cũng có thể sinh ra khi base bị ion hóa. Tác nhân gây đột biến 5-Bromouracil (5-BrU) là chất tương đương với thymine, có brome ở vị trí carbon số 5 thay cho nhóm -CH 3 của thymine. Hoạt tính của nó dựa trên quá tình inolization và ionization. Ở dạng keto, 5-BrU kết cặp với adenin như trường hợp thymine. Tuy nhiên, sự có mặt của nguyên tử bromine làm thay đổi một cách có ý nghĩa sự phân bố electron ở vòng base. Vì vậy 5-BrU có thể chuyển sang dạng enol và dạng ion, và nó có thể kết cặp với guanine như trường hợp cytosine tạo ra cặp 5-BrU-G. Trong lần nhân đôi tiếp theo G kết cặp với C, tạo cặp G-C 221

thay cho cặp A-T. Kết quả gây ra đột biến đồng hoán. Tương tự 5-BrU cũng có thể gây ra đột biến đồng hoán A-T thay cho cặp G-C.

Hình 12.2 Chứng minh một vài kết cặp nhầm có thể xảy ra do kết quả của sự thay đổi 1 tautomer thành 1 tautomer khác

Một hóa chất gây đột biến khác là 2-amino-purine (2-AP), là hóa chất tương đương adenine, có thể kết cặp với thymine. Khi bị proton hóa, 2-AP có thể kết cặp nhầm với cytosine, có thể gây ra thế hệ sau đột biến đồng hoán G-C thay cho A-T do kết cặp nhầm với cytosine trong lần sao chép tiếp theo. Thay thế base (base alteration)

Hình 12.3 Sự kết cặp nhầm chuyên biệt do đột biến cảm ứng alkyl hoá

222

Một vài tác nhân đột biến không gắn vào DNA, mà lại làm biến đổi base gây ra sự kết cặp sai. Tác nhân alkyl được sử dụng phổ biến như là tác nhân đột biến, chẳng hạn như ethylmethanesulfonate (EMS) và nitrosoguanidine (NG) gây đột biến theo cách này. Những tác nhân như thế sẽ thêm nhóm alkyl (nhóm ethyl trong trường hợp EMS và nhóm methyl trong trường hợp NG) ở nhiều vị trí trên cả 4 base. Tuy nhiên, đột biến hầu như chỉ xảy ra khi nhóm alkyl được thêm vào ở oxy số 6 của guanine tạo ra O-6-alkylguanine. Sự alkyl hóa này dẫn đến sự kết cặp nhầm với thymine (Hình 12.3). Kết quả sinh ra đột biến đồng hoán G-C→A-T trong lần sao chép tiếp theo. Tác nhân xen vào giữa (intercalating agents) là nhóm tác nhân quan trong khác gây biến đổi DNA. Nhóm của các hợp chất này bao gồm proflavin, acridin cam và một nhóm các hợp chất hóa học khác. Các tác nhân này là nhóm các phân tử bắt chước các cặp base và có thể xen vào giữa các nitrogen base ở lõi chuỗi xoắn kép DNA. Ở vị trí xen vào này chúng gây sự thêm vào hoặc mất đi một cặp nucleotide. Sai hỏng base: Một số lớn tác nhân đột biến gây sai hỏng một hoặc nhiều base. Vì vậy không thể kết cặp với base đặc trưng. Kết quả làm cản trở sự sao chép vì DNA polymerase không thể tiếp tục quá trình tổng hợp DNA qua những base sai hỏng. Ở E.coli quá trình này xảy ra đòi hỏi hoạt tính của hệ thống SOS. Hệ thống này được kích thích như là một phản ứng khẩn cấp ngăn cản sự chết tế bào khi DNA bị sai hỏng nặng. * Cơ chế của đột biến ngẫu nhiên Đột biến ngẫu nhiên xảy ra do nhiều nguyên nhân: gồm sai hỏng trong quá trình sao chép DNA, các tổn thương ngẫu nhiên, sự chen vào của yếu tố di động. Đột biến ngẫu nhiên hiếm nên khó xác định cơ chế cơ bản. Tuy nhiên, một vài hệ thống chọn lọc cho phép thu được đột biến ngẫu nhiên và phân tích ở mức độ phân tử. Từ bản chất của những thay đổi trình tự có thể suy ra quá trình dẫn đến đột biến ngẫu nhiên. Những sai hỏng ngẫu nhiên (spontaneous lesions) đến DNA có thể sinh ra đột biến. Hai tổn thương ngẫu nhiên thường xuất hiện nhất: depurination và deamination, trong đó depurination phổ biến hơn. Depurination do tác dụng của aflatoxin, làm mất một base purine. Ngoài ra, quá trình mất purine cũng xảy ra một cách tự nhiên. Một tế bào động vật mất ngẫu nhiên khoảng 10.000 purine của DNA trong một thế hệ 223

tế bào khoảng 20 giờ ở 37oC. Nếu tổn thương này được giữ lại, dẫn đến sai hỏng di truyền đáng kể vì trong quá trình sao chép, vị trí mất purine không thể định rõ được loại base nào. Trong những điều kiện nhất định một base có thể chèn vào tạo ra đột biến. Deamination của cytosine tạo ra uracil. Uracil sẽ kết cặp với adenin trong quá trình sao chép, kết quả tạo ra đột biến đồng hoán G-C→ A-T. Deamination 5-methylcytosine tạo ra thymine (Hình 12.4). Quá trình sao chép tạo ra đột biến đồng hoán chuyển C thành T. Ngoài 2 quá trình gây sai hỏng như trên, sự oxy hóa tạo ra các base bị sai hỏng là dạng tổn thương thứ ba.. Dạng oxygen hoạt động như gốc superoxid (O2.-), hydrogen peroxide (H2O2) và gốc hydroxyl (.OH) được tạo ra do sản phẩm của quá trình chuyển hóa (aerobic metabolism). Các dạng này có thể gây tổn thương oxy hóa đến DNA, kết quả tạo ra đột biến.

Hình 12.4 Deamination của Cytosine (a) và 5-methylcytosine

Các sai hỏng trong sao chép DNA cũng là nguồn đột biến khác. Thay thế base: sai hỏng trong sao chép DNA có thể xảy ra khi có một cặp nucleotide ghép không chính xác (như A-C) tạo ra trong quá trình tổng hợp DNA dẫn đến sự thay thế một base. 224

Đột biến thêm vào và mất base: Một loại sai hỏng sao chép khác dẫn đến thêm vào hoặc mất đị một hoặc một số cặp base. Trong trường hợp số base thêm vào hoặc mất đi không chia hết cho 3, sẽ tạo ra đột biến dịch khung trong vùng mã hóa protein.

II. Sửa chữa và bảo vệ DNA
1. Cơ chế sửa sai sinh học Tế bào sống có hàng loạt hệ thống sai hỏng DNA theo nhiều cách khác nhau. Tỷ lệ đột biến tự nhiên thấp do nhờ tính hiệu quả của hệ thống sửa sai này. Sai hỏng của hệ thống sửa sai này dẫn đến tỷ lệ đột biến cao. 1.1. Quang phục hoạt (photoreactivation) hay sửa sai nhờ ánh sáng (light repair) Sau khi xử lý tia tử ngoại gây đột biến, nếu đưa ra ánh sáng thì phần lớn sai hỏng được phục hồi nhờ enzyme photolyase. Enzyme này gắn vào photodimer cắt nó thành các monomer dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời có bước sóng 320-370 nm. Sau đó phục hồi các base ban đầu. (Hình 12.5).

