GVHD : PGS.

TS Nguy n Thy H SVTH : Ph m Ng c Xun Ph m Ng c Thin Tr n c Thi n ng Minh Chu H Thanh Trc L p : HC07SH2 N m h c : 2010-2011

ng

N i dung chnh
I. L im u i nt v b nh ti u ng II. M t s lo i insulin trn th tr ng III. C s khoa h c c a cng ngh s n xu t insulin 1. C u trc phn t insulin 2. T ng h p insulin trong c th 3. Vai tr sinh h c c a insulin IV. Cng ngh s n xu t insulin. 1.S n xu t insulin tch chi t t ng v t 2.S n xu t insulin t th c v t chuy n gen 3.S n xu t insulin t i t ng vi sinh v t chuy n gen 4. K t lu n

I. L i m

B nh ti u ng l m t trong nh ng c n b nh e d a nghim tr ng t i s c kho con ng i.Trn th gi i s ng i m c b nh ti u ng ngy cng t ng, s gia t ng s ng i m c b nh ti u ng s ko theo s gia t ng cc bi n ch ng c a c n b nh ny nh th n kinh, x v a ng m ch S ng i t vong trn th gi i do b nh ti u ng lin t c gia t ng trong nh ng n m g n y. i u i h i ph i tm ra nh ng h ng ti p c n m i cho vi c ng n ng a v i u tr c n b nh ny.

Best v Banting- nh ng ng i u tin chi t su t c insulin n m 1921

Collip v MacLeod- nh ng ng i u tin dng insulin chi t su t i u tr b nh ti u ng type 1 cho Leonard Thomson

Vi nt v b nh ti u

ng

1. Khi ni m 2. Phn lo i 3. Tnh hnh th c t v b nh ti u

ng hi n nay

1. Khi ni m
B nh i tho ng, cn g i l B nh ti u ng, l m t b nh do r i lo n chuy n ha cacbohydrat khi hoc mn insulin c a t y b thi u hay gi m tc ng trong c th , bi u hi n b ng m c ng trong mu lun cao B nh ti u ng l m t trong nh ng nguyn nhn chnh c a nhi u b nh hi m ngho, i n hnh l b nh tim m ch vnh, tai bi n m ch mu no, m m t, suy th n, li t d ng, ho i th , v.v

2. Phn lo i
Ti u ng lo i 1: (ti u ng ph thu c insulin hay ti u ng ng i tr ) chi m kho ng 5-10% t ng s b nh nhn Nguyn nhn b nh: c ch t mi n (tuy n t y b t n cng v ph h y b i chnh c th , lm cho tuy n t y khng cn kh n ng s n xu t insulin n a) Nh ng tri u ch ng i n hnh: ti u nhi u, u ng nhi u, i khi n nhi u, m m t, d c m v s t cn, tr em ch m pht tri n v d b nhi m trng.

 Ti u ng lo i 2: ( ti u ng khng ph thu c insulin hay ti u ng ng i tr ng thnh) chi m kho ng 90-95% trong t ng s b nh nhn b nh ti u ng, th ng g p l a tu i trn 40, nh ng g n y xu t hi n ngy cng nhi u l a tu i 30, th m ch c l a tu i thanh thi u nin. T y ng i b nh v n cn kh n ng s n xu t insulin, nh ng khng . t c tri u ch ng v th ng ch c pht hi n b i cc tri u ch ng c a bi n ch ng(nh i mu c tim, tai bi n m ch mu no), ho c ch c pht hi n tnh c khi i xt nghi m mu tr c khi m . T l ti u ng t ng theo tu i, y u t di truy n c ng ng vai tr quan tr ng. C m i lin quan tr c ti p gi a bo ph v ti u ng lo i 2.

Lo i insulin

Mu s c

Ngu n g c

Th i gian b t u c tc d ng

Th i gian h t tc d ng

Tc d ng nhanh - Insulin Actrapid HM. - Insulinum maxirapid.

Ng trong L n

30 pht (tim d i da)

8 gi

Tc d ng bn ch m - Insulatard HM. - Insulin Lente.

Ng c L n

i 1 gi

20 gi 18 gi

Lo i pha tr n - Mixtard HM 30/70.

Ng

30 pht

20 gi

Tc d ng r t ch m - Utra - Lente

4 gi

30 gi

1. C u trc phn t insulin

o Insulin ng i l m t polypeptide o Bao g m: Chu i A 21 acid amin Chu i B 30 acid amin C m t c u n i disulfur trong chu i A v 2 c u n i disufur n i gi a hai chu i A v B. o Cng th c ha h c: C257H383N65O77S6 o Tr ng l ng phn t : 5808
C u trc ha h c c a insulin

2. T ng h p insulin trong c th
Preproinsulin: l chu i peptid di 110 acid amine, t ng h p trong cc t bo c a o Langerhans c a tuy n t y. Proinsulin: Khi Preproinsulin ti n t i l i n i ch t, m t protease chuyn bi t s c t b o n peptide tn hi u t o proinsulin. Proinsulin hnh thnh c u n i disulfur trong l i n i ch t, hnh thnh c u trc b c ba. Insulin: Hnh thnh qua qu trnh phn c t nh enzyme PC1/3 t i lin k t gi a chu i B v C v enzyme PC2 ngay v tr lin k t gi a chu i A v C.

3. Vai tr sinh h c c a insulin

 Insulin v trao i hydratcacbon Insulin v trao i lipit Nh ng tc ng khc c a insulin

Gia t ng tu n hon insulin

T bo h p thu glucose

N ng l ng trao i ch t T ng h p ch t bo T ng h p Glycogen

Kch thch tuy n t y ti t ra insulin T ng l ng Glucose trong mu

ng Glucose cn l i

Glucose trong mu

Gi m l ng Glucose trong mu

H p thu Glucose vo mu

Kch thch tuy n t y ti t ra Glucagon

Glycogen chuy n thnh Glucose gan

Gia t ng tu n hon Glucagon

bi u hi n s

i u ha hm l

ng glucose mu

Nh ng tc

ng khc c a insulin

- Insulin lm t ng tnh h p th c a cc axitamin. - Insulin lm t ng tnh th m cc ion kali, magie v photphat v c t o i u ki n cho qu trnh photphoryl ho v s d ng glucoz.

Insulin lm t ng tnh th m cc ion kali, magie v photphat v c

ng v t

Insulin

th c v t

T vi sinh v t

1.S n xu t insulin tch chi t t

ng v t

T nh ng th p nin 1920 cho n nh ng n m u c a th p nin 1980, insulin c t o ra b ng cch c l p t tuy n t y c a ng v t nh heo v b v c tinh s ch Ngy nay lo i insulin ny c tinh ch b ng ph k t tinh khi t ha r t cao. ng php s c

Ch ng lo i Ng Th Gia sc(tru, b ng a, d c u Ng a Sei whale i

Chu i A cc v tr 8 9 10 Thr-Ser-ILe Thr-Ser-ILe Thr-Ser-ILe Ala-Ser- Val Ala-Gly- Val Thr-Gly-Leu Ala-Ser-Thr

Chu i B cc v tr 30 Thr Ala Ser Ala Ala Ala Ala

Heo,ch,tinh d ch c voi

S thay

i chu i c u trc amino acid c a cc loi ng i (Source W.F ganong, 2004)

ng v t so v i con

S n xu t insulin t t bo g c ti u ng
Nh ng t bo g c t dy r n c kh n ng s n xu t m t h p ch t c tn l C-peptide (m t ch t protein ti n thn c a insulin v ch hi n di n khi t bo s n xu t ra insulin). S hi n di n C-pep c m t l ng insulin nh t nh cs n xu t b i t bo g c c dng thay th cho t bo t y t ng h h i ho c b ph h y.

tr b nh

Cc nh khoa h c Anh v M cho bi t h SX c insulin t t bo g c l y t dy r n tr s sinh i u tr b nh ti u ng. ( nh: www.neonet.ch)