Hình 12.5 Sự tạo thành và sự loại bỏ dimer thymine

225

1.2. Sửa sai bằng làm mất nhóm alkyl (dealkylation) Enzyme alkyltransferasecos thể sửa trực tiếp các sai hỏng. Chúng cắt nhóm alkyl từ chất nitrosoguanine và ethylmethnesulfonate và gắn vào vị trí O-6 guanine. Enzyme methyltransferase của E. coli có khả năng chuyển nhóm methyl từ chất O-6 methylguanine sang gốc cistein trên phân tử protein. Tuy nhiên hệ thống sửa sai này có thể bảo hòa nếu mức độ alkyl hóa đủ cao. * Sửa sai bằng cắt bỏ (excision repair pathway) Phần lớn các cơ chế sửa sai khác thực hiện theo lối cắt bỏ (excistion repair) không cần ánh sáng nhờ các nuclease, sau đó thay vào các base đúng. Có thể xảy ra theo nhiều cách: + Cắt các base (base excision repair) Sự cắt bỏ các base sai hỏng nhờ các enzyme DNA glycosylase. Các enzyme này nhận biết các base bị biến đổi và các điểm mất purine hay mất pyrimidine và thủy giải liên kết Nglycosilic nối base với đường. Rồi enzyme AP endonuclease cắt liên kết đường và phosphate gần base bị biến đổi. Sau đó enzyme thứ ba, deoxyribophosphodiesterase loại bỏ từng nucleotide kế tiếp nhau ở đoạn bị hỏng. Sau đó, DNA polymerase lấp đầy khoảng trống với các nucleotide bổ sung với sợi khuôn còn lại. Enzyme DNA ligase sẽ gắn các khe hở giữa 2 đầu 3'-5' (Hình 12.6). Trong tế bào tồn tại một số DNA glycosylase. Chẳng hạn, enzyme uracil-DNA glycosylase cắt uracil khỏi DNA. Uracil tạo thành do đột biến mất nhóm amin ngẫu nhiên ở cytosine, dẫn đến đột biến đồng hoán thay C bằng T. Enzyme này phát hiện ra uracil trên DNA như là một bất thường, chúng sẽ cắt bỏ và sửa sai. + Cắt các nucleotide: Sự cắt bỏ vùng có nhiều pyrimidine dimer được thực hiện nhờ enzyme exinuclease (enzyme rạch mạch hay enzyme tạo khấc trên DNA) như phức hợp 3 enzyme được mã hóa bới gene uvr ABC của E. coli. Phức hợp này cắt đoạn 12 nucleotide trên một mạch: 8 nucleotide từ một đầu bị sai hỏng và 4 nucleotide của đầu còn lại. Khoảng trống của 12 nucleotide này sẽ được lấp đầy nhờ enzyme DNA polymerase I dựa vào mạch đơn bổ sung kia của trình tự DNA gốc. DNA ligase sẽ gắn vào các khe hở.

226

Hình 12.6 Sửa sai bằng cắt bỏ nucleotide

+ Đọc sửa đối với các base bắt cặp sai Cơ chế đọc sửa đối với các base bắt cặp sai (proofreading for base-pair matching) được thực hiện trong sao chép DNA. Trong quá trình sao chép, trước khi thực hiện phản ứng polymer hóa nối các nucleotide, các nucleotide triphotphate mới phải bắt cặp bổ sung với mạch khuôn. Nếu sự bắt cặp sai xảy ra, DNA polymerase sẽ loại bỏ nucleotide bắt cặp sai. Ngay cả trước khi nucleotide mới ráp vào, enzyme dò lại cặp base cuối, nếu chúng không bắt cặp thì sự polymer hóa tiếp theo bị dừng. Cặp nucleotide ở đầu cuối 3' bắt cặp sai sẽ bị loại bỏ nhờ hoạt tính exonuclease3'→5' của DNA polymerase. Khi đã bắt cặp đúng, quá trình polymer hóa mới được tiếp tục. Hoạt tính đọc sửa đối với các base bắt cặp sai là đặc tính của nhiều DNA polymerase đảm bảo cho sự kéo dài chính xác của mạch đạng được tổng hợp. + Sửa sai dựa vào tính tương đồng (Homology-dependent repair system)

227

Hình 12.7 Mô hình bẻ gãy sợi đôi nhờ trao đổi chéo

228

Một hệ thống sửa sai quan trọng đã phát hiện tính chất bổ sung đối song song của 2 mạch đơn DNA để phục hồi đoạn sai hỏng trở lại trạng thái bình thường ban đầu. Trong hệ thống này, đoạn DNA sai hỏng bị cắt bỏ và thay bằng một đoạn nucleotide mới được tổng hợp bổ sung với sợi khuôn đối diện. Sự sửa sai xảy ra qua sợi khuôn và nguyên tắc của sao chép DNA bảo đảm sự sửa sai hoàn thành với độ chính xác cao - đó là sự giải phóng sai hỏng (error-free). Có 2 hệ thống chủ yếu để loại bỏ sai hỏng: Hệ thống sửa chữa sai hỏng phát hiện ra trước khi sao chép và hệ thống sửa chửa sai hỏng phát hiện trong quá trình diễn biến sao chép (sửa sai sau sao chép). + Sửa sai đứt mạch kép (repair of double-strand break) Khi cả 2 sợi của chỗi xoắn kép bị đứt ở cùng một vị trí, được gọi là đột biến đứt mạch đôi, có thể gây ra sai hình nhiễm sắc thể, làm chết tế bào hoặc tạo ra trạng thái tiến ung thư. Tế bào sử dụng nhiều protein và con đường sửa sai đứt gãy mạch đôi là thực hiện tái tổ hợp trong giảm phân. Quá trình sửa chữa do trao đổi chéo trong giảm phân xảy ra như sau (Hình 12.7): Trên một nhiễm sắc thể xảy ra sự đứt mạch đôi và kết quả ăn mòn các đầu mút ở đoạn ngắn của DNA sợi đơn. Đầu 3' của một trong những sợi này "xâm lấn" vào một chromatid. Đoạn xâm lấn làm mồi cho tổng hợp các base bị mất của nó nhờ sử dụng sợi đối song song của chromatid như là sợi khuôn. Sự tổng hợp mới này sẽ tạo ra một vòng sợi đơn lai với một sợi đơn không xâm lấn. Vì vậy tạo ra một vùng dị hợp tử nhỏ "Aa" và sử dụng như mạch khuôn để khôi phục các base bị mất trên sợi đó. DNA polymerase sẽ lấp đầy chỗ trống và enzyme ligase sẽ nối các đầu mút xảy ra trong cấu trúc đặc biệt giống với trao đổi chéo 2 sợi đơn. Cấu trúc này cũng chứa các đoạn bắt cặp không tương đồng đơn giản. Trao đổi chéo sợi đơn được gọi là cấu trúc Holliday (Holliday structure) do Holliday phát hiện vào những năm 1960. + Hệ thống SOS Ở tế bào vi khuẩn hoặc tế bào eukaryote bị sai hỏng nặng do chiếu tia uv, tia X hoặc do tác dụng của các hóa chất gây đột biến, hệ thống sửa sai khẩn cấp được khởi động. Ở E. coli, hệ thống này có liên quan với hai protein được mã hóa bởi gene lexA và recA. Protein lexA là một chất ức chế, 229

nó gắn vào hộp SOS, chồng lấp các promotor của các gene SOS, ngăn cản sự phiên mã nhóm các gene của hệ thống SOS. Một vài sản phẩm của DNA bị tổn thương sẽ làm hoạt hóa enzyme protease recA. Protein recA bị hoạt hóa sẽ cắt bỏ protein lexA, cho phép các gene của hệ thống SOS phiên mã. Phản ứng của hệ thống SOS xảy ra trong thời gian ngắn nhưng phức tạp. Nó bao gồm các quá trình làm tăng hoạt tính tái tổ hợp, thay đổi trong khởi sự sao chép, ức chế nuclease và kích thích phục hồi sao chép và chuyển sai hỏng thành sửa sai úp sấp (error-prone replication). Tế bào bây giờ sẽ xảy ra sự sao chép DNA nhanh hơn bình thường. Nếu sửa sai không kịp, tế bào phải chấp nhận hoặc bị đột biến hoặc bị chết.

III. Các yếu tố di truyền vận động (Transposable genetic elements)
1. Các yếu tố di truyền vận động ở prokaryote Trình tự đoạn xen (insertion sequence) của vi khuẩn Trình tự xen đoạn là một đoạn DNA của vi khuẩn di chuyển từ một vị trí trên nhiễm sắc thể đến vị trí mới trên cùng nhiễm sắc thể hoặc trên nhiễm sắc thể khác. Khi xen vào giữa gene, yếu tố IS làm gián đoạn trình tự mã hóa và làm bất hoạt sự biểu hiện của gene. Một số trường hợp, có tín hiệu kết thúc phiên mã và dịch mã, yếu tố IS làm cản trở sự biểu hiện ở sau promotor trong cùng operon.. Yếu tố IS được tìm thấy đầu tiên ở operon gal của E. coli, chia làm bốn nhóm: IS1, IS2, IS3 và IS4. Chúng có thể phân bố rãi rác trên nhiễm sắc thể chính của vi khuẩn và trên các plasmid. Ví dụ yếu tố IS1 có khoảng 5-8 bản sao trên nhiễm sắc thể với chiều dài 768 bp. Tất cả các yếu tố IS đều chứa đoạn DNA mã hóa cho protein, được gọi là transposase, là enzyme cần thiết cho sự di chuyển của yếu tố IS từ một vị trí trên nhiễm sắc thể đến vị trí khác. Đoạn gene này nằm giữa 2 đoạn lặp lại đảo ngược (inverted repeat - IR) ngắn. Ví dụ yếu tố IS1 có khoảng 5-8 bản sao trên nhiễm sắc thể với chiều dài 768 bp, đoạn lặp lại đảo ngược có kích thước 18-23 bp, yếu tố IS2 có 5 bản sao và các yếu tố IS khác. Yếu tố IS là những vùng của các trình tự xác định, chúng là những vị trí xảy ra trao đổi chéo. Ví dụ: Sự tái tổ hợp của plasmid và nhiễm sắc thể của E. coli tạo ra những chủng Hfr xảy ra qua trao đổi chéo đơn giữa yếu tố IS trên plasmid và yếu tố IS trên nhiễm sắc thể. 230

Bảng 12.2. Một vài trình tự xen vào và kích thước của chúng
Trình tự xen vào IS1 IS2 Số bản sao trong E. coli 5-8 bản sao trên nhiễm sắc thể 5 bản sao trên nhiễm sắc thể, 1 bản sao trên plasmid IS3 5 bản sao trên nhiễm sắc thể, 2 bản sao trên plasmid IS4 IS5 1-2 bản sao trên nhiễm sắc thể, Chưa biết 1400 1250 16-18 Ngắn 1400 32-38 Chiều dài (bp) 768 1327 Đoạn lặp lại đảo ngược (bp) 18-23 32-41

1.1. Gene nhảy của prokaryote Các yếu tố IS riêng lẻ không chỉ có khả năng tự di chuyển mà khi hai yếu tố này nằm đủ gần nhau thì chúng có thể vận động như một đơn vị hoàn chỉnh và mang theo các gene nằm giữa chúng. Cấu trúc phức tạp này được gọi là transposon. Có hai kiểu transposon ở vi khuẩn:

Hình 12.8 Đặc trưng về cấu trúc của transposon hỗn hợp (composite transposon) và transsposon đơn giản (simple transposon)

231

Transposon hỗn hợp (composite transposon) chứa nhiều gene nằm giữa 2 trình tự IS gần nhau, có hướng ngược nhau tạo ra tình tự lặp lại đảo ngược (inverted repeat - IR). Một trong 2 yếu tố IS mã hóa cho transposase xúc tác cho sự chuyển vị của cả transposon. Chẳng hạn Tn10 là transposon hỗn hợp mang gene mã hóa cho tính kháng kháng sinh tetracyline. Gene này nằm giữa hai yếu tố IS10 có hướng ngược nhau. Transposon đơn giản (simple transposon) ở giữa các trình tự IR, nhưng những trình tự này ngắn (<50 bp) và không mã hóa cho transposase. Sự chuyển vị của chúng không phải là kết quả của sự liên kết với yếu tố IS. Các transposon đơn giản mã hóa transposase riêng thêm vào để mang các gene của vi khuẩn. Tn3 là một transposon đơn giản (Hình 12.8). Transposon hỗn hợp và transposon đơn giản đều chứa các gene thêm vào liên quan đến chức năng mới ở tế bào vi khuẩn. Cả hai loại này thường được gọi chung là transposon. Transposon dài hơn yếu tố IS, thường chứa vài kb), chúng chứa các gene mã hóa cho protein thêm vào. 1.2. Cơ chế của sự chuyển vị Đầu tiên, transposase cắt vết hình chữ chi qua 5 cặp base (khác với sự cắt của enzyme restriction endonuclease) ở vi trí DNA mục tiêu (target site DNA) (Hình 12.9). Tiếp theo là sự hội nhập của transposon qua trung gian của transposase, transposon xen vào giữa các đầu mút của chữ chi. Đầu lồi ra của sợi đơn được sử dụng như là khuôn để tổng hợp sợi bổ sung thứ hai. Sự gắn vào tạo sự sao chép 5 cặp base, được gọi là sự sao chép điểm mục tiêu (target site duplication). Hầu hết các yếu tố di động của prokaryote đều sử dụng một trong 2 cơ chế chuyển vị: là sao chép (replicative) và bảo thủ (conservative) hay không sao chép. Trong con đường sao chép (như ở Tn3), một bản sao mới của yếu tố di động tạo ra khi chuyển vị, kết quả là một bản sao ở vị trí mới và bản sao còn lại ở vị trí cũ. Trong con đường bảo thủ (như ở trường hợp Tn10) không có sự sao chép. Thay vào đó, yếu tố được cắt ra từ nhiễm sắc thể hoặc plasmid và được gắn vào vị trí mới. Con đường này còn được gọi là con đường "cắt và dán" (cut and paste)

232

Hình 12.9. Sự nhân đôi đoạn trình tự DNA ngắn ở điếm xen vào (insertion site)

2. Các yếu tố di truyền vận động ở eukaryote Các yếu tố di truyền vận động ở eukaryote chia làm 2 nhóm: nhóm là các retrotransposon và nhóm 2 là các DNA transposon. 2.1. Các retrotransposon Gery Fink và cs. là những người đầu tiên sử dụng nấm men để nghiên cứu điều hoà hoạt tính gene ở eukaryote. Các tác giả này đã phân lập được hàng ngàn đột biến gene HIS4 mã hóa enzyme tham gia tổng hợp histidine. Trong số hơn 1.500 đột biến ngẫu nhiên HIS4 được tìm thấy có 2 đột biến có kiểu hình không bền vững. Các đột biến không bền vững này có tần số phục hồi lại dạng kiểu dại cao 1.000 lần hơn các đột biến HIS4 khác. 233