Nh

c i m
i

Insulin V c c u trc khng hon ton gi ng insulin ng Ho t ng ch c n ng trong c th km h n insulin ng i Kh n ng h p th km C th gy ra cc ph n ng mi n d ch trong c th Trong qu trnh tch chi t khng th lo i b gy b nh V Qui trnh tch chi t i h i k thu t cao Chi ph Kh SX l t (c n l ng l n t y SX) gi thnh cao ng l n v i quy m cng nghi p

c h t cc tc nhn

S n xu t Insulin tr b nh ti u hoa rum

Cc nh khoa h c H Calgary c y m t gen Insulin nhn t o vo cy hoa rum. Khi gen ny i vo ho t ng, hoa rum s b t u s n sinh ra Insulin nhanh h n cc ph ng php truy n th ng c ti n hnh trn l n, b, men hay vi khu n. Kho ng 4.000m2 hoa s c s n l ng ln t i g n 1kg Insulin 6.475 ha hoa rum l c th chi t xu t Insulin cho ton b nh ng ng i m c b nh ti u ng trn th gi i.

ng t

Cy hoa rum dng

chi t su t insulin

Tr b nh ti u ng b ng insulin t rau di p ho c cy thu c l

Nghin c u ny c th c hi n b i gio s Henry Daniell, thu c Tr ng i h c Central Florida, v cc c ng s . Nhm nghin c u a cc t bo th c v t ng kh c ch a insulin d i d ng b t vo c th chu t m c b nh ti u ng. Khi cc t bo ny ti n vo ru t chu t, vi khu n ang s ng s phn h y cc thnh t bo v insulin thot ra s c ad nd n vo mu. Sau 8 tu n l th nghi m, cc chuyn gia nh n th y [glucose] trong mu v n c ti u chu t tr l i m c an ton, v cc t bo beta trong tuy n t y c a chu t s n xu t c insulin m c c n thi t cho c th .

Gio s Henry Daniell ( H Central Florida)

 Hi n nay, c nhi u ph ng php s n xu t insulin ti t h p d a trn cc ch ng vi sinh v t bi n i gen, ch y u l vi khu n (E.coli, Bacillus brevis) ho c n m men (Saccharomyces cerevisiae , Pichia pastoris) C 2 nhm ph ng php s n xu t Insulin ti t h p trong cc ch ng VSV bi n i gen l : nhm ph ng php 2 chu i v nhm ph ng php miniproinsulin.

Ph ng php 1: inh t ng h p insulin ti t h p theo ph ng php 2 chu i

Nh

c i m : Hi u su t t o Insulin ho t tnh khng cao.

Ph ng php 2: Sinh t ng h p Insulin ti t h p theo ph ng php miniproinsulin (MPI)

ng nghin c u m i:

Ni v cc h th ng t bo dng bi u hi n insulin ti t h p, ng i ta s d ng r t a d ng t vi sinh v t t i t bo ng v t v c th c v t. Trong s , t bo vi sinh v t cs d ng nhi u nh t do chng d thao tc, d a vo p d ng quy m s n xu t cng nghi p, nhi u nh t l E. coli v n m men. G n y, ng i ta a ra m t h th ng bi u hi n khc cho cc lo i protein ti t h p l Pichia pastoris.

 H n 3 th p nin qua, E.coli c s d ng r ng ri nh t bo ch cho bi u hi n protein. Tuy nhin, vi c ng d ng E.coli trong qu trnh bi u hi n cc protein c ngu n g c t eukaryote cn b h n ch do E.coli thi u cc b my n i bo th c hi n cc qu trnh bi n i sau d ch m. T bo E.coli khi bi u hi n protein c khuynh h ng gi l i ui Met, ui amino acid ny c th nh h ng t i s n nh c a protein v gy p ng mi n d ch, sau khi bi u hi n, vi c t o ra i u ki n g p cu n cho protein r t kh kh n th c hi n, r t t n th i gian v qu trnh ny khng ph i lc no c ng thnh cng. Nh ng i u ny lm t ng gi thnh s n xu t protein khi s d ng h th ng t bo E.coli

Nh ng thu n l i c a h th ng Pichia pastoris

C ng nh n m men S.cerevisiae, P.pastoris l vi sinh v t n bo d nui c y, d thao tc an ton i v i con ng i. P.pastoris l m t eukaryote, c cc qu trnh bi n i sau d ch m nh kh n ng g p cu n, hnh thnh c u n i disulfide, v glycosyl ha. Do , nhi u protein khi bi u hi n trong h th ng vi khu n b b t ho t do hnh thnh d i d ng th vi nh ng l i c ho t tnh sinh h c cao khi bi u hi n trong P.pastoris. C m t promoter m nh, s d ng ch t c m ng l methanol r ti n h n so v i t bo E.coli C kh n ng pht tri n pH t 3z7 do c th i u ch nh pH gi m thi u t i a ho t ng c a protease i v i protein ti t ra

 C th pht tri n v i m t t bo cao h n nhi u l n so v i S.cerevisiae C th bi u hi n protein v i hm l ng t miligram t i gram c trong nghin c u phng th nghi m l n trong s n xu t quy m cng nghi p Cc protein c a b n thn P.pastoris c ti t ra mi tr ng v i hm l ng r t th p nn qu trnh tinh s ch v thu nh n protein m c tiu v sau s r t d dng. Thnh ph n mi tr ng nui c y n gi n, chi ph ln men th p, cc ph ng php s d ng c th ng m i ha, ch ng v cc vector bi u hi n c s n trn th tr ng H n ch c s nhi m trong qu trnh ln men Qu trnh ln men c th th c hi n nhanh chng

a. Ch ng vi sinh v t v plasmid

Ch ng vi sinh v t: Pichia pastoris E.Coli

Plasmid (Invitrogen)  pPIC9K  TOPO pCR2.1

 Ch ng Pichia pastoris th ng c s d ng nhi u nh t l GS115 (his4), c gene m ha cho histidinol dehydrogenease b t bi n nn khng c kh n ng t t ng h p histidine; ch a gene AOX1 v AOX2, pht tri n c trn methanol m c ngang b ng v i ch ng hoang d i.  Ch ng E.coli DH5 hoang d i (Nanogen Biopharma)

Vector nhn dng pCR2.1

Topo pCR2.1 3,931 bp

Kch th c 3,931 bp Trnh t sao chp f1 Gen khng ampicillin Gen khng kanamycin ..

Vector bi u hi n pPIC9K (invitrogen)

Thi t k v t ng h p gene m ha cho hMPI

Trong nghin c u ny, trnh t gene m ha cho insulin ng i c bi n i m t s acid amin so v i trnh t cng b trn NCBI nh m lm t ng kh n ng bi u hi n protein, t ng hi u qu g p cu n, v t ng ho t tnh sinh h c.

 Trong nghin c u ny, hMPI c thi t k bao g m 53 amino acid: chu i B 29 amino acid; mini C 3 amino acid (Asp-Gly-Lys), chu i A 21 amino acid. Sau qu trnh g p cu n, 3 amino acid n i 2 chu i A v B s c c t b b ng trypsin t o ra insulin tr ng thnh. Trong c u trc insulin, v tr LysB29 c th b phn c t khi x l b ng tripsin nn chu i B c thi t k ch c 29 amino acid, ThrB30 c thm vo sau khi qu trnh x l tripsin hon t t. ProB28 c thay th b ng AspB28, HisB10 c thay th b ng AspB10

 Do c nhi u thay th trong trnh t amino acid c a insulin, nn thay v t ng h p gene b ng ph ng php PCR v i khun m u t mRNA ng i v v i c p m i c tr ng cho gene m ha cho insulin, sau ti n hnh t o t bi n i m t i nh ng v tr c n thi t, chng ti s d ng ph ng php t ng h p ha h c

 Hai chu i oligonucleotide m ha cho hMPI c t ng h p ha h c v i ph n overlap di 20 nucleotide. Ph n ng PCR c th c hi n v i s hi n di n c a enzyme Klenow nh m ko di 2 o n oligonucleotide t thnh trnh t DNA m ch i hon ch nh.