Những đột biến này cho đoạn DNA lớn xen vào gene HIS4, sự xen vào này được thực hiện do một trong các yếu tố là Ty của nấm men. Có 35 bản sao của yếu tố xen đoạn gọi là Ty1 ở genome của nấm men. Việc tạo dòng những yếu tố này từ các allele đột biến cho thấy xen đoạn này không giống với yếu tố IS hoặc transposon của vi khuẩn. Thay vào đó chúng có đặc tính của retrovirus (virus của động vật). Có sự giống nhau trong cấu trúc và thành phần gene của retrovirus và yếu tố Ty1 được phân lập từ đột biến HIS4. Giống với retrovirus, transposon của nấm men có lặp đoạn cuối dài (long terminal repeat sequence) LTRs, chứa hàng trăm cặp base, được gọi là trình tự δ nằm ở 2 phía đoạn mã hóa, cả hai đều chứa gene gag và gene pol. Retrovirus có ít nhất 3 gene mã hóa cho 3 protein trong quá trình sao chép: gene gag mã hóa cho một protein có vai trò làm biến tính RNA genome. Gene pol mã hóa enzyme reverse transcriptase. Gene env mã hóa cho protein vỏ. Yếu tố Ty chỉ chứa gene gag và gene pol, không chứa gene env. (Hình 12.10)

Hình 12.10 Sự chuyển vị nhờ retrotransposition 234

Mô hình về sự chuyển vị nhờ retrotransposon. Một bản phiên mã RNA từ retrotransposon dưới tác dụng của enzyme phiên mã ngược tạo thành DNA nhờ enzyme reverse transcriptase được mã hóa bởi retrotransposon. Bản sao DNA được chèn vào vị trí mớI trên bộ gene. Vào năm 1985, J.Bocke và G. Fink đã chứng minh, yếu tố Ty1, giống với retrovirus, thực hiện việc di chuyển qua trung gian RNA. Chúng bắt đầu bằng biến đổi yếu tố Ty1 của nấm men được tạo dòng trên plasmid. Trước tiên ở một đầu mút của yếu tố, có sự xen vào một promotor được hoạt hóa nhờ thêm galactose vào môi trường. Thứ hai, một intron từ một gene khác của nấm men được đưa vào vùng mã hóa của transposon Ty. Sự thêm vào galactose làm tăng tần số chuyển vị của yếu tố Ty bi biến đổi. Điều này làm tăng số lượng RNA, vì galactose kích thích phiên mã RNA Ty bắt đầu từ promotor nhạy cảm galactose. Nhiều đột biến ngẫu nhiên được phân lập ở ruồi dấm cho thấy cũng chứa retrotransposon. Yếu tố copia của ruồi dấm cấu trúc tương tự với yếu tố Ty của nấm men. Chúng xuất hiện từ 10-100 vị trí trên bộ gene của ruồi dấm. Những đột biến nhất định của ruồi dấm là kết quả của sự xen vào của yếu tố copia và những yếu tố khác. Chẳng hạn, đột biến white-apricot (wa) về màu mắt của ruồi dấm tạo ra do sự xen vào yếu tố của họ copia ở locus white. Sự xen retrotransposon LTR vào các gene ở thực vật như ở ngô, cũng góp phần tạo ra các đột biến ngẫu nhiên. 2.2. DNA transposon Nhiều yếu tố di động được tìm thấy ở eukaryote chuyển vị bằng cơ chế giống với vi khuẩn. Bản thân yếu tố IS và transposon hoặc là bản sao của chúng có thể xen vào vị trí mới trên genome. Các yếu tố di chuyển theo cách này được gọi là yếu tố nhóm 2 hoặc DNA transposon. Yếu tố di động được McClintok phát hiện đầu tiên ở ngô là các DNA transposon. Tuy nhiên tính đặc trưng phân tử của DNA transposon đầu tiên lại là yếu tố p ở ruồi dấm. Yếu tố p được phát hiện khi nghiên cứu thể lai mất khả năng sinh sản (dysgenesis), hiện tượng xảy ra khi lai ruồi cái thuộc chủng phòng thí nghiệm với ruồi đực ở quần thể tự nhiên. Trong phép lai như thế, chủng phòng thí nghiệm được xem là có kiểu tế bào M (M cytotype) và giống gốc 235

tự nhiên được xem là có kiểu tế bào P (P cytotype). Phép lai của M (cái) x P (đực) cho thế hệ sau kiểu hình ở dòng mầm với gồm dạng bất thụ với tỷ lệ đột biến, tần số sai hình nhiễm sắc thể và không chia ly nhiễm sắc thể cao. Phép lai nghịch không xảy ra hiện tượng thoái hóa giống (dysgenics). Đột biến dysgenics không bền, chúng có thể phục hồi dạng kiểu dại hoặc biến đổi thành allele đột biến khác với tần số cao. Sự giống nhau về đột biến không bền vững ở ruồi dấm và ở ngô đưa đến giả thuyết đột biến dysgenic được gây ra do sự xen yếu tố di động vào những gene đặc biệt, làm chúng bị bất hoạt. Chẳng hạn hầu hết các đột biến trên ở ruồi dấm do xen yếu tố di động vào gene white. Những yếu tố như vậy gọi là yếu tố p, có từ 30-50 bản sao trên genome ở chủng P và hoàn toàn vắng mặt ở chủng M. Yếu tố P có chiều dài từ 0,5-2,9 kb. Kích thước khác nhau này do do nhiều yếu tố P không đầy đủ mà bị mất đoạn ở giữa. Yếu tố P với kích thước đầy đủ tương đương với transposon đơn giản ở vi khuẩn, có đầu mút là đoạn lặp đảo ngược ngắn (31 bp) và nó mã hóa cho transposase. Gene mã hóa cho transposase ở eukaryote chứa 3 intron và 4 exon. Ở ngô, yếu tố Ac và Ds có thể di chuyển trên nhiễm sắc thể , tác động lên các gene kiểm tra màu sắc của các hạt aleuron. Các yếu tố này được phân lập cho thấy có liên quan với DNA transposon của vi khuẩn và của các eukaryote khác. Giống với yếu tố P của ruồi dấm, yếu tố Ac có đoạn cuối lặp lại đảo ngược mã hóa cho transposase, yếu tố Ds lại không mã hóa cho transposase. Khi Ac trên genome, transposase của nó có thể bám vào đầu mút của cả yếu tố Ac và Ds và khởi động sự chuyển vị của chúng.. Yếu tố Ac và Ds là thành viện của họ transposon đơn giản. Ngoài ra, còn có các họ yếu tố di động khác ở ngô. Mỗi họ chứa yếu tố tự động mã hóa cho transposase có thể chuyển được yếu tố trong cùng một họ, nhưng không thể chuyển đến các họ khác vì transposase chỉ có thể bám vào đầu mút của các thành viên trong họ. Ở người, yếu tố di động chiếm một nữa genome người. Đa số yếu tố di động thuộc 2 dạng retrotransposon là yếu tố nhân rãi rác kích thước dài (long interspersed nuclear element) LINEs và yếu tố nhân rãi rác kích thước ngắn (short interspersed nuclear element) SINEs. LINE di chuyển nhờ retrotransposition đã sử dụng yếu tố mã hóa reverse transcriptase, nhưng lại thiếu một vài tính chất về cấu trúc của yếu tố giống retrovirus bao gồm LTR. 236