T o dng t bo E.coli DH5 mang plasmid pCR2.1 ch a gen m ha cho hMPI

V i m c ch khu ch i v l u tr gen hMPI cho cc th nghi m ti p theo, TA cloning kit c dng dng ha gen hMPI vo pCR2.1 (t l s n ph m PCR:plasmid ~3:1) 160C qua m c s hi n di n c a T4 ligase. Qu trnh n i ny s t o plasmid pCR2.1 ti t h p mang gen hMPI(pCR2.1/hMPI). Plasmid ny c i n bi n n p vo E.coli DH5 . Trn mi tr ng LB ch a ampicillin (50 g/ml) c b sung X-gal (80 g/ml) v IPTG (1mM). Cc khu n l c mang plasmid ti t h p c mu tr ng v ki m tra l i b ng ph ng php PCR khu n l c v i c p m i thng d ng M13-F/R cho vector pCR2.1. Nh ng khu n l c cho k t qu d ng tnh c tch chi t plasmid, v kh ng nh l i l n n a b ng ph n ng c t gi i h n v i EcoRI v NotI.

T o dng t bo E.coli DH5 mang plasmid pCR 2.1 ch a gene m ha cho hMPI

T o dng t bo E.coli DH5 mang plasmid pPIC9k ch a gen m ha cho hMPI

Plasmid ti t h p pCR2.1/hMPI v plasmid pPIC9K cng c c t b i EcoRI v Not I. gene m c tiu c tinh s ch t s n ph m c t plasmid ti t h p pCR2.1/hMPI v n i vo plasmid pPIC9K b ng enzyme T4 ligase t o plasmid ti t h p pPIC9K/hMPI. Plasmid ti t h p pPIC9K/hMPI c i n bi n n p vo E.coli DH5 v tr i trn mi tr ng th ch LB ch a 50 g/ml ampicillin, 370C.cc khu n l c c ki m tra b ng ph ng php PCR v i c p m i AOX1-F/R c tr ng cho vector pPIC9K ng th i vector ny c i gi i trnh t ch c ch n gen m ha cho hMPI khng c g thay i so v i khi thi t k

Plasmid ti t h p pCR2.1/hMPI

Plasmid pPIC9K

EcoRI v NotI pPIC9K/hMPI

E.Coli DH5 Mi tr ng th ch LB -50 g/ml Amp 370C -AOX1-F: 5-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3

- AOX1-R:5-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3

Ki m tra khu n l c b ng PCR Gi i trnh t v i c p m i AOX1-F/R Kh ng nh gen m ha cho hMPI

3.3 T o dng t bo n m men P.pastoris mang gen m ha cho hMPI

Plasmid ti t h p pPIC9K/hMPI c c t b ng Sal I t i v tr HIS4 t o ra plasmid d ng th ng v i n bi n n p vo t bo P.pastoris. Sau khi bi n n p, qu tnh ti t h p t ng ng s di n ra gi a pPIC9K/hMPI v genome c a n m men. Nh ng dng t bo c ch a pPIC9K/hMPI ti t h p c sng l c trn mi tr ng MD. y l mi tr ng ch n l c cho cc ch ng t bi n khuy t d ng hisdidine.

 Vector bi u hi n pPIC9K/hMPI c ch a cc gene HIS4 c kh n ng i u khi n sinh t ng h p histidine trong khi ch ng P.pastoris GS115 khng c kh n ng ny, do , ch nh ng dng t bo c s ti t h p t ng ng gi a pPIC9K/hMPI v genome c a P.pastoris m i c kh n ng m c c trn mi tr ng ny. Cc khu n l c m c ctrn mi tr ng MD c ti n hnh tch chi t genomic DNA ki m tra s hi n di n c a gene hMPI b ng PCR v i c p m i AOX1-F/R.

Plasmid pPIC9K/hMPI c c t b ng SalI t i v tr HIS4

Plasmid d ng th ng i n bi n n p Tb P.Pastoris Ti t h p t ng ng gi a pPIC9K v genone c a n m men

Sng l c trn mt MD

T bo P.Pastoris ti t h p c mang gen m ha cho hMPI Tch chi t DNA v ki m tra s hi n di n c a gen hMPI b ng PCR

C p m i AOX1-F/R

3.4 Sng l c dng t bo n m men P.pastoris c kh n ng bi u hi n hMPI cao

Cc khu n l c cho k t qu PCR d ng tnh c nui c y lin t c trn mi tr ng YPD v i n ng khng sinh G418 t ng d n (1,2,4,6 mg/ml) nh m sng l c nh ng ch ng P.pastoris ti t h p c mang nhi u b n sao c a gen m ha cho hMPI.

 Cc dng ny sau c nui c y trn mi tr ng MM. Mng nitrocellulose c p tr c ti p ln b m t n m men v ti p t c nui c y qua m. Khi , hMPI c n m men ti t ra s bm trn mng. Khng th c hi u khng hMPI(Abcam) c s d ng pht tn hi u hMPI trn mng; ty thu c m nh t c a tn hi u t ng ng v i kh n ng bi u hi n cao hay th p c a t ng dng P.pasrstoris ti t h p !" ch n l c c dng P.pastoris c mang nhi u b n sao gen m c tiu v c kh n ng bi u hi n hMPI cao.

K t qu ki m tra kh n ng bi u hi n mini-proinsulin c a cc dng t bo n m men Pichia pastoris b ng p mng trn khu n l c lai mi n d ch v i khng th a dng khng insulin. Nh ng m i tn ch cc dng t bo c kh n ng bi u hi n mini-proinsulin cao.

3.5 Bi u hi n hMPI

quy m nui c y l c

Ch ng P.pastoris ti t h p c ch a gene m ha cho hMPI (RPPI02) c t ng sinh qua m trong mi tr ng BMGY 280C, l c 250 vng/pht cho t i khi OD600 t 5-6. Sinh kh i n m men c thu nh n b ng ly tm 6000 vng/pht, v chuy n sang mi tr ng BMMY sao cho OD600 t 1. y l ch s OD ban u thch h p cho qu trnh c m ng MeOH v bi u hi n hMPI. Bnh nui c y c y b ng kh u trang y t ( qua kh o st), l c 250 vng/pht t ng t i a thong kh cho n m men trong su t qu trnh bi u hi n. Qu tnh bi u hi n c duy tr nh t 200C nh m gi m thi u kh n ng bi u hi n cc protein t p c a chnh t bo n m men, t ng % hMPI trong protein t ng s . Sau 24h nui c y, MeOH 100% c thm vo mi tr ng nui c y n n ng cu i l 1% cho t i khi k thc qu trnh bi u hi n. m u c thu sau m i 24h ki m tra m t t bo n m men trong mi tr ng nui c y.

Ch ng RPPI02 Mi tr ng BMGY T0 C=280 C

L c 250 vng/pht

T ng sinh OD600 t 5-6 Thu nh n sinh kh i

Ly tm 6000 vng/pht T=15 pht Mi tr ng BMMY T0 C=200 C L c 250 vng/phut y b ng kh u trang y t Thm MeOH sau m i 24h nui c y Ly tm thu d ch n i Ki m tra b ng pp Bradford v phn tch trn tricine SDS-PAGE 15%

Nui c y OD600 t1

C m ng v bi u hi n hMPI

Ki m tra hm l

ng protein

3.6 Bi u hi n hMPI trn quy m fermentor

Ch ng RPPI02 c t ng sinh b ng nui c y l c v i mi tr ng YPD nhi t 280C, l c 250 vng /pht trong kho ng 18-20h. sinh kh i sau c chuy n vo 2L mi tr ng BM trong fermentoe 5L c b sung PTM1, ti p t c t ng sinh trn fermentor v i c ch t l glycerol. Trong qu trnh ln men, t c t ng tr ng c a P.pastoris c theo di thng qua s gia t ng sinh kh i t theo th i gian, l ng O2 cung c p lin t c 6L/h.