SINE được mô tả như là LINE không tự động, vì chúng có tính chất cấu trúc đặc trưng của LINE nhưng không mã hóa cho reverse transcriptase riêng. Người ta cho rằng chúng di chuyển được nhờ enzyme reverse transcriptase được mã hóa bởi LINE trong genome. SINE ở người được gọi là trình tự Alu vì nó chứa trình tự điểm cắt của enzyme cắt hạn chế Alu. Genome của người chứa hơn 1 triệu trình tự Alu chỉ một phần hoặc toàn bộ, chiếm hơn 10% genome của người. Trình tự Alu đầy đủ có kích thước 200 nucleotide. DNA genome mang yếu tố di động lớn hơn 20 lần DNA mã hóa cho tất cả protein người. Tần số đột biến ngẫu nhiên do xen vào yếu tố nhóm 2 là thấp chưa đến 0,2% trong tổng các đột biến ngẫu nhiên. Trong khi đó ở những tế bào động vật khác như chuột do xen retrotransposon lên đến 10% đột biến ngẫu nhiên, cao hơn 50 lần ở người có lẽ liên quan với hoạt tính của yếu tố retrotransposon cao hơn ở chuột.

Câu hỏi ôn tập
1. Vì sao phần lớn các đột biến ảnh hưởng đến các gene cấu trúc thường là lặn so với các allele hoang dại? 2. Sự hình thành đột biến dịch khung diễn ra như thế nào? 3. Các hóa chất gây đột biến có đặc điểm gì? 4. Giải thích cơ sở đột biến của các tác nhân gây đột biến sau: 5bromuracil, acid nitrơ và acridin. Xác định xem chúng tạo ra dạng đột biến nào (đồng hoán, đảo hoán hay dịch khung)? 5. Hãy mô tả một loại sai hỏng ngẫu nhiên dẫn đến đột biến. 6. Phân tích sự giống nhau và khác nhau giữa các kiểu transposition. 7. Các trình tự đảo ngược có vai trò gì trong transposition? 8. Cho một chuỗi trình tự nucleotid trên mRNA như sau: Dạng hoang dại: ... 5' AAUCCUUACGGA 3' ... Dạng đột biến: .... 5' AAUCCUACGGA 3' ... Hãy cho biết sai hỏng trên xảy ra do loại đột biến nào? 9. Đột biến xảy ra trong trình tự nucleotid do kết cặp nhầm như sau: 5' AGCTGCCTT 3'

237

3' ACGATGGAA 5' (mạch khuôn) ↓ mRNA Hãy cho biết acid amin nào sẽ được tìm thấy ở codon có nucleotid bị thay đổi như trên? 10. Ở bắp, tần số đột biến của locus R (màu cây) rất câo: 492 đột biến trên 106 giao tử. Gene tạo màu đỏ của nội nhủ Pr có tần số đột biến là 11 đột biến trên 106 giao tử. Hãy cho biết cần phải phân tích bao nhiêu cây mới tìm được 1 đột biến kép của 2 gen trên?

Tài liệu Tham khảo
Phạm Thành Hổ. 2000. Di truyền học. NXB Giáo Dục. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (1998). Cơ sở di truyền học. NXB Giáo dục. Hoàng Trọng Phán. 1995. Di truyền học phân tử. Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế Anthony J. F. Griffiths, Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin, William M. Gelbart, David T. Suzuki, Jeffrey H. Miller. 2004. An introduction to genetics analysis. W.H. Freeman Publishers. Harlt D.L., Jones E.W. 1998. Genetics - Principle and analysis. Jone and Bartlett Publshers, Toronto, Canada. Stansfield W.D. 1991. Schaum’s outline of theory and problems of genetics. McGraw-Hill, Companies, Inc., United States of America. Watson D.J, Baker T.A., Bell S.P., Gann A., Levine M., Losick R. 2004. Molecular biology of the gene. Benjamine Cummings, San Francisco, United States of America.

238

Chương 13

Đôt biên nhiêm săc thê
Mục tiêu của chương
Giới thiệu cac loai đôt biên câu truc nhiêm săc thê, bản chât của vật chất di truyền là DNA, thành phần, cấu trúc của phân tử DNA, dạng DNA khác nhau trong tế bào.

Số tiết: 3 Nội dung

I. Đột biến câu truc nhiêm săc thê
Các đột biến cấu trúc NST hay còn gọi là sai hình NST (chromosome structure) hay cấu trúc lại NST (chromosome rearrangement) được phát hiện bằng phương pháp tế bào học. Các đột biến loại này thực chất là sắp xếp lại các gen hoặc giảm hay tăng liều lượng gen.

Hình 13.1 Cơ chế phát sinh một số đột biến cấu trúc nhiễm sắt thể

239

Hinh 13.2 Cac dang đột biến nhiêm săc thê

Các sai hình NST có thể chia thành 2 loại: Bên trong NST: mất đoạn, đảo đoạn, tăng đoạn Giữa các NST: chuyển đoạn 1. Biến đổi cấu trúc trên một NST: 1.1. Sự phát sinh các đột biến cấu trúc trên NST Sai hình NST liên quan đến sự đứt đoạn của NST. Có khi 1 NST bị đứt ra quá 2 đoạn và sau đó được nối lại nhưng thường không giữ cấu trúc cũ. Điều đó dẫn đến nhiều kiểu đột biến cấu trúc NST khác nhau. Các đoạn vòng tròn không tâm động thường bị mất đi trong phân bào. Có thể xảy ra trường hợp 2 đoạn có tâm động nối nhau, khi phân bào sẽ bị kéo căng ra 2 đầu thành cầu chromatid và sau đó bị đứt ra không đều tạo ra một cái mất đoạn và cái kia tăng đoạn. 1.2. Mất đoạn Sự thiếu một đoạn NST gồm 2 loại: mất đoạn (deletion) ở giữa NST và mất đỉnh (deficiency). Đoạn NST bị mất nếu nhỏ có thể mang 1 gen hoặc một phần gen. Trong trường hợp này hiệu quả kiểu hình có thể giống như xuất hiện alen đột biến ở locus đó. Các mất đoạn không có đột biến nghịch, bởi 240

vì đoạn NST bị mất khó ngẫu nhiên được gắn trở lại do đột biến. Nhờ đó mất đoạn có thể phân biệt với đột biến gen. Sự mất một đoạn dài NST thường gây chết do sự mất cân bằng di truyền của bộ gen.