3.7 Thu nh n v tinh s ch hMPI

3.8 Chuy n ha hMPI thnh hI

hMPI sau khi c tinh s ch s c c t b ng tripsin lo i b chu i C-peptide; ng th i g n thm ThrB30 t o thnh hI. Ph ng php: 20mg hMPI c ha trong 0.1 ml h n h p 34.3% acid acetic v 42.2% N,N dimethylformamide trong n c. 0.2ml 2M Thr-Obut trong N,N dimethylformamide c thm vo ph n ng v duy tr 120C. 2mg trypsin pha trong 0.05ml 0.05M calcium acetate c b sung vo h n h p ph n ng. Sau 96h 120C, protein c t a v i 4ml actetone lm l nh s n, c n protein c thu nh n b ng ly tm 13000v/p trong 15p 40C.

1. Xy d ng m hnh chu t ti u b ng STZ

ng type I

C ch : Khi chu t c tim i.p streptozotocin (STZ) kch thch qu trnh ph h y t bo tuy n t y. i t ng : Chu t nh t tr ng ci 5 tu n tu i. Chia lm 6 nhm, 5 con/nhm.
Nhm1 Nhm 2-6

SCB

STZ + SCB

Xy d ng m hnh chu t ti u type I b ng STZ

Tim STZ l n1
Ngy 0

ng

Tim STZ l n2
Ngy 1 Ngy 2 Ngy 3 Ngy 4 Ngy 5

-4h
Ki m tra n ng glucose trong mu h ng ngy

2. Th nghi m ho t tnh hI ti t h p in vivo

Th nghi m trn 4 nhm: 1 nhm chu t bnh th ng, 3 nhm chu t ti u ng (5con/nhm)

Chu t kh e PBS

Chu t b nh PBS

Chu t b nh Insulin (NOVO)

Chu t b nh hI

Ch ng m

2. Th nghi m ho t tnh hI ti t h p in vivo

Tim insulin B i
0h N Ki m tra n ng glucose trong mu (1,5h/l n) 1,5h 3h 4,5h 6h 7,5h

qu trnh theo di tc hnh chu t ti u

ng nhanh c a hI ln m ng typeI STZ

3. K t qu th nghi m
a) Tc ng nhanh c a hI :  Nhm i ch ng: c tim PBS c hm l ng ng huy t t ng theo th i gian trong su t 7,5h  Nhm tim insulin (NOVO) l ng ng huy t gi m m nh sau 1,5h. Sau , hm l ng ng l i t ng ln, trong 4,5h sau khi tim insulin hm l ng ng huy t v n duy tr d i ng ng 250mg/dl.  Nhm c tim hI tc ng c a insulin t ng t nh insulin (NOVO). hI c tc d ng lm gi m l ng ng huy t c a chu t ti u ng Type I STZ t ng t nh insuin(NOVO)

b) Tc d ng lu di c a hI:  Nhm ch ng m (chu t kh e) v n duy tr hm l ng ng huy t n nh, kh i l ng chu t t ng d n v 100% chu t duy tr s ng st.  Nhm chu t ti u ng khng tim insulin c hm l ng ng huy t t ng d n theo ngy, sau 10 ngy l ng ng huy t lun m c cao (" 500mg/dl) kh i l ng c th gi m m nh. Sau 12 ngy 100% chu t ch t.  Nhm c tim hI v insulin (NOVO) cho k t qu di n bi n b nh t ng t nhau. 100% chu t s ng sau 15 ngy quan st, hm l ng ng huy t duy tr n nh. Bn c nh kh i l ng c th chu t t ng d n. hI c tc d ng t ng ng insulin (NOVO) trong qu trnh c i thi n tnh tr ng b nh chu t ti u ng TypeI STZ

4. K t lu n
V i nh ng k t qu t c thi t l p thnh cng h th ng t bo P.pastoris dng cho bi u hi n hMPI trn quy m nui c y l c v quy m fermenter v i hm l ng protein t 150 g/l v 1g/l. Ph ng php t a protein sau ln men b ng (NH4 )2SO4 v tinh s ch protein b ng s c k l c gel c ng c xy d ng v i hi u su t cao ln n 90%. hI th hi n hoat tnh t t, t ng ng v i s n ph m insulin th ng m i c a NOVO Ch n Pichia pastoris l h th ng ph h p bi u hi n protein ng i v a cho n ng su t cao, chi ph ln men th p, trong khi protein c bi u hi n c ho t tnh t t khi th nghi m in vivo.