Hình 13.3 Sơ đồ mô tả hiện tương "giả trội"

Sự mất đỉnh của đoạn NST mang gen trội A cho phép alen lặn a có biểu hiện kiểu hình. Khi một sinh vật dị hợp tử (Aa), sự mất đoạn có A thì alen lặn a trên NST kia có biểu hiện kiểu hình. Hiện tượng này gọi là "giả trội" (Pseudodominant), thật ra locus tương ứng ở trạng thái bán dị hợp tử (Hemizygote). Tiếp hợp ở giảm phân I khi có mất đoạn Sự mất đoạn ở cá thể dị hợp có thể phát hiện ở kì trước của giảm phân I khi các NST tương đồng bắt cặp. Nếu có mất đoạn sẽ thấy xuất hiện một vòng tròn do không có đoạn NST tương đồng. Ví dụ về đột biến mất đoạn ở người: khi mất vai ngắn của NST số 5, karyotype 46,XY,del(5p) dẫn đến hội chứng mèo kêu (Cri du chat). Trẻ sơ sinh bị hội chứng này có tiếng khác như mèo kêu. Bệnh được gặp với tần số 1/50.000 trẻ, biểu hiện chậm trí, đầu nhỏ và hiếm khi sống được tới lúc trưởng thành. Sự mất một phần vai dài của NST số 22 (được gọi là NST Philadelphia, lấy tên thành phố nơi phát hiện ra đầu tiên). Nó được tìm thấy ở tế bào tủy xương (cùng với các tế bào có NST bình thường) của 90% 241

những người bệnh bạch huyết myelocyt kinh niên (một dạng ung thư). Thường đoạn bị mất đó được chuyển đến một NST dài hơn (thường là NST số 9). 1.3. Lặp đoạn (tăng đoạn - Duplication) Các lặp đoạn NST có thể tăng lên bằng nhiều cách khác nhau. Nói chung sự lặp đoạn không gây hậu quả nặng nề như mất đoạn, thậm chí một số lặp đoạn có lợi cho tiến hóa là tạo vật liệu di truyền mới. Lặp đoạn có thể ở cạnh nhau, xa nhau trên cũng một NST hay ở vào các NST khác. Nhờ lặp đoạn có thể nghiên cứu ảnh hưởng của số lượng và vị trí khác mức bình thường của một đoạn NST hay gen. Kiểu hình của lặp đoạn có khi trội, có khi lặn hay trung gian hoặc có tác động tích lũy. Trường hợp điển hình về lặp đoạn là đột biến trội mắt thỏi Bar (B) nằm trên NST X của Drosophila. Trường hợp tăng một đoạn, dị hợp tử +/Bar thì mắt bé hơn bình thường một ít, hẹp cạnh nên có dạng kéo dài. Ruồi đồng hợp BB có mắt nhỏ hơn. Nếu lặp đoạn đôi, tăng hơn bình thưòng 2 đoạn sẽ là đột biến Bar kép, có kiểu hình mắt nhỏ hơn nữa nên gọi là "thỏi kép". Số đoạn lặp lại có thể đến 7 đoạn thành "siêu Bar" mắt nhỏ nhất. Gen mắt thỏi B có tác động gia tăng theo chiều giảm kích thước mắt, số đoạn lặp càng nhiều, mắt càng bé. Có trường hợp khác, lặp đoạn tác động theo hướng ngược lại, số đoạn càng tăng thì kiểu hình càng trở về bình thường hơn. Các kiểu gen hoang dại, Bar và Bar kép tương ứng với các đoạn trên NST khổng lồ Sự tăng đoạn Bar như một nhân tố trội về mặt di truyền. Khi nuôi các ruồi Bar đồng hợp tử BB nhận thấy các ruồi hoang dại xuất hiện ở ruồi con với tần số1/1.600 và các ruồi Bar kép cũng xuất hiện với tần số tương tự. Sự xuất hiện các kiểu hình bất thường có thể giải thích bằng trao đổi chéo không cân bằng khi tiếp hợp ở giảm nhiễm I. 1.4. Đảo đoạn (Inversion) Đảo đoạn xảy ra lúc đoạn trong đứt đi quay 1800 rồi được nối lại. 242

Giả sử trình tự bình thường của đoạn NST là 1-2-3-4-5-6, hai chỗ bị đứt xảy ra ở vùng 2-3 và 5-6 và đoanh bị đứt nối đảo ngược. Như vậy NST có đoạn 1-2-5-4-3-6

Hình 13.4 Nguồn gốc của đảo đoạn

Đảo đoạn mang tâm động (Pericentric inversion) Tâm động nằm bên trong đoạn bị đảo. Trong giảm nhiễm I các NST tương đồng khi tiếp hợp sẽ tạo vòng tròn kép. Nếu trao đổi chéo xảy ra giữa 2 sợi NST đơn trong vùng đảo đoạn thì 2 chromatid đó của mỗi NST thường có chiều dài không cân bằng nhau. Trong trường hợp này, một nữa sản phẩm của giảm phân vừa có lặp đoạn lại có mất đoạn nên mất sức sống. Nữa khác của các giao tử (không có trao đổi chéo) có sức sống bình thường gồm 1/4 có đoạn với trình tự gen bình thường và 1/4 có đảo đoạn. Ví dụ ở dị hợp tử có đảo đoạn xảy ra trao đổi chéo ở vùng 3-4. Các NST tái tổ hợp có đoạn trắng đoạn đen đều làm giao tử mất sức sống vì có gen thừa, có gen thiếu. + NST đen trắng bên trái có các gen (6-3-4-56) (2 gen 6, thiếu gen 12) + NST đen trắng bên phải có các gen (1-2-5-4-3-2-1) (2 gen 1-2, lại thiếu gen 6)

243

Hình 13.5 Trao đổi chéo xảy ra ở đoạn đảo

a

b

Hinh 13.6 Căp nhiêm săc thê di hơp do đao đoan hinh thanh vong trong giam phân (a) Sơ đô của sư tao vong (b) Anh chup hiên vi điện tư qua trinh tao vong

244

Đảo đoạn không mang tâm động (Paracentric inversion)

Hinh 13.7. Trao đôi cheo xay ra ơ đoan bi đao

Hinh 13.8 San phâm giam phân do kết qua trao đôi cheo đơn ơ vong đao đoan không mang tâm động

245

Tâm động nằm ngoài đoạn bị đảo. Trao đổi chéo xảy ra bên trong đoạn đảo tạo NST hướng tâm (có 2 tâm động - dêcntric chromosome) và trong kì sau I sẽ tạo nên cầu nối, nối 2 cực tế bào. Cầu nối sẽ bị đứt ở bất kì chỗ nào tạo ra các đoạn không cân bằng chứa lặp đoạn hoặc mất đoạn. Ví dụ trường hợp xảy ra trao đổi chéo giữa 4-5 Trao đổi chéo xảy ra ở đoạn không mang tâm động Các NST không có trao đổi chéo (trắng cả hay đen cả) tạo giao tử có sức sống, số khác tạo giao tử mất sức sống vì không cân bằng di truyền. Đoạn không tâm động (acentric fragment) tạo ra sẽ bị mất vì không di chuyển được về cực. Một nữa sản phẩm của giảm phân sẽ mất sức sống vì do thừa và thiếu gen, 1/4 có sức sống bình thường và 1/4 có sức sống với NST có đảo đoạn. Biến đổi cấu trúc giữa các NST 1.5. Chuyển đoạn (Translocation) Chuyển đoạn là sự trao đổi các đoạn giữa các NST không tương đồng. Trao đổi đoạn có thể xảy ra trong đôi NST tương ứng (thường khác chức năng) như giữa X và Y hoặc giữa các NST khác đôi. Sự chuyển đoạn thuận nghịch (reciprocal) xảy ra do sự tao đổi các đoạn giữa 2 NST không tương đồng. Trong giảm phân, các NST có chuyển đoạn tiếp hợp với nhau tạo nên hình chéo. Tiếp theo khi các NST đẩy nhau để về các cực, sẽ có 2 trường hợp: + Bốn NST vào cuối kỳ trước I đẩy nhau tạo nên vòng tròn. Sự phân ly trong trường hợp này sẽ tạo nên các giao tử không sức sống vì mang một số NST có dư hoặc thiếu gen. Ví dụ: 1-4-3-4 thiếu 2 và 1-2-2-3 thiếu 4. + Sự hình thành số 8 do đẩy chéo nhau giữa các NST. Trong trường hợp này các giao tử được tạo nên có sức sống vì có cân bằng gen (mỗi giao tử đều có 1-2-3-4). Hai trường hợp trên xảy ra với xác suất như nhau nên các dạng có chuyển đoạn thường nữa bất dụcc (50% giao tử chết). Tiêu chuẩn thứ hai để phát hiện các chuyển đoạn là có sự thay đổi nhóm liên kết gen. Một số gen của một nhóm liên kết gen có thể chuyển sang nhóm liên kết gen khác. Ngoài các hệ quả di truyền trên, chuyển đoạn có thể gây hiệu quả vị trí 246

(position effect). Các gen khi dời chỗ có thể có biểu hiện khác, ví dụ từ vùng đồng nhiễm sắc (euchromatin) chuyển sang vùng dị nhiễm sắc (heterochromatin) ít có hoạt tính hơn.

Hinh 13.9 Qua trinh giam phân xay ra ơ thê di hơp chuyên đoan

Sự hình thành chuyển đoạn và sự tiếp hợp của chúng trong giảm phân I * Nhiễm sắc thể đều (Isochromosome) Các NST có hai vai dài không đều nhau có thể chuyển thành NST đều với 2 vai bằng nhau về chiều dài và tương đồng với nhau về mặt di truyền nhờ sự phân chia tâm động khác thường vuông góc với sự tách tâm động bình thường. NST X tâm mút của Drosophila có thể chuyển thành dạng"X dính" do sự phân chia tâm động theo chiều vuông góc với bình thường. Do sự phân chia khác thường đó, 2 chromatid thay vì phân li về 2 cựu lại dính nhau, có đoạn bị mất.

247

* Chuyển đoạn Robertson (Robertsonian translocation) Một chuyển đoạn đặc biệt được gọi là Robertson. Đây là trường hợp hình thành NST tâm giữa do sự nối lại của 2 NST. Chuyển đoạn thuận nghịch được thực hiện giưa 2 NST tâm đầu A và B, khi A bị đứt phía dưới tâm động tạo vai dài mất tâm động, còn B bị đứt ở đầu mút ngắn trên tâm động, 2 đoạn nối nhau tạo NST tâm đều mang tâm động của B. Đoạn có tâm động A với vai ngắn nối với đoạn ngắn của B hình thành NST con có tâm động A. NST con mới có nhiều châtss dị nhiễm sắc không quan trọng nên thường mất đi. Chuyển đoạn Robertson có hậu quả làm giảm số lượng NST.

Hinh 13.10 Chuyên đoan Roberson

Sự hình thành NST tâm giữa do sự nối lại của 2 NST tâm đầu (chuyển đoạn Robertson) Người có 46 NST, các vượn người (hắc tinh tinh, khỉ đột, đười ươi) có 48 NST. NST thứ hai của người gồm hai đoạn giống 2 NST khác nhau của các vượn người. Rất có thể từ tổ tiên chung, một chuyển đoạn Robertson đã tạo nên loài người do sự nối lại của 2 NST khác nhau, làm giảm số lượng còn 46 thay vì 48 như ở các loài vượn người.

II. Đột biến số lượng NST.
Đa bội thể (polyploidy): hiểu theo nghĩa rộng là sự thay đổi số lượng NST. Sự thay đổi số lượng NST có nhiều kiểu: đa bội nguyên (euploidy), đa bội lai (alloploidy) và đa bội lệch (aneuploidy) 1. Đa bội nguyên 248

Sự tăng nguyên lần bộ NST đơn bội của một loài, được gọi là đa bội thể nguyên hay đa bội thể thuần. Đây là đa bội hiểu theo nghĩa hẹp, nếu có cá thể 2n NST thì dạng 3n, 4n, 5n ... là các dạng đa bội thể. - Thể đơn bội (Monoploid): một số sinh vật Eukaryote bậc thấpnhư vi nấm, vi tảo có nhân dơn bội. Các cơ thể đơn bội ở sinh vật bậc cao thường ít hơn và có sức sống kém hơn dạng lưỡng bội bình thường. Các thực vật đơn bội đã được tìm thấy nhưng thường bất thụi. Một số ít động vật tồn tại ở dạng đon bội. Một ngoại lệ đáng lưu ý là ong đực và ong vò vẽ. - Thể tam bội (Triploid): tam bội NST (3n) có thể được tạo nên do sự kết hợp giữa các giao tử đơn bội với giao tử lưỡng bội. Bộ NST đon bội thứ ba của thể tam nhiễm thường phân bố vào các tế bào sinh dục với nhiều loại tổ hợp khác nhau, tạo nên các giao tử mất cân bằng di truyền. Các thể tam bội có độ bất thụ cao nên trong thiên nhiên, chúng thường ở dạng sinh sản vô tính như cây chuối. - Thể tứ bội (Tetraploid): tứ bội NST (4n) có thể xuất hiện trong các tế bào cơ thể do sự tăng đôi số NST của tế bào soma. Sự tăng đôi số NST có thể xảy ra nhờ tác động của alkaloid colchicine vào tế bào hoặc do sự hợp nhất của các giao tử 2n. Trong cơ thể lưỡng bội, tế bào một số mô chuyên biệt trở thành đa bội. Ví dụ một số tế bào gan của người là thể đa bội, nội nhủ của hạt nhiều loài thực vật là thể tam bội.

Hinh 13.11 Thê lương bội (phia trai) va thê tư bội (phia phai) cua nho

249

2. Đa bội thể lai: còn gọi là thể dị bội Đa bội thể lai có được khi cả 2 bộ NST của 2 loài khác nhau cùng đứng chung trong một tế bào (2nA + 2nB).

Hình 13.12 Thể đa bội lai ở lúa mì

250

Hinh 13.13 Thê đa bội lai tao thanh khi lai giưa hai loai Raphanus vơi Brassica

3. Đa bội lệch hay đa nhiễm Sự thay đổi số lượng NST chỉ liên quan đến một cặp hoặc một số cặp NST được gọi là đa bội thể lệch. Các dạng đa bội thể lệch: + Thể đơn nhiễm hay thể một (2n - 1) + Thể tam nhiễm hay thể ba (2n + 1) + Thể tứ nhiễm hay thể bốn (2n + 2) + Thể tam nhiễm kép (2n + 1 + 1) + Thể vô nhiễm hay thể không (2n - 2)

Hinh 13.14 Cơ chế hinh thanh cac giao tư thưa hoc thiếu nhiêm săc thê do sư không chia ly cua nhiêm săc thê trong giam phân

251

Các thể đa bội lệch ở người: Ở người nhiều hội chứng di truyền do các thể đa bội lệch làm thay đổi số lượng cặp NST giới tính, đưa đến các dạng: XXX (siêu nữ), XXY (Klinefelter), OX (Turner), OY (chết) + Hội chứng Turner do Henry Turner mô tả đầu tiên ở người nữ mất một NST X (OX), có công thức 2n - 1 = 45. Hội chứng có nhiều biểu hiện đặc trưng như lùn (chiều cao < 1,5 m), cơ quan sinh dục kém phát triển (không dậy thì), kém thông minh ...

Hình 13.15 Đặc điểm hội chứng Turner (XO)

+ Hội chứng Klinefelter do Henry Klinefelter mô tả ở những người nâm dư 1 NST X (XXY), công thức 2n + 1 = 47. Hội chứng có những biểu hiện đặc trưng như bất thụ, ngón tay, chân dài, phát triển ngực, có tính nữ và suy giảm trí tuệ. 252

+ Người siêu nữ (XXX)_ do dư một NST X, bộ gen 2n + 1 = 47, thoái hóa, suy giảm trí tuệ. + Hội chứng Down do Langdon Down phát hiện, thường là tam nhiễm ở cặp NST số 21 của người. Tỷ lệ xuất hiện khoảng 1/600 ở trẻ sơ sinh. Người bệnh có một số biểu hiện đặc trưng như: thoái hóa trí tuệ, mắt giống mắt người Mông cổ. Có mối liên hệ thuận giữa số trẻ sinh ra mắc bệnh Down và tuổi của các bà mẹ. Tỷ lệ đó là 1/500 ở các bà mẹ 20 - 30 tuổi, 1/300 ở các bè mẹ 40-45 tuổi và 1/60 ở các bà mẹ lớn hơn 45 tuổi. Tuổi cha hầu như không ảnh hưởng. Ở người các đơn nhiễm ít thấy hơn, có lẽ do mang nhiều gen lặn nguy hiểm, nên ở trạng thái bán hợp tử khó sống.

Hình 13.16 Đặc điểm hội chứng Clinefelter (XXY)

253

Hinh 13.16 Nguôn gôc Hội chưng Down

254

Hình 13.17

Đặc điểm hội chứng Down

III. Đột biến gây tạo hay cảm ứng
1. Tác động gây đột biến của bức xạ ion hóa Tia X, các tia phóng xạ α, β, γ, các neutron và cả tia tử ngoại đều là các tác nhân gây đột biến. Trừ tia tử ngoại có khả năng xuyên thấu yếu nên chỉ tác động lên các sinh vật đơn bào và giao tử, các tia khác đều có tác dụng gây đột biến lên tất cả các dạng sinh vật. Tác dụng gây đột biến của phóng xạ có 2 đặc điểm: - Không có ngưỡng tác dụng, tức không có liều vô hại - Số lượng đột biến tỷ lệ thuận với liều lượng phóng xạ, không phụ thuộc cường độ và thời gian chiếu xạ 1.1. Bức xạ ion hóa Ánh sáng nhìn thấy chỉ là một phần rất nhỏ của phổ sóng điện từ. Sóng có bước sóng càng ngắn thì chứa năng lượng càng lớn và khả năng xuyên thấu càng mạnh. So với ánh sáng nhìn thấy (bước sóng khoảng 10-4 µ m), các tia X, tia γ, tia vũ trụ có bước sóng từ 1 nm và ngắn hơn, được gọi là bức xạ ion hóa. Các bức xạ này được tạo ra nhờ các máy chiếu tia X, proton, neutron và được phát ra từ các nguồn phóng xạ như radium, cobalt 60, ... tạo các tia anpha, beta và gamma 1.2. Ảnh hưởng của liều lượng (dose) và cường độ bức xạ (radiation intensity) Các thí nghiệm sau năm 1927 với bức xạ năng lượng cao cho thấy các đột biến gây tạo (đột biến cảm ứng) phụ thuộc rất lớn vào liều lượng, liều càng lớn tần số đột biến càng cao. Khi liều lượng quá cao, sự phụ thuộc có phức tạp hơn, có thể do nhiều tế bào bị chết. Điểm đáng lưu ý, nhiều nghiên cứu cho thấy các bức xạ ion hóa có hiệu quả gây đột biến ở tất cả các sinh vật và không có liều lượng ngưỡng, có nghĩa là dù liều lượng thấp vẫn có khả năng gây đột biến. 2. Tác động của tia tử ngoại

255

Tia tử ngoại có bước sóng dài (10-5-10-6 cm) nên khó tạo ion, có lẽ chỉ tác động đến những chất hấp thu nó trực tiếp. Trong tế bào các chất hữu cơ mạch vòng chủ yếu như purin và pyrimidin hấp thu trực tiếp tia tử ngoại. Mối liên quan chặt chẽ giữa tia tử ngoại và các cấu phần ADN đã được chứng minh. ADN hấp thu tia tử ngoại mạnh nhất ở bước sóng 2537 Ơ, đây chính là bước sóng làm tăng tần số đột biến ở hạt phấn cây bắp. Dưới tác dụng của tia tử ngoại, cytosine gắn thêm phân tử nước vào liên kết C=C của mạch vòng và thymine bị đứt liên kết C=C mạch vòng nối 2 phân tử thành dimer thymine. 3. Các tác nhân gây đột biến hóa chất Có nhiều hóa chất gây biến dị di truyền, đến nay đã tìm ra những hóa chất cho hiệu quả đột biến cao hơn phóng xạ. Các hóa chất gây đột biến có đặc điểm là chỉ có thể gây hiệu quả đột biến đối với một số ít đối tượng. Các tác nhân gây đột biến hóa học có thể chia thành các nhóm sau: Nhóm 1: Các chất ức chế tổng hợp bazơ nitơ trong cấu trúc ADN như cofein, ethyl uretan ... Nhóm 2: các chất đồng đẳng với bazơ nitơ như cofein, 5-bromuracil, các chất này gần giống với bazơ nitơ nên ADN gắn nhầm khi tổng hợp. Nhóm 3: Các chất alkyl hóa làm đứt mạch ADN như ethyl methanesulfonate (EMS), methyl methanesulfonate (MMS), ethylene imine (EI) ... Nhóm 4: Các chất khác như chất oxy hóa - khử như HNO2, hydroxygenlamine (H2NOH). Nhóm 5: Các chất chêm vào ADN gồm proflavin, chất màu acridin. Tất cả tác nhân gây đột biến đều là tác nhân gây ung thư, nhưng các tác nhân gây ung thư không phải đều gây đột biến. Hiện nay nhiều tác nhân gây đột biến được sử dụng trong chọn giống nhằm tăng nguồn biến dị.

Câu hỏi và Bài tập
!. Bản chất và hậu của của đứt gãy và nối lại của nhiễm sắc thể. 2. Hậu quả của đảo đoạn.

256

3. Các hình dạng quan sát được trong giảm nhiễm của đồng hợp chuyển đoạn. 4. Hậu quả của trao đổi chéo đơn ở quá trình hình thành bộ bốn ở thể dị hợp chuyển đoạn là gì? 5. Mô tả sự kiện di truyền dẫn đến sự hình thành ngưới nam XYY. 6. Sự không phân ly của nhiễm sắc thể giới tính xảy ra ở người nữ trong lần giảm phân thứ hai đã tạo ra những loại trứng nào? 7. Giải thích sự tăng độ hứu thụ ở thể lai khác loài khi có sự nhân đôi số lượng nhiễm sắc thể của chúng.

Tài liệu Tham khảo
Phạm Thành Hổ. 2000. Di truyền học. NXB Giáo Dục. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (1998). Cơ sở di truyền học. NXB Giáo dục. Hoàng Trọng Phán. 1995. Di truyền học phân tử. Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế Anthony J. F. Griffiths, Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin, William M. Gelbart, David T. Suzuki, Jeffrey H. Miller. 2004. An introduction to genetics analysis. W.H. Freeman Publishers. Harlt D.L., Jones E.W. 1998. Genetics - Principle and analysis. Jone and Bartlett Publshers, Toronto, Canada. Stansfield W.D. 1991. Schaum’s outline of theory and problems of genetics. McGraw-Hill, Companies, Inc., United States of America. Watson D.J, Baker T.A., Bell S.P., Gann A., Levine M., Losick R. 2004. Molecular biology of the gene. Benjamine Cummings, San Francisco, United States of America.

257

You're Reading a Free Preview

Tải về
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->